VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

The work presented in this doctoral dissertation has been carried out at theInstitute of Biotechnology from 2000 to 2008.Supervisor:prof. dr. Virginijus Siksnys (Institute of Biotechnology)(physical sciences, biochemistry (04 P), proteins, enzymology (P310))Evaluation board of dissertation of Biochemistry trend:Chairman:prof. habil. dr. Kęstutis Sasnauskas (Institute of Biotechnology)(physical sciences, biochemistry (04 P), proteins, enzymology (P310))Members:prof. dr. Vida Kirvelienė (University of Vilnius)(physical sciences, biochemistry (04 P), proteins, enzymology (P310))dr. Arvydas Lubys (Fermentas UAB)(physical sciences, biochemistry (04 P), proteins, enzymology (P310))dr. Gintaras Valinčius (Institute of Biochemistry)(physical sciences, chemistry (03 P), physical chemistry (P 400))prof. habil. dr. Artūras Žukauskas (University of Vilnius)(physical sciences, physics (02 P), semiconductor physics (P 265))Official opponents:dr. Česlovas Venclovas (Institute of Biotechnology)(biomedical sciences, biology (01 B), bioinformatics, medical informatics,biomathematics, biometrics (B 110))dr. Saulius Serva (Fermentas UAB)(physical sciences, biochemistry (04 P), proteins, enzymology (P310))The thesis defence will take place on 28 th of November, 2008, 11 a.m. at theInstitute of Biotechnology, Graičiūno 8, Vilnius, LT–02241, Lithuania.The summary of the thesis was distributed on 27 th of October, 2008.The thesis is available at the Library of Institute of Biotechnology and at theLibrary of University of Vilnius.

TURINYSTURINYS 1SUTRUMPINIMŲ SĄRAŠAS 2ĮVADAS 3TYRIMŲ METODIKA 5REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 11I. Restrikcijos endonukleazių, specifinių CCGG/CCNGG DNR sekoms, baltymų sekų panašumai 11II. Ecl18kI ir EcoRII aktyvaus centro/taikinio C:G nukleotidų atpažinimo determinantės 121. Ecl18kI spėjamo aktyvaus centro ir taikinio C:G nukleotidų atpažinimo determinančiųmutacinė analizė 132. Spėjamo Ecl18kI aktyvaus centro ir C:G bazių poros atpažinimo determinančių patvirtinimas 153. EcoRII spėjamo aktyvaus centro ir taikinio C:G bp atpažinimo determinančių mutacinė analizė 164. EcoRII spėjamo aktyvaus centro ir taikinio C:G atpažinimo determinančių patvirtinimas 185. Restrikcijos fermentų šeima, savo atpažinimo sekoje turinti CC:GG tetranukleotidą 19III. Kaip Ecl18kI, EcoRII-C ir PspGI atpažįsta DNR taikinius? 201. Restrikcijos endonukleazė Ecl18kI išsuka atpažinimo taikinio centrinius nukleotidus 202. Ecl18kI, EcoRII-C ir PspGI taikinio centrinių nukleotidų išsukimo tirpale tyrimas 222.1. Substratai 2-aminopurino fluorescencijos analizei 232.2. Ecl18kI-DNR komplekso fluorescencijos analizė esant Ca 2+ 232.3. Ecl18kI-DNR komplekso fluorescencijos analizė nesant Ca 2+ 242.4. Ecl18kI išsukamos bazės surišimo „kišenės“ mutantų-DNR komplekso fluorescencinė analizė 252.5. EcoRII-C ir PspGI fluorescencinė analizė 263. Nukleotido išsukimo fenomenas 27IV. Detalaus EcoRII sąveikos su DNR mechanizmo tyrimas 281. EcoRII-DNR komplekso stechiometrija: galimas DNR surišimo vietų skaičius 281.1. EcoRII-N sąveikos su DNR tyrimas sustabdyto elektroforetinio judrumo poslinkioPAAG metodu 281.2. EcoRII-N susirišimo su DNR tyrimas panaudojant gelfiltraciją 291.3. EcoRII-C susirišimo su DNR tyrimas gelfiltracijos metodu 302. EcoRII kinetiniai tyrimai siekiant patvirtinti trijų DNR surišimo modelį 322.1. DNR plazmidinių substratų kinetiniams tyrimams konstravimas 322.2. Plazmidinės DNR hidrolizė EcoRII esant [E]≥[S] 332.3. EcoRII reakcijos in trans 362.4. Plazmidinės DNR hidrolizė EcoRII esant [E]

SUTRUMPINIMŲ SĄRAŠAS2-AP2-aminopurinasλ žadbangos ilgis, kuriam esant sužadinamas fluoroforasλ embangos ilgis, kuriam esant vyksta fluoroforo emisijaAJMatominės jėgos mikroskopijaa.r.aminorūgštisbpbazių poraCDcirkuliarinis dichroizmasCPKCPK yra sutartinis spalvų kodavimas atvaizduojant vandenilioatomus balta spalva, anglies atomus juoda arba pilka spalvomis,azoto atomus mėlyna, deguonies atomus raudona, fosforo atomusoranžine, sieros atomus geltona, magnio atomus - žalia spalvomisDTT1,4-ditiotreitolisEDTAetilendiamintetraacto rūgštisHPLCaukšto slėgio skysčių chromotografijaIPTGizopropil-β-D-tiogalaktopiranozidasYpirimidinas T arba C, timinas or citozinasJSAjaučio serumo albuminaskbkilobazė(s)KTkambario temperatūraL1linijinė plazmidinės DNR forma, turinti vieną dvigrandininį trūkįL2plazmidinės DNR forma, turinti du dvigrandininius trūkiusL3plazmidinės DNR forma, turinti tris dvigrandininius trūkiusM. metiltransferazėM mmolekulinė masėNA, T, G arba C; adeninas, timinas, guaninas arba citozinasNDSnatrio dodecilsulfatasntnukleotidas(i)PAAGpoliakrilamidinis gelisPDB IDbaltymų duomenų bazės Protein Data Bank identifikacijos numerisPGRpolimerazinė grandininė reakcijaRpurinas A arba G, adeninas arba guaninasR. arba REazė restrikcijos endonukleazėSC arba G, citozinas arba guaninasSeMetselenometioninasSSsuperspiralizuota DNR formas.vnt.sutartiniai vienetaiTEMEDN,N,N’,N’-tetrametiletilendiaminasTris2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiolisvntvienetasVTplazmidinės DNR forma, turinti viengrandininių trūkiųWA arba T, adeninas arba timinaswtlaukinis tipas2

ĮVADASII tipo restrikcijos endonukleazės (REazės) atpažįsta trumpas, 4-8 bp, DNR sekasir kerpa abi taikinio grandines atpažinimo sekoje arba šalia jos susidarant 5′-fosfatui ir3′-hidroksilo grupei 1 . Šiuo metu įvairiose bakterijose yra surasta beveik 3800 II tipoREazių, atpažįstančių daugiau kaip 260 skirtingų DNR sekų (http://rebase.neb.com).II tipo endonukleazės sudaro bene didžiausią funkciškai susijusių fermentų šeimą. Josyra plačiai naudojamos molekulinėje biologijoje ir biotechnologijoje, tačiau šių fermentųstruktūra ir veikimo mechanizmai yra palyginti menkai ištyrinėti.II tipo REazės yra suskirstytos į keturias šeimas pagal konservatyvias aktyvauscentro aminorūgštis: PD-(E/D)XK, PLD, HNH ir GIY-YIG 2-8 . Neseniai publikuotarestrikcijos fermento PabI struktūra pasižymi nauja struktūrine sankloda, tad šisfermentas gali tapti dar vienos naujos nukleazių šeimos atstovu 9 .II tipo PD-(E/D)XK šeimos fermentai yra geriausiai funkciškai ir struktūriškaiištyrinėti. Pavyzdžiui, iš 26 II tipo REazių, kurių tretinė struktūra yra žinoma, 24priklauso būtent šiai šeimai. Remiantis bioinformatikine restrikcijos fermentų sekųanalize, spėjama, kad PD-(E/D)XK šeimai galėtų būti priskiriama net ~70% šiuo metuREBASE duomenų bazėje esančių REazių 10 . Šiai grupei priklausantys fermentai DNRhidrolizei naudoja kofaktoriaus Mg 2+ joną(-us), kurį(-iuos) koordinuoja rūgštinės a.r.liekanos iš PD-(E/D)XK motyvo. PD-(E/D)XK šeimos fermentų aktyvų centrąsudarančios aminorūgštys yra išsidėsčiusios ant konservatyvios baltymo struktūrinėsšerdies, kuri sudaryta iš penkių β-juostų ir dviejų jas supančių α-spiralių 11 . Šios šeimosfermentai pasižymi skirtingais specifiškumais, tad kyla natūralus klausimas, kaipkonservatyvi šių baltymų struktūrinė sankloda sugeba talpinti įvarius specifiškumus.1 lentelė. Restrikcijos fermentų, savoatpažinimo sekoje turinčių konservatyvųCC:GG motyvą, šeimaFermentas Tipas Atpažinimo sekaHpyF100III IIP↓ CCGGAgeI IIP A ↓ CCGGTKpn2I IIP T ↓ CCGGANgoMIV IIF G ↓ CCGGCBsaWI IIP W ↓ CCGGWBse634I/Cfr10I IIF R ↓ CCGGYSgrAI IIF CR ↓ CCGGYGPspGI IIP↓ CCWGGEcoRII IIE↓ CCWGGEcl18kI IIP↓ CCNGGPfoI IIP T ↓ CCNGGAMes norėtume suprasti, kaipfermentai, savo atpažinimo sekoje turintyskonservatyvų CC:GG motyvą, atpažįsta irkerpa skirtingas DNR sekas (1 lentelė).Šiame darbe mes nusprendėme ištirtiREazių Ecl18kI ir EcoRII, atpažįstančiųatitinkamai ↓ CCNGG ir ↓ CCWGG DNRsekas (‘ ↓ ’ žymi kirpimo vietą; N – G, A, Tarba C; W – A arba T), veikimomechanizmą ir struktūrines ypatybes.REazė Ecl18kI buvo surastaEnterobacter cloaceae 18k bakterijose 12 .Iki šiol Ecl18kI struktūra ir veikimomechanizmas buvo praktiškai netyrinėti.EcoRII yra IIE tipo REazė, kuri,skirtingai nuo įprastų IIP tipo fermentų,nekerpa DNR molekulių, turinčių pavieniusCCWGG atpažinimo taikinius 13 . DNRhidrolizei EcoRII yra būtina fermento sąveika su dviem CCWGG sekomis, bet tik vienaDNR taikinio kopija yra perkerpama, tuo tarpu antrasis taikinys veikia kaip alosterinisaktyvatorius pirmojo taikinio hidrolizei 13-15 . Nepaisant gausybės publikacijų, duomenysapie EcoRII veikimo mechanizmą yra prieštaringi ir reikalauja papildomų tyrimų.3

Darbo tikslai1. Identifikuoti REazių Ecl18kI ir EcoRII aktyvaus centro ir taikinio atpažinimodeterminantes.2. Išsiaiškinti, kaip restrikcijos fermentai Ecl18kI ir EcoRII, atpažįstantys pertrauktaspalindromines DNR sekas, sąveikauja su centriniu sekos nukleotidu.3. Išsiaiškinti REazės EcoRII DNR hidrolizės mechanizmą.Darbo mokslinis naujumasŠiame darbe mes parodėme, kad pertrauktas palindromines DNR sekasatpažįstantys restrikcijos fermentai Ecl18kI (atpažįsta CCNGG) ir EcoRII (CCWGG) beiheksanukleotidines sekas atpažįstančios REazės Bse634I/Cfr10I (RCCGGY), NgoMIV(GCCGGC) (1 lentelė) turi panašius struktūrinę sanklodą, aktyvius centrus ir taikinioCC:GG dalies atpažinimo determinantes. Mes atradome, kad Ecl18kI REazė,sąveikaudama su pertraukta atpažinimo seka CCNGG, išsuka centrinę bazių porą išdvigubos DNR spiralės. Bazės išsukimo mechanizmas iki šiol buvo žinomas tik DNRmodifikuojantiems fermentams (metiltransferazėms, reparacijos fermentams ir kt.), kurieišsuka modifikuojamą DNR bazę į aktyvų centrą. Mes parodėme, jog REazė Ecl18kIišsuka atpažįstamos sekos centrinius nukleotidus, kad atpažintų savo seką bei užtikrintųfosfodiesterinės jungties hidrolizę. Be to, mes parodėme, kad centrinį nukleotidą(us) išCCWGG sekos išsuka ir EcoRII katalitinis domenas (EcoRII-C) bei PspGI REazė.Pasiremdami šiame darbe gautais eksperimentiniais duomenimis mes pasiūlėme naująREazės EcoRII veikimo mechanizmą, pagal kurį fermentas efektyviai fosfodiesterinėsjungties hidrolizei vienu metu privalo surišti tris, o ne du DNR taikinius.Darbo reikšmėRestrikcijos fermentai yra plačiai taikomi biotechnologijoje kaip molekulinėsžirklės, leidžiančios tiksliai perkirpti DNR norimoje vietoje, ir yra nepakeičiami genųinžinerijoje. Baltymų inžinerijos metodais keičiant restrikcijos fermentus būtų galimasukurti naujus molekulinius įrankius biotechnologijai, bet tokių eksperimentų sėkmė yrakol kas labai ribota. Naujų fermentų racionalaus konstravimo strategijos parinkimasreikalauja detalaus REazių struktūros ir veikimo mechanizmų, užtikrinančių fermentųspecifiškumą, pažinimo. Šis darbas parodo, kaip evoliuciškai susijusios REazėsrealizuoja savo specifiškumą ir suteikia naujų idėjų baltymų inžinieriams.Ginamieji disertacijos teiginiai1. Giminingais specifiškumais pasižyminčios REazės Ecl18kI ( ↓ CCNGG), EcoRII( ↓ CCWGG) bei Bse634I/Cfr10I (R ↓ CCGGY) ir NgoMIV (G ↓ CCGGC) turikonservatyvius aktyvius centrus ir atpažinimo sekos C:G bazių poros atpažinimodeterminantes.2. Savo specifiškumui užtikrinti REazė Ecl18kI iš savo atpažinimo sekos CCNGGišsuka abu centrinius nukleotidus į baltymo „kišenę“.3. 2-Aminopurino, esančio restrikcijos fermentų Ecl18kI, EcoRII-C ar PspGI taikiniocentrinėje padėtyje, fluorescencijos signalas išauga prisirišus fermentui, kas rodo, kadšios REazės išsuka DNR atpažinimo sekos nukleotidus(ą) tirpale.4. REazės EcoRII DNR atpažinimo sekos abiejų grandinių sutartiniam kirpimui būtinastrijų DNR taikinių surišimas.4

TYRIMŲ METODIKAFermentai. T4 polinukleotidkinazė, DNR polimerazės, šarminė fosfatazė, T4 DNR ligazė irvisos darbe naudotos REazės pagamintos „Fermentas UAB “. Jaučio serumo albuminas –„Fermentas UAB“ arba „Pierce“. Termolizinas pagamintas firmoje „Serva“ arba „Sigma“.Visi šie produktai naudoti atsižvelgiant į gamintojo rekomendacijas. RekombinantinisEcoRII-C preparatas kinetiniams tyrimams gautas iš M. Reuter (Institute of Virology, Berlin,Vokietija).Oligonukleotidiniai substratai. Šiame darbe naudoti nemodifikuoti deoksioligonukleotidaibuvo susintetinti „Metabion“, o turintys 2-AP modifikaciją − „Integrated DNATechnologies”. DNR oligodupleksai (2 lentelė) buvo gaunami sulydant atitinkamus viengrandininiusdeoksioligonukleotidus. Gaminant radioaktyviais izotopais žymėtus substratus,prieš sulydymą reikiama DNR grandinė buvo žymima 5’-gale 33 P izotopu panaudojant T4polinukleotidkinazę ir [γ 33 P]ATP („Hartmann Analytic”).2 lentelė. Darbe naudoti sintetiniai oligodupleksaiOligodupleksasSP16aNSP16SP16bSP12SP33NSP33NSP25/28T/AT/22FSSeka5'-CGTAGCCTGGGGCTAG-3'3'-GCATCGGACCCCGATC-5'5'-AGCGTAGCACTGGGCT-3'3'-TCGCATCGTGACCCGA-5'5’-CGTAGCCTGGTCGATC-3’3’-GCATCGGACCAGCTAG-5’5’-TAGCCTGGTCGA-3’3’-ATCGGACCAGCT-5’5’-AATGGGCTCGCACGCCTGGTATTATCGATTG3’-TTACCCGAGCGTGCGGACCATAATAGCTAACTA-3’AT-5’5’-AATGGGCTCGCACGGCGGCTATTATCGATTG3’-TTACCCGAGCGTGCCGCCGATAATAGCTAACTA-3’AT-5’5’-CGCACGACTTGTCACAAGAGCACGC-3’3’-GCGTGCTGAACAGTGTTCTCGTGCGTTG-5’5’-CGCACGCCTTCCTGGAAGCACACTA-3’3’-GCGTGCGGAAGGACCTTCGTGTGAT-5’5’-CGCACGCCTTCCTGGAAGCACACTA-3’3’-GCGTGCGGAAGG2CCTTCGTGTGAT-5’5’-CGCACGCCTTCCTGGAAGCACACTA-3’3’-GCGTGCGGA2GGACCTTCGTGTGAT-5’Paskirtis16 bp specifinis dupleksas Ecl18kIbaltymo-DNR sąveikai tirti16 bp nespecifinis dupleksasEcl18kI baltymo-DNR sąveikai tirti16 bp specifinis dupleksas EcoRII-Ngelfiltracijos eksperimentui16 bp specifinis dupleksas EcoRII-Cgelfiltracijos eksperimentui33 bp specifinis dupleksas EcoRIIbaltymo-DNR sąveikos irplazmidinės DNR hidrolizėsstimuliacijos in trans tyrimams33 bp nespecifinis dupleksas EcoRIIbaltymo-DNR sąveikos irplazmidinės DNR hidrolizėsstimuliacijos in trans tyrimams25/28 bp nespecifinis dupleksasEcl18kI wt, W61Y, W61A,EcoRII-C, PspGI, MvaI baltymo-DNR sąveikai tirti25 bp specifinis dupleksas neturintis2-AP, skirtas 2-AP fluorescencijostyrimams25 bp specifinis dupleksas turintis2-AP, skirtas 2-AP fluorescencijostyrimams25 bp specifinis dupleksas turintis2-AP šalia taikinio, skirtas 2-APfluorescencijos tyrimams* Ecl18kI, EcoRII, PspGI ir MvaI taikiniai paryškinti; 2 – 2-aminopurino modifikacijapabraukta ir paryškinta. DNR duplekso sekoje 2FS 2-aminopurinas įvestas šalia taikinio.DNR. λ dam – dcm – DNR, plazmidės pUC19 dam – dcm – , pUC19 ir pBluescript IIKS (+)gautos iš „Fermentas UAB”. pET21b (+) buvo gauta iš „Novagen“. pKpn2I-ori plazmidė5

gauta iš S. Jurėnaitės-Urbanavičienės (Biotechnologijos institutas) ir A. Lubio(„Fermentas UAB“). pHSG415 ts _wt_M.Ecl18kI (Cm r ), pUC129_wt_R.Ecl18kI (Ap r ) irpQE30_wt_ _R.Ecl18kI-H 6 (Ap r ) Ecl18kI raiškos plazmidės gautos iš A.S. Solonin(Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino, Rusija).pDK1_wt_M.EcoRII (Cm r ), pQE30_wt_R.EcoRII-H 6 (Ap r ), pQE30_R.EcoRII-N-H 6 (Ap r ),pQE30_Y41A_R.EcoRII-H 6 (Ap r ), pQE30_E271A_R.EcoRII-H 6 (Ap r ), pQE30_D299A_R.EcoRII-H 6 (Ap r ), pDK11_wt_R.M.EcoRII (Ap r ) EcoRII raiškos plazmidės ir plazmidėpVH1 (Kn r ) (turinti lacI q geną) gautos iš M. Reuter (Institute of Virology, Berlin, Vokietija).pACYC184_wt_M.PspGI (Cm r ) ir pET21a (+)_wt_R.PspGI (Ap r ) PspGI raiškos plazmidėsgautos iš „New England Biolabs”.Kamienai. Naudota E. coli JM109, BL21(DE3), HMS174(DE3), ER2566 (DE3) ir GM31.Buferiai. Proteolizės buferis 10 mM Tris–HCl (pH 7.5 esant 25°C), 200 mM KCl, 1 mMDTT. Susirišimo buferis I 33 mM Tris-acetatas (pH 7.9 esant 37°C), 66 mM K-acetatas,0.1 mg/ml JSA, 10% glicerolio. Susirišimo buferis II 40 mM Tris-acetatas (pH 8.3 esant25°C), 0.1 mg/ml JSA, 10% glicerolio. Reakcijos buferiai 33 mM Tris-acetatas (pH 7.9esant 15, 25 arba 37°C), 66 mM K-acetatas, 10 mM Mg-acetatas, 0.1 mg/ml JSA.Fluorescencijos buferis 33 mM Tris-acetatas (pH 7.9 esant 25°C), 66 mM K-acetatas.Gelfiltracijos buferis I 100 mM Na-fosfatas (pH 6.7 esant 25 C), 100 mM Na-sulfatas.Gelfiltracijos buferis II 20 mM Tris-HCl (pH 7.5 esant 25 C), 200 mM KCl, 5 mM CaCl 2 ,10% glicerolio.Baltymų elektroforezė poliakrilamidiniame gelyje esant denatūruojančioms sąlygoms.Elektroforezės buferio sudėtis: 25 mM Tris, 190 mM glicino (pH 8.3 esant KT) ir 0.1%NDS. Koncentruojančio ir frakcionuojančio gelių sudėtis: atitinkamai 4% (125 mMTris-HCl (pH 6.8 esant KT) ir 0.1% NDS) ir 12% (375 mM Tris-HCl (pH 8.8 esant KT) ir0.1% NDS) akrilamido / N,N'-metilenbisakrilamido (santykis 37.5:1). Baltymų mėginiaibuvo sumaišomi 1:1 su mėginio buferiu (100 mM Tris-HCl (pH 6.8 esant KT), 4% NDS,200 mM DTT, 20% glicerolio, bromfenolio mėlynojo pėdsakai), gauti mišiniai priešelektroforezę palaikomi 5 min 95 °C vandens vonelėje. Pavyzdžiai buvo frakcionuojami1-1.5 h esant KT (25 V/cm). Geliai, nudažyti kumasi mėliu, buvo fotografuojamiskaitmenine fotokamera BioDocAnalyze („Biometra“), o gauti vaizdai analizuojamikompiuterine 1-D Main („Advanced American Biotechnology“) programa.Elektroforezė agaroziniuose geliuose esant nedenatūruojančioms sąlygoms. DNRfragmentų ir įvairių plazmidinių substratų formų, susidarančių karpant superspiralizuotusplazmidinius substratus restrikcijos fermentais, atskyrimui naudoti 0.8-1.2% agaroziniaigeliai. Elektroforetinio buferio sudėtis: 100 mM natrio borato, 15 mM natrio acetato, 2 mMEDTA (pH 8.2 esant KT) ir 0.5 µg/ml etidžio bromido. UV lempa apšviesti geliai buvofotografuojami skaitmenine fotokamera, o gauti vaizdai analizuojami programa 1-D Main(„Advanced American Biotechnology“).DNR fragmentai reikalingi AJM, genų inžinerijos procedūroms, bei SS plazmidinės DNRforma EcoRII hidrolizės reakcijoms buvo frakcionuojami 0.8-2.0% agaroziniuose geliuoseelektroforezės buferyje be etidžio bromido (40 mM Tris-acetato (pH 8.3 esant KT) ir 1 mM16EDTA). DNR buvo išgryninama panaudojant ekstrakciją fenoliu .Elektroforezė poliakrilamidiniame gelyje esant nedenatūruojančioms sąlygoms.Elektroforetinio buferio sudėtis: 40 mM Tris-acetato (pH 8.3 esant 25 °C) ir 5-10 mM kalcioacetato arba 0.1 mM EDTA. Darbe naudoti 6-8% akrilamido / N,N'-metilenbisakrilamido(santykis 29:1) geliai. Radioaktyviais izotopais žymėti oligonukleotidai buvo sumaišomi suįvairiais baltymo kiekiais, gauti mišiniai palaikomi KT 10 min ir frakcionuojami gelyje 2-3valandas esant KT ir ~6 V/cm. Po elektroforezės geliai buvo išdžiovinami, o radioaktyviDNR detektuojama BAS-MS („FujiFilm“) fosforescencinių ekranų ir Cyclone TM6

