VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

2.3. EcoRII reakcijos in transpEcoRII-2 ir pEcoRII-3 plazmidžių hidrolizės eksperimentai rodo, kadDNR hidrolizei restrikcijos fermentu EcoRII reikalingi mažiausiai du EcoRIItaikiniai vienoje DNR molekulėje (in cis). C.D. Pein ir kt. 14,15 parodė, kadnehidrolizuojamų DNR substratų, kuriuose EcoRII taikiniai yra toli vienas nuokito, karpymą galima stimuliuoti pridedant į reakciją specifinio oligoduplekso,turinčio EcoRII taikinį. Mes atlikome analogiškus eksperimentus, registruodamipEcoRII-1,-2,-3 hidrolizės reakcijos eigą, esant specifiniam oligodupleksui.Tokios reakcijos metu galėtų susidaryti įvairūs fermento-DNR kompleksai:fermento ir plazmidinės DNR, mišrus fermento-oligoduplekso-plazmidinės DNR,bei fermento-oligoduplekso. Šių formų kiekis greičiausiai priklausys nuoreakcijoje esančios baltymo koncentracijos, oligoduplekso:plazmidinės DNRsantykio ir fermento-plazmidinės DNR, bei fermento-oligoduplekso susirišimokonstantų. Todėl specifinio oligoduplekso įtaka EcoRII katalizuojamai hidrolizėsreakcijai buvo tiriama įvairiomis reakcijos sąlygomis.pEcoRII-1 hidrolizė EcoRII esant specifiniam oligodupleksuipEcoRII-1 plazmidinės DNR hidrolizės reakcija EcoRII [E]>[S] sąlygomis(1.5 nM pEcoRII-1 ir 100 nM fermento) yra labai lėta ir jos vienintelis produktas –VT DNR (19D pav.). Pridėjus į reakciją 3000 nM specifinio 33 bp oligoduplekso(2 lentelė) reakcija žymiai pagreitėja ir jos pagrindiniu ir vieninteliu produktutampa L1 DNR (19G pav.).pEcoRII-2 hidrolizė EcoRII esant specifiniam oligodupleksuipEcoRII-2 plazmidinės DNR hidrolizės EcoRII reakcijos esant optimaliaifermento koncentracijai (1.5 nM DNR ir 2.0 nM fermento) pirmas tarpinisproduktas yra VT DNR, kuris vėliau paverčiamas L1 (19B pav.). Į reakcijos mišinįįdėjus 60 nM specifinio oligoduplekso, reakcijos eiga pasikeičia (19H pav.). Ir ištiesų, esant SP33, SS pEcoRII-2 DNR lygiagrečiai paverčiama praktiškaiekvimoliariniu kiekiu į VT ir L1 DNR formas, kurios vėliau virsta į L2(19H pav.).pEcoRII-3 hidrolizė EcoRII esant specifiniam oligodupleksuipEcoRII-3 DNR hidrolizės EcoRII reakcijos eiga esant specifiniamoligodupleksui beveik identiška kaip ir nesant SP33 (19I pav.). Abiem atvejais SSDNR pirmiausiai paverčiama į L1 DNR, praktiškai nesusidarant VT formai. Tiesa,L1 formos susidarymo greitis kiek didesnis esant SP33, nes specifinisoligodupleksas in trans stimuliuoja pEcoRII-2 karpymą (19H pav.).2.4. Plazmidinės DNR hidrolizė EcoRII esant [E]