Centrifree® Ultrafiltratie units - Millipore

Gebruikershandleiding
Centrifree®
Ultrafiltratie units
Voor onderzoeksdoeleinden
en in vitro diagnostisch gebruik
Nederlands
Inleiding
Centrifree® units scheiden op een snelle en efficiënte manier kleine hoeveelheden eiwitgebonden micro
opgeloste stoffen (0,15–1,0 ml) van serum, plasma en andere biologische monsters met behulp van een
methode die ultrafiltratie heet. Nauwkeurige scheiding vindt plaats in een paar minuten , zonder verdunning,
verandering in fysiologische pH, ionsamenstelling of ongebonden micro opgeloste stofconcentratie.
Deze apparaten bevatten laag-adsorptieve hydrofiele membranen en O-ringen zonder weekmakers om
verzekerd te zijn van uitstekende recovery. Retentievolume is 10 µL of minder.
In tegenstelling tot dialyse, gel-filtratie of houtskooladsorptie, biedt ultrafiltratie een betere nauwkeurigheid
bij het meten van vrije ligandconcentratie, bindingscapaciteit of affiniteitconstanten. Het elimineert
tijdrovende methodologie, de noodzaak voor gespecialiseerde apparatuur, verdunningsfouten en verschuivingen
in bindings equilibrium.
Ultrafiltratie verandert het vrije ligandvolume en de concentratie van de micro opgeloste stof niet. Eiwit
wordt selectief verdeeld in een fractie van het monstervolume (het concentraat), terwijl de vrije ligand
samen met het oplosmiddel ongehinderd door het membraan gaat.
De massawerking en conservering van de massa voor ideale eiwitbinding voorspellen dat de vrije ligandconcentratie
in het ultrafiltraat constant zullen blijven, op voorwaarde dat de molaire bindingscapaciteit
en affiniteit onafhankelijk zijn van de totale eiwitconcentratie. Resultaten van verschillende systemen die
constante vrije ligandconcentratie zien in opeenvolgende ultrafiltraatfracties, ondersteunen deze
voorspellingen.
Verandering van de vrije ligandconcentratie die niet wordt veroorzaakt door membraanretentie of
adsorptie, is bewijs voor de gewijzigde capaciteit of affiniteit van bindende eiwitten door de aggregatie
of andere niet-ideale eiwit-eiwit-interacties. Afhankelijk van de toepassing kunt u het resulterende filtraat
kwantitatief of kwalitatief analyseren op vrije ligandconcentratie.
Beoogd gebruik
Centrifree® apparaten zijn bedoeld voor in vitro diagnostisch gebruik en zijn bedoeld voor het scheiden
van eiwitgebonden micro opgeloste stof in kleine volumes (0,15-1,0 ml) van serum, plasma en andere
biologische monsters voorafgaand aan analyse.
Centrifree® Ultrafiltratie units
1

Centrifree® componenten
De Centrifree® ultrafiltratie unit biedt maximale efficiëntie voor het verwerken van meerdere monsters.
Elke eenheid bestaat uit een membraan en een O-ring die permanent verzegeld zijn tussen het monsterreservoir
en de supportbasis. Een afneembare filtraatbeker zit aan de basis bevestigd. De Centrifree® unit is
slechts bedoeld voor eenmalig gebruik.
Reservoirdeksel
Monsterreservoir
Geleverde materialen
Filtraatbeker
De volgende componenten worden geleverd met de Centrifree® ultrafiltratie units.
● 50 ultrafiltratie units
● 50 reservoirdoppen
● 50 filtraatbekers
● 50 deksels van filtraatbekers
NB: De rode reservoirdoppen worden meegeleverd om monsterevaporatie en pH-verandering door verlies
van CO 2 te voorkomen.
Benodigde apparatuur
● Centrifugeeer met rotoradapter of carriers voor 17 × 100 mm buizen en die geschikt zijn voor
1000–2000 × g.
NB: Gebruik voor een optimale oplosmiddeldoorstroom een centrifuge met vaste hoek rotor.
● Pasteurpipet of pipet met vast volume voor monsterafgifte.
Opslag en houdbaarheid van de filters
● Bewaren bij 15-30 °C.
● Houdbaarheidstermijn is drie jaar vanaf productiedatum. Zie de vervaldatum op het verpakkingslabel.
2 Centrifree® Ultrafiltratie units
O-ring
Membraan
Membraandersteuningsbasis
Dop filtraatbeker