(„Perkin Elmer“) skenerio pagalba. DNR fragmentų kiekiai nustatyti OptiQuant 3.0kompiuterine programa („Perkin Elmer“).Elektroforezė poliakrilamidiniame gelyje esant denatūruojančioms sąlygoms.Elektroforezės buferio sudėtis: 100 mM Tris-borato (pH 8.2 esant KT) ir 2 mM EDTA.Gelių sudėtis: 20% akrilamido / N,N'-metilenbisakrilamido (santykis 29:1) ir 7 M karbamidoelektroforezės buferyje. Prieš užnešant pavyzdžius, vykdyta 2 h preforezė (30 V/cm),užnešti pavyzdžiai frakcionuoti dar 2-3 h. Po elektroforezės geliai buvo išdžiovinami, oradioaktyvi DNR aptinkama kaip aprašyta aukščiau.Mutagenezė. Kryptinga Ecl18kI ir EcoRII aktyvaus centro ir C:G bp atpažinimo a.r.mutagenezė buvo vykdyta dviejų stadijų PGR („megapradmens“) metodu 17 . Ecl18kI W61Yir W61A mutantai sukonstruoti pagal modifikuotą „QuickChange“ mutagenezės protokolą 18 .Mutacijų įvedimas tik konkrečioje vietoje buvo patvirtintas, nustatant geno nukleotidinęseką.Ecl18kI raiška ir gryninimas. Ecl18kI raiškai naudotas E. coli JM109 kamienas, turintismetiltransferazės geną plazmidėje pHSG415 ts _wt_M.Ecl18kI (Cm r ) 12 , bei REazės genąplazmidėje: 1) pQE30_R.Ecl18kI-H 6 (Ap r ) 12 − mutantinių E125A, D160A, K182A, R186A,E187A, R188A, E195A baltymų raiškai; 2) pUC129_wt_R.Ecl18kI (Ap r ) 12 − wt baltymocharakterizavimui; 3) pET21b (+)_R.Ecl18kI (Ap r ) − kristalinimo, fluorescencijoseksperimentuose, bei W61Y ir W61A mutantinių baltymų raiškai. SeMet žymėtas Ecl18kIgautas auginant E. coli minimalioje M9 terpėje 19 , pagal publikuotą metodiką 20 . Kiti Ecl18kIbaltymai auginti LB terpėje 16 . Mutantiniai 6 histidinų inkarą turintys Ecl18kI baltymaiišgryninti baltymų mišinį frakcionuojant Ni 2+ jonus chelatuojančioje ir AH-sefarozėskolonėlėse („GE Healthcare“). Wt baltymo charakterizavimui Ecl18kI buvo išgrynintasskysčių chromatografijos būdu naudojant heparin-sefaroze, Q-sefaroze, mėlyna sefaroze(„GE Healthcare“) ir hydroksilapatitu („Calbiochem”) užpildytas kolonėles. Wt, SeMet,W61Y ir W61A Ecl18kI baltymai kristalinimo ir fluorescencijos eksperimentams išgrynintipanaudojant fosfoceliuliozės P11 („Whatman“), Q-sefarozės, bordo-sefarozės ir AHsefarozės(„GE Healthcare“) sorbentus.EcoRII raiška ir gryninimas. EcoRII mutantinių baltymų raiškai naudotas E. coli JM109kamienas, turintis REazės geną plazmidėje pQE30_R.EcoRII-H 6 (Ap r ) ir metiltransferazėsgeną plazmidėje pDK1_wt_M.EcoRII (Cm r ) 21 . wt EcoRII baltymo raiška buvo gauta E. colikamiene HM174 (DE3, pVH1 (Kn r )), turinčiame plazmidę pDK11_R.M. EcoRII (Ap r )) 22 .Siekiant padidinti EcoRII K328A, D329A ir R330A baltymų išeigą, šių mutantų raiškaibuvo pasirinkta minimali M9 terpė; kitų EcoRII baltymų raiška pasiekta auginant E. coliląsteles LB terpėje 16 . Mutantiniai 6 histidinų inkarą turintys EcoRII baltymai išgryninti kaipaprašyta 21,23 . wt EcoRII buvo išgrynintas skysčių chromatografijos būdu naudojantfosfoceliulioze P11 („Whatman”), heparin-sefaroze ir AH-sefaroze („GE Healthcare”)užpildytas kolonėles. DNR susirišimo ir gelfiltracijos eksperimentams EcoRII-C buvogautas proteolizės būdu ir proteolizės mišinys buvo naudotas be papildomo gryninimo(žiūrėti žemiau). EcoRII-C, naudotas 2-AP turinčių oligodupleksų susirišimo, hidrolizės irfluorescencijos eksperimentuose, buvo gautas proteolizuojant EcoRII Y41A mutantinįbaltymą, kuris pasižymi mažu aktyvumu 24 . 1 mg Y41A suskaldyto termolizinu proteolizėsmišinys frakcionuotas HiTrap heparino („GE Healthcare”) kolonėlėje pagal gamintojorekomendacijas. EcoRII-C identifikuotas frakcijose pagal padidėjusį λ dam – dcm – DNRhidrolizės efektyvumą proteolizės metu 24 .PspGI ir MvaI raiška ir gryninimas. PspGI baltymo raiška pasiekta E. coli ER2566 (DE3)kamiene su plazmidėmis pACYC184_wt_M.PspGI (Cm r ) ir pET21a (+)_wt_R.PspGI(Ap r )), auginant LB terpėje. PspGI išgrynintas kaip aprašyta 25,26 . MvaI baltymo raiška irgryninimas atlikti kaip aprašyta 27 .7

Masių spektrometrija. Wt ir SeMet Ecl18kI molekulines mases nustatė V. Lukša (SicorBiotech UAB, Vilnius) ir G. Lukinavičius (Biotechnologijos institutas, Vilnius) naudojantHewlett-Packard 1100 spektrometrą.Baltymų sekų analizė. Teoriniai fizikiniai baltymų parametrai nustatyti panaudojantProtParam tool (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Ecl18kI, EcoRII, EcoRII-C irPspGI baltymų koncentracijos išreikštos dimerais, EcoRII-N ir MvaI − monomerais. Sekųpalyginimas atliktas naudojant FASTA ir Multalin 28 (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) programas.Cirkuliarinio dichroizmo spektroskopija. CD spektrai užrašyti panaudojant „Jasco“ J-710CD spektrometrą: Ecl18kI mutantai buferyje 30 mM Tris-HCl (pH 7.0 at 25°C), 150 mMNaCl, EcoRII mutantai − 10 mM Tris−HCl (pH 7.5 at 25°C), 200 mM KCl, 10% glicerolis,0.01% triton X-100.Analitinis ultracentrifugavimas. Ecl18kI baltymų molekulinės masės tirpale buvonustatytos analitinio ultracentrifugavimo pagalba esant pusiausvyrinėms sedimentacijossąlygoms. Eksperimentą atliko C. Urbanke (Hanover Medicinische Hochschule, Vokietija)su „Beckman-Coulter“ Model XL-A analitine ultracentrifuga, molinės masės buvosuskaičiuotos kaip aprašyta 29 .Dalinė proteolizė. EcoRII-C ir EcoRII-C mutantai gauti proteolizuojant termolizinu0.5 mg/ml (5.4 µM) EcoRII Proteolizės buferyje (su 20–45% glicerolio, 0.015–0.1%triton X-100 ir 2 mM Ca-acetato) esant 25 °C temperatūrai. Proteolizės mišinyje naudotasbaltymo ir termolizino santykis 10:1 (pagal masę) (K328A, D329A, R330A mutantams −2.5:1). Proteolizė buvo stabdoma pridedant EDTA iki galutinės 9 mM koncentracijos irinkubuojant mėginius 3 min 40 °C. Proteolitiniai baltymų fragmentai buvo frakcionuojamielektroforezės pagalba. Po proteolizės EcoRII buvo pilnai sukarpytas ir EcoRII-C reakcijosmišinyje sudarė >90%, tad DNR susirišimo ir gelfiltracijos eksperimentams proteolizėsmišinys naudotas be papildomo gryninimo. EcoRII-C išeiga įvertinta densitometrinėsanalizės būdus standartu naudojant wt EcoRII, nuskanavus kumasi mėliu nudažytus gelius(kaip aprašyta aukščiau). Proteolitinio EcoRII-C N-galo a.r. seka nustatyta ZMMK-Servicelabor (University of Cologne, Vokietija).Baltymo ir DNR sąveikos tyrimas. Šiuose eksperimentuose buvo naudoti 33 P izotopupažymėti oligodupleksai (2 lentelė). Įvairūs baltymų kiekiai buvo inkubuojami 10 min KTsu DNR oligodupleksais (0.1-1 nM) susirišimo buferyje turinčiame 0.1 mM EDTA arba 5-10 mM Ca-acetato. 6 histidinų inkarą turinčio wt, aktyvaus centro ir C:G atpažinimoEcl18kI mutantai su DNR oligodupleksais buvo inkubuoti Susirišimo buferyje I; wt EcoRII,EcoRII-N, EcoRII-C (išgrynintas), PspGI, MvaI, bei wt, W61Y ir W61A Ecl18kI inkubuotiSusirišimo buferyje II. EcoRII-C ir EcoRII-C mutantų DNR surišimo eksperimentuoseįvairūs baltymo kiekiai iš proteolizės mišinio (sustabdyto pridedant EDTA, bet nekaitinant40 °C) inkubuoti su DNR Proteolizės buferyje su 10% glicerolio ir 0.1 mg/ml JSA (esant irnesant 10 mM Ca-acetato). Laisva DNR ir baltymo-DNR kompleksai buvo frakcionuojamipoliakrilamidiniame gelyje esant nedenatūruojančioms sąlygoms, radioaktyvi DNRidentifikuota ir DNR fragmentų kiekiai nustatyti kaip aprašyta aukščiau. K d vertė įvertintaspecifiniam oligodupleksui DNR susirišimo duomenis aprašant lygtimi:y = {s 0 - x - K d + [(s 0 + x +K d ) 2 - 4s 0 x] 0.5 }/2kur y yra nesurištos į kompleksą DNR dalis (išreikšta nM), x yra bendra baltymokoncentracija reakcijos mišinyje, s 0 yra bendra DNR koncentracija reakcijos mišinyje ir K d −baltymo-DNR komplekso disociacijos konstanta.Fermento DNR hidrolizės aktyvumo nustatymas. Wt, aktyvaus centro ir C:G atpažinimoEcl18kI mutantų aktyvumas nustatytas inkubuojant 75 nM Ecl18kI su 2.5 nM8

pUC19 dam − dcm − plazmidine DNR Reakcijos buferyje (pH 7.9 esant 15 °C) esant 15 °Ctemperatūrai. Reakcijos stabdytos pridedant mėginio buferio su EDTA. Gauti pavyzdžiaibuvo frakcionuojami agaroziniame gelyje esant nedenatūruojančioms sąlygoms. SSsubstrato koncentracijos mažėjimas laike aprašytas vienos eksponentės lygtimi irsuskaičiuota reakcijos greičio konstanta k 1 .EcoRII wt ir mutantinių baltymų (bei Ecl18kI E125A ir E187A baltymų) aktyvumasnustatytas inkubuojant įvairius baltymo kiekius 50-yje µl Reakcijos buferio (pH 7.9 esant37°C), turinčiame 1 µg fago λ dam − dcm − DNR. Reakcija vykdyta 37 °C temperatūroje irsustabdyta pridedant mėginio buferio su EDTA. Reakcijos produktai atskirti 0.8% agarozėsgelyje ir vizualiai įvertintas substrato sukarpymo pilnumas. Vienas fermento aktyvumovienetas yra toks baltymo kiekis, kuris pilnai hidrolizuoja 1 µg fago λ DNR per 60 min 50-yje µl reakcijos mišinio optimaliomis sąlygomis. Wt EcoRII specifinis aktyvumas2 × 10 5 vnt/mg.Wt Ecl18ki, W61Y ir W61A Ecl18kI, EcoRII-C, PspGI gebėjimas hidrolizuoti 2-APturinčius substratus įvertintas naudojant 33 P izotopu pažymėtus oligodupleksus. Ecl18kIhidrolizės reakcijos atliktos inkubuojant 300 nM Ecl18kI su 200 nM oligodupleksoReakcijos buferyje (pH 7.9 esant 25 °C) esant 20 °C temperatūrai. EcoRII-C ir PspGIhidrolizės reakcijos atliktos inkubuojant 1000 nM baltymo su 200 nM oligodupleksoReakcijos buferyje (pH 7.9 esant 25°C) esant 25 °C temperatūrai. Reakcijos stabdytospridedant mėginio buferio su EDTA. Reakcijos pavyzdžiai analizuoti ir įvertinti kaipaprašyta 30 .Ecl18kI-DNR struktūros nustatymas. Ecl18kI-DNR komplekso struktūrą 1.7 Å skiriamąjageba nustatė dr. M. Bochtler grupė (International Institute of Molecular and Cell Biology,Warsaw, Lenkija) panaudojant daugybinio anomalaus išsklaidymo metodą, bei SeMetžymėtą baltymą ir KBr mirkinius.2-aminopurino fluorescencijos intensyvumo matavimai. 2-AP fluorescencijosmatavimams naudoti 25 bp oligodupleksai (2 lentelė), turintys 2-AP įvairiose atpažinimosekos vietose. Fluorescencijos intensyvumas 25°C temperatūroje matuotas Fluoromax-3(„Jobin Yvon“) spektrometru su Xe lempa. Emisijos spektrai (340−420 nm) užrašytinaudojant λ žad = 320 nm sužadinimo bangos ilgį, sužadinimo plyšio plotį 2 nm ir emisijosplyšio plotį 8 nm. Kiekvienas spektras užrašytas bent 2 kartus. Spektro matavimui 250 nMT/2 ar 2FS oligoduplekso sumaišyta su 1250 nM baltymo Fluorescencijos buferyje nesant iresant 10 mM Ca-acetato. Kontroliniai spektrai užrašyti analogiškomis sąlygomis, tiknaudojant NSP25/28 oligodupleksą. Koreguoti 2-AP emisijos spektrai gauti atėmuskontrolinio mėginio spektrus. Oligoduplekso titravimo eksperimentuose emisijos spektraiužrašyti baltymo-DNR kompleksams naudojant 250 nM T/2 oligoduplekso ir 0-2000 nMbaltymo.Gelfiltracija. wt EcoRII, EcoRII-N, EcoRII-N-DNR, bei EcoRII-C wt ir mutantųgelfiltracijos eksperimentai buvo atlikti Gelfiltracijos buferyje I naudojant Waters Breeze(„Waters“) HPLC chromatografinę sistemą ir TSK-GEL Super SW2000 kolonėlę („TosohBioscience”). EcoRII-N (1.5 µM) ar wt EcoRII (2 µM) buvo sumaišomi su DNR (2 lentelė)20 µl Gelfiltracijos buferyje I. EcoRII-N-DNR kompleksai buvo paruošti sumaišant 30 pmolEcoRII-N su įvairiais kiekiais SP16b oligoduplekso. Wt EcoRII-C ir EcoRII-C mutantųoligomerizacijos tyrime ant gelfiltracijos kolonėlės užnešta 20 µl proteolizės mišinio(sustabdyto su EDTA, bet nekaitinant 40 °C). EcoRII-C-DNR gelfiltracijos eksperimentaibuvo atlikti Gelfiltracijos buferyje II naudojant ÄKTA FPLC („GE Healthcare“)chromatografinę sistemą ir Superdex 200 HR kolonėlę („GE Healthcare“). 2.6 µMEcoRII-C išgryninto po proteolizės buvo sumaišoma su įvairiais kiekiais SP12oligoduplekso (2 lentelė) 100 µl. Eliucija buvo stebima matuojant absorbciją prie 215 ir9

260 nm. Baltymo ir baltymo-DNR kompleksų M m buvo nustatytos naudojantis kalibracinekreive, sudaryta išmatavus žinomos M m standartinių baltymų („Bio-Rad“) eliucijos tūrius.Plazmidinių substratų konstravimas ir gryninimas. Plazmidinės DNR pEcoRII-1,pEcoRII-2, pEcoRII-3, turinčios atitinkamai 1, 2 arba 3 EcoRII taikinius su identiškomissupančiomis sekomis bei identiškomis taikinių orientacijomis buvo sukonstruotosgenetiniais metodais plazmidės pKpn2I-ori pagrindu. Plazmidės buvo išgrynintos iš E. coliGM31 dcm − kamieno ir išgrynintos ultracentrifugavimu CsCl gradiente esant etidžiobromidui ir papildomai frakcionuojant agarozėje nedenatūruojančiomis sąlygomispanaudojant ekstrakciją fenoliu 16 .Plazmidinių substratų hidrolizė. Reakcijos su plazmidiniais DNR substratais buvoatliekamos Reakcijos buferyje (pH 7.9 esant 25 °C) esant 25°C temperatūrai. Naudota1.5 nM DNR substrato ir 0.05-500 nM wt EcoRII, 0.2-125 nM PspGI ir 0.1-20 nMEcoRII-C. Plazmidinės DNR hidrolizės stimuliacijos oligodupleksais eksperimentuosenaudota 33 bp oligodupleksai (2 lentelė) 0.2 nM-16 µM koncentracijose. Reakcijosstabdytos pridedant mėginio buferio su EDTA. Gauti pavyzdžiai buvo frakcionuojamiagaroziniame gelyje esant nedenatūruojančioms sąlygoms. Esant fermento pertekliui irekvimoliariniui baltymo-DNR santykiui SS substrato koncentracijos mažėjimas laikeaprašytas vienos eksponentės lygtimi ir suskaičiuota reakcijos greičio konstanta k obs .Reakcijose, kuriose buvo naudotas substrato perteklius, SS substrato koncentracijosmažėjimo tiesinei daliai pritaikyta tiesinė lygtis ir suskaičiuota reakcijos greičio konstantak cat .Duomenų apdorojimas. Baltymo-DNR komplekso disociacijos konstantos K d ir kinetiniųkonstantų skaičiavimui naudota KyPlot 2.0 programa 31 .DNR fragmentų AJM konstravimas ir gryninimas. EcoRII AJM skirti DNR fragmentaiPGR1 ir PGR3, turintys, atitinkamai, 1 ir 3 EcoRII taikinius, sukonstruoti PGR pagalbapadauginat norimą pBluescript IIKS (+) plazmidės regioną. PGR produktai buvofrakcionuoti agaroziniame gelyje nedenaturuojančiomis sąlygomis ir išgryninti panaudojantQIAquick Gel Extraction Kit („Qiagen”).EcoRII-DNR atominės jėgos mikroskopija. EcoRII-DNR kompleksus paruošė, AJMvaizdus surinko ir apdorojo prof. dr. Y. Lyubchenko grupė (University of Nebraska MedicalCenter, JAV). 10 µl EcoRII susirišimo reakcijos inkubuotos 15 min KT naudojant 10-100 nM PGR3 fragmento ir 20-200 nM EcoRII arba 205 nM PGR1 fragmento ir 209 nMEcoRII 40 mM HEPES (pH 8.4 esant 25°C) buferyje. Baltymo-DNR kompleksai buvoužfiksuojami pridedant 0.5% glutaro aldehido ir inkubuojant papildomai 10 min. Pofiksacijos (reakciją sustabdžius Tris-HCl (pH 7.1)) kompleksai išgryninti panaudojantMontage PGR („Millipore”) filtrą. Pavyzdžiai įvairiais skiedimais buvo fiksuojami antžėručio paviršiaus ir AJM vaizdai surinkti „virpančiojo zondo” režimu (angl. „tappingmode”). AJM vaizdų rinkimui naudojant Multimode SPM Nanoscope IV sistemą(„Veeco/Digital Instruments”). Kiekvieno EcoRII-DNR komplekso baltymo prisirišimovietos atstumas iki DNR fragmento galų, baltymo tūris, komplekso išeiga buvo nustatytanaudojant FemtoScan Online („Advanced Technologies Center“) kompiuterinę programą.AJM vaizdų duomenų analizė atlikta kaip aprašyta 32 .10

2. Spėjamo Ecl18kI aktyvaus centro ir C:G bazių poros atpažinimodeterminančių patvirtinimas3 paveikslas. Ecl18kI (auksinė) irNgoMIV (žalia) aktyvių centrųstruktūrinis sugretinimas (adaptuotaiš 39 ). Mg 2+ jonai iš NgoMIV-DNRkomplekso struktūros pavaizduoti pilkaspalva.Ecl18kI-DNR komplekso struktūra(nesant Me 2+ ) buvo nustatyta 1.7 Åskiriamąja geba 39 .Ecl18kI ir NgoMIV struktūrinispalyginimas atskleidė, kad Ecl18kIspėjamos aktyvaus centro a.r. iš tiesųstruktūriškai atitinka NgoMIV aktyvauscentro a.r. 39 (3 pav.). NgoMIV-DNR-Mg 2+ struktūroje D140 koordinuoja duMg 2+ jonus. Struktūriniame Ecl18kI irNgoMIV baltymų palyginyje Ecl18kID160 atitinka NgoMIV D140, tadgalima manyti, kad Ecl18kI D160funkcija taip pat yra koordinuoti dumetalo jonus. Ecl18kI E195 Cα atomasatitinka NgoMIV E201 Cα atomą,tačiau abiejų glutamatų šoniniųgrandinių konformacija skiriasi. Galimaspėti, kad Ecl18kI E195 konformacijagalėtų pasikeisti esant Me 2+ jonams.394 paveikslas. Ecl18kI ir NgoMIV taikinio C:G atpažinimas (adaptuota iš ). Ecl18kI(A) ir NgoMIV (B) sąveika su CC:GG dinukleotidu vienoje taikinio pusėje. Nurodyti tiksudaromi tiesioginiai kontaktai su C:G seka. (a) ir (b) žymi a.r. iš skirtingų baltymodimero monomerų. Fermentų atpažinimo sekos nurodytos po paveikslu. Bazių poros,kurių atpažinimas atvaizduotas paveiksle, yra taikinyje pabrauktos.15

