VILNIAUS UNIVERSITETAS - Biotechnologijos institutas

Darbo tikslai1. Identifikuoti REazių Ecl18kI ir EcoRII aktyvaus centro ir taikinio atpažinimodeterminantes.2. Išsiaiškinti, kaip restrikcijos fermentai Ecl18kI ir EcoRII, atpažįstantys pertrauktaspalindromines DNR sekas, sąveikauja su centriniu sekos nukleotidu.3. Išsiaiškinti REazės EcoRII DNR hidrolizės mechanizmą.Darbo mokslinis naujumasŠiame darbe mes parodėme, kad pertrauktas palindromines DNR sekasatpažįstantys restrikcijos fermentai Ecl18kI (atpažįsta CCNGG) ir EcoRII (CCWGG) beiheksanukleotidines sekas atpažįstančios REazės Bse634I/Cfr10I (RCCGGY), NgoMIV(GCCGGC) (1 lentelė) turi panašius struktūrinę sanklodą, aktyvius centrus ir taikinioCC:GG dalies atpažinimo determinantes. Mes atradome, kad Ecl18kI REazė,sąveikaudama su pertraukta atpažinimo seka CCNGG, išsuka centrinę bazių porą išdvigubos DNR spiralės. Bazės išsukimo mechanizmas iki šiol buvo žinomas tik DNRmodifikuojantiems fermentams (metiltransferazėms, reparacijos fermentams ir kt.), kurieišsuka modifikuojamą DNR bazę į aktyvų centrą. Mes parodėme, jog REazė Ecl18kIišsuka atpažįstamos sekos centrinius nukleotidus, kad atpažintų savo seką bei užtikrintųfosfodiesterinės jungties hidrolizę. Be to, mes parodėme, kad centrinį nukleotidą(us) išCCWGG sekos išsuka ir EcoRII katalitinis domenas (EcoRII-C) bei PspGI REazė.Pasiremdami šiame darbe gautais eksperimentiniais duomenimis mes pasiūlėme naująREazės EcoRII veikimo mechanizmą, pagal kurį fermentas efektyviai fosfodiesterinėsjungties hidrolizei vienu metu privalo surišti tris, o ne du DNR taikinius.Darbo reikšmėRestrikcijos fermentai yra plačiai taikomi biotechnologijoje kaip molekulinėsžirklės, leidžiančios tiksliai perkirpti DNR norimoje vietoje, ir yra nepakeičiami genųinžinerijoje. Baltymų inžinerijos metodais keičiant restrikcijos fermentus būtų galimasukurti naujus molekulinius įrankius biotechnologijai, bet tokių eksperimentų sėkmė yrakol kas labai ribota. Naujų fermentų racionalaus konstravimo strategijos parinkimasreikalauja detalaus REazių struktūros ir veikimo mechanizmų, užtikrinančių fermentųspecifiškumą, pažinimo. Šis darbas parodo, kaip evoliuciškai susijusios REazėsrealizuoja savo specifiškumą ir suteikia naujų idėjų baltymų inžinieriams.Ginamieji disertacijos teiginiai1. Giminingais specifiškumais pasižyminčios REazės Ecl18kI ( ↓ CCNGG), EcoRII( ↓ CCWGG) bei Bse634I/Cfr10I (R ↓ CCGGY) ir NgoMIV (G ↓ CCGGC) turikonservatyvius aktyvius centrus ir atpažinimo sekos C:G bazių poros atpažinimodeterminantes.2. Savo specifiškumui užtikrinti REazė Ecl18kI iš savo atpažinimo sekos CCNGGišsuka abu centrinius nukleotidus į baltymo „kišenę“.3. 2-Aminopurino, esančio restrikcijos fermentų Ecl18kI, EcoRII-C ar PspGI taikiniocentrinėje padėtyje, fluorescencijos signalas išauga prisirišus fermentui, kas rodo, kadšios REazės išsuka DNR atpažinimo sekos nukleotidus(ą) tirpale.4. REazės EcoRII DNR atpažinimo sekos abiejų grandinių sutartiniam kirpimui būtinastrijų DNR taikinių surišimas.4