VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

Taigi, biocheminiai ir struktūriniai duomenys rodo, kad E125, D160, K182ir E195 a.r. sudaro Ecl18kI aktyvų centrą. Ecl18kI aktyvus centras panašus įNgoMIV aktyvų centrą, kaip ir buvo nuspėta 36 .Ecl18kI ir NgoMIV struktūrinis palyginimas atskleidė, kad NgoMIV irEcl18kI spėjamos taikinio C:G atpažinimo determinantės struktūriškai sutampa 39(4 pav.). Ecl18kI R186, E187 ir R188 sudaro kontaktus su atpažįstamomisbazėmis didžiajame griovyje. Iš mažojo griovio pusės kito subvieneto Q114sudaro specifinius kontaktus su taikinio guaninais.Tad, Ecl18kI R186, E187 ir R188 a.r. sutampa su NgoMIV R191, D193 irR194 a.r., kurios vienareikšmiai atpažįsta NgoMIV taikinio GCCGGC pusėssekos vidinius C:G nukleotidus, kaip ir buvo nuspėta 36 .3. EcoRII spėjamo aktyvaus centro ir taikinio C:G bp atpažinimodeterminančių mutacinė analizėM. Reuter grupė bandė identifikuoti REazės EcoRII aktyvaus centrąieškodama baltymo sekoje kanoninio PD-(D/E)XK motyvo 23,40,41 . Mutacinėanalizė parodė, kad E96 ir E271 a.r. yra svarbios fermento aktyvumui. Tačiauvienareikšmiškai EcoRII aktyvus centro lokalizacija nebuvo įrodyta. Mes iškėlėmealternatyvią hipotezę, kad EcoRII C-gale esančio sekos motyvo271 EX 27 PDX 24 KX 12 E 337 a.r. sudaro fermento katalitinį-metalo surišimo centrą, oK328, D329 ir R330 a.r. atsakingos už taikinio C:G nukleotidų atpažinimą 36 (žr.I. skyrių). Siekiant patikrinti EcoRII spėjamų aktyvaus centro (E271, D299, K324ir E337) ir taikinio C:G atpažįstančių a.r. (K328, D329 ir R330) svarbą fermentųfunkcijai, mes sukonstravome šių a.r. mutantus, juos išgryninome ir ištyrėme jųsavybes (žr. „Tyrimų metodiką“).Fago λ dam – dcm – DNR hidrolizės eksperimentai parodė, kad E271A,D299A, K324A ir E337A mutantai yra absoliučiai neaktyvūs arba jų katalitinisaktyvumas nukritęs >10 5 kartų (5 lentelė). Tai patvirtina šių a.r. svarbą EcoRIIkatalizėje. Be abejo, toks pat mutantinių baltymų fenotipas tikėtinas, jei a.r.svarbios fermento-DNR sąveikai. Norėdami patikrinti, ar baltymo C-galinėjedalyje spėjamo aktyvaus centro a.r. pakeitimas alaninais įtakoja fermentogiminingumą DNR, mes ištyrėme šių mutantinių baltymų sąveiką su DNR.Ankstesni EcoRII dalinės proteolizės eksperimentai atskleidė, kad EcoRIIbaltymas yra sudarytas iš dviejų domenų, pasižyminčių skirtingomisfunkcijomis 24 . N-galinis EcoRII domenas (EcoRII-N) riša CCWGG DNR seką,bet jos nekerpa, tuo tarpu EcoRII C-galinis domenas (EcoRII-C) veikia kaip IIPtipo REazė, kuri atpažįsta ir kerpa CCWGG seką turinčią DNR 24 . Norėdamiišvengti N-galinio domeno įtakos, mes wt EcoRII ir mutantinius baltymusproteolizavome termolizinu, kuris degradavo N-galinį domeną, taip gavome C-galinį domeną (EcoRII-C, E271A-C, D299A-C, K324A-C ir E337A-C) (žr.„Tyrimų metodiką“).Kadangi M. Mucke ir kt. 24 nepavyko pademonstruoti EcoRII-C specifiniosusirišimo su DNR, mes nusprendėme surasti sąlygas, kuriose C-galinis domenasspecifiškai sąveikauja su DNR. Daugelio REazių susirišimui būtini Ca 2+16