Exsudação radicular e sua utilização por rizobactérias - IAC
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INSTITUTO AGRONÔMICO<br />
PÓS-GRADUAÇÃO<br />
AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL<br />
<strong>Exsudação</strong> <strong>radicular</strong> e <strong>sua</strong> <strong>utilização</strong> <strong>por</strong> <strong>rizobactérias</strong><br />
ELAINE RODRIGUES DA SILVA<br />
Campinas, SP<br />
Abril de 2011<br />
Orientadora: Dra. Sueli dos Santos Freitas<br />
Dissertação submetida como requisito<br />
parcial para obtenção do grau de<br />
Mestre em Agricultura Tropical e<br />
Subtropical, na área de Gestão de<br />
Recursos Agroambientais.
À minha família<br />
DEDICO<br />
ii
A Deus, fonte da minha vida<br />
AGRADECIMENTOS<br />
À Dra. Sueli dos Santos Freitas pela orientação, pelos valiosos ensinamentos e amizade<br />
À Dra. Terezinha de Jesus Garcia Salva pelo apoio nas análises com o HPLC e ensinamentos<br />
À Dra. Adriana Parada Dias da Silveira pelos conhecimentos e amizade<br />
À Dra. Mônica Ferreira de Abreu pela permissão do uso de seu laboratório nas análises com o<br />
espectrofotômetro<br />
À Rosana pelos inúmeros auxílios a mim concedidos e pela paciência<br />
Aos meus pais, Isaac e Márcia, pelo apoio incondicional e carinho não só neste momento, mas<br />
em todos da minha vida<br />
Aos meus irmãos Cláudia e Fábio e ao meu noivo Rodrigo, pessoas muito im<strong>por</strong>tantes para<br />
mim, sem as quais eu não teria chegado até aqui<br />
Aos colegas de laboratório pelo auxílio na realização de experimentos e momentos de<br />
descontração<br />
Aos amigos e colegas que fizeram os dias serem mais agradáveis: Raquel, Fernanda, Júlia,<br />
Matheus, Ana Olívia, Daniel, Giseli, Jhonny, Kelly, Daniela, Thais, Eliezer e Leonardo<br />
A todos os funcionários da Pós-Graduação do Instituto Agronômico<br />
À Capes pela bolsa concedida<br />
iii
SUMÁRIO<br />
RESUMO......................................................................................................................... v<br />
ABSTRACT.................................................................................................................... vi<br />
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 1<br />
2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................... 2<br />
2.1 As Bactérias do Gênero Pseudomonas...................................................................... 2<br />
2.2 As RPCPs e <strong>sua</strong>s Interações com Plantas.................................................................. 3<br />
2.3 <strong>Exsudação</strong> Radicular................................................................................................. 11<br />
3 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................... 13<br />
3.1 Montagem do Sistema Gnotobiótico......................................................................... 13<br />
3.2 Experimentos de Coleta e Análise de Exsudatos....................................................... 14<br />
3.2.1 Liberação e coleta dos exsudatos.......................................................................... 14<br />
3.2.2 Identificação e quantificação de carboidratos....................................................... 16<br />
3.2.3 Análise do teor de proteínas................................................................................... 16<br />
3.3 Experimento de Utilização, pelos Isolados, dos Açúcares Contidos nos Exsudatos. 17<br />
3.4 Experimento de Avaliação de Colonização das Raízes pelos Isolados..................... 19<br />
3.5 Análises de Variância................................................................................................ 20<br />
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................. 20<br />
4.1 Construção do Sistema Gnotobiótico........................................................................ 20<br />
