VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

oligoduplekso fluorescencijos (11B,C pav.). Fluorescencijos išaugimą Ecl18kI-T/2komplekse lyginant su laisvo T/2 fluorescencija galima būtų paaiškinti 2-APaplinkos pasikeitimu, atsiradusiu dėl 2-AP išsukimo iš dvigrandininės DNRspiralės, kaip anksčiau buvo parodyta kitiems fermentams 54-62 .11 paveikslas. 2-AP fluorescencijos intensyvumo pokyčiai Ecl18kI-DNR50kompleksuose . 250 nM T/2 oligodupleksas titruotas wt Ecl18kI, reakcijos buferyje2+esant (A) arba nesant (D) Ca . Pateikiami koreguoti 2-AP, esančio komplekse su wt2+Ecl18kI, emisijos spektrai reakcijos mišinyje esant (B) arba nesant (E) Ca jonams.Diagramos (C) ir (F) iliustruoja fluorescencijos intensyvumo vertes 2-AP emisijoskoreguotų spektrų maksimumo taške. (B), (E) bei (C), (F) atvejais buvo naudota1250 nM wt Ecl18kI ir 250 nM T/2 arba 2FS oligoduplekso (žr. 2 lentelę ir „Tyrimųmetodiką“).2.3. Ecl18kI-DNR komplekso fluorescencijos analizė nesant Ca 2+Ecl18kI sąveikos su DNR eksperimentai parodė, kad Ecl18kI giminingumasDNR sumažėja tirpale nesant Ca 2+ jonų (6 lentelė). Atlikus 2-AP turinčiooligoduplekso titravimo Ecl18kI baltymu eksperimentus paaiškėjo, kad esantdidesnėms baltymo ir DNR koncentracijoms Ecl18kI sudaro binarinį Ecl18kIspecifinėsDNR kompleksą (K d = 52 ± 12 nM) (11D pav.). Reakcijos tirpalenesant Ca 2+ ir esant sotinančioms baltymo koncentracijoms Ecl18kI-T/2komplekse, 2-AP fluorescencija išauga 28 kartus lyginant su laisvo oligodupleksoT/2 fluorescencija (11E, F pav.). Tuo tarpu Ecl18kI-2FS 2-AP fluorescencijamažai pasikeičia lyginant su laisvo oligoduplekso 2FS fluorescencija. Taigi, 2-APsignalo išaugimas buferyje be Ca 2+ jonų yra ~4 kartus stipresnis nei buferyje suCa 2+ jonais.24