Taigi, biocheminiai ir struktūriniai duomenys rodo, kad E125, D160, K182ir E195 a.r. sudaro Ecl18kI aktyvų centrą. Ecl18kI aktyvus centras panašus įNgoMIV aktyvų centrą, kaip ir buvo nuspėta 36 .Ecl18kI ir NgoMIV struktūrinis palyginimas atskleidė, kad NgoMIV irEcl18kI spėjamos taikinio C:G atpažinimo determinantės struktūriškai sutampa 39(4 pav.). Ecl18kI R186, E187 ir R188 sudaro kontaktus su atpažįstamomisbazėmis didžiajame griovyje. Iš mažojo griovio pusės kito subvieneto Q114sudaro specifinius kontaktus su taikinio guaninais.Tad, Ecl18kI R186, E187 ir R188 a.r. sutampa su NgoMIV R191, D193 irR194 a.r., kurios vienareikšmiai atpažįsta NgoMIV taikinio GCCGGC pusėssekos vidinius C:G nukleotidus, kaip ir buvo nuspėta 36 .3. EcoRII spėjamo aktyvaus centro ir taikinio C:G bp atpažinimodeterminančių mutacinė analizėM. Reuter grupė bandė identifikuoti REazės EcoRII aktyvaus centrąieškodama baltymo sekoje kanoninio PD-(D/E)XK motyvo 23,40,41 . Mutacinėanalizė parodė, kad E96 ir E271 a.r. yra svarbios fermento aktyvumui. Tačiauvienareikšmiškai EcoRII aktyvus centro lokalizacija nebuvo įrodyta. Mes iškėlėmealternatyvią hipotezę, kad EcoRII C-gale esančio sekos motyvo271 EX 27 PDX 24 KX 12 E 337 a.r. sudaro fermento katalitinį-metalo surišimo centrą, oK328, D329 ir R330 a.r. atsakingos už taikinio C:G nukleotidų atpažinimą 36 (žr.I. skyrių). Siekiant patikrinti EcoRII spėjamų aktyvaus centro (E271, D299, K324ir E337) ir taikinio C:G atpažįstančių a.r. (K328, D329 ir R330) svarbą fermentųfunkcijai, mes sukonstravome šių a.r. mutantus, juos išgryninome ir ištyrėme jųsavybes (žr. „Tyrimų metodiką“).Fago λ dam – dcm – DNR hidrolizės eksperimentai parodė, kad E271A,D299A, K324A ir E337A mutantai yra absoliučiai neaktyvūs arba jų katalitinisaktyvumas nukritęs >10 5 kartų (5 lentelė). Tai patvirtina šių a.r. svarbą EcoRIIkatalizėje. Be abejo, toks pat mutantinių baltymų fenotipas tikėtinas, jei a.r.svarbios fermento-DNR sąveikai. Norėdami patikrinti, ar baltymo C-galinėjedalyje spėjamo aktyvaus centro a.r. pakeitimas alaninais įtakoja fermentogiminingumą DNR, mes ištyrėme šių mutantinių baltymų sąveiką su DNR.Ankstesni EcoRII dalinės proteolizės eksperimentai atskleidė, kad EcoRIIbaltymas yra sudarytas iš dviejų domenų, pasižyminčių skirtingomisfunkcijomis 24 . N-galinis EcoRII domenas (EcoRII-N) riša CCWGG DNR seką,bet jos nekerpa, tuo tarpu EcoRII C-galinis domenas (EcoRII-C) veikia kaip IIPtipo REazė, kuri atpažįsta ir kerpa CCWGG seką turinčią DNR 24 . Norėdamiišvengti N-galinio domeno įtakos, mes wt EcoRII ir mutantinius baltymusproteolizavome termolizinu, kuris degradavo N-galinį domeną, taip gavome C-galinį domeną (EcoRII-C, E271A-C, D299A-C, K324A-C ir E337A-C) (žr.„Tyrimų metodiką“).Kadangi M. Mucke ir kt. 24 nepavyko pademonstruoti EcoRII-C specifiniosusirišimo su DNR, mes nusprendėme surasti sąlygas, kuriose C-galinis domenasspecifiškai sąveikauja su DNR. Daugelio REazių susirišimui būtini Ca 2+16

jonai 37,42,43 . Ecl18kI DNR susirišimo eksperimentai taip pat parodė, kadgiminingumą DNR didina Ca 2+ jonai (2 pav.).5 paveikslas. Wt EcoRII-C sąveikos su DNR tyrimas sustabdyto elektroforetinio44judrumo poslinkio PAAG metodu (adaptuota iš ). 1 nM 33P izotopu žymėtosspecifinės arba nespecifinės DNR (oligodupleksai SP33 ir NSP33, žr. 1 lentelę) buvosumaišyta su įvairiais EcoRII-C kiekiais (baltymo dimero koncentracijos nM nurodytospo autoradiogramomis) ir baltymo-DNR kompleksai frakcionuoti PAAG ir detektuotikaip aprašyta „Tyrimų metodikoje“. PAAG elektroforezė vykdyta esant (A) 0.1 mMEDTA arba (B) 5 mM Ca-acetato. Paskutiniame kiekvieno gelio takelyje naudotas wtEcoRII vietoj EcoRII-C.5 lentelė. EcoRII mutantinių baltymų savybės*EcoRII Specifinis aktyvumas, %** K d , nM****Wt 100 11±1E271A 0 >2000D299A 0 >2000K324A 0 8±1E337A

Ir iš tiesų, atlikus EcoRII-C DNR susirišimo eksperimentus, paaiškėjo, kadnesant Me 2+ , EcoRII-C neriša nei specifinės, nei nespecifinės DNR (5A pav.). Tuotarpu, pridėjus Ca 2+ jonų į susirišimo ir į elektroforezės buferius, EcoRII-C rišaspecifinį oligodupleksą su K d = 11 ± 1 nM ir neriša nespecifinės DNR (5B pav.).Tolimesni DNR sąveikos tyrimo eksperimentai su EcoRII mutantais buvoatlikti esant Ca 2+ . E337A-C ir K324A-C giminingumas DNR nepasikeitė lyginantsu EcoRII-C, kas patvirtina, kad šios a.r. svarbios baltymo katalizėje. Tuo tarpuD299A-C ir E271A-C mutantų susirišimas yra pablogėjęs lyginant su wtEcoRII-C (5 lentelė). EcoRII D299 yra D134 ir D140 atitikmuo, atitinkamai,Cfr10I ir NgoMIV fermentuose (3 lentelė). Šios liekanos dalyvauja dviejų Me 2+jonų koordinavime šių fermentų aktyviame centre. Kadangi EcoRII-C susirišimuisu DNR būtini Ca 2+ jonai (5 pav.), tai D299 pakeitimas alaninu greičiausiaipablogina Ca 2+ jonų surišimą aktyviame centre. Tai pablogina ir DNR surišimą.Panašiu fenotipu pasižymi ir Ecl18kI D160A mutantas (4 lentelė). E271A mutantogiminingumas DNR taip pat sumažėjęs. Kadangi pagal analogiją su NgoMIVE271 (ir E125 Ecl18kI) E271 galėtų dalyvauti koordinuojant Me A joną, tai galimaspėti, kad būtent Me 2+ kompleksavimas „A“ padėtyje (6 pav.) yra kritinisEcoRII-C (ir Ecl18kI) specifiniam DNR surišimui.Spėjamas C:G bazių poros atpažinime dalyvaujančias C-galinėje EcoRIIdalyje esančias a.r. K328, D329 ir R330 mes taip pat pakeitėme alaninais irištyrėme mutantinių baltymų savybes (žr. „Tyrimų metodiką“). K328 ir R330pakeitimas alaninais lėmė tiek fermento katalitinio aktyvumo (pilno ilgiomutantinių baltymų), tiek giminingumo DNR (C-galinių baltymų) žymųsumažėjimą (5 lentelė). Tai patvirtina spėjimą, kad šios a.r. yra svarbios baltymospecifinei sąveikai su DNR. Tiesa, D329A mutacija labai sumažino fermentoaktyvumą, tačiau specifinis susirišimas su DNR pablogėjo tik ~10 kartų lyginantsu wt EcoRII-C.Taigi, mutacinės analizės duomenys neprieštarauja hipotezei, kad EcoRII( ↓ CCWGG) turi panašų katalitinį/metalo surišimo centrą ir panašų struktūrinįmechanizmą taikinio C:G atpažinimui kaip ir Bse634I/Cfr10I (R ↓ CCGGY) beiNgoMIV (G ↓ CCGGC) 44 .4. EcoRII spėjamo aktyvaus centro ir taikinio C:G atpažinimo determinančiųpatvirtinimasX.E. Zhou ir kiti 45 nustatė EcoRII R88A baltymo tretinę struktūrą 2.1 Åskiriamąja geba. Struktūra patvirtino EcoRII domeninę organizaciją: N-efektorinisdomenas EcoRII-N turi naują struktūrinę sanklodą ir galimą DNR surišimo vietą,C-katalitinio domeno EcoRII-C struktūrinė sankloda būdinga PD-(D/E)XK šeimosREazėms.EcoRII ir NgoMIV baltymų struktūrinis palyginimas rodo, kad EcoRII-Cdomeno E271, D299, K324 ir E337 a.r. atitinka NgoMIV aktyvaus centro E70,D140, K187 ir E201 a.r., o EcoRII-C K328, D329 ir R330 a.r. atitinka NgoMIVR191, D193 ir R194 a.r., dalyvaujančias taikinio C:G atpažinime, kaip buvo18

nuspėta iš sekų palyginio 36 (6 pav.). Pagal aktyvių centrų analogiją galima spėti,kad EcoRII, kaip ir NgoMIV, aktyviame centre kompleksuoja du Me 2+ jonus.6 paveikslas. EcoRII, Bse634I, Cfr10I ir NgoMIV aktyvūs centrai ir C:Gatpažinimo elementai 44 . (A) EcoRII (žydra), Bse634I (geltona), Cfr10I (rausva) irNgoMIV (žalia) baltymų struktūrinis palyginimas identifikuoja EcoRII aktyvaus centro2+a.r. Mg jonai iš NgoMIV-DNR komplekso struktūros pavaizduoti žaliai ir pažymėti34Me A bei Me B kaip . Hidrolizuojamas DNR fosfatas pažymėtas oranžine spalva. (B)NgoMIV (žalia) a.r. dalyvaujančios taikinio C:G atpažinime ir jų struktūriniaiekvivalentai EcoRII (žydra).5. Restrikcijos fermentų šeima, savo atpažinimo sekoje turinti CC:GGtetranukleotidąII tipo restrikcijos fermentai sudaro didelę funkciškai susijusių fermentųšeimą, tačiau šie baltymai pasižymi žema sekų homologija 1 . Sekų panašumai yrabūdingi tik fermentams, atpažįstantiems panašias ar identiškas DNR sekas irpasižymintiems vienoda DNR kirpimo vieta 46 .Šiame darbe mes identifikavome restrikcijos fermentų šeimą, kuri atpažįsta↓ CCNGG/ ↓ CCWGG bei R ↓ CCGGY/G ↓ CCGGC DNR sekas (3 lentelė). Šiųfermentų atpažinimo seka turi bendrą CCGG tetranukleotidą, Ecl18kI ir EcoRIIatveju „pertrauktą“ N arba W, ir jie kerpa DNR prieš pirmąjį C, susidarantskirtingiems kirpimo produktams (4 arba 5 nt 5′ išsikišusiems galams). Remiantissekų panašumais (duomenys nepateikti) į šią grupę galima įtraukti ir kitusrestrikcijos fermentus, turinčius bendrą CCGG tetranukleotidą taikinyje(1 lentelė): ↓ CCGG (HpyF100III, G. Tamulaitienė, R. Sukackaitė ir V. Šikšnys,nepublikuoti duomenys), T ↓ CCGGA (Kpn2I) ir CR ↓ CCGGYG (SgrAI) 38,44 .Įdomu, kad į šią fermentų grupę patenka REazės, priklausančiosskirtingiems II tipo potipiams. Pvz., homodimerinė PspGI priklauso ortodoksiniamII tipo P potipiui 26 . EcoRII priklauso IIE tipo fermentams, kurie yra homodimerai,turintys du skirtingus DNR surišimo centrus; vienas iš jų yra alosterinis, kitas −aktyvus centras 40,47 . IIF tipo Bse634I, Cfr10I ir NgoMIV yra homotetramerai,19

suformuojantys du identiškus aktyvius centrus, kurie koordinuotai vienu metusugeba perkirpti du DNR dvigrandininius taikinius 33-35 .III. Kaip Ecl18kI, EcoRII-C ir PspGI atpažįsta DNR taikinius?Gauti duomenys rodo, kad Ecl18kI ir EcoRII fermentai naudoja panašųstruktūrinį mechanizmą taikinio C:G bazių poros atpažinimui kaip ir Bse634I,Cfr10I bei NgoMIV. Iš principo, Ecl18kI atpažinimo seka CCNGG ir EcoRIIatpažinimo seka CCWGG gali būti laikomos Bse634I/Cfr10I ir NgoMIVatpažinimo sekų RCCGGY/GCCGGC „pertrauktais“ variantais, kuriuose tarpdviejų CC:GG „blokų“ įterptas N arba W. Kyla klausimas, kaip Ecl18kI ir EcoRII,naudodami tokį patį aktyvų centrą ir C:G atpažinimo mechanizmą, „sutalpina“ Narba W nukleotidus, esančius atpažinimo sekos viduryje?BglI (GCCNNNN ↓ NGGC) ir SfiI (GGCCNNNN ↓ NGGCC) restrikcijosfermentų monomerai struktūriškai yra labai panašūs į EcoRV (GAT ↓ ATC)monomerą, tačiau šie restrikcijos fermentai skirtingai dimerizuojasi ir sudaroskirtingus kirpimo produktus 48,49 . Tad būtų galima spėti, kad Ecl18kI ir EcoRIIbaltymų dimerų sąveikos paviršiai yra organizuoti skirtingai nuo Bse634I, Cfr10Iir NgoMIV baltymų; tačiau katalizei ir atpažinimui visuose šiuose baltymuose yranaudojami tokie patys struktūriniai elementai.7 paveikslas. Konservatyvi Ecl18kI irNgoMIV dimerų organizacija 39 . Ecl18kI(auksinė) ir NgoMIV (žalia) dimerųsugretinimas. Didesni rutuliukai žymi a.r.,dalyvaujančių katalizėje, Cα-atomus.Mažesni rutuliukai žymi Cα-atomus a.r.,sudarančių vandenilines jungtis suatpažinimo sekos bazėmis. Kairėje pusėjegeltonai pažymėtos Ecl18kI a.r., dešinėježaliai – atitinkamos NgoMIV a.r..1. Restrikcijos endonukleazė Ecl18kIišsuka atpažinimo taikinio centriniusnukleotidusEcl18kI-DNR ir NgoMIV-DNRdimerų struktūrų erdvinis sugretinimasrodo, kad Ecl18kI ir NgoMIV katalitiniųir C:G atpažinimo a.r. Cα-atomaiabiejuose monomeruose beveik sutampa(7 pav.) 39 . Tad akivaizdu, kad skirtingiEcl18kI ir NgoMIV kirpimo produktai(4 ir 5 nt su 5′ išsikišusiais galais) yra nedėl baltymų dimerizacijos paviršiųskirtumų. Ecl18kI struktūra atskleidė,kad fermentas naudoja visiškai naująDNR atpažinimo mechanizmą, kurisleidžia labai elegantiškai paaiškintiskirtingus Ecl18kI ir NgoMIV fermentųspecifiškumus ir DNR kirpimoproduktus. DNR oligodupleksasEcl18kI-DNR komplekse yra stipriaideformuotas. Atpažinimo sekoscentrinės bazių poros nukleotidai yra pilnai išsukti iš dvigrandininės DNR spiralės(8A pav.) 39 . Abi išsuktos bazės yra patalpinamos Ecl18kI „kišenėje”, kurią sudaro20

altymo R57 šoninės grandinės atomai iš vienos pusės ir W61 indolo žiedas iškitos pusės (8B pav.).508 paveikslas. Išsukti nukleotidai Ecl18kI–DNR komplekse . (A) Ecl18kI dimero–DNR kompleksas. Baltymas pavaizduotas pilkai, DNR raudonai. 60–69 ir 91–136 a.r.neparodytos dėl aiškumo. (B) Išsuktos DNR bazės surišimo „kišenė”. Pavaizduota tikvieno baltymo monomero „kišenė” ir išsukta adenino bazė.Dėl bazės išsukimo, bei papildomo DNR lenkimo (angl. „kinkdeformation”) Ecl18kI atpažinimo sekos CCGG dalis tampa struktūriškai tapatianalogiškai sekai NgoMIV taikinyje GCCGGC. Dėl DNR deformacijų Ecl18kIkerpami fosfatai suartėja iki 17.2 Å, kuris praktiškai sutampa su atstumu tarpkerpamų fosfatų NgoMIV-DNR komplekse (9 pav.).9 paveikslas. DNR konformacijų palyginimas Ecl18kI-DNR ir NgoMIV-DNR39struktūrose . DNR iš Ecl18kI-DNR komplekso (A, C) ir NgoMIV-DNR komplekso(B, D). Vaizdai (C) ir (D) pasukti 90° laipsnių (A) ir (B) atžvilgiu pagal vertikalią ašį.Centrinė nukleotidų pora išsukta iš dvigrandininės DNR spiralės (A, C). Atstumas tarpkerpamų fosfatų (pažymėti žaliai) lygus 17.2 Å tiek Ecl18kI–DNR, tiek ir NgoMIV–DNR kompleksuose.Taigi, išsukdamas centrinę nukleotidų porą, Ecl18kI 5 bp atpažinimo seką„paverčia“ 4 bp seka ir todėl gali atpažinti CC:GG nukleotidus, panaudodamastuos pačius atpažinimo elementus kaip NgoMIV, bet generuoja skirtingo ilgio21

produkto DNR galus. Ecl18kI yra pirmoji REazė, savo specifiškumoužtikrinimui išsukanti nukleotidus iš atpažinimo sekos 39 .Kadangi Ecl18kI, EcoRII-C irPspGI restrikcijos fermentai pasižymitam tikru sekų panašumu, galima spėti,kad ir EcoRII-C ir PspGI gali išsukticentrinę bazių porą iš atpažinimo sekosCCWGG.Atlikta mutacinė ir struktūrinėanalizė rodo, kad Ecl18kI, EcoRII-C,bei PspGI turi analogiškas C:Gatpažinimo determinantes 26,36,39,44,45 . Beto, Ecl18kI R57 ir W61, kurie sudaroišsukamos bazės surišimo „kišenę”, turistruktūrinius atitikmenis ir EcoRII-C10 paveikslas. Išsukamos bazėssurišimo „kišenės” Ecl18kI, EcoRII-Cir PspGI fermentuose struktūrinissugretinimas. Ecl18kI (auksinė),EcoRII-C (žydra) ir PspGI (oranžinė)monomerų sugretinimas generuotaspanaudojant Ecl18kI-DNR kompleksostruktūrą (PDB ID 2FQZ 39 ), EcoRII apoformą(PDB ID 1NA6 45 ) ir PspGIstruktūrinį modelį 51 .domene − R222 ir Y226 (10 pav.).PspGI tretinė struktūra kol kas nėražinoma, tačiau J.M. Bujnicki ir kt. atliktimodeliavimo eksperimentai siūlo, kadPspGI yra struktūriškai panašus įEcl18kI 51 . Pagal PspGI modelį, Ecl18kIR57 ir W61 ekvivalentai PspGI baltymeyra R161 ir F64. Genetiniaieksperimentai netiesiogiai patvirtina,kad PspGI gali naudoti centrinės baziųporos išsukimo mechanizmą, tiesa, išCCSGG, o ne iš CCWGG sekos 51 . Reikia pažymėti, kad skirtingai nuo Ecl18kI,kuris nerodo jokio specifiškumo centrinei bazių porai, EcoRII-C ir PspGIkatalizėje diskriminuoja A:T nuo G:C.2. Ecl18kI, EcoRII-C ir PspGI taikinio centrinių nukleotidų išsukimo tirpaletyrimasEcl18kI-DNR komplekso kristalo struktūra parodė, kad fermentas naudojaatpažinimo sekos centrinių nukleotidų išsukimo mechanizmą taikiniui atpažinti.Norėdami pademonstruoti, kad Ecl18kI naudoja nukleotidų išsukimo mechanizmąir tirpale, mes pasitelkėme adenino bazės analogo 2-aminopurino (2-AP)fluorescencijos tyrimo metodą. Neutraliame pH 2-AP sudaro Watson-Crick baziųporą su T, kuri savo stiprumu mažai skiriasi nuo A:T bazių poros 52 . 2-APfluorescencija yra stipriai gesinama polinukleotiduose dėl bazių tarpusaviostekingo (angl. „stacking“) sąveikos 53 ir todėl fluorescencija išauga, kai bazė yraišsukama iš dvigrandininės DNR spiralės 54,55 . Mes taip pat atlikome 2-APfluorescencijos tyrimus ir su EcoRII-C ir PspGI fermentais, norėdami atsakyti įklausimą, ar šie restrikcijos fermentai taip pat naudoja nukleotidų išsukimomechanizmą sąveikaudami su savo atpažinimo seka.22

2.1. Substratai 2-aminopurino fluorescencijos analizei2-AP fluorescencijos eksperimentams buvo sukonstruoti 25 bp DNRsubstratai, turintys 2-AP įvairiose taikinio padėtyse (2 lentelė). Oligoduplekse T/2taikinio centrinės padėties adeninas pakeistas 2-AP, o oligoduplekse 2FS, 2-APįvestas šalia atpažinimo sekos. Siekiant parodyti, kad 2-AP modifikacija neįtakojaEcl18kI, EcoRII-C ir PspGI giminingumo DNR, buvo atlikti sąveikos su DNRtyrimo eksperimentai su šiais substratais (žr. „Tyrimų metodiką”). Buvo parodyta,kad Ca 2+ pagerina Ecl18kI susirišimą su DNR, o EcoRII-C (5 pav.) ir PspGI 26fermentų specifinei sąveikai su DNR jie būtini, tad DNR surišimo eksperimentaibuvo atlikti esant ir nesant Ca 2+ . Rezultatai yra pateikiami 6 lentelėje. Rezultataiiliustruoja, kad 2-AP įvedimas substratuose nedaro įtakos fermentų giminingumuiDNR. Kontroliniai oligodupleksų T/A, T/2 ir 2FS hidrolizės eksperimentai parodė,kad tiek oligodupleksai, turintys 2-AP, tiek neturintys 2-AP Ecl18kI, EcoRII-C irPspGI yra hidrolizuojami panašiu greičiu (7 lentelė ir duomenys nepateikti).6 lentelė. Ecl18kI, EcoRII-C, PspGI ir MvaI baltymų kompleksų su 2-AP DNRsubstratais disociacijos konstantos*FermentasK d , nM*nesant Ca 2+ esant Ca 2+Ecl18kI wt 170±70 0.11±0.03Ecl18kI W61Y 190±100 0.64±0.07Ecl18kI W61A 170±40 1.2±0.4EcoRII-C >1000 0.4±0.1PspGI >500 0.5±0.1MvaI 0.08±0.03 0.08±0.03* DNR surišimo konstanta K d yra ta pati baltymo-DNR kompleksuose su visais oligodupleksaisT/A, T/2 ir 2FS. Visi baltymai nespecifinį oligodupleksą NSP (2 lentelė) riša aukštesnėse50koncentracijose, nei specifinę DNR. Lentelė paimta iš .Taigi, adenino pakeitimas 2-aminopurinu neįtakoja Ecl18kI, EcoRII-C irPspGI giminingumo DNR ir todėl 2-AP modifikacija gali būti naudojama šiųbaltymų fluorescencijos eksperimentuose.2.2. Ecl18kI-DNR komplekso fluorescencijos analizė esant Ca 2+2-AP turintį oligodupleksą titravome Ecl18kI baltymu. Eksperimentas buvoatliktas buferyje esant Ca 2+ jonams ir registruojant fluorescencijos intensyvumąesant λ em = 367 nm (žr. „Tyrimų metodiką“). Reakcijos mišinyje esant tik DNR,fluorescencijos signalas yra nežymus, nes 2-AP yra dvigrandininėje B-DNR ir jofluorescencija yra gesinama dėl bazių tarpusavio sąveikos (11B pav.). Reakcijosmišinyje su T/2 oligodupleksu didinant Ecl18kI koncentraciją 2-AP fluorescencijadidėja ir pasiekus ekvimoliarinį tašką fluorescencijos intensyvumas nebekinta(11A pav.). Įsisotinimo taške Ecl18kI-DNR 2-AP fluorescencijos intensyvumasišaugo 6.5 karto lyginant su laisvo oligoduplekso fluorescencija (11C pav.). Tuotarpu Ecl18kI-2FS komplekse 2-AP fluorescencija mažai skiriasi nuo 2FS23

oligoduplekso fluorescencijos (11B,C pav.). Fluorescencijos išaugimą Ecl18kI-T/2komplekse lyginant su laisvo T/2 fluorescencija galima būtų paaiškinti 2-APaplinkos pasikeitimu, atsiradusiu dėl 2-AP išsukimo iš dvigrandininės DNRspiralės, kaip anksčiau buvo parodyta kitiems fermentams 54-62 .11 paveikslas. 2-AP fluorescencijos intensyvumo pokyčiai Ecl18kI-DNR50kompleksuose . 250 nM T/2 oligodupleksas titruotas wt Ecl18kI, reakcijos buferyje2+esant (A) arba nesant (D) Ca . Pateikiami koreguoti 2-AP, esančio komplekse su wt2+Ecl18kI, emisijos spektrai reakcijos mišinyje esant (B) arba nesant (E) Ca jonams.Diagramos (C) ir (F) iliustruoja fluorescencijos intensyvumo vertes 2-AP emisijoskoreguotų spektrų maksimumo taške. (B), (E) bei (C), (F) atvejais buvo naudota1250 nM wt Ecl18kI ir 250 nM T/2 arba 2FS oligoduplekso (žr. 2 lentelę ir „Tyrimųmetodiką“).2.3. Ecl18kI-DNR komplekso fluorescencijos analizė nesant Ca 2+Ecl18kI sąveikos su DNR eksperimentai parodė, kad Ecl18kI giminingumasDNR sumažėja tirpale nesant Ca 2+ jonų (6 lentelė). Atlikus 2-AP turinčiooligoduplekso titravimo Ecl18kI baltymu eksperimentus paaiškėjo, kad esantdidesnėms baltymo ir DNR koncentracijoms Ecl18kI sudaro binarinį Ecl18kIspecifinėsDNR kompleksą (K d = 52 ± 12 nM) (11D pav.). Reakcijos tirpalenesant Ca 2+ ir esant sotinančioms baltymo koncentracijoms Ecl18kI-T/2komplekse, 2-AP fluorescencija išauga 28 kartus lyginant su laisvo oligodupleksoT/2 fluorescencija (11E, F pav.). Tuo tarpu Ecl18kI-2FS 2-AP fluorescencijamažai pasikeičia lyginant su laisvo oligoduplekso 2FS fluorescencija. Taigi, 2-APsignalo išaugimas buferyje be Ca 2+ jonų yra ~4 kartus stipresnis nei buferyje suCa 2+ jonais.24