4.2 Composição de Açúcares dos Exsudatos................................................................... 21<br />
4.3 Concentração de Proteínas dos Exsudatos................................................................. 25<br />
4.4 Utilização, pelos Isolados Bacterianos, dos Açúcares Contidos nos Exsudatos....... 27<br />
4.5 Colonização das Raízes pelos Isolados..................................................................... 30<br />
4.6 Considerações Finais.......................................................................................... 33<br />
5 CONCLUSÕES............................................................................................................ 36<br />
6 REFERÊNCIAS........................................................................................................... 37<br />
iv
<strong>Exsudação</strong> <strong>radicular</strong> e <strong>sua</strong> <strong>utilização</strong> <strong>por</strong> <strong>rizobactérias</strong><br />
RESUMO<br />
Sabe-se que as plantas são capazes de influenciar a composição da comunidade microbiana ao<br />
redor de seu sistema <strong>radicular</strong> pela exsudação de carboidratos e outros compostos. A rizosfera<br />
de alface (Lactuca sativa) é habitada <strong>por</strong> <strong>rizobactérias</strong> promotoras de crescimento de plantas<br />
(RPCPs), inclusive as fluorescentes de Pseudomonas sp. No entanto, a produção de<br />
inoculantes com essas bactérias tem sido dificultada <strong>por</strong> resultados ainda variáveis. Dessa<br />
forma, o principal objetivo deste trabalho foi realizar uma análise mais detalhada do ambiente<br />
rizosférico que permitisse determinar qual a influência da exsudação <strong>radicular</strong> de açúcares e<br />
proteínas <strong>por</strong> alface, sobre a colonização <strong>radicular</strong> <strong>por</strong> essas bactérias rizosféricas,<br />
comparando com os resultados encontrados em chicória e rúcula. Para isso cultivaram-se<br />
plantas de alface, rúcula e chicória em sistema gnotobiótico, sendo analisados os exsudatos<br />
quanto ao teor de açúcar, <strong>por</strong> cromatografia líquida de alto desempenho, e de proteínas, <strong>por</strong><br />
espectrofotometria, 7 e 21 dias após emergência da radícula. Também se testou a <strong>utilização</strong>,<br />
em meio de cultura, dos açúcares encontrados, <strong>por</strong> isolados de Pseudomonas, e<br />
posteriormente a colonização das raízes das plantas pelos mesmos isolados. Detectou-se a<br />
presença de uma certa variedade de açúcares: galactose, xilose, manose e sacarose, em<br />
quantidades traço, e arabinose, frutose e glicose + manose em maiores concentrações. A<br />
exsudação desses açúcares apresentou diferenças em concentração entre as três espécies<br />
vegetais e entre os dois períodos amostrados. Não houve diferenças na exsudação de proteínas<br />
entre as plantas ou períodos. Assim, os açúcares e proteínas parecem não serem os únicos<br />
componentes dos exsudatos responsáveis pela colonização aparentemente preferencial de<br />
espécies fluorescente do gênero Pseudomonas em plantas de alface. Todos os isolados de<br />
Pseudomonas utilizaram pelo menos um dos três açúcares encontrados em maior<br />
concentração (glicose, frutose e arabinose), como única fonte de energia, além de terem<br />
colonizado as raízes das três espécies vegetais.<br />
Palavras-chave: Lactuca sativa, promoção de crescimento, RPCPs.<br />
v
Root exudation and its use by rhizobacteria<br />
ABSTRACT<br />
The plants can influence the composition of microbial communities around their roots<br />
by exudation of carbohydrates and other compounds. The rhizosphere of lettuce (Lactuca<br />
sativa) is inhabited by plant growth promoting rhizobacteria (PGPRs), including fluorescent<br />
Pseudomonas sp. However, the production of inoculants with these bacteria has been<br />
impaired due to unstable results. Thus, the main objective of this study was to realize a more<br />
