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A amiloodiniose (“marine velvet disease”, “coral fish disease”) é ...

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Departamento de Aquicultura, Instituto de Investigação das Pescas e do Mar<br />

Avenida de Brasília, 1449-006 Lisboa, PORTUGAL<br />

O presente trabalho assinala a primeira ocorrência<br />

de <strong>amiloodiniose</strong> em pregado, Psetta maxima (L). Descrevem-se<br />

as alterações comportamentais observadas, bem<br />

como o quadro sintomatológico associado à parasitose. O diagnóstico<br />

foi estabelecido com base em esfregaços a fresco,<br />

biópsias das brânquias e pele e no exame histológico das<br />

brânquias, o que permitiu identificar os trofontes e observar<br />

as alterações histopatológicas do epit<strong>é</strong>lio branquial. Foram<br />

implementadas terapêuticas utilizando o sulfato de cobre e o<br />

peróxido de hidrog<strong>é</strong>nio numa tentativa de controlar a infestação.<br />

Doença parasitária, Amyloodinium ocella -<br />

tum, Psetta maxima.<br />

This is the first report of amyloodiniosis in Psetta<br />

m a x i m a (L.). Behavioural changes are described as well as<br />

the clinical signs caused by the parasite. Definite diagnosis<br />

was made by the identification of trophonts in wet mounts of<br />

skin and gills and histopathological section of gills with parasite.<br />

Copper sulphate and hydrogene peroxid were used as<br />

treatments to control the parasitosis.<br />

Parasitic disease, Amyloodinium ocellatum,<br />

Psetta maxima.<br />

A <strong>amiloodiniose</strong> (<strong>“marine</strong> <strong>velvet</strong> <strong>disease”</strong>, <strong>“coral</strong><br />

<strong>fish</strong> <strong>disease”</strong>) <strong>é</strong> uma doença parasitária cujo agente<br />