Taigi šie rezultatai leidžia teigti, kad Ecl18kI-DNR-Ca 2+ trinario kompleksostruktūra skiriasi nuo dvinario komplekso Ecl18kI-DNR struktūros. Galimamanyti, kad tirpale esant Ca 2+ jonams fermento išsuktos bazės patenka tiesiai įbaltymo surišimo „kišenę“ ir tuo pačiu yra gesinamos baltymo aplinkinių a.r., otuo tarpu tirpale nesant Ca 2+ išsuktos bazės išlaiko didesnį mobilumą ir pasižymididesniu fluorescencijos intensyvumu dėl mažesnio 2-AP fluorescencijosgesinimo.2.4. Ecl18kI išsukamos bazės surišimo „kišenės“ mutantų-DNR kompleksofluorescencinė analizė2-AP, patekusio į baltymo surišimo „kišenę“, fluorescencija dažnai yragesinama hidrofobinėje aplinkoje 61-64 . Ecl18kI-DNR komplekse išsukti nukleotidaipatenka į baltymo „kišenę“, kurioje yra W61. Norėdami patikrinti, ar W61 gesina2-AP fluorescenciją, mes kryptingos mutagenezės būdu pakeitėme šią a.r. tirozinuir alaninu.Ecl18kI W61Y mutantinis fermentas išlaikė 0.07-0.2% specifinio aktyvumolyginant su wt, tuo tarpu W61 pakeitimas į alaninu pilnai inaktyvavo Ecl18kI. Abumutantiniai baltymai specifiškai sąveikauja su DNR 6-10 kartų sumažėjusiugiminingumu (6 ir 7 lentelės).Atlikus fluorescencijos tyrimoeksperimentus paaiškėjo, kadreakcijos tirpale esant Ca 2+ irsotinančiomsbaltymokoncentracijoms Ecl18kI mutanto-T/2komplekse 2-AP fluorescencija išauga~75 kartus W61Y atveju ir~125 kartus W61A atveju (lyginant sulaisvo oligoduplekso T/2fluorescencija) (12 pav.). Tad galimamanyti, kad abu mutantiniai baltymai12 paveikslas. 2-AP fluorescencijossugeba išsukti centrinį(ius)intensyvumo pokyčiai Ecl18kI wt ir W6150 nukleotidą(us) iš atpažinimo sekos.mutantų kompleksuose su DNR .Diagrama iliustruoja fluorescencijosintensyvumo vertes 2-AP emisijoskoreguotų spektrų maksimumo taške(367 nm wt, 365 nm W61Y ir W61AEcl18kI, 370 nm oligodupleksams).Eksperimente buvo naudota 1250 nMbaltymo ir 250 nM T/2 arba 2FSoligoduplekso, bei 10 mM Ca-acetato (žr.„Tyrimų metodiką“).2-AP fluorescencija trinariuosekompleksuose W61Y-DNR-Ca 2+12 kartų, o W61A-DNR-Ca 2+ net~20 kartų didesnė negu wtEc18kI-DNR-Ca 2+ komplekse(8 lentelė). Taigi, W61Y ir W61Amutantų fluorescencijos rezultataineprieštarauja prielaidai, kad wtEcl18kI trinariame komplekse 2-APfluorescencija yra gesinama dėl sąveikos su W61. Aišku, taip pat negalima atmestigalimybės, kad triptofaną pakeitus mažesne a.r., 2-AP gali užimti įvairiasskirtingas konformacijas ir tai įtakoja jo fluorescencijos intensyvumą. Iš principo,25

2-AP fluorescencijos intensyvumo pokyčiai Ecl18kI-DNR komplekse nebūtinairodo nukleotido išsukimą iš dvigrandininės DNR, o gali būti susiję su baltymoindukuota drastiška DNR deformacija. Tačiau, kadangi 2-AP fluorescencijosišaugimas W61 mutanto-DNR-Ca 2+ komplekse yra daug kartų didesnis negu wt-DNR-Ca 2+ komplekse (lyginant su laisvo oligoduplekso T/2 fluorescencija),galima manyti, kad būtent dėl išsukimo iš DNR fluoroforas patenka į indoložiedo kaimynystę baltymo kišenėje ir jo fluorescencija yra efektyviai gesinama.7 lentelė. Ecl18kI mutantinių fermentų W61Y ir W61A DNR hidrolizės greičiųkonstantosFermentask 1 , s -1 *oligodupleksas T/A oligodupleksas T/2 oligodupleksas 2FSEcl18kI wt 0.22±0.05 0.33±0.04 0.29±0.05Ecl18kI W61Y 4.5±0.03×10 -4 2.7±0.1×10 -4 2.0±0.4×10 -4Ecl18kI W61A 0 0 0* Dėl aiškumo pateikiama tik vienos iš DNR grandinių hidrolizės greičio konstantos. Tiek wt,tiek mutantiniai fermentai abi DNR grandines hidrolizavo tuo pačiu greičiu.13 paveikslas. 2-AP fluorescencijosintensyvumo pokyčiai EcoRII-C ir PspGI50kompleksuose su DNR . Diagramailiustruoja fluorescencijos intensyvumo vertes2-AP emisijos koreguotų spektrų maksimumotaške (360 nm EcoRII-C ir PspGI, 370 nmMvaI ir oligodupleksams). Eksperimente buvonaudota 1250 nM baltymo ir 250 nM T/2 arba2FS oligoduplekso, bei 10 mM Ca-acetato (žr.„Tyrimų metodiką“).Fermento katalitinioaktyvumo praradimas irgiminingumo DNR sumažėjimas 10kartų pakeitus W61 alaninu liudijaapie išsuktos bazės ir W61 indoložiedo sąveikos svarbą fermentofunkcijai.2.5. EcoRII-C ir PspGIfluorescencinė analizėNorėdami atsakyti į klausimą,ar ir EcoRII-C bei PspGIrestrikcijos fermentai naudojanukleotidų išsukimo mechanizmą,sąveikaudami su atpažinimo sekaCCWGG, mes išanalizavome 2-APfluorescencijos intensyvumopokyčius, susidarant šių fermentųkompleksams su DNR. EcoRII-Cbaltymas buvo gautas dalinėsproteolizės metodu ir išgrynintaschromatografiniais metodais (žr. „Tyrimų metodiką“).2-AP fluorescencijos eksperimentai parodė, kad EcoRII-C-T/2 kompleksefluorescencijos intensyvumas išauga ~12 kartų, o PspGI-T/2 komplekse 64 kartuslyginant su laisvo oligoduplekso T/2 fluorescencija (13 pav. ir 8 lentelė). Taigi,26

2-AP fluorescencijos analizė rodo, kad EcoRII-C ir PspGI fermentai naudojanukleotido(ų) išsukimo mechanizmą, kaip ir Ecl18kI.Ecl18kI, EcoRII-C ir PspGI kompleksuose su DNR 2-AP fluorescencijosintensyvumas lyginant su laisvos DNR signalu yra skirtingas (8 lentelė). Šieskirtumai gali būti dėl skirtingos išsuktos bazės apsupties Ecl18kI, EcoRII-C irPspGI kišenėse (10 pav.).8 lentelė. 2-AP fluorescencijos intensyvumo pokyčiai Ecl18kI, EcoRII-C ir PspGIkompleksuose su DNR*Fermentas F(fermentas-T/2)/F(T/2) F(fermentas-2FS)/F(2FS)Ecl18kI wt 6.5 (28.1**) 2.9 (1.1**)Ecl18kI W61Y 76.2 2.5Ecl18kI W61A 123.6 2.2EcoRII-C 11.8 1.2PspGI 62.9 1.6MvaI 0.9 0.8* F – fluorescencijos intensyvumas. Visi eksperimentai (išskyrus wt Ecl18kI) buvo atliktireakcijos buferyje esant Ca 2+ . F(fermentas-T/2)/F(T/2) ir F(fermentas-2FS)/F(2FS) –fluorescencijos intensyvumų santykiai: fermento-DNR komplekso fluorescencijos intensyvumosantykis su laisvos DNR fluorescencijos intensyvumu, atitinkamai naudojant T/2 ir 2FSoligodupleksus. Fluorescencijos intensyvumo vertė F atitinka 2-AP emisijos koreguotų spektrųvertes maksimumo taške (žr. „Tyrimų metodiką“). ** wt Ecl18kI fluorescencijos intensyvumųsantykių vertės nurodytos skliausteliuose atitinka vertes apskaičiuotas iš eksperimentų reakcijosmišinyje naudojant Ca 2+ .Kontroliniame eksperimente mes atlikome MvaI REazės ir DNR komplekso2-AP fluorescencijos intensyvumo matavimus. MvaI atpažįsta ir hidrolizuoja DNRseką CC ↓ WGG, kaip ir EcoRII-C bei PspGI 65 . MvaI-DNR komplekse DNR mažaiskiriasi nuo kanoninės B-formos 27 . Atlikti DNR surišimo eksperimentai parodė,kad MvaI riša 2-AP turintį oligodupleksą T/2 (6 lentelė), tačiau nekeičia jofluorescencijos intensyvumo (13 pav.).3. Nukleotido išsukimo fenomenasAtlikti 2-AP fluorescencijos eksperimentai rodo, kad restrikcijos fermentaiEcl18kI, EcoRII-C ir PspGI naudoja nukleotidų išsukimo mechanizmą tirpale 50 .Šie eksperimentai papildo PspGI genetinius eksperimentus, kurie leidžia teigti,kad PspGI sugeba išsukti centrinę bazių porą iš CCSGG DNR sekos 51 . NeseniaiD. Daujotytė ir kt. 66 panaudodami cheminį žymėjimą chloracetaldehidu patvirtino,kad REazės Ecl18kI ir PspGI išsuka centrinį C iš sekos CCSGG.Bazės ar nukleotido išsukimo mechanizmas buvo parodytas daugeliuifermentų: metiltransferazėms 67,68 , glikozilazėms 69-72 , glikoziltransferazėms 73,74 ,įvairiems DNR reparacijos fermentams 75-80,81-83 . Visi šie fermentai naudoja baziųišsukimą, kad palengvintų prieigą prie DNR heterociklinių bazių, kurias jievienaip ar kitaip modifikuoja. Mes parodėme, kad Ecl18kI, EcoRII-C ir PspGIREazės bazės išsukimo mechanizmą naudoja savo specifiškumui užtikrinti. Šiomechanizmo suradimas REazėse demonstruoja, kad nukleotido išsukimo27

mechanizmą specifiškumo užtikrinimui gali naudoti ir kiti fermentai ar DNRsurišantys baltymai.IV. Detalaus EcoRII sąveikos su DNR mechanizmo tyrimasEcoRII yra IIE tipo endonukleazė, kuri yra katalitiškai aktyvi tik vienu metusurišusi dvi CCWGG sekas, tačiau reakcijos metu tik viena DNR taikinio kopijayra perkerpama, tuo tarpu antrasis taikinys tarnauja kaip alosterinis aktyvatoriuspirmojo taikinio hidrolizei 40,47,84,85 . EcoRII biocheminiai tyrimai prasidėjo daugiaunei prieš 30 metų. Jų metu buvo pasiūlytas keletas fermento veikimo mechanizmų,tačiau, mūsų nuomone, nei vienas iš jų iki galo nepaaiškina EcoRII alosterinėsaktyvacijos principo. Šiame darbe mes nusprendėme išanalizuoti prieštaringąEcoRII sąveikos su DNR mechanizmą, panaudodami biocheminius ir kinetiniusmetodus.1. EcoRII-DNR komplekso stechiometrija: galimas DNR surišimo vietųskaičiusNorėdami išsiaiškinti EcoRII-DNR komplekso stechiometriją, mes atlikomeDNR susirišimo eksperimentus su EcoRII-N ir EcoRII-C domenais. Norėdamiatmesti galimą dvigubą baltymo sąveiką su DNR N-galinėje ir C-galinėje dalyje,eksperimentus atlikome su išgrynintais EcoRII-N ir EcoRII-C baltymais (žr.„Tyrimų metodiką“).1.1. EcoRII-N sąveikos su DNR tyrimas sustabdyto elektroforetinio judrumoposlinkio PAAG metoduEcoRII-N susirišimo su DNR buvo tirtas panaudojant sustabdytoelektroforetinio judrumo PAAG metodą (žr. „Tyrimų metodiką“). Anksčiauatliktuose analogiškuose eksperimentuose su 191 bp ilgio DNR fragmentu buvogauti du skirtingo judrumo specifiniai EcoRII-N-DNR kompleksai 24 . Autoriaiaiškino, kad tai galėtų būti susiję arba su preparato heterogeniškumu arbaEcoRII-N sugebėjimu dimerizuotis esant reakcijos mišinyje specifinės DNR.EcoRII-N sąveiką su DNR mes tyrėme panaudodami 33 bp specifinįoligodupleksą (2 lentelė) ir tą patį baltymo preparatą, kurį savo eksperimentuosenaudojo M. Mucke ir kt. 24 . Atlikus EcoRII-N DNR susirišimo eksperimentus,paaiškėjo, kad nesant Me 2+ , tirtame baltymo koncentracijų intervale EcoRII-Nneriša nespecifinės DNR, o specifinę riša su K d = 1.6 ± 0.3 nM (14 pav.).Įdomu, kad EcoRII-N specifiškai riša DNR nesant Me 2+ , kurie yra būtiniEcoRII-C domeno specifiniam DNR surišimui. Tuo tarpu dvivalenčio metalopridėjimas smarkiai pablogina EcoRII-N specifinę sąveiką su DNR (duomenysnepateikti). Beje, mūsų eksperimente gauta K d vertė yra ~20 kartų mažesnė, neieksperimente naudojant 191 bp specifinį DNR fragmentą 24 . Gelyje matoma silpnagreičiau judanti juostelė (14 pav.) galėtų būti trumpesnio EcoRII-N varianto,išsigryninusio kartu su pilno ilgio EcoRI-N baltymu ir specifinės DNRkompleksas. Iš tiesų, išanalizavus išgryninto EcoRII-N preparatą NDS-PAAG28

matyti, kad baltymo preparatas turi du skirtingus nedaug besiskiriančius M mbaltymus (duomenys nepateikti), kurie abu reaguoja su anti-EcoRII antikūnais 24 .Yra žinoma, kad EcoRII-N domenas yra jautrus proteolitinei degradacijai invitro 24 . Tad tikėtina, kad trumpesnis EcoRII-N baltymas egzistuoja E. coliląstelėse dėl galimos baltymo degradacijos C-galinėje dalyje, kuris išgryninamaskartu su pilno ilgio EcoRII-N panaudojant Ni 2+ -chelatinę kolonėlę.14 paveikslas. EcoRII-N sąveikos su DNR tyrimas sustabdyto elektroforetiniojudrumo poslinkio PAAG metodu 36,44 . 1 nM 33P izotopu žymėtos specifinės arbanespecifinės DNR (oligodupleksai SP33 ir NSP33, žr. 2 lentelę) buvo sumaišyti suįvairiais EcoRII-N kiekiais (baltymo monomero koncentracijos nM nurodytos poautoradiogramomis) ir baltymo-DNR kompleksai frakcionuoti PAAG (esant 0.1 mMEDTA) ir detektuoti kaip aprašyta „Tyrimų metodikoje“.EcoRII kristalinėje struktūroje du N-galiniai domenai sudaro dimerą 45(17 pav.). Analitinio ultracentrifugavimo duomenys rodo, kad izoliuotas EcoRII-Nbaltymas tirpale egzistuoja kaip monomeras ir dimerizuojasi tik aukštosekoncentracijose (baltymo dimerizacijos K d ~1.85 ± 0.19 µM) 24 . Kita vertus,EcoRII-N specifiškai riša specifinę DNR jau esant nanomoliarinėms baltymokoncentracijoms (14 pav.), kurios daug mažesnės nei dimerizacijos K d . Tad galimamanyti, kad EcoRII-N su DNR sąveikauja kaip monomeras. Jeigu EcoRII-Ndimerizuojasi susirišdamas DNR, tada stebimame PAAG baltymo-DNRspecifiniame komplekse dvi baltymo monomero molekulės galėtų būti surišusiosvieną arba dvi DNR molekules.1.2. EcoRII-N susirišimo su DNR tyrimas panaudojant gelfiltracijąNorėdami nustatyti EcoRII-N-DNR komplekso stechiometriją mespanaudojome gelfiltraciją (žr. „Tyrimų metodiką“). Tiriamo pavyzdžio molekulinėmasė M m buvo suskaičiuota pagal kalibracinę kreivę, kuri buvo sudarytaišanalizavus gelfiltracinėje kolonėlėje žinomų M m baltymų standartus.EcoRII-N nesant DNR iš gelfiltracinės kolonėlės eliuavosi kaip 23 kDa M mbaltymas (15 pav., mėlynos spalvos kreivė), kurio molekulinė masė M m artimateorinei EcoRII-N monomero masei (22.9 kDa). Ant gelfiltracinės kolonėlėsužnešus 16 bp specifinį oligodupleksą (2 lentelė), jo eliucijos tūris atitiko 27 kDaM r (15 pav., žalios spalvos kreivė). Nustatyta oligoduplekso M m 2.5 kartus viršijateorinę 10.7 kDa vertę. Tai galėtų būti susiję su DNR oligoduplekso cilindrine29

forma, kuri gelfiltracinėje kolonėlėje migruoja kaip atitinkamai didesnėsmolekulinės masės rutulio formos baltymas standartas. Sumaišius EcoRII-N su16 bp specifiniu oligodupleksu moliariniu santykiu 2:1 (monomeras:DNR)(15 pav., violetinės spalvos kreivė), pavyzdys iš kolonėlės eliuavosi dviemsmailėmis: ~38 kDa M m (teorinė EcoRII-N monomero-DNR komplekso M m yra33.6 kDa) ir ~22 kDa, kas atitiktų laisvo baltymo M m . Tad užnešus antgelfiltracinės kolonėlės 2-kartinį EcoRII-N monomero perteklių lyginant su DNR,galima manyti, kad iš kolonėlės eliuojasi laisvo baltymo (~22 kDa) ir monomero-DNR komplekso (~38 kDa) frakcijos. Kitame gelfiltracijos eksperimente buvopadidintas DNR kiekis išlaikant tą patį baltymo kiekį: sumaišant EcoRII-N su16 bp specifiniu oligodupleksu moliariniu santykiu 1:2 (monomeras:DNR).Pavyzdys iš kolonėlės taip pat eliuavosi dviem smailėmis: viena, atitinkanti~38 kDa (EcoRII-N monomero-DNR kompleksas), ir kita, atitinkanti laisvos DNRsmailę (~27 kDa) (15 pav., oranžinės spalvos kreivė).15 paveikslas. EcoRII-N gelfiltracija naudojant Super SW2000 kolonėlę 44 . (A) wtEcoRII, EcoRII-N ir EcoRII-N-DNR molekulinės masės. Eksperimentinės wtEcoRII (●), EcoRII-N (∇), specifinio 16 bp DNR oligoduplekso (□) ir EcoRII-N–DNR komplekso (∆) M m buvo suskaičiuotos interpoliuojant nuo standartųkalibracinės tiesės, gautos atlikus gelfiltraciją naudojant žinomos M m baltymųstandartus (●). (B) EcoRII-N–DNR gelfiltracijos eliucijos profiliai. Gelfiltracijaatlikta kaip aprašyta „Tyrimų metodikoje“.Taigi, EcoRII-N tirpale egzistuoja monomerinėje formoje ir DNR rišasantykiu 1:1 44 .1.3. EcoRII-C susirišimo su DNR tyrimas gelfiltracijos metoduWt EcoRII iš kolonėlės eliuavosi kaip 73 kDa baltymas (teorinė dimero M m~90.5 kDa). Anksčiau publikuoti rezultatai teigia, kad EcoRII tirpale egzistuojadimerinėje formoje 21,86 .Kadangi EcoRII-C tretinė struktūra 45 turi REazėms būdingą struktūrinęsanklodą, galima manyti, kad C-galinis domenas tirpale egzistuoja ir DNR rišakaip dimeras, kaip ir daugelis II tipo restrikcijos fermentų. Norėdami tuo įsitikinti,30

mes atlikome EcoRII-C-DNR komplekso gelfiltracijos eksperimentą. Gelfiltracijainaudojome chromatografiniais metodais išgrynintą EcoRII-C preparatą (žr.„Tyrimų metodiką“).Tiriamo pavyzdžio M m buvo suskaičiuota pagal kalibracinę kreivę, kuribuvo gauta išanalizavus gelfiltracinėje kolonėlėje žinomų M m baltymų standartus.EcoRII-C nesant DNR iš gelfiltracinės kolonėlės eliuavosi kaip 68 kDa baltymas(16 pav., mėlynos spalvos kreivė). Ši M m artima teorinio EcoRII-C dimero 52 kDaM m . 12 bp specifinio oligoduplekso (2 lentelė) eliucijos tūris atitiko 18 kDa(16 pav., žalios spalvos kreivė). Skirtumą tarp eksperimentinės ir teorinės (8 kDa)M m galima būtų paaiškinti DNR oligoduplekso cilindrine forma (žr. aukščiau).Gelfiltracijos eksperimente sumaišius EcoRII-C su 12 bp specifiniu oligodupleksumoliariniu santykiu 0.3:1 (dimeras:DNR) (16 pav., violetinės spalvos kreivė),pavyzdys iš kolonėlės eliuavosi dviem smailėmis: ~59 kDa (teorinė EcoRII-Ndimero-DNR komplekso M m yra 60 kDa) ir ~18 kDa, kas atitiktų laisvooligoduplekso M m . Naudojant kitus įvairius EcoRII-C (dimero):DNR santykius,papildomų smailių, atitinkančių kitokias M m , gelfiltracijos eksperimento metunebuvo gauta (duomenys nepateikti). Iš gelfiltracinės kolonėlės laisvas EcoRII-Cišsiplovė kaip didesnės molekulinės masės baltymas objektas nei EcoRII-C-DNRkompleksas, ką galima paaiškinti, kad tirpale esant DNR, EcoRII-C formuojadaugiau kompaktišką globulę.16 paveikslas. EcoRII-C gelfiltracija naudojant Superdex 200 HR 10/30 kolonėlę.(A) EcoRII-C ir EcoRII-C-DNR molekulinės masės. Eksperimentinės EcoRII-C (∇),specifinio 12 bp DNR oligoduplekso (□) ir EcoRII-C–DNR komplekso (∆) M m buvosuskaičiuotos interpoliuojant nuo standartų kalibracinės tiesės, gautos atlikus gelfiltracijąnaudojant žinomos M m baltymų standartus (●). (B) EcoRII-C–DNR gelfiltracijoseliucijos profiliai. Gelfiltracija atlikta kaip aprašyta „Tyrimų metodikoje“.Taigi, EcoRII-C tirpale egzistuoja kaip dimeras ir dimeras riša vieną DNRkopiją.DNR susirišimo ir gelfiltracijos eksperimentai parodė, kad EcoRII C-galiniųdomenų dimeras ir EcoRII-N monomeras gali surišti po vieną DNR molekulę.Tad, pilno ilgio EcoRII turi potencialias tris DNR surišimo vietas: vieną C-galinių domenų dimere ir dvi kiekviename iš N-galinių domenų 44 .31