detailed analysis of the rhizosphere environment to determine the influence of the root<br />
exudation of sugars and proteins from lettuce, concerning the rhizospheric colonization by<br />
these bacteria, and comparing it with endive and arugula. So, lettuce, endive and arugula were<br />
cultivated in gnotobiotic systems, and the exudates were analyzed on the sugar content in<br />
high-performance liquid chromatography, and protein in a spectrophotometer, 7 and 21 days<br />
after the shoot emergence. The use of sugars by Pseudomonas isolates and colonization of<br />
plant roots by these isolates were tested. The presence of a variety of sugars: galactose,<br />
xylose, mannose and sucrose in trace amounts, and arabinose, glucose + maltose and fructose<br />
at higher concentrations was detected. The exudation of these sugars presented concentrations<br />
differences between the three plant species and between the two periods. There were no<br />
differences in the exudation of proteins between plants or periods. Thus, the sugars and<br />
proteins were not the only components of the exudates responsible for the colonization<br />
species of fluorescent Pseudomonas in lettuce. All strains of Pseudomonas used at least one<br />
of the three sugars found in higher concentrations (glucose + maltose, fructose and arabinose)<br />
as the only energy source, and have colonized the roots of three plant species.<br />
Key-words: PGPR, Lactuca sativa, grown promoting<br />
vi
1 INTRODUÇÃO<br />
Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs) são bactérias que<br />
colonizam raízes de plantas e promovem seu crescimento quando inoculadas em sementes,<br />
raízes ou tubérculos. Esse grupo de bactérias vem sendo pesquisado há décadas em todo o<br />
mundo, com vários relatos de sucesso e de insucesso, em diversas situações. Os principais<br />
gêneros de bactérias que têm sido usados como promotores de crescimento, em estudos, são<br />
Pseudomonas spp., Azospirillum spp., Bacillus spp., Burkholderia spp. e Azotobacter spp.<br />
Espécies de Pseudomonas têm sido benéficas em cereais e leguminosas, entre outros grupos<br />
vegetais.<br />
Acredita-se que as RPCPs produzam substâncias promotoras de crescimento, como os<br />
fitormônios auxina, citocinina e giberelina, e previnam o estabelecimento de patógenos na<br />
rizosfera <strong>por</strong> produzirem antibióticos, sideróforos ou enzimas hidrolíticas, além de poderem<br />
induzir a resistência sistêmica. Mas, apesar do conhecimento de seus benefícios às plantas, as<br />
RPCPs ainda não são usadas na produção de inoculantes <strong>por</strong>que os resultados obtidos em<br />
estudos ainda são variáveis, ou seja, são resultados que não se repetem, ou testes in vitro cujos<br />
resultados não são alcançados no campo.<br />
Entre as espécies de RPCPs estão algumas das fluorescentes do gênero Pseudomonas,<br />
que habitam a rizosfera de algumas plantas, como a alface (Lactuca sativa), favorecendo seu<br />
crescimento. Como o local onde vivem e atuam é o ambiente rizosférico, é aí que se devem<br />
buscar os fatores que determinam o sucesso de seu estabelecimento, o que poderia explicar a<br />
instabilidade nos resultados dos trabalhos com as RPCPs. Assim, seria im<strong>por</strong>tante entender se<br />
os exsudatos da alface têm influência sobre as bactérias rizosféricas e como isso ocorre,<br />
podendo significar a colonização ou não do ambiente rizosférico, já que vários estudos têm<br />
indicado que a composição e a quantidade dos exsudatos liberados pelas raízes influenciam<br />
diretamente o ambiente rizosférico, beneficiando a colonização de certas comunidades.<br />
Assim, as raízes das plantas liberam vários compostos como açúcares, ácidos<br />
orgânicos, aminoácidos, entre outros, e tanto este conteúdo como a quantidade em que são<br />
liberados são influenciados <strong>por</strong> diversos fatores, como espécie da planta e estádio de<br />