etiológico <strong>é</strong> o dinoflagelado<br />

De distribuição cosmopolita (Lom e Dyková,<br />

1992), este dinoflagelado termofílico e eurialino foi<br />

encontrado em inúmeras esp<strong>é</strong>cies de peixes selvagens<br />

estuarinas e marinhas (Sinderman, 1990;<br />

Southgate, 1993), sendo um dos poucos parasitas<br />

que pode infestar quer os elasmobrânquios (tubarões<br />

e raias) quer os teleósteos (Lawler, 1980). Em estabulação,<br />

a sua proliferação pode originar elevada<br />

mortalidade (Needham e Wootten, 1978). As áreas<br />

atingidas incluem o Mediterrâneo, Mar Ve r m e l h o ,<br />

Golfo do M<strong>é</strong>xico, etc. (Southgate, 1993). As principais<br />

esp<strong>é</strong>cies comerciais de maricultura mais atingidas,<br />

são o robalo em Israel (Paperna, 1980) e Itália<br />

(Ghittino , 1980; Christofilogiannis, 1993) e a<br />

dourada em França (Paperna e Baudin Laurencin,<br />

1979), Israel (Paperna e Baudin Laurencin, 1979;<br />

Paperna, 1980), Itália (Barbaro e Francescon, 1985)<br />

e Jugoslávia (Paperna, 1983). Em Portugal a <strong>amiloodiniose</strong><br />

foi observada em robalo na Lagoa de Óbidos<br />

e Estuário do Sado (Menezes, 2000) e na mesma<br />

esp<strong>é</strong>cie e em dourada em piscicultura (Menezes,<br />

1994).<br />

O <strong>é</strong> um parasita que atinge<br />

principalmente as brânquias (Brown, 1934;<br />

Brown e Hovasse, 1946; Sinderman, 1990; Noga,<br />

1996) e tamb<strong>é</strong>m a pele (Lom e Dyková, 1992). A<br />

ocorrência de epizootias deste dinoflagelado em<br />

aquário tem servido de base ao estudo morfológico<br />

do parasita, do seu ciclo biológico (Brown, 1934;<br />

Brown e Hovasse 1946), a estudos ultra-estruturais<br />

das c<strong>é</strong>lulas branquiais infestadas e ao maior conhecimento<br />

sobre o efeito patog<strong>é</strong>nico do parasita (Lom e<br />

Lawler, 1973 cit. Eiras, 1994). Paperna (1980) sumariou<br />

toda a informação sobre a biologia e patogenicidade<br />

do e recentemente<br />

estudou-se a resposta imunitária e a resistência<br />

adquirida à reinfestação em peixes que sobreviveram<br />

à infestação parasitária inicial, usando o m<strong>é</strong>todo de<br />

E L I S A (enzyme-linked immunosorbent assay)<br />

(Smith ., 1994; Cecchini , 2001). A resistência<br />

à infestação pelo e n v o l v e<br />

as imunidades inata e adquirida (Dickerson e Clark,<br />

1996; Woo, 1996). Lawler (1980) e Paperna (1980)<br />

referiram que algumas esp<strong>é</strong>cies de peixes adquirem<br />

imunidade ao mediada por<br />

anticorpos específicos após uma exposição sub-letal<br />

a este parasita. É o caso da tilápia (O re o c h ro m i s<br />

aureus) (Smith ., 1994), do “tomato clown <strong>fish</strong>”<br />

(Amphiprion fre n a t u s) (Cobb ., 1998), do<br />

“hybrid striped bass” (M o rone saxatilis X M.<br />

c h ry s o p s) (Smith ., 1994) e do robalo (D i c e n -<br />

trarchus labrax) (Cecchini , 2001).<br />

Num ensaio laboratorial de crescimento, os pregados<br />

encontravam-se divididos em 4 lotes (A, B, C, e<br />

D), cada um com 9 indivíduos (peso m<strong>é</strong>dio 27 g)<br />

mantidos em pequenos circuitos fechados, com recirculação,<br />

constituídos por um tanque de fibra de<br />

vidro com aproximadamente 70 litros de água e um<br />

filtro biológico. Em três deles (A, B, e C) a água era<br />

201


Ramos, P. e Oliveira, J. M.<br />

aquecida por uma resistência, sendo as temperaturas<br />

de 27, 25 e 23 ± 1 ºC respectivamente. No tanque D<br />

a água estava à temperatura ambiente (20-22 ºC). A<br />

salinidade era de 34 ± 1 ‰ em todos os tanques.<br />

A presença de foi inicialmente<br />

revelada pela observação ao microscópio óptico<br />

de trofontes nas brânquias de um pregado que<br />

tinha morrido no tanque A, 17 dias após a introdução.<br />

Para o estabelecimento do diagnóstico definitivo,<br />

realizaram-se esfregaços a fresco e biópsias das<br />

brânquias e pele, bem como o exame histopatológico<br />

das brânquias. As brânquias foram fixadas em formol<br />

salgado neutro a 10 %, processadas rotineiramente<br />

e incluídas em parafina. Realizaram-se cortes<br />

com 5 µm e colorações com hematoxilina e eosina<br />

(H&E).<br />

Após a morte do último indivíduo dos tanques<br />

aquecidos (no dia 28 após a introdução e pertencente<br />

ao lote C), foi efectuado um pequeno ensaio terapêutico<br />

na tentativa de controlo do parasita com os pregados<br />