Richtlijnen voor gebruik
● Serum, plasma of andere biologische vloeistoffen kunnen met Centrifree® units worden gebruikt. Voor
efficiëntere doorstroomsnelheden verwijdert u de fibrine door het monster te centrifugeren voordat u
het in het reservoir laadt.
● Het aanbevolen monstervolume is 0,15–1,0 ml.
● Voor de beste resultaten kunt u beter een centrifuge met een vaste hoek rotor dan met een bucket
gebruiken en u draait op 1000-2000 x g.
VOORZICHTIG: Niet laten draaien op een relatieve centrifugale kracht boven 2000 x g.
● Voervoorbereidende ligandadsorptie en eiwitretentiestudies uit om geschiktheid van het systeem voor
de beoogde toepassing te bepalen.
● Centrifree® ultrafiltratie units zijn bedoeld voor gebruik met biologische vloeistoffen en wateroplossingen.
Apparaten niet gebruiken met organische oplosmiddelen.
● Bepaal de juiste temperatuur voor uw toepassing. Voor een nauwkeurige meting van de monstertemperatuur
voor en na centrifugeren, steekt u een weerstandsthermometer of een thermokoppel door de
reservoirdop in het monster in het reservoir. Behoud de gewenste temperatuur door een verwarmde
centrifuge te gebruiken of door de centrifugerotor en kamer voor te verwarmen. In een rotor met vaste
hoek bereikt de inhoud van de unit een thermaal evenwicht met de rotor in 5-10 minuten. De hoge
snelheid van ultrafiltratie die door Centrifree® units wordt bereikt, minimaliseert het effect van de
temperatuur op ligandbinding.
● Niet gebruiken voor concentratie en recovery van macromoleculen.
● Componentonderdelen niet autoclaveren.
● Centrifree® units niet hergebruiken.
● Als het membraan in de ultrafiltratie units eenmaal nat is, niet opnieuw laten drogen. Als u de unit niet
onmiddellijk na voorspoelen gebruikt, moet u zorgen dat er vloeistof op het membraan staat totdat de
unit wordt gebruikt.
● Het Ultracel® membraan in de unit bevat sporen van glycerine (~ 2 µL). Als deze stof de analyse
beïnvloedt, spoelt u de unit met gedeïoniseerd water of 0,1 N NaOH totdat er geen interferentie wordt
waargenomen. Als 0,1 N NaOH wordt gebruikt voor het verwijderen van glycerine, spoelt u de unit voor
gebruik grondig met gedeïoniseerd water of buffer. Centrifugeer gedurende ten minste 15 minuten om
zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen. Om verdunningsfouten die worden veroorzaakt door ingesloten
vloeistof (~ 10 µL) na spoelen te voorkomen, gooit u de eerste aliquot van het ultrafiltraat weg.
Hoe dient u Centrifree® Ultrafiltratie units te gebruiken
Verwijder voor het gebruik van de Centrifree® de rode reservoirdop.
1. Houd het reservoir vast in een hoek van ongeveer 45° waarbij de pipetpunt de reservoirwand aanraakt.
Voeg de monsteroplossing toe in een gelijkmatige stroom voorzichtig toe om luchtbelletjes te
voorkomen.
NB: Zorg ervoor dat u het membraan niet aanraakt met de punt van de pipet.
2. Dop het monsterreservoir af en plaats vervolgens de unit in een centrifuge met vaste hoek rotor met
17 x 100 mm adapters. Breng de centrifuge in evenwicht met een gelijksoortig apparaat.
NB: De rode reservoirdop mag niet meer dan 3-4 mm naar beneden over de bovenkant van het
reservoir vallen. Nog meer druk kan prefiltratie veroorzaken, hetgeen vervolgens kan leiden tot
analysefouten als het monster niet op de gewenste bedrijfstemperatuur is.
Centrifree® Ultrafiltratie units
3

