VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

suformuojantys du identiškus aktyvius centrus, kurie koordinuotai vienu metusugeba perkirpti du DNR dvigrandininius taikinius 33-35 .III. Kaip Ecl18kI, EcoRII-C ir PspGI atpažįsta DNR taikinius?Gauti duomenys rodo, kad Ecl18kI ir EcoRII fermentai naudoja panašųstruktūrinį mechanizmą taikinio C:G bazių poros atpažinimui kaip ir Bse634I,Cfr10I bei NgoMIV. Iš principo, Ecl18kI atpažinimo seka CCNGG ir EcoRIIatpažinimo seka CCWGG gali būti laikomos Bse634I/Cfr10I ir NgoMIVatpažinimo sekų RCCGGY/GCCGGC „pertrauktais“ variantais, kuriuose tarpdviejų CC:GG „blokų“ įterptas N arba W. Kyla klausimas, kaip Ecl18kI ir EcoRII,naudodami tokį patį aktyvų centrą ir C:G atpažinimo mechanizmą, „sutalpina“ Narba W nukleotidus, esančius atpažinimo sekos viduryje?BglI (GCCNNNN ↓ NGGC) ir SfiI (GGCCNNNN ↓ NGGCC) restrikcijosfermentų monomerai struktūriškai yra labai panašūs į EcoRV (GAT ↓ ATC)monomerą, tačiau šie restrikcijos fermentai skirtingai dimerizuojasi ir sudaroskirtingus kirpimo produktus 48,49 . Tad būtų galima spėti, kad Ecl18kI ir EcoRIIbaltymų dimerų sąveikos paviršiai yra organizuoti skirtingai nuo Bse634I, Cfr10Iir NgoMIV baltymų; tačiau katalizei ir atpažinimui visuose šiuose baltymuose yranaudojami tokie patys struktūriniai elementai.7 paveikslas. Konservatyvi Ecl18kI irNgoMIV dimerų organizacija 39 . Ecl18kI(auksinė) ir NgoMIV (žalia) dimerųsugretinimas. Didesni rutuliukai žymi a.r.,dalyvaujančių katalizėje, Cα-atomus.Mažesni rutuliukai žymi Cα-atomus a.r.,sudarančių vandenilines jungtis suatpažinimo sekos bazėmis. Kairėje pusėjegeltonai pažymėtos Ecl18kI a.r., dešinėježaliai – atitinkamos NgoMIV a.r..1. Restrikcijos endonukleazė Ecl18kIišsuka atpažinimo taikinio centriniusnukleotidusEcl18kI-DNR ir NgoMIV-DNRdimerų struktūrų erdvinis sugretinimasrodo, kad Ecl18kI ir NgoMIV katalitiniųir C:G atpažinimo a.r. Cα-atomaiabiejuose monomeruose beveik sutampa(7 pav.) 39 . Tad akivaizdu, kad skirtingiEcl18kI ir NgoMIV kirpimo produktai(4 ir 5 nt su 5′ išsikišusiais galais) yra nedėl baltymų dimerizacijos paviršiųskirtumų. Ecl18kI struktūra atskleidė,kad fermentas naudoja visiškai naująDNR atpažinimo mechanizmą, kurisleidžia labai elegantiškai paaiškintiskirtingus Ecl18kI ir NgoMIV fermentųspecifiškumus ir DNR kirpimoproduktus. DNR oligodupleksasEcl18kI-DNR komplekse yra stipriaideformuotas. Atpažinimo sekoscentrinės bazių poros nukleotidai yra pilnai išsukti iš dvigrandininės DNR spiralės(8A pav.) 39 . Abi išsuktos bazės yra patalpinamos Ecl18kI „kišenėje”, kurią sudaro20