do lote D, os quais se encontravam<br />

parasitados. Dividiram-se em três grupos de três indivíduos.<br />

O grupo 1 serviu de testemunha não lhe<br />

sendo aplicado qualquer tratamento, o grupo 2 foi<br />

sujeito a um banho de sulfato de cobre (0.1 ppm) durante<br />

10 dias e ao grupo 3 foi aplicado um banho de<br />

peróxido de hidrog<strong>é</strong>nio (100 ppm) durante 30 minutos,<br />

com repetição 5 dias depois. Relativamente ao<br />

lote tratado com sulfato de cobre, uma vez que o ião<br />

cobre <strong>é</strong> muito tóxico e dada a dificuldade em manter<br />

a sua concentração na solução, optou-se por renovar<br />

diariamente o banho de tratamento.<br />

Os primeiros sinais observados revelaram alterações<br />

no comportamento, nomeadamente respiração<br />

rápida e superficial, aglomeração dos peixes junto<br />

dos arejadores, no fundo dos tanques, movimentos<br />

natatórios erráticos em torno das paredes do tanque e<br />

perda progressiva do apetite.<br />

Inicialmente, os sintomas eram subtis mas, com a<br />

evolução do processo, observaram-se alterações da<br />

pigmentação da pele tais como o aparecimento de<br />

manchas de despigmentação/hiperpigmentação (Fig.<br />

1), congestão e erosão das barbatanas, hipersecrecção<br />

mucosa cutânea e dilatação do ventre, culminando<br />

com a morte dos indivíduos.<br />

Verificou-se a existência de associação entre o<br />

agravamento da sintomatologia e a temperatura da<br />

água dos tanques, com evolução da infestação mais<br />

rápida e mortalidade precoce nos tanques de temperatura<br />

mais elevada.<br />

O exame ao microscópio óptico das preparações a<br />

fresco de esfregaços da pele e brânquias permitiu<br />

observar hipersecrecção de muco, congestão do epit<strong>é</strong>lio<br />

branquial e identificar morfologicamente as<br />

formas parasitárias que constituem o ciclo de vida<br />

do (Fig. 2).<br />

Observou-se a presença de trofontes, inicialmente<br />

nas brânquias (Fig. 3) e posteriormente na pele dos<br />

pregados. De forma arredondada (quando presos ao<br />

202<br />

Pregados infestados por<br />

epit<strong>é</strong>lio branquial) ou ligeiramente oval, estas c<strong>é</strong>lulas<br />

únicas, que são imóveis por não disporem de flagelos,<br />

encontravam-se envolvidas numa membrana<br />

densa, exibiam um grande núcleo esf<strong>é</strong>rico rodeado<br />

por grânulos refringentes e possuíam, no seu pólo<br />

m e n o r, um disco de fixação. Este, com um pedúnculo<br />

bastante curto irradiando projecções filiformes, os rizóides,<br />

evidenciavam uma formação semelhante a<br />

um tentáculo móvel, o estomatópode (Fig. 2-A). Foram<br />

observados quistos de forma arredondada ou<br />

oval (Fig. 2-B) e em diversas fases de multiplicação:<br />

bipartição (Fig. 2-C), tetrapartição (Fig. 2-D) e multiplicações<br />

sucessivas (Fig. 2-E). Posteriormente a<br />

parede do quisto rompeu-se e foram libertadas as c<strong>é</strong>lulas<br />

filhas (dinosporos), flageladas (Fig. 2-F), móveis<br />

e menores que a c<strong>é</strong>lula mãe.<br />

O exame histopatológico permitiu observar hiperplasia<br />

do epit<strong>é</strong>lio branquial com fusão das lamelas<br />

branquiais acompanhadas de edema, levando ao destacamento<br />

das c<strong>é</strong>lulas de suporte das brânquias (Fig.<br />

4). Observaram-se ainda alterações degenerativas,<br />

necrose das c<strong>é</strong>lulas do epit<strong>é</strong>lio branquial e depleção<br />

das c<strong>é</strong>lulas mucosas.<br />

No presente estudo verificou-se, que o lote testemunha<br />

morreu na totalidade após 48 horas, enquanto<br />

que os pregados tratados sobreviveram. Nos esfregaços<br />

efectuados após os tratamentos não foram encontrados<br />

parasitas.<br />

As formas observadas em exame a fresco e cortes<br />

histológicos, apresentam as características do<br />

descritas por Brown (1934),<br />

Brown e Hovasse (1946), Kudo (1960), Lom e<br />

Dyková (1992), Cheung (1993) e Eiras (1994) que<br />

constituem o ciclo de vida trifásico do<br />

( A m l a c h e r, 1970; Cobb , 1998):<br />

fase parasitária (trofontes), fase de divisão ou multiplicação<br />

(quistos) e fase infestante (dinosporos),<br />

idêntico ao ciclo de vida do ciliado<br />

(Noga, 1996).<br />

A presença de trofontes na pele e brânquias foi<br />

tamb<strong>é</strong>m observada por Paperna (1980) na dourada,<br />

contrariamente às observações de Noga . (1991)


