VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

mechanizmą specifiškumo užtikrinimui gali naudoti ir kiti fermentai ar DNRsurišantys baltymai.IV. Detalaus EcoRII sąveikos su DNR mechanizmo tyrimasEcoRII yra IIE tipo endonukleazė, kuri yra katalitiškai aktyvi tik vienu metusurišusi dvi CCWGG sekas, tačiau reakcijos metu tik viena DNR taikinio kopijayra perkerpama, tuo tarpu antrasis taikinys tarnauja kaip alosterinis aktyvatoriuspirmojo taikinio hidrolizei 40,47,84,85 . EcoRII biocheminiai tyrimai prasidėjo daugiaunei prieš 30 metų. Jų metu buvo pasiūlytas keletas fermento veikimo mechanizmų,tačiau, mūsų nuomone, nei vienas iš jų iki galo nepaaiškina EcoRII alosterinėsaktyvacijos principo. Šiame darbe mes nusprendėme išanalizuoti prieštaringąEcoRII sąveikos su DNR mechanizmą, panaudodami biocheminius ir kinetiniusmetodus.1. EcoRII-DNR komplekso stechiometrija: galimas DNR surišimo vietųskaičiusNorėdami išsiaiškinti EcoRII-DNR komplekso stechiometriją, mes atlikomeDNR susirišimo eksperimentus su EcoRII-N ir EcoRII-C domenais. Norėdamiatmesti galimą dvigubą baltymo sąveiką su DNR N-galinėje ir C-galinėje dalyje,eksperimentus atlikome su išgrynintais EcoRII-N ir EcoRII-C baltymais (žr.„Tyrimų metodiką“).1.1. EcoRII-N sąveikos su DNR tyrimas sustabdyto elektroforetinio judrumoposlinkio PAAG metoduEcoRII-N susirišimo su DNR buvo tirtas panaudojant sustabdytoelektroforetinio judrumo PAAG metodą (žr. „Tyrimų metodiką“). Anksčiauatliktuose analogiškuose eksperimentuose su 191 bp ilgio DNR fragmentu buvogauti du skirtingo judrumo specifiniai EcoRII-N-DNR kompleksai 24 . Autoriaiaiškino, kad tai galėtų būti susiję arba su preparato heterogeniškumu arbaEcoRII-N sugebėjimu dimerizuotis esant reakcijos mišinyje specifinės DNR.EcoRII-N sąveiką su DNR mes tyrėme panaudodami 33 bp specifinįoligodupleksą (2 lentelė) ir tą patį baltymo preparatą, kurį savo eksperimentuosenaudojo M. Mucke ir kt. 24 . Atlikus EcoRII-N DNR susirišimo eksperimentus,paaiškėjo, kad nesant Me 2+ , tirtame baltymo koncentracijų intervale EcoRII-Nneriša nespecifinės DNR, o specifinę riša su K d = 1.6 ± 0.3 nM (14 pav.).Įdomu, kad EcoRII-N specifiškai riša DNR nesant Me 2+ , kurie yra būtiniEcoRII-C domeno specifiniam DNR surišimui. Tuo tarpu dvivalenčio metalopridėjimas smarkiai pablogina EcoRII-N specifinę sąveiką su DNR (duomenysnepateikti). Beje, mūsų eksperimente gauta K d vertė yra ~20 kartų mažesnė, neieksperimente naudojant 191 bp specifinį DNR fragmentą 24 . Gelyje matoma silpnagreičiau judanti juostelė (14 pav.) galėtų būti trumpesnio EcoRII-N varianto,išsigryninusio kartu su pilno ilgio EcoRI-N baltymu ir specifinės DNRkompleksas. Iš tiesų, išanalizavus išgryninto EcoRII-N preparatą NDS-PAAG28