2. EcoRII kinetiniai tyrimai siekiant patvirtinti trijų DNR surišimo modelįStruktūriniai ir biocheminiai tyrimai parodė, kad EcoRII baltymas pasižymidomenine organizacija (17A pav.) 24,44,45 . Gelfiltracijos ir DNR susirišimoeksperimentai rodo, kad kiekvienas N-galinis domenas suriša po vieną DNRkopiją, o C-galinių domenų dimeras - dar vieną DNR kopiją. Todėl teoriškai wtEcoRII viso turi tris potencialias DNR surišimo vietas (17B pav., kairė). Šismodelis iš principo prieštarauja šiuo metu pripažintam dviejų taikinių surišimomodeliui (17B pav., dešinė) 40,47,87 , kuris būdingas kitam IIE tipo restrikcijosfermentui NaeI 88 .17 paveikslas. Galimi EcoRII sąveikos su DNR mechanizmai 36 . (A) EcoRII apostruktūra(PDB ID 1NA6 ). N-galiniai domenai pažymėti raudona spalva, C-galiniai45domenai – mėlyna. (A) EcoRII domeninė organizacija pavaizduota schematiškai: N-galiniai alosteriniai DNR surišantys domenai pavaizduoti raudonais ovalais; C-galiniaikatalitiniai domenai pavaizduoti mėlynomis inksto formos figūromis; DNR pavaizduotapilkais stačiakampiais. Dviejų taikinių surišimo modelis siūlo, kad du N-galinių domenųdimeras suriša vieną DNR kopiją, o C-galinių domenų dimeras – dar vieną. Trijų taikiniųsurišimo modelis siūlo, kad kiekvienas N-galinis domenas monomeras suriša po vienąDNR kopiją, o C-galinių domenų dimeras – trečią kopiją.Norėdami patikrinti, kurį iš galimų DNR surišimo mechanizmų EcoRIInaudoja katalizėje, mes ištyrėme fermento hidrolizės kinetiką naudodamiplazmidinius DNR substratus.2.1. DNR plazmidinių substratų kinetiniams tyrimams konstravimasNorint nustatyti REazių optimaliam veikimui būtiną taikinių skaičių dažnainaudojamos žiedinės superspiralizuotos DNR plazmidės, turinčios vieną ar dvifermento taikinio kopijas. Pavyzdžiui, ortodoksiniai IIP tipo restrikcijos fermentaiplazmides su vienu ir dviem taikiniais hidrolizuoja panašiu greičiu, o restrikcijosfermentai, sąveikaujantys su dviem DNR taikiniais, plazmides su dviem taikiniaishidrolizuoja žymiai greičiau, negu DNR su vienu taikiniu 89 . Norėdami nustatytitaikinių skaičių, būtiną EcoRII fermento optimaliam katalitiniam veikimui, messukonstravome plazmides, turinčias vieną, du ir tris EcoRII taikinius (18 pav.).Kadangi konkretaus taikinio hidrolizės greitis dažnai priklauso nuo šalia taikinio32

esančių gretimų sekų, konstruojant plazmides, turinčias du ir tris taikinius būtinaužtikrinti, kad visų taikinių apsuptis būtų identiška visose plazmidėse. PlazmidėspEcoRII-1, pEcoRII-2 ir pEcoRII-3 (18 pav.), turinčios atitinkamai vieną, du ir trisEcoRII taikinius su identiškomis apsuptimis ir identiškomis taikinių orientacijomisbuvo sukonstruotos plazmidės pKpn2I-ori (plazmidės pKpn2RM3.7 darinys 90 )pagrindu (žr. „Tyrimų metodiką“).Šių plazmidžiųkarpymas REaze EcoRIIbuvo tiriamas skirtingomiseksperimentinėmis sąlygomis.Atliekant kinetiniuseksperimentus vienosfermento apsukos sąlygomis(esant fermento pertekliui,18 paveikslas. Plazmidžių, naudotų EcoRIIkinetiniuose tyrimuose, schema 91 . EcoRII taikiniaipažymėti juodais stačiakampiais. Visi taikiniai turiidentiškas apsuptis ir identiškas orientacijas (žr.„Tyrimų metodiką“). Skaičiai laužtiniuoseskliaustuose žymi santykinę taikinio poziciją taikinio,pasirinkto atskaitos pradžia, atžvilgiu.t.y., [E]>[S]) galima išmatuotiabiejų DNR grandiniųhidrolizės greičius iridentifikuoti tarpinius reak-cijos produktus. Esantdaugelio fermento apsukųsąlygoms (esant fermentonepritekliui, t.y., [E]

fermento perteklius. Šis rezultatas patvirtina anksčiau literatūroje paskelbtuseksperimentinius duomenis 13 .Priešingai negu pEcoRII-1, pEcoRII-2 plazmidę EcoRII optimaliosekoncentracijose karpo žymiai greičiau (k obs = 1.3±0.1 min –1 ) susidarant įvairiemsreakcijos produktams (19B pav.). SS DNR pirmiausiai yra paverčiama į VT DNR,kuri vėliau yra paverčiama į linijinę plazmidinę DNR, turinčią vieną dvigrandininįtrūkį (L1). Labai lėtai taip pat susidaro ir galutinis reakcijos produktas L2 −plazmidinė DNR, turinti du dvigrandininius trūkius ir padalinta į du fragmentus.34

Kadangi EcoRII yra alosteriškai reguliuojamas fermentas 14 L2 produktasgalėtų susidaryti reakcijai vykstant in trans (žr. žemiau). Alternatyviu būdu,perkirptas taikinys galėtų stimuliuoti antro plazmidėje esančio taikinio kirpimą. Ištiesų, DNR oligodupleksas, imituojantis EcoRII produktą, sugeba stimuliuotiREazę EcoRII 15 , panašiai kaip ir kitus restrikcijos fermentus − SgrAI 92,93 beiBse634I 94 .Plazmidės pEcoRII-3 hidrolizės eiga EcoRII, esant optimaliai fermentokoncentracijai, skiriasi nuo pEcoRII-2 hidrolizės eigos viena svarbia detale(19C pav.). pEcoRII-3 SS DNR yra pirmiausiai paverčiama į L1 produktą,hidrolizuojant iš karto abi DNR grandines viename iš taikinių; tuo tarpupEcoRII-2 atveju fermentas iš pradžių įveda viengrandininį trūkį viename ištaikinių susidarant pirmajam tarpiniam produktui VT. SS DNR nykimo greičiaipEcoRII-3 ir pEcoRII-2 reakcijose iš principo nesiskiria (atitinkamaik obs(3-taikiniai) = 3.2±0.1 min -1 ir k obs(2-taikiniai) = 1.3±0.1 min -1 ). Vėliau, įvedus darvieną dvigrandininį trūkį viename iš taikinių, L1 paverčiama į L2, greičiausiaipagal tą patį mechanizmą, kaip ir karpant pEcoRII-2 plazmidę (žr. aukščiau).pEcoRII-1 plazmidės atveju EcoRII koncentracijos didinimas neturėjoįtakos nei reakcijos greičiui, nei reakcijos eigai, kas rodo, kad DNR substratas yraįsotintas fermentu (19A, D pav.). pEcoRII-2 plazmidės atveju, EcoRIIkoncentraciją padidinus nuo 2 nM iki 100 nM SS mažėjimas smarkiai sulėtėja, oL1 išeiga stipriai sumažėja (19B, E pav.). Panašus efektas stebimas ir pEcoRII-3plazmidės hidrolizės atveju. Šiuo atveju VT DNR produktas tampa pagrindiniureakcijos produktu, L1 DNR išeiga stipriai sumažėja (19F pav.) ir reakcijos eigatampa labai panaši į pEcoRII-2 plazmidės hidrolizės eigą (19E pav.).19 paveikslas. Restrikcijos endonukleazės EcoRII pEcoRII-1,-2 ir -3 plazmidiniųsubstratų hidrolizės reakcijos 91 . Paveikslėliai virš grafikų iliustruoja įvairias DNRformas, kurios teoriškai galėtų susidaryti karpant pEcoRII-1,-2 ir -3 DNR EcoRII.Reakcijose buvo naudojama pastovi 1.5 nM plazmidinės DNR koncentracija ir įvairiosbaltymo koncentracijos. Reakcijose optimaliomis sąlygomis (A−C) naudota 2 nMEcoRII, o fermento pertekliaus sąlygose (D−F) − 100 nM EcoRII. Reakcijose suspecifiniu oligodupleksu baltymo ir DNR koncentracijos: pEcoRII-1 atveju (G) −100 nM EcoRII ir 3000 nM SP33 (žr. 1 lentelę); pEcoRII-2 (H) ir pEcoRII-3 (I) atvejais− 2 nM EcoRII ir 60 nM SP33. Visos reakcijos buvo vykdytos 25 °C reakcijos buferyjekaip aprašyta “Tyrimų metodikoje”. Grafikuose parodyti superspiralizuotos SS (∆),žiedinės su viengrandininiu trūkiu VT (●), linijinės, turinčios vieną dvigrandininį trūkįL1 (□), turinčios du dvigrandininius trūkius L2 (▼) ir turinčios tris dvigrandininiustrūkius L3 (◊) plazmidinės DNR formų kiekiai atitinkamais laiko momentais. pEcoRII-2ir pEcoRII-3 atvejais VT, L1 (pEcoRII-2), o VT, L1 ir L2 (pEcoRII-3) plazmidinės DNRformos gali turėti papildomus viengrandininius trūkius antrame (trečiame) EcoRIItaikinyje, tačiau šių DNR formų nebuvo įmanoma identifikuoti agaroziniame gelyje. SSDNR nykimo kinetinės kreivės (B), (C), (E), (F), (G), (H) ir (I) grafikuose aprašytosviena eksponente (pavaizduota ištisine linija).35

2.3. EcoRII reakcijos in transpEcoRII-2 ir pEcoRII-3 plazmidžių hidrolizės eksperimentai rodo, kadDNR hidrolizei restrikcijos fermentu EcoRII reikalingi mažiausiai du EcoRIItaikiniai vienoje DNR molekulėje (in cis). C.D. Pein ir kt. 14,15 parodė, kadnehidrolizuojamų DNR substratų, kuriuose EcoRII taikiniai yra toli vienas nuokito, karpymą galima stimuliuoti pridedant į reakciją specifinio oligoduplekso,turinčio EcoRII taikinį. Mes atlikome analogiškus eksperimentus, registruodamipEcoRII-1,-2,-3 hidrolizės reakcijos eigą, esant specifiniam oligodupleksui.Tokios reakcijos metu galėtų susidaryti įvairūs fermento-DNR kompleksai:fermento ir plazmidinės DNR, mišrus fermento-oligoduplekso-plazmidinės DNR,bei fermento-oligoduplekso. Šių formų kiekis greičiausiai priklausys nuoreakcijoje esančios baltymo koncentracijos, oligoduplekso:plazmidinės DNRsantykio ir fermento-plazmidinės DNR, bei fermento-oligoduplekso susirišimokonstantų. Todėl specifinio oligoduplekso įtaka EcoRII katalizuojamai hidrolizėsreakcijai buvo tiriama įvairiomis reakcijos sąlygomis.pEcoRII-1 hidrolizė EcoRII esant specifiniam oligodupleksuipEcoRII-1 plazmidinės DNR hidrolizės reakcija EcoRII [E]>[S] sąlygomis(1.5 nM pEcoRII-1 ir 100 nM fermento) yra labai lėta ir jos vienintelis produktas –VT DNR (19D pav.). Pridėjus į reakciją 3000 nM specifinio 33 bp oligoduplekso(2 lentelė) reakcija žymiai pagreitėja ir jos pagrindiniu ir vieninteliu produktutampa L1 DNR (19G pav.).pEcoRII-2 hidrolizė EcoRII esant specifiniam oligodupleksuipEcoRII-2 plazmidinės DNR hidrolizės EcoRII reakcijos esant optimaliaifermento koncentracijai (1.5 nM DNR ir 2.0 nM fermento) pirmas tarpinisproduktas yra VT DNR, kuris vėliau paverčiamas L1 (19B pav.). Į reakcijos mišinįįdėjus 60 nM specifinio oligoduplekso, reakcijos eiga pasikeičia (19H pav.). Ir ištiesų, esant SP33, SS pEcoRII-2 DNR lygiagrečiai paverčiama praktiškaiekvimoliariniu kiekiu į VT ir L1 DNR formas, kurios vėliau virsta į L2(19H pav.).pEcoRII-3 hidrolizė EcoRII esant specifiniam oligodupleksuipEcoRII-3 DNR hidrolizės EcoRII reakcijos eiga esant specifiniamoligodupleksui beveik identiška kaip ir nesant SP33 (19I pav.). Abiem atvejais SSDNR pirmiausiai paverčiama į L1 DNR, praktiškai nesusidarant VT formai. Tiesa,L1 formos susidarymo greitis kiek didesnis esant SP33, nes specifinisoligodupleksas in trans stimuliuoja pEcoRII-2 karpymą (19H pav.).2.4. Plazmidinės DNR hidrolizė EcoRII esant [E]

VT DNR forma, kurioje yra perkirpta tik viena DNR grandinė, tuo tarpu L1formos, kurioje viename iš taikinių perkirptos abi grandinės, susidaro gana nedaug(20B pav.). pEcoRII-2 hidrolizės metu SS DNR forma yra praktiškai visapaverčiama į VT formą, kuri kaupiasi reakcijos mišinyje. Linijinė DNR forma,kurioje yra perkirpta antroji grandinė, gali susidaryti tik EcoRII fermentuisusirišus su VT DNR plazmidės forma kito katalitinio akto metu.20 paveikslas. Restrikcijos endonukleazių EcoRII ir NaeI reakcijos naudojant91plazmidinius DNR substratus esant fermento daugelio apsukų sąlygoms .Paveikslėliai virš grafikų iliustruoja įvairias DNR formas, kurios teoriškai galėtųsusidaryti karpant plazmidines DNR fermentais EcoRII ir NaeI. Plazmidžių turinčių 2 ir3 taikinius atvejais VT, L1 (plazmidės su 2 taikiniais atveju), o VT, L1 ir L2 (plazmidėssu 3 taikiniais atveju) plazmidinės DNR formos gali turėti papildomus viengrandininiustrūkius antrame (trečiame) fermento taikinyje, žinoma šių DNR formų nebuvo įmanomaidentifikuoti agaroziniame gelyje. (A)−(C) grafikai vaizduoja EcoRII reakcijas naudojantpEcoRII-1,-2 ir -3 plazmidinę DNR. Reakcijose buvo naudojama pastovi 1.5 nMplazmidinės DNR koncentracija ir 0.1 nM baltymo koncentracija. Reakcijos buvovykdytos 25 °C reakcijos buferyje kaip aprašyta “Tyrimų metodikoje”, analizuotos irpavaizduotos kaip ir 19 paveiksle. (D) ir (F) grafikai vaizduoja NaeI reakcijas naudojant95plazmides, turinčias 1 ir 2 taikinius ).Daugelio fermento apsukų sąlygose, pEcoRII-3 plazmidės hidrolizės EcoRIIeiga skiriasi nuo pEcoRII-2 reakcijos eigos: po pEcoRII-3 plazmidės hidrolizės37

EcoRII į tirpalą atsipalaiduoja L1 DNR forma, kurioje yra perkirptos abi vienotaikinio grandinės (20C pav.). Šiose sąlygose L2 ir L3 DNR formų susidaro tiktaipėdsakai. Analizuojant reakcijos produktus agaroziniame gelyje, nebuvo įmanomaatskirti linijinės DNR formos, turinčios dvigrandininį trūkį, nuo linijinės DNRformos, turinčios dvigrandininį trūkį su papildomais viengrandininiais trūkiais.Antrąjį dvigrandininį trūkį L1 formoje pervedant į L2 formą EcoRII naudoja tąpatį mechanizmą kaip pEcoRII-2 plazmidės hidrolizės atveju (žr. aukščiau). Šiuoatveju EcoRII suriša L1 DNR formą, padaro vieną viengrandininį trūkį,disocijuoja nuo DNR ir antrojo surišimo akto metu perkerpa antrąją grandinęgeneruodama L2 produktą arba L1 su dviem viengrandininiais trūkiais DNRformą. Tad agaroziniame gelyje L1 DNR forma migruoja taip pat kaip ir DNR L1forma turinti vieną arba du viengrandininius trūkius atskiruose taikiniuose.2.5. Plazmidinės DNR hidrolizė EcoRII-CM. Mucke ir kt. 24 pademonstravo, kad izoliuotas EcoRII-C efektyviaihidrolizuoja DNR, turinčią vieną EcoRII taikinį. Mes ištyrėme pEcoRII-1, -2 ir -3plazmidžių hidrolizę panaudodami išgrynintą EcoRII-C fermentą. Fermentodaugelio apsukų sąlygomis hidrolizės reakcija yra greita ir EcoRII-C plazmidiniussubstratus greitai paverčia galutiniais produktais. pEcoRII-2 ir -3 atveju DNRforma su vienu dvigrandininiu trūkiu kaupiasi tirpale ir sekančio katalitinio aktometu ji yra paverčiama galutiniais reakcijos produktais (21A−C pav.). Reikiapastebėti, kad reakcijos metu susikaupia ~40 % L1 DNR formos (21B, C pav.).Tai yra būtent toks tarpinio produkto kiekis, kuris turėtų susidaryti, jeigufermentas visus (2 arba 3) taikinius kerpa nepriklausomai vienas nuo kito vienodugreičiu 96-98 . Fermento vienos apsukos sąlygomis hidrolizės reakcija buvo pergreita, kad ją būtų galima atlikti nenaudojant greito maišymo aparatūros.2.6. Plazmidinės DNR hidrolizė PspGIPspGI yra homodimerinė REazė, kuri atpažįsta tą pačią seką, kaip EcoRII,bet DNR hidrolizei PspGI nėra būtina sąveika su dviem taikiniais 26 . Mes ištyrėmepEcoRII-1, -2 ir -3 plazmidžių hidrolizės reakcijas, katalizuojamas PspGIfermentu, vienos apsukos sąlygomis (21D-F pav.). Mes nustatėme, kad PspGI šiųsubstratų SS formą efektyviai paverčia į L1 DNR formą, sutartinai perkirpdamaabi DNR grandines viename taikinyje. Esant fermento daugelio apsukų sąlygoms,reakcijos eigoje kaupiasi L1 DNR forma, perkirpta per vieną iš taikinių.Greičiausiai PspGI perkirpęs vieną taikinį nuo jo nudisocijuoja, ir produktoatsipalaidavimas į tirpalą yra lėčiausia, t.y. limituojanti reakcijos stadija(duomenys nepateikti).2.7. EcoRII reakcijos panaudojant pEcoRII-1, -2 ir -3: išvadosEksperimentiniai duomenys, pateikiami 19 ir 20 paveiksluose, rodo, kadEcoRII reakcijos eiga, hidrolizuojant pEcoRII-1, -2 ar -3 plazmides, yra skirtinga.Iš tiesų, EcoRII nehidrolizuoja pEcoRII-1 plazmidės visose tirtose baltymo38

koncentracijose (19A, D pav. ir 20A pav.). pEcoRII-1 yra perkerpama tik pridėjusį reakcijos mišinį specifinio oligoduplekso (19G pav.).21 paveikslas. Restrikcijos endonukleazių EcoRII-C ir PspGI reakcijos naudojantpEcoRII-1,-2 ir -3 plazmidinius substratus 91 . Paveikslėliai virš grafikų iliustruojaįvairias DNR formas, kurios teoriškai galėtų susidaryti karpant plazmidines DNRfermentais EcoRII-C ir PspGI. Plazmidžių, turinčių 2 ir 3 taikinius, atvejais VT, L1(plazmidės su 2 taikiniais atveju), o VT, L1 ir L2 (plazmidės su 3 taikiniais atveju)plazmidinės DNR formos gali turėti papildomus viengrandininius trūkius antrame(trečiame) fermento taikinyje, tačiau šių DNR formų nebuvo įmanoma identifikuotiagaroziniame gelyje. Reakcijose buvo naudojama pastovi 1.5 nM plazmidinės DNRkoncentracija. (A−C) reakcijose buvo naudota 0.2 nM EcoRII-C, o (D−F) − 20 nMPspGI. Reakcijos buvo vykdytos 25 °C reakcijos buferyje kaip aprašyta “Tyrimųmetodikoje”, analizuotos ir pavaizduotos kaip ir 19 paveiksle. SS DNR nykimo kinetinėskreivės (D)−(F) grafikuose aprašytos viena eksponente (pavaizduota ištisine linija).Priešingai negu pEcoRII-1 atveju, plazmidė pEcoRII-2 yra gerai karpomaEcoRII esant optimalioms reakcijos sąlygoms ([E]≈[S]) (19B pav.) iš pradžiųsusidarant viengrandininį trūkį turinčiai VT DNR, o po to lėtai ją paverčiant į L1 irL2 DNR formas, turinčias dvigrandininius trūkius. pEcoRII-2 skaldymas žymiaisulėtėja esant EcoRII pertekliui (19E pav.). Kiekvieno EcoRII apsisukimo aktometu nuo fermento atsipalaiduoja ir reakcijos mišinyje kaupiasi VT DNRproduktas (20B pav.). Tiesa, L1 DNR forma tampa dominuojančiu reakcijos39