Ramos, P. e Oliveira, J. M.<br />

E<br />

D<br />

F<br />

Ciclo de vida trifásico do em .<br />

Trofonte - fase parasitária (A). (aprox. X 150)<br />

Tomonte - fase de divisão ou de multiplicação (B; C e D aprox. X 150) e (E)<br />

Dinosporo - fase infestante (F). (aprox. X 750)<br />

Brânquia infestada por trofontes de<br />

(aprox., X 40).<br />

C<br />

Corte histológico de uma brânquia de<br />

infestada por Tronfonte entre as<br />

lamemas branquias. e Edema epitelial. (aprox. x100; H&E)<br />

B<br />

A<br />

203


Ramos, P. e Oliveira, J. M.<br />

em “hybrid striped bass” infestado com este parasita.<br />

Paperna e Laurencin (1979) referem que as infestações<br />

da pele são raramente observadas, mesmo em<br />

tanques maciçamente infestados, com excepção das<br />

larvas de robalo e de dourada em que a pele <strong>é</strong> o local<br />

preferido de fixação do parasita (Paperna, 1980). Por<br />

sua vez, Montgomery . (1999) referem as brânquias<br />

como sendo o local de infestação primária no<br />

Cheung . (1981) registaram<br />

a presença de trofontes em locais pouco usuais<br />

como sejam a submucosa, músculo e tecido conjuntivo<br />

da faringe e rim anterior do<br />

(L.).<br />

Dispondo de condições ambientais favoráveis<br />

como temperatura elevada e constante (Brown,<br />

1934; Eiras, 1994) e luminosidade intensa que parecem<br />

ser os factores que mais influenciam a reprodução<br />

(Eiras, 1994), o ciclo evolutivo <strong>é</strong> normalmente<br />

completado no substrato do fundo do tanque ou no<br />

próprio peixe (Sinderman, 1990), como observado<br />

no presente caso em que a hipersecrecção de muco<br />

reteve as formas de multiplicação.<br />

As imagens histopatológicas observadas por<br />

Paperna (1980) em robalo e dourada foram igualmente<br />

observadas no pregado.<br />

Uma vez feito o diagnóstico, <strong>é</strong> essencial uma<br />

intervenção rápida na implementação de um tratamento<br />

eficaz contra o e seguro<br />

para o peixe, de forma a prevenir uma perda<br />

rápida do “stock”. Embora a forma livre (dinosporo)<br />

seja susceptível à quimioterapia, a forma vegetativa<br />

(trofonte) e os estadios de esporulação (tomonte) são<br />

resistentes, o que torna a erradicação difícil (Lawler,<br />

1980; Paperna, 1983), quer por exigir tratamentos<br />

prolongados de modo a permitir que todos os trofontes<br />

e tomontes formem dinosporos (Noga, 1996),<br />

quer por exigir o controlo periódico de reinfestação<br />

e ainda, pela limitação da sua aplicação quando o<br />

peixe se destina ao consumo humano (Anónimo,<br />

1988). Se a estes factores acrescentarmos a elevada<br />

taxa de multiplicação do parasita, um ciclo de vida<br />

curto (Paperna , 1981), uma grande tolerância às<br />

variações ambientais (Schwarz e Smith, 1998) e o<br />

facto das infestações serem assincrónicas (Noga,<br />

1987), o <strong>é</strong> o protozoário<br />

ectoparasita mais patog<strong>é</strong>nico e difícil de controlar,<br />

constituindo uma s<strong>é</strong>ria preocupação para os piscicultores<br />

(Eiras, 1994).<br />

Schwarz e Smith (1998) referem m<strong>é</strong>todos de controlo<br />

da <strong>amiloodiniose</strong> de natureza física e de natureza<br />

química. Os primeiros, atrav<strong>é</strong>s da renovação e<br />

filtração da água, lavagem e desinfecção dos circuitos,<br />

visam minimizar o grau de infestação do Amylo -<br />

odinium ocellatum, removendo fisicamente os<br />

tomontes enquistados antes da libertação dos dinosporos<br />

e evitam a reinfestação (Paperna ., 1981).<br />

Há referências ao uso de banhos em água doce durante<br />

