VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

produktu optimaliomis sąlygomis reakcijos mišinyje esant specifiniamoligodupleksui (19H pav.).Panašiai, kaip ir pEcoRII-2 atveju, plazmidė pEcoRII-3 yra gerai karpomaEcoRII (19C pav. ir 20C pav.). Stacionariomis reakcijos sąlygomis reakcijosgreičiai nustatyti pagal SS DNR formos mažėjimą laike yra panašūs pEcoRII-2 ir -3 atvejais (k cat(2-taikiniai) = 0.3±0.1 min –1 , k cat(3-taikiniai) = 0.6±0.1 min –1 ). Taip patpalyginami yra pEcoRII-2 ir -3 hidrolizės reakcijos greičiai ir esant lygiaisubstrato ir fermento koncentracijai (k obs(2-taikiniai) = 1.3±0.1 min –1 , k obs(3-taikiniai) =3.2±0.1 min –1 ). Įdomu, kad panašiai kaip ir EcoRII-2 atveju pEcoRII-3 plazmidėshidrolizė sulėtėja esant fermento pertekliui reakcijos mišinyje (19F pav.).Pagrindinis skirtumas tarp pEcoRII-2 ir -3 plazmidžių hidrolizės eigos yra tai, kadpEcoRII-3 atveju pirmasis tarpinis produktas yra L1 DNR forma su vienudvigrandininiu trūkiu, tuo tarpu pEcoRII-2 atveju dominuoja VT DNR produktoforma turinti viengrandininį trūkį(ių). Be to, L1 DNR forma yra vienintelisreakcijos produktas, besikaupiantis reakcijos eigoje stacionariomis sąlygomis(19C pav.), o tai reiškia, kad EcoRII vieno katalitinio akto metu sugebahidrolizuoti abi taikinio grandines prieš atsipalaiduodama nuo DNR. Iš tiesų, esantlygioms fermento ir pEcoRII-3 plazmidės koncentracijoms didžioji SS DNR dalisyra tiesiai paverčiama į L1 produktą, o tai rodo, kad EcoRII taikinio abi grandinesperkerpa sutartinai (19C pav.).EcoRII hidrolizės stimuliacija antru taikiniu puikiai dera su anksčiaupublikuotais EcoRII hidrolizės rezultatais 14,15 . Pagal šiai dienai pripažintą dviejųtaikinių surišimo modelį (17A pav.) 40,47,87 , specifinės DNR taikinio surišimasN-domenais stimuliuoja antro DNR taikinio susirišimą ir hidrolizę C-galiniodimero katalitiniame centre. Žinoma, šis modelis niekaip negali paaiškinti, kodėlsusidaro skirtingi tarpiniai produktai pEcoRII-2 ir -3 plazmidžių hidrolizės atvejais(19 pav. ir 20C pav.).Šias skirtingas reakcijos eigas galima paaiškinti trijų taikinių surišimomodeliu (17A pav.). X.E. Zhou ir kt. 45 pasiūlė, kad fermento EcoRII aktyvumasyra reguliuojamas autoinhibicijos mechanizmu. Nustačius apo-EcoRII tretinęstruktūrą paaiškėjo, kad du N-galiniai efektoriniai domenai erdviškai blokuojaDNR patekimą į katalitinį/DNR surišimo centrą, esantį C-galinių domenųdimerizacijos paviršiuje (autoinhibicija). Autoriai pasiūlė, kad esant tirpalespecifinei DNR, visų pirma taikinį suriša EcoRII N-galiniai efektoriniai domenai.Tai iššaukia baltymo konformacinius persitvarkymus: N-galiniai domenaipasislenka nuo C-aktyvaus centro, o C-galiniai domenai suartėja suformuodamiaktyvų dimerą, sugebantį surišti dar vieną DNR taikinio kopiją (įvykstaaktyvacija). Pagal trijų taikinių surišimo modelį, ir vienos DNR kopijos surišimasN-domene indukuoja baltymo konformacinius pasikeitimus, pakankamus įvyktikatalizei C-domene. Tačiau, tiktai abiems N-galiniams domenams surišus povieną DNR kopiją, galima sutartina abiejų DNR grandinių hidrolizė trečiametaikinyje, esančiame C-galinio dimero aktyviame centre 91 .pEcoRII-1 plazmidės atveju, vienas N-galinis domenas susiriša suvieninteliu taikiniu esančiu plazmidėje ir greičiausiai aktyvuoja EcoRII-C.40