produktu optimaliomis sąlygomis reakcijos mišinyje esant specifiniamoligodupleksui (19H pav.).Panašiai, kaip ir pEcoRII-2 atveju, plazmidė pEcoRII-3 yra gerai karpomaEcoRII (19C pav. ir 20C pav.). Stacionariomis reakcijos sąlygomis reakcijosgreičiai nustatyti pagal SS DNR formos mažėjimą laike yra panašūs pEcoRII-2 ir -3 atvejais (k cat(2-taikiniai) = 0.3±0.1 min –1 , k cat(3-taikiniai) = 0.6±0.1 min –1 ). Taip patpalyginami yra pEcoRII-2 ir -3 hidrolizės reakcijos greičiai ir esant lygiaisubstrato ir fermento koncentracijai (k obs(2-taikiniai) = 1.3±0.1 min –1 , k obs(3-taikiniai) =3.2±0.1 min –1 ). Įdomu, kad panašiai kaip ir EcoRII-2 atveju pEcoRII-3 plazmidėshidrolizė sulėtėja esant fermento pertekliui reakcijos mišinyje (19F pav.).Pagrindinis skirtumas tarp pEcoRII-2 ir -3 plazmidžių hidrolizės eigos yra tai, kadpEcoRII-3 atveju pirmasis tarpinis produktas yra L1 DNR forma su vienudvigrandininiu trūkiu, tuo tarpu pEcoRII-2 atveju dominuoja VT DNR produktoforma turinti viengrandininį trūkį(ių). Be to, L1 DNR forma yra vienintelisreakcijos produktas, besikaupiantis reakcijos eigoje stacionariomis sąlygomis(19C pav.), o tai reiškia, kad EcoRII vieno katalitinio akto metu sugebahidrolizuoti abi taikinio grandines prieš atsipalaiduodama nuo DNR. Iš tiesų, esantlygioms fermento ir pEcoRII-3 plazmidės koncentracijoms didžioji SS DNR dalisyra tiesiai paverčiama į L1 produktą, o tai rodo, kad EcoRII taikinio abi grandinesperkerpa sutartinai (19C pav.).EcoRII hidrolizės stimuliacija antru taikiniu puikiai dera su anksčiaupublikuotais EcoRII hidrolizės rezultatais 14,15 . Pagal šiai dienai pripažintą dviejųtaikinių surišimo modelį (17A pav.) 40,47,87 , specifinės DNR taikinio surišimasN-domenais stimuliuoja antro DNR taikinio susirišimą ir hidrolizę C-galiniodimero katalitiniame centre. Žinoma, šis modelis niekaip negali paaiškinti, kodėlsusidaro skirtingi tarpiniai produktai pEcoRII-2 ir -3 plazmidžių hidrolizės atvejais(19 pav. ir 20C pav.).Šias skirtingas reakcijos eigas galima paaiškinti trijų taikinių surišimomodeliu (17A pav.). X.E. Zhou ir kt. 45 pasiūlė, kad fermento EcoRII aktyvumasyra reguliuojamas autoinhibicijos mechanizmu. Nustačius apo-EcoRII tretinęstruktūrą paaiškėjo, kad du N-galiniai efektoriniai domenai erdviškai blokuojaDNR patekimą į katalitinį/DNR surišimo centrą, esantį C-galinių domenųdimerizacijos paviršiuje (autoinhibicija). Autoriai pasiūlė, kad esant tirpalespecifinei DNR, visų pirma taikinį suriša EcoRII N-galiniai efektoriniai domenai.Tai iššaukia baltymo konformacinius persitvarkymus: N-galiniai domenaipasislenka nuo C-aktyvaus centro, o C-galiniai domenai suartėja suformuodamiaktyvų dimerą, sugebantį surišti dar vieną DNR taikinio kopiją (įvykstaaktyvacija). Pagal trijų taikinių surišimo modelį, ir vienos DNR kopijos surišimasN-domene indukuoja baltymo konformacinius pasikeitimus, pakankamus įvyktikatalizei C-domene. Tačiau, tiktai abiems N-galiniams domenams surišus povieną DNR kopiją, galima sutartina abiejų DNR grandinių hidrolizė trečiametaikinyje, esančiame C-galinio dimero aktyviame centre 91 .pEcoRII-1 plazmidės atveju, vienas N-galinis domenas susiriša suvieninteliu taikiniu esančiu plazmidėje ir greičiausiai aktyvuoja EcoRII-C.40

pEcoRII-1 plazmidės EcoRII praktiškai nekarpo, nes EcoRII-C negali prie prieitiprie taikinio, kuris yra susirišęs su N-domenu (22 pav.). Nedidelis EcoRIIkatalitinis aktyvumas galimas tik in trans reakcijoje, kai aktyvuotas EcoRII-Ckerpa taikinį, esantį kitoje DNR molekulėje (19A,D pav.).22 paveikslas. EcoRII sąveikos su pEcoRII-1, -2 ir -3 plazmidiniais substratais91įvairiose eksperimentinėse sąlygose schema . EcoRII-DNR kompleksai, galimaisusidarantys pEcoRII-1, -2 ir -3 plazmidžių hidrolizės metu esant optimalioms ([E]≈[S])arba fermento pertekliaus ([E]>[S]) sąlygoms. Po kiekvienu kompleksu yra nurodytitarpiniai kompleksai, susidarantys pirmojo katalitinio ciklo metu. N-galiniai EcoRIIdomenai pavaizduoti raudonai, C-galiniai EcoRII domenai pavaizduoti mėlynai, juodistačiakampiai žymi EcoRII taikinius plazmidinėje DNR molekulėje.pEcoRII-2 plazmidės atveju, vienam iš EcoRII N-domenų surišus vieną išdviejų pEcoRII-2 plazmidės taikinių įvyksta baltymo konformaciniaipersitvarkymai atsidarant aktyviam centrui C-galiniame domene, ir tuomet antrasisEcoRII-N domenas ir EcoRII-C domeno dimeras konkuruoja tarpusavyje dėlantrojo taikinio (22 pav.). Katalitiškai produktyvus kompleksas susidaro tiktaisurišus antrąjį taikinį EcoRII-C domenui, kuriame yra fermento aktyvus centras(22 pav.). pEcoRII-2 hidrolizės eksperimentai rodo, kad EcoRII vieno katalitinioakto metu sugeba perkirpti tiktai vieną DNR grandinę taikinyje (20B pav.). Galibūti, kad dėl konkurencijos tarp EcoRII-N ir EcoRII-C, katalitiškai aktyvaussinaptinio komplekso gyvavimo trukmė tampa per trumpa, kad EcoRII-C domenassugebėtų spėti perkirpti abi taikinio grandines vieno katalitinio akto metu(22 pav.). Galimas alternatyvus pEcoRII-2 reakcijos eigos paaiškinimas - fermento41

sutartiniam taikinio abiejų grandinių kirpimui EcoRII-C aktyviame centre yrabūtina sąlyga sutartinas abiejų N-domenų surišimas po DNR taikinį.Priešingai negu pEcoRII-2 plazmidės atveju, pEcoRII-3 substrate EcoRIIdimeras turi galimybę vienu metu surišti visus tris DNR taikinius (22 pav.).EcoRII-C katalitinis dimeras pEcoRII-3 plazmidėje viename iš taikinių kerpasutartinai abi grandines (19C pav.) ir tada disocijuoja į tirpalą susidarant produktuiL1 (20C pav.). Kitoje stadijoje, L1 substrate, kuris turi du EcoRII taikinius,EcoRII perkerpa vieną iš taikinių susidarant L2 DNR produktui (20C pav.).Trijų taikinių EcoRII-DNR surišimo modelis taip pat leidžia paaiškinti,kodėl pasikeičia reakcijos produktai naudojant aukštesnes fermentokoncentracijas. Iš tiesų, esant fermento pertekliui, papildomos EcoRII dimeromolekulės gali sąveikauti vienu metu su pEcoRII-2 ar -3 substratu per N-galinįdomeną, apsunkindamos EcoRII-C domeno DNR surišimą ir kirpimą (22 pav.).Tai lemia sumažėjusį reakcijos greitį ir išaugusį reakcijos eigoje susidarančio VTDNR produkto kiekį (19E, F pav.).Reakcijos produktų santykio ir reakcijos greičio pasikeitimus esant tirpalespecifiniam oligodupleksui taip pat galima paaiškinti trijų taikinių surišimomodeliu. Papildomai įdėjus į reakcijos mišinį specifinio oligoduplekso, atsirandagalimybė susidaryti katalitiškai produktyviems EcoRII kompleksams, nes vienasar abu N-galiniai domenai gali in trans surišti taikinį, esantį oligoduplekse. Taip intrans aktyvuotoje molekulėje EcoRII-C domenas gali efektyviai perkirptipEcoRII-1 substratą (19G pav.). pEcoRII-2 plazmidės atveju, stimuliacija in transpadidina L1 produkto išeigą (19B,H pav.). Šiuos reakcijos greičio ir eigospasikeitimus galima paaiškinti analogišku pEcoRII-3 atveju tirpale egzistuojančiųkatalitiškai aktyvių EcoRII molekulių, surišusių po tris DNR taikinius, išaugimu.Kita vertus, specifinio oligoduplekso pridėjimas turi mažą įtaką reakcijos eigai supEcoRII-3 substratu (19C, I pav.), nes in cis susidarantis sinaptinis kompleksasyra labiau stabilus nei in trans 99 .EcoRII-C domenas ir PspGI pEcoRII-1, -2 ir -3 plazmides hidrolizuojavienodu greičiu. Šis eksperimentas dar kartą patvirtina anksčiau publikuotusduomenis, kad EcoRII-C domenas egzistuoja kaip IIP tipo REazė, ir josoptimaliam aktyvumui nereikalinga sąveika vienu metu su keletu taikinių 24 .2.8. EcoRII ir NaeI: du IIE tipo restrikcijos fermentai, du skirtingi reakcijosmechanizmaiREazė NaeI yra kitas gerai ištyrinėtas IIE tipo restrikcijos fermentas, kuriooptimaliam aktyvumui reikalinga sąveika su dviem DNR taikiniais 100-102 . Jiatpažįsta ir kerpa CCC ↓ GGG DNR seką. M.L. Embleton ir kt. 95 atliko plazmidžių,turinčių vieną ir du NaeI taikinius, kinetinius tyrimus fermento daugelio apsukųsąlygomis. Norėdami akivaizdžiau palyginti reakcijos eigas NaeI ir EcoRIIfermentams, mes pateikėme publikuotus NaeI kinetinius duomenis 9520D, E paveiksle. Daugelio apsukų sąlygomis NaeI plazmidę su vienu taikiniuhidrolizuoja labai lėtai (20D pav.). Plazmidės su dviem NaeI taikiniais atvejufermentas kerpa abi vieno iš taikinių DNR grandines susidarant L1 produktui42

(20E pav.); tuo tarpu EcoRII analogišku atveju reakcijos eigoje susidaro VT DNRformos produktas. Tiesa, EcoRII L1 DNR susidaro plazmidės pEcoRII-3 atveju(20C pav.). Taigi, NaeI fermento sutartiniam taikinio dviejų grandinių hidrolizeireikalinga vienu metu sąveika su dviem taikiniais, tuo tarpu EcoRII reikalingasąveika su trimis taikiniais.Mes manome, kad stebimus NaeI ir EcoRII fermentų reakcijų skirtumus suplazmidėmis, turinčiomis du taikinius, apsprendžia skirtinga jų struktūrinėorganizacija. NaeI kristalinė struktūra rodo, kad šis domeninės organizacijosbaltymas turi dvi DNR surišimo vietas: NaeI N-galinis domenas turi panašų į IIPrestrikcijos fermento EcoRV aktyvų centrą, kuriame surišama viena DNR kopija,tuo tarpu C-galinis domenas dimeras formuoja antrąją DNR surišimo vietą,sudarytą iš dviejų spiralė-linkis-spiralė motyvų 88,103 . NaeI apo-struktūrojekatalitinis centras, esantis N-galiniame domene, nėra galutinai organizuotas, kadgalėtų surišti ir hidrolizuoti DNR. Vienos taikinio kopijos susirišimas DNRsurišimo C-galinių domenų dimere indukuoja baltymo konformaciniuspasikeitimus, kurie palengvina antros DNR molekulės susirišimą N-galiniųdomenų dimero suformuotame aktyviame centre. Tuomet įvyksta katalizė ir vienumetu perkerpamos abi DNR grandinės. NaeI-DNR kompleksas atitinkaschematiškai 17B paveiksle pavaizduotą dviejų taikinių surišimo modelį. Tuotarpu, EcoRII apo-struktūra ir biocheminiai tyrimai siūlo, kad EcoRII turi viso trisDNR surišimo vietas: vieną C-katalitiniame domeno dimere ir po vienąkiekviename iš N-efektorinių domenų 44,45 .EcoRII-DNR sąveikos modelis labiau panašus į IIS tipo restrikcijosfermentų, negu į archetipinės IIE tipo NaeI sąveiką su DNR. IIS tipo fermentoFokI veikimui būtinas dviejų taikinių surišimas, nors yra kerpamas tik vienas iš jų,panašiai kaip ir IIE tipo fermentų 104 . Du FokI monomerai, kiekvienam surišus povieną DNR kopiją per N-galinius atpažinimo domenus, dimerizuojasi perkatalitinius C-galinius domenus 105,106 . Katalitinis dimeras su DNR sąveikaujanespecifiškai ir hidrolizuoja abi DNR grandines vieno susirišimo metu 105-109 . Tuotarpu kitas IIS tipo restrikcijos fermentas BfiI, kurio DNR hidrolizei Mg 2+ nėrabūtini, nesant DNR egzistuoja dimerinėje formoje. BfiI N-galinis dimeras turi tikvieną aktyvų centrą, kuris yra panašus į nespecifinės EDTA atsparios nukleazėsNuc, priklausančios fosfolipazės D superšeimai, aktyvų centrą 110 . C-galiniaidomenai, struktūriškai panašūs į EcoRII-N, kiekvienas riša po vieną specifinėsDNR kopiją, ir tada vienas aktyvus centras hidrolizuoja iš pradžių apatinę, po to irviršutinę taikinio DNR grandines 111 . Taigi, suteikus FokI ir BfiI katalitiniamsdomenams taikinio atpažinimo determinantes, šias REazes galėtume paversti įfermentus, veikiančius pagal EcoRII principą.Šiuo metu yra žinoma nemažai restrikcijos fermentų pavyzdžių, kurie tampaaktyvūs tik vienu metu susirišę daugiau negu vieną taikinio kopiją, panašiai kaipEcoRII ir NaeI 47,112-114 . Pavyzdžiui, NarI nehidrolizuoja retai pasitaikančių DNRmolekulėje GG ↓ CGCC sekų, tačiau gali būti aktyvuojamas in trans pridėjusspecifinio oligoduplekso 100,112 . Šio baltymo struktūrinė organizacija nėra žinoma,tačiau neseniai publikuota NarI kinetinė analizė panaudojant plazmides, turinčias43

vieną ir du taikinius 115 . NarI kerpa plazmidinę DNR, turinčią vieną taikinįsusidarant VT produktui, panašiai kaip EcoRII atveju, tik žymiai efektyviau. SSplazmidinę DNR su dviem taikiniais NarI taip pat paverčia į VT DNR formą,perkirpdama vieną grandinę viename iš taikinių, kuri vėliau paverčiama į L1,perkirpus ir antrąją taikinio grandinę. Toliau reakcijos eigoje L1 labai lėtai buvopaverčiama L2, panašiai kaip ir EcoRII atveju. Taigi, plazmidžių turinčių vieną irdu NarI taikinius hidrolizės reakcijos eiga leidžia manyti, kad gamtojeegzistuoja ir daugiau IIE tipo restrikcijos fermentų, naudojančių tą patįreakcijos mechanizmą, aprašytą EcoRII. Ateityje bus įdomu sužinoti, ar NarIsutartiniam taikinio abiejų grandinių kirpimui būtinas koordinuotas trijų taikiniųsurišimas.3. EcoRII-3-DNR sinaptinio komplekso vizualizacija panaudojant AJM23 paveikslas. EcoRII-DNRsinaptinio komplekso dviejųDNR kilpų modelis 32 . N-galiniai DNR surišantys domenaipavaizduoti raudonais ovalais;C-galiniai katalitiniai domenaipavaizduoti mėlynomis inkstoformos figūromis; DNRpavaizduota dviguba pilkosspalvos linija.EcoRII kinetiniai tyrimai parodė, kadfermento optimaliam aktyvumui reikalingasąveika su trimis taikiniais. Norėdami tiesiogiaivizualizuoti EcoRII-3-DNR sinaptiniuskompleksus, mes panaudojome atominės jėgosmikroskopiją (AJM).Norėdami patikrinti trijų taikinių EcoRIIsurišimo modelį, mes panaudojome DNRfragmentą, turintį tris EcoRII taikinius. Tuoatveju, jeigu šis modelis teisingas, EcoRII-DNRsinaptiniame komplekse baltymas surištų visustaikinius ir sugebėtų suformuoti dviejų kilpųDNR struktūras (23 pav.).3.1. DNR fragmentų konstravimas EcoRIIAJMAJM eksperimentui PGR pagalbanaudojant pBluescript IIKS (+) plazmidę 116 buvosukonstruoti DNR fragmentai PGR1 ir PGR3,turintys, atitinkamai, vieną ir tris EcoRIItaikinius. Fragmentuose EcoRII taikiniaipažymėti A1, T ir A2 (24 pav.). Raidės A arba Tžymi EcoRII atpažinimo sekos CCWGGcentrinę bazę viršutinėje grandinėje. PGR1 DNR yra 205 bp ilgio ir turi 5 bpatpažinimo taikinį A2 fragmento centre (24 pav.). PGR3 DNR fragmentas yra810 bp ilgio ir turi tris 5 bp taikinius atskirtus 312 ir 283 bp atstumu: A1 ir A2 yrakraštiniai taikiniai, T yra centrinis taikinys (24 pav.). Fragmente kraštiniai taikiniaiyra nutolę nuo fragmento galų po 100 bp. Atstumai tarp taikinių − 312 bp ir283 bp buvo parinkti taip, kad sudarytų maždaug pusę viso PGR3 fragmento ilgioir taip užtikrintų pakankamą DNR lankstumą, reikalingą kilpų susidarymui 117,118 .44

3.2. EcoRII-PGR3 kompleksų vizualizavimas ir charakterizavimasPGR3 DNR fragmento ir wt EcoRII kompleksai buvo paruošti kaip aprašyta„Tyrimų metodikoje“, susirišimo buferyje naudojant Ca 2+ jonus vietoje Mg 2+ , kadišvengtume galimos DNRhidrolizės. Gauti DNRbaltymokompleksai buvoužfiksuojami susiuvantglutaro aldehidu.25 paveikslas iliustruojadviejų kilpų DNRstruktūras stebimas AJMvaizde. 25B-E paveiksluosepateikiama keletasįvairių dviejų kilpų DNRstruktūrų pavyzdžių. Visomsjoms būdinga panašimorfologija: struktūrojestebimos panašaus dydžiodvi kilpos ir du trumpi24 paveikslas. DNR fragmentai naudoti EcoRII AJMeksperimentuose 32 . Linijinių DNR fragmentų PGR1(turintis vieną EcoRII taikinį) ir PGR3 (turintis trisEcoRII taikinius) parametrai nurodyti bp ir nm. 5 bptaikiniai pažymėti pilkais stačiakampiais.pečiai. Norėdami parodyti, kad kilpos susidaro baltymui specifiškai sąveikaujantsu DNR, buvo išmatuoti fragmento kilpų, pečių bei kontūro ilgiai. Matavimųrezultatai pateikti 26A-C paveiksluose ir 9 lentelėje.25 paveikslas. EcoRII-DNR kompleksų AJM vaizdai 32 . (A)Bendras AJM vaizdas su įvairiais baltymo-DNR kompleksais.Kairiame kampe yra išdidintas dviejų kilpų DNR struktūrosvaizdas. (B-E) Dviejų kilpų struktūrų AJM vaizdų galerija.Kadangi abi kilposyra panašaus dydžio,jų AJMvaizduose atskirtinepavyko ir histogramojekilpų ilgiomatavimų rezultataspateikiamas vienasmaile. Teoriniaifragmento, kilpų irpečių ilgiai buvoįvertinti laikant, kadPGR3 DNR yra B-konformacijoje. Palyginuseksperimentiniusilgių matavimussu teoriškaipaskaičiuotais (24 pav.) matyti, kad jie praktiškai mažai skiriasi.Tad, AJM rezultatai patvirtina, kad EcoRII fermentas sugeba specifiškaisurišti tris DNR taikinius į sinaptinį kompleksą susiformuojant dviejų kilpųstruktūroms 32 .45

26 paveikslas. Baltymo ir DNR parametrų matavimai EcoRII-PGR3 dviejų kilpųkompleksuose 32 . Histogramose pavaizduota DNR fragmento ilgių matavimai: fragmentopečių (A), kilpų (B) ir kontūro (C) ilgiai. Įvertinti teoriškai galimi ilgiai atitinkamai yra34 nm (A), 97.9 ir 107.8 nm (B), bei 278.8 nm (C). (D) EcoRII baltymo tūrio matavimai.3EcoRII dimero teorinis tūris yra 175.1 nm .Norėdami įvertinti komplekso stechiometriją, mes atlikome baltymo tūriomatavimus. Matavimų rezultatai pateikti 26D paveiksle. Baltymo molekulinėsmasės perskaičiavimas į tūrį buvo atliktas kaip aprašyta 32 . Pagal šiuosskaičiavimus teorinė EcoRII dimero 90.5 kDa molekulinė masė atitinka175.1 nm 3 .3227 paveikslas. Įvairūs EcoRII-PGR3 kompleksai (adaptuota iš ). (A) Sinaptiniaikompleksai: (i) mažosios kilpos kompleksas, (ii) didžiosios kilpos kompleksas.Nesinaptiniai baltymo-DNR kompleksai, kuriuose įvairus baltymo molekulių skaičiusyra susirišęs su DNR molekulės taikiniais: (B) fragmentas su viena baltymo molekule,(C) dviem, (D) trimis. Histogramose pavaizduota eksperimentiškai nustatytas baltymotūris kompleksuose. Šalia histogramų pateikti AJM vaizdai iliustruoja įvairius baltymo-DNR kompleksus.46