Hoe dient u Centrifree® Ultrafiltratie units te gebruiken, vervolg
3. Equilibreer de unit en het monster op de temperatuur die voor uw applicatie nodig is.
4. Draai de unit op 1000-2000 x g zolang als nodig is om het gewenste filtraatvolume te verkrijgen.
Raadpleeg voor richtlijnen met betrekking tot centrifugetijd de paragraaf over ‘Ultrafiltratiesnelheid’.
5. Verwijder de unit voorzichtig uit de centrifugerotor en maak de filtraatbeker met het ultrafiltraat los.
Dek de filtraatbeker af met het meegeleverde deksel totdat het ultrafiltraat kan worden geanalyseerd.
WAARSCHUWING: Zorg er bij het weggooien van gebruikte componenten voor dat u de
voorzorgsmaatregelen volgt voor het afvoeren van zaken die besmet zijn met
mogelijk infectueus of gevaarlijk biologisch materiaal.
Prestatie
De volgende paragrafen gaan over de verschillende prestatiekenmerken, waaronder polarisatiecontrole,
ultrafiltratiesnelheid, membraanprestatie, pH-controle en niet-specifieke adsorptie.
Polarisatiecontrole
Gebruik van een rotor met vaste hoek biedt polarisatiecontrole en minimaliseert de kans op artefacten
door eiwit-eiwitinteractie. De hoek neutraliseert de opbouw van achtergebleven eiwit op het membraanoppervlak,
omdat deze dichte laag naar buiten glijdt en zich ophoopt aan de rand van het membraan. In
een bucket rotor wordt de polarisatielaag over het gehele membraanoppervlak samengepakt, waardoor de
doorstroom van oplosmiddel wordt beperkt.
Eiwitvrij
ultrafiltraat
Ultrafiltratiesnelheid
Doorstroomsnelheid hangt af van de eiwitconcentratie in het monster, startvolume, relatieve centrifugale
kracht (RCK), rotortype en temperatuur. Hoge doorstroomsnelheden worden veroorzaakt door maximaal
membraanoppervlak, polarisatiecontrole en optimale transmembraandruk die wordt bereikt met
monstervolumes groter dan 300 µl. Optimale filtratiesnelheden worden bereikt met 1000–2000 × g. Een
hogere centrifugale kracht verhoogt de doorstroomsnelheid niet significant en wordt niet aanbevolen.
Vergelijking van centrifuge met vaste hoek rotors en met b
Rotor RCK (× g) Typisch ultrafiltraatvolume (µl)
Vaste hoek (33°) 1000 160–170
Bucket 1000 115–120
1 ml normaal menselijk serum, 10 minuten draaien
Krachtvector
Serum of
plasma
4 Centrifree® Ultrafiltratie units

Karakteristieken ultrafiltratiesnelheden
Ultrafiltraatvolume (µl)
Effect van relatieve centrifugale kracht
Ultrafiltraatvolume (µl)
200
100
300
200
100
1000 µL serum
Omstandigheden: rotor met vaste hoek van 33°, 25 °C
Membraanprestatie
10 20 30
Centrifugeertijd (minuten)
Omstandigheden: rotor met vaste hoek van 33°, 25 °C, 1000 × g
1000 2000
Relatieve centrifugale kracht (x g)
De hoge selectieve doorlatendheid van het anisotropische, hydrofiele Ultracel® ultrafiltratiemembraan
wordt veroorzaakt door de plaatsing van kleine poriën. Doorgaans behouden Centrifree® units 99,9% serumeiwit
en < 5% L-thyroxine (0,1 mg/ml in 0,1 N NaOH) vast.
Vereisten voor het vasthouden van eiwit zijn voor elke toepassing af van de mate van ligandbinding. Voor
een 90% gebonden ligand, zou 1% lekkage van serumeiwit leiden tot een overschatting van 9% van vrije
ligandconcentratie. Voor het meten van vrije thyroxine (> 99,95% gebonden) in onverdund serum, is vasthouden
van eiwit > 99,995% vereist voor een fout < 10%. Centrifree® units worden aanbevolen voor het
scheiden van ligands die tot 99% gebonden.
Centrifree® Ultrafiltratie units
500 µL serum
1000 µL serum
500 µL serum
300 µL serum
150 µL serum
5

