PREPARAÇÃO DE MEIO DE CULTURA

PREPARAÇÃO DE MEIO DE CULTURA
1. Materiais:
- DMEM/RPMI
- Proveta 1000mL
- Béquer* maior que 1000mL
- Magneto/bailarina
- Água meliquê* (1000mL)
- Bicarbonato de sódio (3,7gramas)
- pHmetro
- Balança.
- Àcido Clorídrico (HCl)
- Hidróxido de Sódio (NaOH)
- 2 Falcon 15mL
- Pipetas
* o recipiente com a água mili-Q e o béquer devem estar sempre recobertos
com alumínio, e este deve ter sua parte fosca voltada para o interior dos
mesmos.
2. Procedimentos:
2.1- Calibração do pHmetro:
- 1. Remova o eletrodo da água destilada.
- 2. Lave o eletrodo com água destilada e seque com papel macio.
- 3. Mergulhe o eletrodo em um dos tampões* e aperte o botão
“standadization”.
- 4. Pressione o botão “1”.
- 5. O valor do pH será indicado. Digite o valor esperado e pressione “enter”.
- 6. Repita o procedimento com o outro tampão.
- 7. Lave o eletrodo em água destilada e seque com papel macio.
- 8. Volte o aparelh9o para “standby”.
- 9. Mergulhe o eletrodo em água destilada.
* Termine a calibração com o tampão mais próxmo ao pH que irá corrigir.
2.2- Preparação do meio incompleto DMEM/RPMI:
- 1. Coloque por volta de 200 mL de água mili-Q no béquer, que está
posicionado em cima do agitador.
- 2. Coloque em seu interior, com uma pinça, o magneto.
- 3. Despeje o conteúdo de um envelope na água mili-Q e ligue o agitador no
nível 3, tomando cuidado com a velocidade para não formar espuma no
interior do béquer.
- 4. Lave dentro da embalagem para retirar todo o resquício de pó.
- 5. Acrescente os 3,7 gramas* de Bicarbonato de sódio, aumentando
suavemente a velocidade da rotação do magneto.
- 6. Coloque o restante da água mili-Q, completando 1L.

- 7. Pare a rotação, e agora será necessária a medição do pH.
* Uso da balança:
- Abrir a porta lateral e limpar a superfície com o pincel, ligando-a em seguida
no botão “on/off”
- Pegar um prato de plástico e colocar no centro da superfície metálica.
- Após ser feita a medida do peso do suporte, apertar o botão “zerar”.
- Colocar com uma espátula de pouco em pouco até completar 3,7 gramas de
Bicarbonato de sódio.
- Retirar o suporte, zerar novamente e desligar a balança em “on/off”.
2.3- Medição do pH e regulação do mesmo (pHmetro):
- 1. Remova o eletrodo da água destilada.
- 2. Lave o eletrodo com água destilada e seque com papel macio.
- 3. Mergulhe o eletrodo na solução e aperte o botão pH.
- 4. Realize a leitura somente quando os dígitos estabilizarem.
- 5. Deve-se regular o pH entre 6,,9-7,1, gotejando com o auxílio de um contagotas
a quantidade necessária de HCl ou NaOH, conforme o indicado.*
- 6. Volte o aparelho para “standby”.
- 7. Lave o eletrodo com água destilada e seque com um papel macio.
- 8. Mergulhe o eletrodo em água destilada.
* Este é um valor de pH por volta de 0,3 unidades menor que o ideal, pois,
durante a filtração, ocorre uma alcalinização do meio que pode elevar de 0,1
a 0,3 unidades o pH.
2.4- Filtração do meio:
- 1. Usar um filtro 0,22 µm.
- 2. No interior da capela, retirar a tampa lateral do filtro e conectar a abertura
aparente à borracha.
- 3. Desenroscar a tampa superior do filtro (retirando uma das borrachas que
vetam a passagem de ar) e retirar o alumínio do béquer que contém o meio,
despejando parte do seu conteúdo no filtro.
- 4. Tampar (sem enroscar) o filtro e repor o alumínio no béquer.
- 5. Ligar a bomba.
- 6. Acresentar o meio conforme o volume do filtro for diminuindo, até finalizar
o conteúdo do béquer, repetindo o procedimento 4.
- 7. Desligar a bomba e desconectar o filtro da borracha.
- 8. Despejar o conteúdo filtrado em recipientes adequados, vedando-os com
suas tampas e com para... . (para despejar, pode ser diretamente ou com uma
pipeta, para saber a quantidade exata). Também é importante identifica-los
com a data de produção.
- 9. Uma pequena quantidade de meio incompleto (2ml) deve ser colocado em
um falcon de 15mL com auxílio de uma pipeta.
- 10. Neste falcon, e com o auxílio de outra pipeta, deve-se despejar 3mL de
LB. Este falcon já devidamente misturado deve permanecer por 24h

noshaker para garantir a esterilidade do meio. Se após 24h esse conteúdo
ficar turvo, é indicação de contaminação.
- 10. Caso não seja para completar os meios imediatamente, mantê-los em
geladeira.
2,5- Completando o meio
Materiais:
10% soro bovino fetal ( localização: freezer a -80º C )
1% L-glutamina ( localização: freezer a -80º C )
1% antibiótico ( localização: freezer a -80º C )
2,5% hepes ( localização: geladeira a -4º C )
Procedimentos:
1. Descongelar todos os materiais armazenados no freezer à temperatura
ambiente (25º C) , colocando-os, para isso, numa vasilha com água.
2. É importante observar se as amostras estão completamente
descongeladas
3. O hepes também deve ser levado à 25º C, retirando-o da geladeira e
deixando-o ...
4. Para 1L de meio, pega-se com uma pipeta para cada material as
quantidades adequadas (100mL de soro bovino fetal, 10mL de Lglutamina,
10mL de antibiótico e 25mL de hepes) , despejando
diretamente no frasco que contém o meio incompleto.
5. O meio está completo.