Eksperimentiškai nustatyta (26D pav.) 167 nm 3 baltymo tūrio vertė yraartima teoriniam baltymo tūriui. Taigi, AJM rezultatai rodo, kad dviejų kilpųstruktūras formuoja EcoRII baltymo dimeras 32 .AJM vaizduose buvo taip pat randamos ir kitokios DNR struktūros,27 paveikslas. Be dviejų kilpų struktūrų taip pat buvo stebimi sinaptiniaikompleksai, pavadinti „mažosiomis” bei „didžiosiomis” kilpomis (27A pav. (i) ir(ii)). „Mažoji“ kilpa galėtų susidaryti, jeigu baltymas surištų centrinį T (24 pav.)taikinį ir vieną iš kraštinių A1 arba A2 (24 pav.), „didžioji“ kilpa galėtų susidarytijeigu baltymas surištų abu kraštinius taikinius (A1 ir A2, 24 pav.). Kiti trysnesinaptiniai kompleksai (27B-D pav.) stebimi vienai (B), dviems (C) ar trims (D)EcoRII molekulėms prisirišus prie DNR taikinių. Analogiškai dviejų kilpųkompleksams, šioms DNR struktūroms buvo atlikti ilgio matavimai siekiantparodyti, kad visi šie kompleksai yra specifiniai. Rezultatai pateikiami 9 lentelėje.9 lentelė. DNR fragmentų ilgių matavimai EcoRII-PGR3 kompleksuose*Kompleksasmažosios kilpos kompleksai(N = 80)didžiosios kilpos kompleksai(N = 43)dviejų kilpų kompleksai(N = 22)fragmentas su1 EcoRII molekule(N = 52)fragmentas su2 EcoRII molekulėmis(N = 36)fragmentas su3 EcoRII molekulėmis(N = 18)Ilgiai, nmKontūro Peties(-čių) Kilpos279.2±0.533.0±0.3135.6±0.4106.7±0.3279.2±1.1 32.6±0.3 207.0±1.2276.1±0.5 33.0±0.2 101.5±0.5277.8±0.9276.3±0.530.7±0.4134.6±0.731.9±0.3137.0±0.5Segmento(-ų)106.0±0.3208.0±0.1276.0±0.5 31.3±0.3 103.7±0.4* Visos eksperimentiškai nustatytos vertės gerai atitinka teoriškai suskaičiuotas. N - matavimųskaičius. Histogramose teoriškai galimų artimų maksimumų verčių smailių nebuvo įmanomaatskirti, tad eksperimentiškai nustatyta maksimumo vertė patenka į intervalą tarp abiejųteorinių verčių. Visos histogramos aprašytos Gauso skirstiniu ir suskaičiuotos artiniostandartinės paklaidos. Lentelė paimta iš 32 .Kompleksų stechiometrijos analizė (27 pav.) parodė, kad sinaptiniuskompleksus sudaro baltymo dimeras, o nesinaptinius kompleksus sudaro EcoRIImonomerai ir dimerai. EcoRII-PGR3 specifiniuose kompleksuose įvairių DNRstruktūrų išeiga labai skiriasi. Dviejų kilpų kompleksų išeiga 1.7 %. Didžiosioskilpos kompleksų buvo randama dvigubai daugiau (3.2 %), o mažųjų kilpųkompleksų buvo daugiausia (išeiga 52.2 %). Tokių kompleksų, kuriuose vienaEcoRII molekulė sąveikauja su vienu fragmento taikiniu, kiekis taip pat buvo47

žymus (33.5 %). Likę kompleksai (fragmentai, kuriuose prisirišusios 2 arba 3EcoRII molekulės) sudarė 9.4 %. Nedidelė dviejų kilpų kompleksų išeiga (1.7 %)nestebina, nes ji yra palyginama su didžiosios kilpos kompleksų skaičiumi(3.2 %). Tačiau stebina gausiausias, net 52.2 %, mažųjų kilpų kompleksų skaičius.Tam tikro dydžio kilpos susidarymo tikimybė apsprendžia sinaptinio kompleksosusidarymo išeigą 119,120 . Ši tikimybė kiekybiškai charakterizuojama DNRciklizacijos J-faktoriumi 120,121 . Pagal J-faktoriaus vertę 300-600 bp ilgio DNRkompleksuose, kuriuose susiformuoja kilpos, didžiosios kilpos struktūrų turėtųbūti randama daugiausiai, o mažųjų kilpų turėtų susidaryti šiek tiek mažiau(duomenys nepateikti). Tuo tarpu gauti rezultatai yra priešingi, kas leidžia sakyti,kad DNR kilpų ciklizacijos tikimybė nepaaiškina stebimų kilpų formavimosiišeigų.PGR3 DNR fragmente visi trys EcoRII taikiniai tarpusavyje skiriasi savoorientacija (24 pav.) ir tai galėtų būti skirtingų kilpų išeigų priežastimi. Taikiniųorientacija iš tikro gali būti svarbi, nes EcoRII-N domeno sąveika su taikiniu yraasimetrinė 122 .3.3. EcoRII-PGR1 kompleksų charakterizavimasMes taip pat išanalizavome EcoRII kompleksus su DNR fragmentu PGR1,turinčiu vieną fermento taikinį. Buvo stebimi ir charakterizuoti tiek sinaptiniai (Xformos,susiformavę in trans baltymui surišus dvi DNR molekules,), tieknesinaptiniai kompleksai. Gausiausiai randami buvo nesinaptiniai kompleksai,kuriuose EcoRII yra surišusi vieną DNR molekulę (64.6 %); sinaptiniai X-formoskompleksai sudarė 12.1 % (duomenys nepateikti). DNR struktūrų ilgio matavimaiparodė, kad tiek nesinaptiniuose kompleksuose (30.1 nm), tiek sinaptiniuosekompleksuose visų keturių pečių ilgiai (33.4 nm) gerai atitinka teorinę specifiniokomplekso peties ilgį (34 nm) (duomenys nepateikti). EcoRII tūrio matavimaiparodė, sinaptiniuose kompleksuose EcoRII yra dimeras (duomenys nepateikti).Tuo tarpu nesinaptiniuose kompleksuose baltymas yra monomerinėje arbadimerinėje formoje (duomenys nepateikti). Kontroliniame eksperimente laisvasbaltymas stebimas kaip sferinis rutuliukas, kurio tūris yra 185.6 ± 5.8 nm 3 ir taiatitinka baltymo dimero reikšmę.3.4. EcoRII monomeras baltymo-DNR kompleksuoseAJM rezultatai rodo, kad visuose sinaptiniuose kompleksuose (EcoRIIsąveikaujant su dviem ar trimis taikiniais) dalyvauja baltymo dimeras, tačiaubaltymo monomero-DNR kompleksai yra stebimi EcoRII sąveikos su vienutaikiniu atveju (27 pav.). Kita vertus, EcoRII sąveikaujant su vienu taikiniustebima ir baltymo dimero forma. EcoRII tirpale egzistuoja dimerinėjeformoje 21,86 . EcoRII monomero-DNR komplekso egzistavimas liudija apieEcoRII-DNR komplekso dinaminę pusiausvyrą. Iš tiesų, jeigu baltymas riša DNRkaip dimeras, o po to disocijuoja į monomerus, galima tikėtis stebėti tarpinius48

dalinai disocijavusius kompleksus. Ir iš tiesų, tokius kompleksus pavykoužfiksuoti AJM eksperimente.28 paveiksle matyti, kaip disocijuojančio dimero monomero subvienetasindividualiai sąveikauja su taikiniu įvairiuose sinaptinuose kompleksuose: dviejųkilpų komplekse (A), mažosios kilpos komplekse (B ir C), bei didžiosios kilposkomplekse (D). Tokie sinaptiniai kompleksai nebuvo skaičiuojami ir buvotraktuojami, kaip nepilnai susiformavę kompleksai. Kompleksų, kuriuose vienaEcoRII molekulė sąveikauja su vienu fragmento taikiniu, atvejais nebuvoįmanoma atskirti pilnai susiformavusių nuo dalinai disocijavusių kompleksų ir taipaaiškina bimodalinį baltymo monomero ir dimero pasiskirstymą kompleksuose.3228 paveikslas. Dalinai disocijavusių sinaptinių kompleksų AJM vaizdai . Dalinaidisocijavę kompleksai parodyti dviejų kilpų komplekse (A), mažosios kilpos (B, C) irdidžiosios kilpos (D) kompleksuose. Baltymo monomerinės ir dimerinės formospažymėtos atitinkamai M ir D.AJM duomenys rodo, kad EcoRII restrikcijos fermento dimeras sugebasuformuoti sinaptinius kompleksus vienu metu surišdamas tiek tris, tiek ir du DNRtaikinius. Šie rezultatai pilnai patvirtina pasiūlytą EcoRII trijų taikinių surišimomodelį (17B pav.). Tad dviejų kilpų kompleksų vizualizacija AJM pagalba yratiesioginis trijų taikinių surišimo modelio patvirtinimas.V. Ecl18kI ir EcoRII sąveika su DNR: tyrimų perspektyvosStruktūriniai ir biocheminiai tyrimai, atlikti šiame darbe, parodė, kadEcl18kI ( ↓ CCNGG) ir EcoRII ( ↓ CCWGG) turi panašius aktyvius centrus irpanašias DNR sekos atpažinimo determinantes, kaip ir tetramerinės REazėsBse634I/Cfr10I (R ↓ CCGGY) ir NgoMIV (G ↓ CCGGC) 36,39,44 . Šiame darbe buvopademonstruota, kad Ecl18kI ir EcoRII REazės, sąveikaudamos su atpažinimoseka, išsuka centrinę bazių porą, ir tokiu būdu paverčia 5 bp atpažinimo sekąCCNGG į 4 bp seką CCGG 39 . Dėl šios priežasties Ecl18kI/EcoRII irBse634I/Cfr10I/NgoMIV restrikcijos fermentai gali panaudoti tą patį CC:GGnukleotidų atpažinimo mechanizmą. Tačiau skirtingai negu Ecl18kI, kuris savoatpažinimo sekoje CCNGG nediskriminuoja G:C nuo A:T, EcoRII-C, kerpa tiktaitaikinius, kurių centrinėje padėtyje yra A:T bazių pora. Būtų įdomu sužinoti, kaipšie fermentai užtikrina savo skirtingų sekų CCNGG ir CCWGG atpažinimą.Šiame darbe atlikti kinetiniai tyrimai įrodė, kad EcoRII yra pirmoji REazė,kuriai sutartinei abiejų taikinio DNR grandinių hidrolizei yra būtinas trijų taikinių49

surišimas 91 . AJM eksperimentai patvirtino trijų taikinių surišimo modelį iratskleidė, kad EcoRII-DNR sąveika yra labai dinamiška 32 . Tolimesni vienosmolekulės eksperimentai, AJM registruojant baltymo-DNR sąveiką laike 123 galbūtleistų detektuoti tarpinius EcoRII-DNR kompleksus ir suteiktų informacijos apiefermento taikinio paieškos mechanizmą.Ecl18kI analitinio centrifugavimo eksperimentai rodo, kad baltymas tirpaleegzistuoja dimerinėje formoje 36 . Nustatyta Ecl18kI-DNR struktūra parodė, kadasimetriniame vienete yra Ecl18kI tetrameras, surišęs dvi DNR molekules 39 . Būtųįdomu sužinoti, ar kristalinėje formoje stebimas tetrameras yra funkciškai svarbiEcl18kI oligomerinė būsena tirpale.50

IŠVADOS1. Restrikcijos endonukleazės Ecl18kI ir EcoRII, atpažįstančios CCNGG irCCWGG sekas, turi panašią aktyvaus centro architektūrą ir atpažinimo sekos C:Gbazių poros atpažinimo determinantes kaip ir Bse634I/Cfr10I/NgoMIV restrikcijosfermentai, specifiniai RCCGGY/GCCGGC sekoms.2. Specifiškumui užtikrinti restrikcijos endonukleazė Ecl18kI iš savo atpažinimosekos CCNGG išsuka abu centrinius nukleotidus į baltymo „kišenę“. Tokiu būdu,Ecl18kI ir Bse634I/Cfr10I/NgoMIV fermentai gali naudoti tą patį struktūrinįmodulį skirtingų DNR sekų atpažinimui, bet generuoti skirtingus reakcijosproduktus. Ecl18kI yra pirmasis restrikcijos fermentas, išsukantis nukleotidus išatpažinimo sekos, kad realizuotų savo specifiškumą.3. Fluorescencijos tyrimai rodo, kad naudojant 2-aminopurino, esančio restrikcijosendonukleazių Ecl18kI, EcoRII-C ir PspGI taikinio centrinėje padėtyje,fluorescencijos signalas išauga prisirišus fermentui. Tai leidžia teigti, kad šiefermentai naudoja nukleotido(ų) išsukimo mechanizmą tirpale.4. Biocheminiai ir kinetiniai eksperimentai rodo, kad IIE tipo restrikcijosendonukleazės EcoRII taikinio abiejų grandinių sutartiniam kirpimui būtinas trijų,o ne dviejų DNR taikinių surišimas. Pasitelkus atominės jėgos mikroskopiją,tiesiogiai pademonstruota, kad EcoRII sudaro sinaptinius baltymo-DNRkompleksus, kuriuose baltymas yra surišęs tris DNR taikinius. Pasiūlytas EcoRIIreakcijos mechanizmas skiriasi nuo kito IIE tipo restrikcijos fermento NaeImechanizmo.51

CONCLUSIONS1. Our data demonstrate that Ecl18kI and EcoRII, specific for the CCNGG andCCWGG sequences, respectively, share a conserved catalytic/metal binding sitearchitecture and conserved structural mechanism of the C:G base pair recognitionwith restriction enzymes Bse634I/Cfr10I/NgoMIV specific for theRCCGGY/GCCGGC sequences.2. We show that to achieve its specificity and cleavage pattern Ecl18kI flips bothcentral nucleotides within the CCNGG sequence and buries the extruded bases inthe pockets within the protein. Therefore, the Ecl18kI andBse634I/Cfr10I/NgoMIV enzymes can use a conserved DNA recognition moduleto recognize different sequences, and form superimposable dimers, yet generatedifferent cleavage patterns. Hence, Ecl18kI is the first restriction endonucleasethat flips nucleotides to achieve specificity for its recognition site.3. We demonstrate that Ecl18kI, EcoRII-C and PspGI binding enhance thefluorescence of 2-aminopurines placed at the centers of their recognitionsequences suggesting that restriction endonucleases Ecl18kI, EcoRII-C and PspGIflip nucleotide(s) in solution.4. We provide kinetic and biochemical evidence that Type IIE restrictionendonuclease EcoRII requires simultaneous binding of three rather than tworecognition sites to achieve concerted DNA cleavage at a single site. Atomic forcemicroscopy allows direct visualization of synaptic EcoRII restriction enzyme-DNA complexes involving three DNA binding sites. Reaction mechanismsuggested for EcoRII differs from that of another Type IIE enzyme NaeI.52

PADĖKADisertaciją skiriu savo žmonai Giedrei.Esu labai dėkingas savo darbo vadovui prof. dr. Virginijui Šikšniui už puikųvadovavimą: už vertingus pasiūlymus, diskusijas, už atvirą bendravimą irtoleranciją, taip už entuziastingą įvairių laisvalaikio renginių organizavimą.Dėkoju visiems Baltymų-nukleorūgščių sąveikos tyrimo laboratorijosdarbuotojams už puikią atmosferą kolektyve. Ačiū dr. Giedriui Sasnauskui, dr.Mindaugui Zarembai ir dr. Elenai Manakovai, su kuriais kartu buvo atlikta dalisdisertacijoje pristatomų darbų. Ypatinga padėka dr. Giedriui Sasnauskui užkonsultacijas kinetikos eksperimentuose ir dr. Mindaugui Zarembai už jųvertingus pasiūlymus ir diskusijas.Dėkoju dr. Matthias Bochtler ir Roman H. Szczepanowski (InternationalInstitute of Molecular and Cell Biology, Warsaw, Lenkija) už kristalinę Ecl18kI-DNR struktūrą, bei prof. dr. Yuri L. Lyubchenko ir dr. Luda S. Shlyakhtenko(University of Nebraska Medical Center, JAV) už atliktus EcoRII AJMeksperimentus.Dėkoju prof. dr. Alfred Pingoud ir dr. Wolfgang Wende (Justus-LiebigUniversity, Giessen, Germany) suteikusiems galimybę atlikti CD eksperimentus iruž įgytą patirtį jų laboratorijoje. Dėkoju dr. Sebastian Scholz (Justus-LiebigUniversity, Giessen, Germany) padėjusiam išmokti dirbti su CD aparatūra. Taippat esu dėkingas prof. dr. Claus Urbanke (Medizinische Hochschule Hannover,Vokietija) už analitinio ultracentrifugavimo eksperimentus.Dėkoju dr. Virginijui Lukšai (UAB Sicor Biotech, Vilnius) ir dr. GražvyduiLukinavičiui (Biotechnologijos institutas, Vilnius) už pagalbą atliekant masiųspektrometrijos analizę.Dėkoju Magdalenai Kaus-Drobek ir Monikai Sokolowska (InternationalInstitute of Molecular and Cell Biology, Warsaw, Lenkija) už MvaI klonavimą irbaltymo gryninimą.Noriu padėkoti dr. Daliai Daujotytei (MRC Laboratory of MolecularBiology, Cambridge, Great Britain), prof. dr. Sauliui Klimašauskui(Biotechnologijos institutas, Vilnius), dr. Robert K. Neely, dr. Anita C. Jones irprof. David T. F. Dryden (University of Edinburgh, Great Britain) už diskusijasfluorescencijos eksperimentų tema.Norėčiau išreikšti savo padėką žmonėms, kurių darbas leido man atliktidetalius Ecl18kI ir EcoRII tyrimus: dr. Alexander S. Solonin ir dr. Marat M.Denjmukhametov (Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,Pushchino, Rusija) už Ecl18kI restrikcijos-modifikacijos sistemos klonavimą, dr.Monika Reuter (Institute of Virology, Berlin, Vokietija) už wt EcoRII, EcoRII-N,Y41A, E271A ir D299A raiškos vektorius, New England Biolabs (Ipswich, JAV)už PspGI raiškos vektorius. Tai pat dėkoju dr. Monika Reuter (Institute ofVirology, Berlin, Vokietija) už diskusijas ir kritines pastabas.53

Dėkoju dr. Sonatai Jurėnaitei-Urbanavičienei ir dr. Arvydui Lubiui (UABFermentas, Vilnius) už suteiktą pKpn2I-ori plazmidę.UAB Fermentas (Vilnius) dėkoju už suteiktas pUC19 dam – dcm – irpBluescript IIKS (+) plazmides ir už molekulinės biologijos produktus ir galimybępasinaudoti laboratorine įranga.Dėkingas buvusiems laboratorijos kolegoms dr. Remigijui Skirgailai ir dr.Arūnui Lagunavičiui (UAB Fermentas, Vilnius) už pirmųjų darbo įgūdžiusišugdymą, bei dr. Jolantai Vitkutei (UAB Fermentas, Vilnius) už jos palaikymą.Esu dėkingas doc. dr. Jurgiui Kadziauskui (Vilniaus universitetas,biochemijos katedra) paskatinusiam mane pradėti biochemijos studijas.Noriu pareikšti dėkingumą savo vidurinės mokyklos mokytojams: chemijosmokytojai auklėtojai Janinai Greblikienei, fizikos mokytojui Petrui Jonušui už jųcharizmatinį supažindinimą su paslaptinguoju laboratorijos pasauliu ir savomatematikos mokytojui Stasiui Pikeliui.Taip pat esu dėkingas savo dėdei prof. dr. Sigitui Tamulevičiui ir dr. EgleiTamulevičienei savo pavyzdžiu įkvėpusiems pasirinkti mokslininko profesiją ir jųnuolatiniu domėjimųsi mano darbu.Labai ačiū visiems draugams už jų nuoširdų ir atvirą bendravimą. Manopadėka ir pagarba tėvams ir uošviams už jų supratingumą ir palaikymą. Ypatingapadėka mano žmonai Giedrei, kuriai skiriu savo disertaciją.Disertacija buvo parengta 2000-2008 m. Biotechnologijos institute. Užfinansinę paramą esu dėkingas Howard Hughes Medical Institute, BIOCEL,International Quality Network ir Lietuvos valstybiniam mokslo ir studijų fondui.54

PUBLIKACIJŲ SĄRAŠASDisertacijoje pateikta medžiaga paskelbta šiuose straipsniuose:1. Tamulaitis, G., Solonin, A.S. & Siksnys, V. (2002). Alternative arrangementsof catalytic residues at the active sites of restriction enzymes. FEBS Letters 518,17-22.2. Tamulaitis, G., Mucke, M. & Siksnys, V. (2006). Biochemical and mutationalanalysis of EcoRII functional domains reveals evolutionary links betweenrestriction enzymes. FEBS Letters 580, 1665–1671.3. Tamulaitis, G., Sasnauskas, G., Mucke, M. & Siksnys, V. (2006).Simultaneous binding of three recognition sites is necessary for a concertedplasmid DNA cleavage by EcoRII restriction endonuclease. Journal of MolecularBiology 358, 406–419.4. Bochtler, M., Szczepanowski, R.H., Tamulaitis, G., Grazulis, S., Czapinska,H., Manakova, E. & Siksnys, V. (2006). Nucleotide flips determine the specificityof the Ecl18kI restriction endonuclease. The EMBO Journal 25, 2219-2229.5. Tamulaitis, G., Zaremba, M., Szczepanowski, RH., Bochtler,M. & Siksnys, V. (2007). Nucleotide flipping by restrictionenzymes analyzed by 2-aminopurine steady-state fluorescence.Nucleic Acids Research 35, (14), 4792-4799.6. Shlyakhtenko, LS., Gilmore, J., Portillo, A., Tamulaitis, G.,Siksnys, V. & Lyubchenko, YL. (2007). Direct visualization of theEcoRII-DNA triple synaptic complex by atomic force microscopy.Biochemistry 46, (39), 11128-11136.55

Disertacijoje pateikta medžiaga buvo pristatyta šiose konferencijose:1. Tamulaitis, G., Mucke, M., Reuter, M. & Siksnys, V. (2004). Three rather thantwo recognition sites are required for the optimal catalytic activity of Type IIErestriction endonuclease EcoRII. Abstracts of 5th New England Biolabs Meetingon Restriction-Modification, Bristol, UK; September 04-08, 2004; p. 210.2. Tamulaitis, G., Sasnauskas, G. & Siksnys, V. (2006). Restriction enzymeEcoRII interacts with three recognition sites. Abstracts of 31st FEBS Congress,Istanbul, Turkey, June 24-29, 2006; FEBS Journal 273: p. 190-190 PP420 Suppl.1, JUN 2006.3. Tamulaitis, G., Bochtler, M. & Siksnys, V. (2007). Analysis of nucleotideflipping by restriction enzymes using 2-AP as a probe. 7 th International Meetingon Recognition Studies in Nucleic Acids, Sheffield, UK; April 01-05, 2007; p. 98.Kitos publikacijos:1. Tamulaitis, G. & Lagunavicius, A. (2000). DNA bending induced by MunIrestriction endonuclease. Biologija 4, 11-15.2. Kaus-Drobek, M., Czapinska, H., Sokolowska, M., Tamulaitis, G.,Szczepanowski, R.H., Urbanke, C., Siksnys, V. & Bochtler, M. (2007). Restrictionendonuclease MvaI is a monomer that recognizes its target sequenceasymmetrically. Nucleic Acids Research 35, (6), 2035-2046.3. Sokolowska, M., Kaus-Drobek, M., Czapinska, H., Tamulaitis, G.,Szczepanowski, R.H., Urbanke, C., Siksnys, V. & Bochtler, M. (2007).Monomeric restriction endonuclease BcnI in the apo-form and in an asymmetriccomplex with target DNA. Journal of Molecular Biology 369, (3), 722-734.4. Sokolowska, M., Kaus-Drobek, M., Czapinska, H., Tamulaitis, G., Siksnys, V.& Bochtler, M. (2007). Restriction endonucleases that resemble a component ofthe bacterial DNA repair machinery. Cell Molecular Life Science 64, (18), 2351-2357.5. Gasiunas, G., Sasnauskas, G., Tamulaitis G., Urbanke, C., Razaniene, D. &Siksnys, V. (2008). Tetrameric restriction enzymes: expansion to the GIY-YIGnuclease family. Nucleic Acids Research 36, (3), 938-949.6. Daujotytė, D., Liutkevičiutė Z., Tamulaitis G. & Klimašauskas, S. (2008).Chemical mapping of cytosines enzymatically flipped out of the DNA helix.Nucleic Acids Research 36, (10), e57.56

