VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

sutartiniam taikinio abiejų grandinių kirpimui EcoRII-C aktyviame centre yrabūtina sąlyga sutartinas abiejų N-domenų surišimas po DNR taikinį.Priešingai negu pEcoRII-2 plazmidės atveju, pEcoRII-3 substrate EcoRIIdimeras turi galimybę vienu metu surišti visus tris DNR taikinius (22 pav.).EcoRII-C katalitinis dimeras pEcoRII-3 plazmidėje viename iš taikinių kerpasutartinai abi grandines (19C pav.) ir tada disocijuoja į tirpalą susidarant produktuiL1 (20C pav.). Kitoje stadijoje, L1 substrate, kuris turi du EcoRII taikinius,EcoRII perkerpa vieną iš taikinių susidarant L2 DNR produktui (20C pav.).Trijų taikinių EcoRII-DNR surišimo modelis taip pat leidžia paaiškinti,kodėl pasikeičia reakcijos produktai naudojant aukštesnes fermentokoncentracijas. Iš tiesų, esant fermento pertekliui, papildomos EcoRII dimeromolekulės gali sąveikauti vienu metu su pEcoRII-2 ar -3 substratu per N-galinįdomeną, apsunkindamos EcoRII-C domeno DNR surišimą ir kirpimą (22 pav.).Tai lemia sumažėjusį reakcijos greitį ir išaugusį reakcijos eigoje susidarančio VTDNR produkto kiekį (19E, F pav.).Reakcijos produktų santykio ir reakcijos greičio pasikeitimus esant tirpalespecifiniam oligodupleksui taip pat galima paaiškinti trijų taikinių surišimomodeliu. Papildomai įdėjus į reakcijos mišinį specifinio oligoduplekso, atsirandagalimybė susidaryti katalitiškai produktyviems EcoRII kompleksams, nes vienasar abu N-galiniai domenai gali in trans surišti taikinį, esantį oligoduplekse. Taip intrans aktyvuotoje molekulėje EcoRII-C domenas gali efektyviai perkirptipEcoRII-1 substratą (19G pav.). pEcoRII-2 plazmidės atveju, stimuliacija in transpadidina L1 produkto išeigą (19B,H pav.). Šiuos reakcijos greičio ir eigospasikeitimus galima paaiškinti analogišku pEcoRII-3 atveju tirpale egzistuojančiųkatalitiškai aktyvių EcoRII molekulių, surišusių po tris DNR taikinius, išaugimu.Kita vertus, specifinio oligoduplekso pridėjimas turi mažą įtaką reakcijos eigai supEcoRII-3 substratu (19C, I pav.), nes in cis susidarantis sinaptinis kompleksasyra labiau stabilus nei in trans 99 .EcoRII-C domenas ir PspGI pEcoRII-1, -2 ir -3 plazmides hidrolizuojavienodu greičiu. Šis eksperimentas dar kartą patvirtina anksčiau publikuotusduomenis, kad EcoRII-C domenas egzistuoja kaip IIP tipo REazė, ir josoptimaliam aktyvumui nereikalinga sąveika vienu metu su keletu taikinių 24 .2.8. EcoRII ir NaeI: du IIE tipo restrikcijos fermentai, du skirtingi reakcijosmechanizmaiREazė NaeI yra kitas gerai ištyrinėtas IIE tipo restrikcijos fermentas, kuriooptimaliam aktyvumui reikalinga sąveika su dviem DNR taikiniais 100-102 . Jiatpažįsta ir kerpa CCC ↓ GGG DNR seką. M.L. Embleton ir kt. 95 atliko plazmidžių,turinčių vieną ir du NaeI taikinius, kinetinius tyrimus fermento daugelio apsukųsąlygomis. Norėdami akivaizdžiau palyginti reakcijos eigas NaeI ir EcoRIIfermentams, mes pateikėme publikuotus NaeI kinetinius duomenis 9520D, E paveiksle. Daugelio apsukų sąlygomis NaeI plazmidę su vienu taikiniuhidrolizuoja labai lėtai (20D pav.). Plazmidės su dviem NaeI taikiniais atvejufermentas kerpa abi vieno iš taikinių DNR grandines susidarant L1 produktui42