VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

2-AP fluorescencijos intensyvumo pokyčiai Ecl18kI-DNR komplekse nebūtinairodo nukleotido išsukimą iš dvigrandininės DNR, o gali būti susiję su baltymoindukuota drastiška DNR deformacija. Tačiau, kadangi 2-AP fluorescencijosišaugimas W61 mutanto-DNR-Ca 2+ komplekse yra daug kartų didesnis negu wt-DNR-Ca 2+ komplekse (lyginant su laisvo oligoduplekso T/2 fluorescencija),galima manyti, kad būtent dėl išsukimo iš DNR fluoroforas patenka į indoložiedo kaimynystę baltymo kišenėje ir jo fluorescencija yra efektyviai gesinama.7 lentelė. Ecl18kI mutantinių fermentų W61Y ir W61A DNR hidrolizės greičiųkonstantosFermentask 1 , s -1 *oligodupleksas T/A oligodupleksas T/2 oligodupleksas 2FSEcl18kI wt 0.22±0.05 0.33±0.04 0.29±0.05Ecl18kI W61Y 4.5±0.03×10 -4 2.7±0.1×10 -4 2.0±0.4×10 -4Ecl18kI W61A 0 0 0* Dėl aiškumo pateikiama tik vienos iš DNR grandinių hidrolizės greičio konstantos. Tiek wt,tiek mutantiniai fermentai abi DNR grandines hidrolizavo tuo pačiu greičiu.13 paveikslas. 2-AP fluorescencijosintensyvumo pokyčiai EcoRII-C ir PspGI50kompleksuose su DNR . Diagramailiustruoja fluorescencijos intensyvumo vertes2-AP emisijos koreguotų spektrų maksimumotaške (360 nm EcoRII-C ir PspGI, 370 nmMvaI ir oligodupleksams). Eksperimente buvonaudota 1250 nM baltymo ir 250 nM T/2 arba2FS oligoduplekso, bei 10 mM Ca-acetato (žr.„Tyrimų metodiką“).Fermento katalitinioaktyvumo praradimas irgiminingumo DNR sumažėjimas 10kartų pakeitus W61 alaninu liudijaapie išsuktos bazės ir W61 indoložiedo sąveikos svarbą fermentofunkcijai.2.5. EcoRII-C ir PspGIfluorescencinė analizėNorėdami atsakyti į klausimą,ar ir EcoRII-C bei PspGIrestrikcijos fermentai naudojanukleotidų išsukimo mechanizmą,sąveikaudami su atpažinimo sekaCCWGG, mes išanalizavome 2-APfluorescencijos intensyvumopokyčius, susidarant šių fermentųkompleksams su DNR. EcoRII-Cbaltymas buvo gautas dalinėsproteolizės metodu ir išgrynintaschromatografiniais metodais (žr. „Tyrimų metodiką“).2-AP fluorescencijos eksperimentai parodė, kad EcoRII-C-T/2 kompleksefluorescencijos intensyvumas išauga ~12 kartų, o PspGI-T/2 komplekse 64 kartuslyginant su laisvo oligoduplekso T/2 fluorescencija (13 pav. ir 8 lentelė). Taigi,26