DUOMENYS APIE AUTORIŲGintautas Tamulaitis gimė 1973 m. lapkričio 3 d. Vilniuje.1993-1998 metais studijavo Vilniaus Universitete Chemijos fakultetebiochemijos specialybę. Nuo 1995 metų atliko studentų praktiką Biotechnologijosinstitute, Baltymų-nukleorūgščių sąveikos tyrimo laboratorijoje. Čiavadovaujamas prof. dr. V. Šikšnio ir dr. R. Skirgailos parengė baigiamąjį darbą„Plazmidinės DNR hidrolizės restrikcijos endonukleaze Bse118I kinetikostyrimas“, kurį apgynė 1996 m.. 1998 m. vadovaujant prof. dr. V. Šikšniui ir dr.A. Lagunavičiui sėkmingai apgynė diplominį darbą „Restrikcijos endonukleazėsMunI indukuojamo specifinės DNR lenkimo tyrimas“. Nuo 1998 m. iki 2002 m.Biotechnologijos institute G. Tamulaitis studijavo biochemijos (04 P) kryptiesbaltymų ir enzimologijos (P310) šakos doktorantūroje (vadovasprof. dr. V. Šikšnys). Studijų tema – “Restrikcijos endonukleazės MunI specifinėssąveikos su DNR mechanizmo tyrimas”. 2002-2008 m. dirbo Biotechnologijosinstitute jaunesniuoju mokslo darbuotoju.Pagrindinės G. Tamulaičio mokslinių interesų kryptys – baltymų-DNRsąveikos mechanizmai, restrikcijos endonukleazių struktūros ir funkcijos ryšys beibazės išsukimo mechanizmai.57

SUMMARYType II restriction endonucleases recognize short DNA sequences, typically 4-8 bp inlength, and cleave both phosphodiester bonds at fixed position within or close to theirrecognition sites leaving 5'-phosphate and 3'-hydroxyl groups. Type II restriction enzymesprobably represent the largest family of functionally related enzymes; however the structuraland mechanistical divergence within the family is still poorly understood. Protein sequencecomparison in general reveal no or very weak similarities raising the question of whetherrestriction endonucleases evolved independently. Structural and biochemical studieshowever demonstrate that despite of the lack of sequence homologies, Type II restrictionendonucleases can be assigned to four families based on the presence of conserved activesite amino acids residues. Among the Type II restriction endonucleases families, theenzymes of PD-(E/D)XK family are best characterized both structurally and with respect tothe mechanism of DNA cleavage. Structural studies demonstrate that this family possesses aconserved structural core composed of a five stranded β-sheet and two flanking α-helices,which harbors catalytic center of similar architecture. Moreover, the analysis of structures ofthis family shows that there may be substantial structural homologies of DNA recognitiondeterminants, even though homologies are undetectable at the primary sequence level. Thesimilarity appears to be related to the cleavage patterns of these enzymes.In this study, we focused on the structural and biochemical mechanisms by whichrestriction enzymes Ecl18kI and EcoRII specific for the ↓ CCNGG and ↓ CCWGG sequences,respectively, (‘ ↓ ’ shows the cleavage position, N stands for the any nucleotide, W – for theA/T) achieve their function. Mutational and structural studies studies revealed that Ecl18kIand EcoRII share similar active site architecture and CC:GG DNA recognition elementswith Bse634I/Cfr10I (R ↓ CCGGY) and NgoMIV (G ↓ CCGGC) restriction enzymes. Crystalstructure of Ecl18kI-DNA revealed that the enzyme flips both central nucleotides within theCCNGG sequence and buries the extruded bases in the pockets within the protein.Therefore, the Ecl18kI and NgoMIV enzymes can use a conserved DNA recognition moduleto recognize different sequences and form superimposable dimers, yet generate differentcleavage patterns. Using 2-aminopurine fluorescence assay we demonstrated that Ecl18kI,C-terminal domain of EcoRII (EcoRII-C) and PspGI ( ↓ CCWGG) flips out nucleotides fromtheir target site also in solution. Base fliping is a novel mechanism for restriction enzymes.While many known enzymes that modify DNA flip bases to perform chemistry on theextruded base, Ecl18kI, EcoRII-C and PspGI extrude nucleotides to achieve specificity andadjust the cleavage pattern. EcoRII is an archetypal Type IIE enzyme, which in contrast tothe orthodox Type IIP restriction endonucleases, shows no cleavage activity on DNAcontaining a single recognition site. To activate cleavage it requires binding of two copies ofthe CCWGG sequence, however only one cognate DNA copy is cleaved while the secondacts as an allosteric activator. Despite of the numerous publications, the EcoRII mechanismremained controversial and therefore required further experimental studies. Kinetic andbiochemical data obtained in this work allowed us to suggest an alternative model forEcoRII action. According to the proposed model EcoRII has to bind three rather than tworecognition sites to achieve concerted cleavage of both DNA strands at a single site. AFMstudies confirmed the proposed model demonstrating directly the three-site synaptosomewhich appeared in the images as a two-loop structure.58

LITERATŪROS SĄRAŠAS1. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. & Wende, W. (2005). Cell Mol Life Sci 62, 685-707.2. Bujnicki, J. M. & Rychlewski, L. (2001). J Mol Microbiol Biotechnol 3, 69-72.3. Sapranauskas, R., Sasnauskas, G., Lagunavicius, A., Vilkaitis, G., Lubys, A. & Siksnys, V.(2000). J Biol Chem 275, 30878-85.4. Bujnicki, J. M., Radlinska, M. & Rychlewski, L. (2001). Trends Biochem Sci 26, 9-11.5. Saravanan, M., Bujnicki, J. M., Cymerman, I. A., Rao, D. N. & Nagaraja, V. (2004). NucleicAcids Res 32, 6129-35.6. Kriukiene, E., Lubiene, J., Lagunavicius, A. & Lubys, A. (2005). Biochim Biophys Acta 1751,194-204.7. Ibryashkina, E. M., Zakharova, M. V., Baskunov, V. B., Bogdanova, E. S., Nagornykh, M.O., Den'mukhamedov, M. M., Melnik, B. S., Kolinski, A., Gront, D., Feder, M., Solonin, A. S.& Bujnicki, J. M. (2007). BMC Struct Biol 7, 48.8. Gasiunas, G., Sasnauskas, G., Tamulaitis, G., Urbanke, C., Razaniene, D. & Siksnys, V.(2007). Nucleic Acids Res.9. Miyazono, K., Watanabe, M., Kosinski, J., Ishikawa, K., Kamo, M., Sawasaki, T., Nagata, K.,Bujnicki, J. M., Endo, Y., Tanokura, M. & Kobayashi, I. (2007). Nucleic Acids Res 35, 1908-18.10. Orlowski, J. & Bujnicki, J. M. (2008). Nucleic Acids Res 36, 3552-69.11. Pingoud, A. & Jeltsch, A. (2001). Nucleic Acids Res 29, 3705-27.12. Den'mukhametov, M. M., Zakharova, M. V., Kravets, A. N., Pertsev, A. V., Sineva, E. V.,Repik, A. V., Beletskaia, I. V., Gromova, E. S. & Solonin, A. S. (1997). Mol. Biol. (Mosk) 31,831-8.13. Kruger, D. H., Barcak, G. J., Reuter, M. & Smith, H. O. (1988). Nucleic Acids Res. 16,3997-4008.14. Pein, C.-D., Reuter, M., Cech, D. & Kruger, D. H. (1989). FEBS Lett. 245, 141-144.15. Pein, C.-D., Reuter, M., Meisel, A., Cech, D. & Kruger, D. H. (1991). Nucleic Acids Res. 19,5139-5142.16. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T., Eds. (1989). 2nd ed edit. Cold Spring Harbor,NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.17. Barik, S. (1995). Mol Biotechnol 3, 1-7.18. Zheng, L., Baumann, U. & Reymond, J. L. (2004). Nucleic Acids Res. 32, e115.19. Zimbro, M. J. & Power, D. A., Eds. (2003): Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD.20. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L. & Clardy, J. (1993). JMol Biol 229, 105-24.21. Reuter, M., Kupper, D., Meisel, A., Schroeder, C. & Kruger, D. H. (1998). J Biol Chem 273,8294-300.22. Kupper, D., Reuter, M., Mackeldanz, P., Meisel, A., Alves, J., Schroeder, C. & Kruger, D.H. (1995). Protein Expr Purif 6, 1-9.23. Reuter, M., Schneider-Mergener, J., Kupper, D., Meisel, A., Mackeldanz, P., Kruger, D. H.& Schroeder, C. (1999). J Biol Chem 274, 5213-21.24. Mucke, M., Grelle, G., Behlke, J., Kraft, R., Kruger, D. H. & Reuter, M. (2002). Embo J 21,5262-8.25. Morgan, R., Xiao, J.-P. & Xu, S.-Y. (1998). Appl. Environ. Microbiol. 64, 3669-3673.26. Pingoud, V., Conzelmann, C., Kinzebach, S., Sudina, A., Metelev, V., Kubareva, E.,Bujnicki, J. M., Lurz, R., Luder, G., Xu, S. Y. & Pingoud, A. (2003). J. Mol. Biol. 329, 913-29.27. Kaus-Drobek, M., Czapinska, H., Sokolowska, M., Tamulaitis, G., Szczepanowski, R. H.,Urbanke, C., Siksnys, V. & Bochtler, M. (2007). Nucleic Acids Res. 35, 2035-2046.28. Corpet, F. (1988). Nucleic Acids Res 16, 10881-90.59

29. Siksnys, V., Skirgaila, R., Sasnauskas, G., Urbanke, C., Cherny, D., Grazulis, S. & Huber,R. (1999). J. Mol. Biol. 291, 1105-1118.30. Zaremba, M., Sasnauskas, G., Urbanke, C. & Siksnys, V. (2006). J Mol Biol 363, 800-12.31. Yoshioka, K. (2002). CompStat 17, 425-437.32. Shlyakhtenko, L. S., Gilmore, J., Portillo, A., Tamulaitis, G., Siksnys, V. & Lyubchenko, Y.L. (2007). Biochemistry 46, 11128-36.33. Bozic, D., Grazulis, S., Siksnys, V. & Huber, R. (1996). J. Mol. Biol. 255, 176-186.34. Deibert, M., Grazulis, S., Sasnauskas, G., Siksnys, V. & Huber, R. (2000). Nat. Struct. Biol.7, 792-9.35. Grazulis, S., Deibert, M., Rimseliene, R., Skirgaila, R., Sasnauskas, G., Lagunavicius, A.,Repin, V., Urbanke, C., Huber, R. & Siksnys, V. (2002). Nucleic Acids Research 30, 876-85.36. Tamulaitis, G., Solonin, A. S. & Siksnys, V. (2002). FEBS Lett. 518, 17-22.37. Skirgaila, R. & Siksnys, V. (1998). Biol. Chem. 379, 595-598.38. Pingoud, V., Kubareva, E., Stengel, G., Friedhoff, P., Bujnicki, J. M., Urbanke, C., Sudina,A. & Pingoud, A. (2002). J. Biol. Chem. 277, 14306-14.39. Bochtler, M., Szczepanowski, R. H., Tamulaitis, G., Grazulis, S., Czapinska, H., Manakova,E. & Siksnys, V. (2006). EMBO J. 25, 2219-29.40. Reuter, M., Mucke, M. & Kruger, D. H. (2004). In Restriction endonucleases (Pingoud, A.,ed.), pp. 261-295. Springer, Berlin Heidelberg New York.41. Mucke, M., Lurz, R., Mackeldanz, P., Behlke, J., Kruger, D. H. & Reuter, M. (2000). J BiolChem 275, 30631-7.42. Vipond, I. B., Baldwin, G. S. & Halford, S. E. (1995). Biochemistry 34, 697-704.43. Lagunavicius, A., Grazulis, S., Balciunaite, E., Vainius, D. & Siksnys, V. (1997).Biochemistry 36, 11093-9.44. Tamulaitis, G., Mucke, M. & Siksnys, V. (2006). FEBS Lett. 580, 1665-71.45. Zhou, X. E., Wang, Y., Reuter, M., Mucke, M., Kruger, D. H., Meehan, E. J. & Chen, L.(2004). J. Mol. Biol. 335, 307-19.46. Jeltsch, A., Kroger, M. & Pingoud, A. (1995). Gene 160, 7-16.47. Mucke, M., Kruger, D. H. & Reuter, M. (2003). Nucleic Acids Res 31, 6079-84.48. Newman, M., Lunnen, K., Wilson, G., Greci, J., Schildkraut, I. & Phillips, S. E. (1998).Embo J 17, 5466-76.49. Vanamee, E. S., Viadiu, H., Kucera, R., Dorner, L., Picone, S., Schildkraut, I. & Aggarwal,A. K. (2005). Embo J 24, 4198-208.50. Tamulaitis, G., Zaremba, M., Szczepanowski, R. H., Bochtler, M. & Siksnys, V. (2007).Nucleic Acids Res 35, 4792-9.51. Carpenter, M., Divvela, P., Pingoud, V., Bujnicki, J. & Bhagwat, A. S. (2006). NucleicAcids Res 34, 3762-70.52. Sowers, L. C., Fazakerley, G. V., Eritja, R., Kaplan, B. E. & Goodman, M. F. (1986). ProcNatl Acad Sci U S A 83, 5434-8.53. Ward, D. C., Reich, E. & Stryer, L. (1969). J. Biol. Chem. 244, 1228-37.54. Holz, B., Klimasauskas, S., Serva, S. & Weinhold, E. (1998). Nucleic Acids Res. 26, 1076-83.55. Allan, B. W. & Reich, N. O. (1996). Biochemistry 35, 14757-62.56. Stivers, J. T., Pankiewicz, K. W. & Watanabe, K. A. (1999). Biochemistry 38, 952-63.57. Malygin, E. G., Evdokimov, A. A., Zinoviev, V. V., Ovechkina, L. G., Lindstrom, W. M.,Reich, N. O., Schlagman, S. L. & Hattman, S. (2001). Nucleic Acids Res. 29, 2361-9.58. Reddy, Y. V. & Rao, D. N. (2000). J. Mol. Biol. 298, 597-610.59. Liebert, K., Hermann, A., Schlickenrieder, M. & Jeltsch, A. (2004). J. Mol. Biol. 341, 443-54.60. Walker, R. K., McCullough, A. K. & Lloyd, R. S. (2006). Biochemistry 45, 14192-200.61. Gowher, H. & Jeltsch, A. (2000). J. Mol. Biol. 303, 93-110.60

62. Szegedi, S. S., Reich, N. O. & Gumport, R. I. (2000). Nucleic Acids Res. 28, 3962-71.63. Lenz, T., Bonnist, E. Y., Pljevaljcic, G., Neely, R. K., Dryden, D. T., Scheidig, A. J., Jones,A. C. & Weinhold, E. (2007). J Am Chem Soc 129, 6240-8.64. Scavetta, R. D., Thomas, C. B., Walsh, M. A., Szegedi, S., Joachimiak, A., Gumport, R. I. &Churchill, M. E. (2000). Nucleic Acids Res. 28, 3950-61.65. Butkus, V., Klimasauskas, S., Kersulyte, D., Vaitkevicius, D., Lebionka, A. & Janulaitis, A.(1985). Nucleic Acids Res 13, 5727-46.66. Daujotyte, D., Liutkeviciute, Z., Tamulaitis, G. & Klimasauskas, S. (2008). Nucleic AcidsRes 36, e57.67. Klimasauskas, S., Kumar, S., Roberts, R. J. & Cheng, X. (1994). Cell 76, 357-69.68. Reinisch, K. M., Chen, L., Verdine, G. L. & Lipscomb, W. N. (1995). Cell 82, 143-53.69. Slupphaug, G., Mol, C. D., Kavli, B., Arvai, A. S., Krokan, H. E. & Tainer, J. A. (1996).Nature 384, 87-92.70. Barrett, T. E., Savva, R., Panayotou, G., Barlow, T., Brown, T., Jiricny, J. & Pearl, L. H.(1998). Cell 92, 117-29.71. Lau, A. Y., Scharer, O. D., Samson, L., Verdine, G. L. & Ellenberger, T. (1998). Cell 95,249-58.72. Hollis, T., Ichikawa, Y. & Ellenberger, T. (2000). EMBO J. 19, 758-66.73. Lariviere, L. & Morera, S. (2002). J. Mol. Biol. 324, 483-90.74. Lariviere, L., Sommer, N. & Morera, S. (2005). J. Mol. Biol. 352, 139-50.75. Hosfield, D. J., Guan, Y., Haas, B. J., Cunningham, R. P. & Tainer, J. A. (1999). Cell 98,397-408.76. Vassylyev, D. G., Kashiwagi, T., Mikami, Y., Ariyoshi, M., Iwai, S., Ohtsuka, E. &Morikawa, K. (1995). Cell 83, 773-82.77. Mol, C. D., Izumi, T., Mitra, S. & Tainer, J. A. (2000). Nature 403, 451-6.78. Bruner, S. D., Norman, D. P. & Verdine, G. L. (2000). Nature 403, 859-66.79. Fromme, J. C., Banerjee, A., Huang, S. J. & Verdine, G. L. (2004). Nature 427, 652-6.80. Fromme, J. C. & Verdine, G. L. (2003). EMBO J. 22, 3461-71.81. Goedecke, K., Pignot, M., Goody, R. S., Scheidig, A. J. & Weinhold, E. (2001). Nat. Struct.Biol. 8, 121-5.82. Horton, J. R., Liebert, K., Bekes, M., Jeltsch, A. & Cheng, X. (2006). J. Mol. Biol. 358, 559-70.83. Horton, J. R., Liebert, K., Hattman, S., Jeltsch, A. & Cheng, X. (2005). Cell 121, 349-61.84. Pingoud, V., Sudina, A., Geyer, H., Bujnicki, J. M., Lurz, R., Luder, G., Morgan, R.,Kubareva, E. & Pingoud, A. (2005). J Biol Chem 280, 4289-98.85. Roberts, R. J., Belfort, M., Bestor, T., Bhagwat, A. S., Bickle, T. A., Bitinaite, J.,Blumenthal, R. M., Degtyarev, S., Dryden, D. T., Dybvig, K., Firman, K., Gromova, E. S.,Gumport, R. I., Halford, S. E., Hattman, S., Heitman, J., Hornby, D. P., Janulaitis, A., Jeltsch,A., Josephsen, J., Kiss, A., Klaenhammer, T. R., Kobayashi, I., Kong, H., Kruger, D. H., Lacks,S., Marinus, M. G., Miyahara, M., Morgan, R. D., Murray, N. E., Nagaraja, V., Piekarowicz, A.,Pingoud, A., Raleigh, E., Rao, D. N., Reich, N., Repin, V. E., Selker, E. U., Shaw, P. C., Stein,D. C., Stoddard, B. L., Szybalski, W., Trautner, T. A., Van Etten, J. L., Vitor, J. M., Wilson, G.G. & Xu, S. Y. (2003). Nucleic Acids Res 31, 1805-12.86. Kosykh, V. G., Puntezhis, S. A., Bur'ianov Ia, I. & Baev, A. A. (1982). Biokhimiia 47, 619-25.87. Kirsanova, O. V., Baskunov, V. B. & Gromova, E. S. (2004). Mol Biol (Mosk) 38, 886-900.88. Huai, Q., Colandene, J. D., Topal, M. D. & Ke, H. (2001). Nat Struct Biol 8, 665-9.89. Welsh, A. J., Halford, S. E. & Scott, D. J. (2004). In Restriction endonucleases (Pingoud,A., ed.), pp. 297-318. Springer, Berlin Heidelberg New York.90. Lubys, A., Jurenaite, S. & Janulaitis, A. (1999). Nucleic Acids Res 27, 4228-34.91. Tamulaitis, G., Sasnauskas, G., Mucke, M. & Siksnys, V. (2006). J Mol Biol 358, 406-19.61

92. Wood, K. M., Daniels, L. E. & Halford, S. E. (2005). J Mol Biol 350, 240-53.93. Hingorani-Varma, K. & Bitinaite, J. (2003). J Biol Chem 278, 40392-9.94. Zaremba, M., Sasnauskas, G., Urbanke, C. & Siksnys, V. (2005). J Mol Biol 348, 459-78.95. Embleton, M. L., Siksnys, V. & Halford, S. E. (2001). J Mol Biol 311, 503-14.96. Bilcock, D. T., Daniels, L. E., Bath, A. J. & Halford, S. E. (1999). J. Biol. Chem. 274,36379-36386.97. Stanford, N. P., Szczelkun, M. D., Marko, J. F. & Halford, S. E. (2000). Embo J 19, 6546-57.98. Gormley, N. A., Bath, A. J. & Halford, S. E. (2000). J Biol Chem 275, 6928-36.99. Watson, M. A., Gowers, D. M. & Halford, S. E. (2000). J Mol Biol 298, 461-75.100. Oller, A. R., Vanden Broek, W., Conrad, M. & Topal, M. D. (1991). Biochemistry 30,2543-9.101. Conrad, M. & Topal, M. D. (1992). Nucleic Acids Res 20, 5127-30.102. Conrad, M. & Topal, M. D. (1989). Proc Natl Acad Sci U S A 86, 9707-11.103. Huai, Q., Colandene, J. D., Chen, Y., Luo, F., Zhao, Y., Topal, M. D. & Ke, H. (2000).Embo J 19, 3110-8.104. Bath, A. J., Milsom, S. E., Gormley, N. A. & Halford, S. E. (2002). J Biol Chem 277,4024-33.105. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K. & Schildkraut, I. (1998). Proc Natl Acad Sci U SA 95, 10570-5.106. Wah, D. A., Bitinaite, J., Schildkraut, I. & Aggarwal, A. K. (1998). Proc Natl Acad Sci U SA 95, 10564-9.107. Kaczorowski, T., Skowron, P. & Podhajska, A. J. (1989). Gene 80, 209-16.108. Wah, D. A., Hirsch, J. A., Dorner, L. F., Schildkraut, I. & Aggarwal, A. K. (1997). Nature388, 97-100.109. Vanamee, E. S., Santagata, S. & Aggarwal, A. K. (2001). J Mol Biol 309, 69-78.110. Grazulis, S., Manakova, E., Roessle, M., Bochtler, M., Tamulaitiene, G., Huber, R. &Siksnys, V. (2005). Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15797-802.111. Sasnauskas, G., Halford, S. E. & Siksnys, V. (2003). Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6410-5.112. Reuter, M., Kupper, D., Pein, C. D., Petrusyte, M., Siksnys, V., Frey, B. & Kruger, D. H.(1993). Anal Biochem 209, 232-7.113. Halford, S. E. (2001). Biochem Soc Trans 29, 363-74.114. Halford, S. E., Welsh, A. J. & Szczelkun, M. D. (2004). Annu Rev Biophys Biomol Struct33, 1-24.115. Gowers, D. M., Bellamy, S. R. & Halford, S. E. (2004). Nucleic Acids Res 32, 3469-79.116. Alting-Mees, M. A. & Short, J. M. (1989). Nucleic Acids Res 17, 9494.117. Lyubchenko, Y. L. (2004). Cell Biochem Biophys 41, 75-98.118. Livshits, M. A., Amosova, O. A. & Lyubchenko Yu, L. (1990). J Biomol Struct Dyn 7,1237-49.119. Embleton, M. L., Vologodskii, A. V. & Halford, S. E. (2004). J Mol Biol 339, 53-66.120. Zhang, Y., McEwen, A. E., Crothers, D. M. & Levene, S. D. (2006). Biophys J 90, 1903-12.121. Du, Q., Smith, C., Shiffeldrim, N., Vologodskaia, M. & Vologodskii, A. (2005). Proc NatlAcad Sci U S A 102, 5397-402.122. Mucke, M., Pingoud, V., Grelle, G., Kraft, R., Kruger, D. H. & Reuter, M. (2002). J BiolChem 277, 14288-93.123. Crampton, N., Yokokawa, M., Dryden, D. T., Edwardson, J. M., Rao, D. N., Takeyasu, K.,Yoshimura, S. H. & Henderson, R. M. (2007). Proc Natl Acad Sci U S A 104, 12755-60.62