alguns minutos para desalojar os trofontes antes<br />

de implementar qualquer tratamento (Kabata,<br />

1985; Bruno ., 1997), embora seja “stressante”<br />

para o peixe (Montgomery ., 1999). Uma vez libertados,<br />

os dinosporos podem ser mortos com radiações<br />

ultra-violetas (Lawler, 1977 cit. Noga, 1996).<br />

204<br />

A diminuição da temperatura da água do tanque<br />

(Brown, 1934; Anónimo, 1988; Noga, 1996) e a redução<br />

da iluminação (Kabata, 1985; A n ó n i m o ,<br />

1988) podem ser utilizadas para atrasar o ciclo de<br />

vida do parasita e assim prolongar a vida do peixe.<br />

De realçar que, embora as infestações não surjam a<br />

menos de 17 °C (A. Colorni cit. Noga, 1996), uma<br />

vez que os tomontes páram de se dividir a baixas<br />

temperaturas, podem vir ser produzidos dinosporos<br />

quando colocados a 25 °C, mesmo após quatro meses<br />

a 15 °C (C.E. Bower cit. Noga, 1996). Os dinosporos<br />

permanecem infestantes durante pelo menos<br />

seis dias a 26 °C (Bower, 1987 cit. Noga, 1996).<br />

Embora haja pouca resposta aos tratamentos químicos,<br />

o uso do sulfato de cobre tem revelado alguma<br />

eficácia no tratamento do A m y l o o d i n i u m<br />

o c e l l a t u m ( A m l a c h e r, 1970; Ghittino , 1980;<br />

Barbaro e Francescon, 1985; Noga , 1991;<br />

Southgate, 1993; Scott, 1993; Reed e Floyd, 1994;<br />

Montgomery ., 1999; Cecchini ., 2001),<br />

sendo mesmo usado como profiláctico (Ghitino<br />

., 1980). Por<strong>é</strong>m, o sulfato de cobre tem um efeito<br />

altamente adstringente no epit<strong>é</strong>lio branquial e tóxico<br />

para o fígado (Scott, 1993). Outros produtos têm<br />

sido ensaiados: azul de metileno (Kabata, 1985;<br />

Anónimo, 1988), formalina (Paperna, 1983), acriflavina<br />

(Amlacher, 1970; Kabata, 1985) e peróxido de<br />

hidrog<strong>é</strong>nio (Montgomery ., 1999). Este último<br />

foi usado com sucesso no tratamento do Mugil ce -<br />

p h a l u s (Montgomery-Brock, 2000) e no P o l y d a c t i -<br />

lus sexfilis (Montgomery ., 1999).<br />

Embora não haja medidas de controlo específicas<br />

para esta situação, algumas regras de maneio de<br />

carácter geral, podem ser úteis no controlo das vias<br />

de infestação diminuindo, mas não eliminando, o<br />

risco de introdução do parasita: a quarentena e a<br />

vigilância do peixe que entra na piscicultura (Amlacher,<br />

1970), com uma duração de 14 (Kabata, 1985)<br />

a 20 dias (Noga, 1996); o controlo da qualidade da<br />

água que entra na piscicultura (Kabata, 1985).<br />

Os tratamentos implementados revelaram-se aparentemente<br />

eficazes sendo no entanto de ressalvar<br />

que os resultados obtidos deverão ser tomados apenas<br />

como indicadores, em virtude do reduzido<br />

número de exemplares utilizados.<br />

Este estudo tendo decorrido em condições experimentais<br />

particulares em que as temperaturas favoreceram<br />

o ciclo de vida do parasita, a infestação embora<br />

com um carácter acidental revestiu-se da maior importância,<br />

pois trata-se da primeira referência numa<br />

esp<strong>é</strong>cie relativamente importante em piscicultura.<br />

Esta esp<strong>é</strong>cie <strong>é</strong> neste momento objecto de estudos que<br />

visam a implementação da sua cultura em Portugal,<br />

em tanques de terra, no âmbito da diversificação e<br />

incremento da produtividade neste tipo de sistema.<br />

Os autores agradecem ao Dr. Jaime Menezes a revisão<br />

do texto e a Augusta Moledo, Constança Pasadas,<br />

Luís Belo e Rui Silva pela colaboração prestada<br />

na execução do trabalho.


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