Membraanprestatie, vervolg
Soms kan lekken van serum optreden als gevolg van een defect in het membraan of door een mechanisch
defect. Als de lekkage groter is dan 20%, kleurt het ultrafiltraat geel. Om vast te stellen of de lekkage minder
dan 20% is, moet de eiwitconcentratie in het ultrafiltraat worden gemeten met een gevoelige microeiwitanalyse.
Als u meer zekerheid nodig hebt, maar een routinematige eiwitanalyse wilt vermijden, filtert
u het monster in twee gelijke units.
pH-controle
Stel de acceptatielimiet voor pH-variatie vast voor elk systeem voor ligandbinding. Experimenteel kan
monster-pH worden gecontroleerd door anaerobe monsterverwerking en -overdracht, door begassing van
het monster met 5% CO 2 , 95% O 2 , of door toevoeging van een kleine hoeveelheid geconcentreerde buffer,
op voorwaarde dat het buffer-ion het ligandbinding equilibrium niet wijzigt.
Niet-specifieke adsorptie
Adsorptief verlies hangt af van de concentratie van ligand, de ionische en hydrofobe aard, de temperatuur
en de duur van het contact met de componentoppervlakken en de monstermatrix. Recovery van het
ligand dat is toegevoegd aan eiwitvrij serumultrafiltraat is doorgaans groter dan uit een buffer en qua
gedrag meer voorspelbaar met compleet serum. Laag moleculair gewicht, vet- en aminozuren in eiwitvrij
ultrafiltraat geven interactie met en passiveren componentoppervlakken, terwijl serumeiwitten doorgaans
oppervlakken passiveren die in contact komen met compleet serum. Lage recovery uit eiwitvrij filtraat of
buffer kan een indicatie zijn voor adsorptief verlies en/of membraanretentie van ligand. Ligand recovery in
Centrifree® units is het meest nauwkeurig in aanwezigheid van een bindingseiwit en concurrerende micro
opgeloste stoffen.
Specificaties
Maximaal monstervolume 1,0 ml
Minimaal monstervolume 0,15 ml
Maximale relatieve centrifugale kracht 2000 × g
Actief membraanoppervlak 0,92 cm 2
Retentievolume (membraan en ondersteuning) 10 µL
Afmetingen
Lengte van afgedopte unit met filtraatbeker 95 mm
Diameter 16 mm
Constructiematerialen
Membraan Ultracel® geregenereerde cellulose
Monsterreservoir Policarbonaat
Membraandersteuningsbasis Policarbonaat
Filtraatbeker Polyethyleen
Deksel filtraatbeker Polyethyleen
O-ring Ethyleenpropyleen diëenmonomeer (EPDM)
VOORZICHTIG: Centrifree® componenten zijn niet autoclaafbaar. Niet gebruiken met organische
oplosmiddelen!
6 Centrifree® Ultrafiltratie units

In vitro diagnostische productetikettering
De volgende tabel definieert de symbolen die op de labels staan van de Centrifree® unit.
Symbool Definitie Symbool Definitie
V In vitro diagnostisch medisch apparaat N Fabricagedatum
h Catalogusnummer M Fabrikant
D Niet voor hergebruik l Temperatuurlimiet
H Gebruiken voor d Niet-steriel product
g Batchcode C CE-conformiteitsmarkering
Bestelinformatie
In deze paragraaf staat het catalogusnummer voor Centrifree® ultrafiltratie units. Raadpleeg de paragraaf
over technische ondersteuning voor contactgegevens. U kunt dit product ook online kopen op
www.millipore.com/products.
Omschrijving
Centrifree® Ultrafiltratie units
Catalogusnummer
Aantal/pk
Centrifree® unit (voor in vitro diagnostisch gebruik) 4104 50
Opmerking
De informatie in dit document kan zonder melding worden gewijzigd en moet niet worden uitgelegd als
een toezegging door Merck Millipore Ltd. (“Millipore”) of een filiaal daarvan. Noch Merck Millipore Ltd. of
een van zijn filialen neemt verantwoordelijkheid voor fouten die voor kunnen komen in dit document.
Technische Ondersteuning
Voor meer informatie kunt u contact opnemen met het dichtstbijzijnde kantoor. Bijgewerkte wereldwijde
contactgegevens zijn beschikbaar op onze website www.millipore.com/offices. U kunt ook de technische
ondersteuningspagina www.millipore.com/techservice op onze website bezoeken.
Standaardgarantie
De garantie die van toepassing is op de producten genoemd in deze publicatie vindt u op
www.millipore.com/terms (onder de “Verkoopvoorwaarden” die van toepassing zijn op uw aankoop).
7

Geproduceerd in Ierland
Merck Millipore Ltd.
Tullagreen,
Carrigtwohill,
Co. Cork, IRL
Het M-logo is een handelsmerk van Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland.
Millipore, Centrifree en Ultracel zijn geregistreerde handelsmerken van Merck KGaA.
© 2012 EMD Millipore Corporation. Alle rechten voorbehouden.
PR03523TR, Rev. A, Nederlands, 03/12
8 Centrifree® Ultrafiltratie units
I
I
B
C
G
B
O
R
H
P
P
U
K
E
M
p
N
S
I
B
O
T
S