VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

Masių spektrometrija. Wt ir SeMet Ecl18kI molekulines mases nustatė V. Lukša (SicorBiotech UAB, Vilnius) ir G. Lukinavičius (Biotechnologijos institutas, Vilnius) naudojantHewlett-Packard 1100 spektrometrą.Baltymų sekų analizė. Teoriniai fizikiniai baltymų parametrai nustatyti panaudojantProtParam tool (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Ecl18kI, EcoRII, EcoRII-C irPspGI baltymų koncentracijos išreikštos dimerais, EcoRII-N ir MvaI − monomerais. Sekųpalyginimas atliktas naudojant FASTA ir Multalin 28 (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) programas.Cirkuliarinio dichroizmo spektroskopija. CD spektrai užrašyti panaudojant „Jasco“ J-710CD spektrometrą: Ecl18kI mutantai buferyje 30 mM Tris-HCl (pH 7.0 at 25°C), 150 mMNaCl, EcoRII mutantai − 10 mM Tris−HCl (pH 7.5 at 25°C), 200 mM KCl, 10% glicerolis,0.01% triton X-100.Analitinis ultracentrifugavimas. Ecl18kI baltymų molekulinės masės tirpale buvonustatytos analitinio ultracentrifugavimo pagalba esant pusiausvyrinėms sedimentacijossąlygoms. Eksperimentą atliko C. Urbanke (Hanover Medicinische Hochschule, Vokietija)su „Beckman-Coulter“ Model XL-A analitine ultracentrifuga, molinės masės buvosuskaičiuotos kaip aprašyta 29 .Dalinė proteolizė. EcoRII-C ir EcoRII-C mutantai gauti proteolizuojant termolizinu0.5 mg/ml (5.4 µM) EcoRII Proteolizės buferyje (su 20–45% glicerolio, 0.015–0.1%triton X-100 ir 2 mM Ca-acetato) esant 25 °C temperatūrai. Proteolizės mišinyje naudotasbaltymo ir termolizino santykis 10:1 (pagal masę) (K328A, D329A, R330A mutantams −2.5:1). Proteolizė buvo stabdoma pridedant EDTA iki galutinės 9 mM koncentracijos irinkubuojant mėginius 3 min 40 °C. Proteolitiniai baltymų fragmentai buvo frakcionuojamielektroforezės pagalba. Po proteolizės EcoRII buvo pilnai sukarpytas ir EcoRII-C reakcijosmišinyje sudarė >90%, tad DNR susirišimo ir gelfiltracijos eksperimentams proteolizėsmišinys naudotas be papildomo gryninimo. EcoRII-C išeiga įvertinta densitometrinėsanalizės būdus standartu naudojant wt EcoRII, nuskanavus kumasi mėliu nudažytus gelius(kaip aprašyta aukščiau). Proteolitinio EcoRII-C N-galo a.r. seka nustatyta ZMMK-Servicelabor (University of Cologne, Vokietija).Baltymo ir DNR sąveikos tyrimas. Šiuose eksperimentuose buvo naudoti 33 P izotopupažymėti oligodupleksai (2 lentelė). Įvairūs baltymų kiekiai buvo inkubuojami 10 min KTsu DNR oligodupleksais (0.1-1 nM) susirišimo buferyje turinčiame 0.1 mM EDTA arba 5-10 mM Ca-acetato. 6 histidinų inkarą turinčio wt, aktyvaus centro ir C:G atpažinimoEcl18kI mutantai su DNR oligodupleksais buvo inkubuoti Susirišimo buferyje I; wt EcoRII,EcoRII-N, EcoRII-C (išgrynintas), PspGI, MvaI, bei wt, W61Y ir W61A Ecl18kI inkubuotiSusirišimo buferyje II. EcoRII-C ir EcoRII-C mutantų DNR surišimo eksperimentuoseįvairūs baltymo kiekiai iš proteolizės mišinio (sustabdyto pridedant EDTA, bet nekaitinant40 °C) inkubuoti su DNR Proteolizės buferyje su 10% glicerolio ir 0.1 mg/ml JSA (esant irnesant 10 mM Ca-acetato). Laisva DNR ir baltymo-DNR kompleksai buvo frakcionuojamipoliakrilamidiniame gelyje esant nedenatūruojančioms sąlygoms, radioaktyvi DNRidentifikuota ir DNR fragmentų kiekiai nustatyti kaip aprašyta aukščiau. K d vertė įvertintaspecifiniam oligodupleksui DNR susirišimo duomenis aprašant lygtimi:y = {s 0 - x - K d + [(s 0 + x +K d ) 2 - 4s 0 x] 0.5 }/2kur y yra nesurištos į kompleksą DNR dalis (išreikšta nM), x yra bendra baltymokoncentracija reakcijos mišinyje, s 0 yra bendra DNR koncentracija reakcijos mišinyje ir K d −baltymo-DNR komplekso disociacijos konstanta.Fermento DNR hidrolizės aktyvumo nustatymas. Wt, aktyvaus centro ir C:G atpažinimoEcl18kI mutantų aktyvumas nustatytas inkubuojant 75 nM Ecl18kI su 2.5 nM8