desenvolvimento da planta, e também influenciam diferentemente a microbiota rizosférica,<br />
podendo levar a diferentes resultados quanto à colonização <strong>radicular</strong>.<br />
1
Sabe-se, <strong>por</strong> exemplo, que a rizosfera de alface favorece a colonização de bactérias<br />
fluorescentes do gênero Pseudomonas, em comparação com outras plantas e com outra<br />
bactéria rizosférica do gênero Bacillus, independentemente do ambiente de cultivo ou das<br />
características do solo, e que este fato deve ser devido à composição e quantidade de<br />
exsudatos liberados pelas diferentes plantas. Assim, a composição e as quantidades das<br />
substâncias liberadas pela alface favoreceriam as bactérias fluorescentes do gênero<br />
Pseudomonas.<br />
Dessa forma, comprovada a influência da espécie vegetal na colonização da região<br />
rizosférica e tendo em mente que os exsudatos liberados podem exercer grande influência<br />
sobre essa característica, seria im<strong>por</strong>tante descobrir qual a composição dos exsudatos de<br />
Lactuca sativa (alface), em pelo menos algumas substâncias, e se alguma delas tem efeito<br />
sobre o crescimento de Pseudomonas spp. do grupo fluorescente.<br />
Portanto, os objetivos deste trabalho foram a verificação da im<strong>por</strong>tância da exsudação<br />
<strong>radicular</strong> de açúcares e proteínas <strong>por</strong> alface sobre a colonização rizosférica <strong>por</strong> bactérias<br />
rizosféricas fluorescentes do gênero Pseudomonas e a avaliação, in vivo, do estabelecimento<br />
de espécies de Pseudomonas fluorescentes na rizosfera de alface em comparação com outras<br />
espécies vegetais.<br />
2.1 As Bactérias do Gênero Pseudomonas<br />
2 REVISÃO DE LITERATURA<br />
As bactérias do gênero Pseudomonas são Gram-negativas, habitam normalmente o<br />
solo e a água, onde <strong>sua</strong>s atividades são im<strong>por</strong>tantes na mineralização da matéria orgânica.<br />
Algumas espécies causam doenças em plantas e exibem variados graus de especificidade com<br />
hospedeiros (BUCHANAN & GIBBONS, 1974).<br />
A maioria das espécies estudadas, incluindo as parasitas, não requerem nenhum fator<br />
de crescimento e podem se desenvolver em meio mineral com um composto orgânico como<br />
única fonte de carbono e energia. Poucas espécies requerem aminoácidos ou vitaminas. O<br />
acetato pode ser usado como principal nutriente <strong>por</strong> todas as espécies que têm sido<br />
caracterizadas. O lactato, o succinato e a glicose podem ser usados pela maioria, mas não <strong>por</strong><br />
todas as espécies. Uma característica marcante de muitos membros do gênero é <strong>sua</strong> habilidade<br />
2
em usar uma grande variedade de compostos orgânicos como única ou principal fonte de<br />
crescimento: alguns isolados utilizam mais de 100 diferentes substratos (BUCHANAN &<br />
GIBBONS, 1974).<br />
O grupo fluorescente produz pigmentos amarelo-esverdeados, que fluorescem em luz<br />
ultravioleta (comprimento de onda abaixo de 260 nm), particularmente em meios deficientes<br />
em ferro (<strong>por</strong> exemplo: meio B de KING et al., 1954). Algumas espécies de Pseudomonas<br />
fluorescentes também produzem pigmentos denominados fenazinas, que podem ser azuis,<br />
alaranjados ou verdes, particularmente no meio A de KING et al. (1954).<br />
Muitos estudos vêm indicando que as bactérias do gênero Pseudomonas<br />
frequentemente dominam a rizosfera, onde têm papel fundamental na ciclagem de nutrientes e<br />
na fertilidade do solo (ROSALES et al., 1995; PICARD et al., 2000) e como <strong>rizobactérias</strong><br />
promotoras do crescimento de plantas (RPCPs) (PICARD et al., 2000; ROSS et al., 2000;<br />
BERGSMA-VLAMI et al., 2005).<br />
Dentre as RPCPs, as Pseudomonas, principalmente as do grupo fluorescente, são as<br />
bactérias mais bem estudadas, devido a <strong>sua</strong>s características como presença em diversos<br />
ambientes e em elevadas populações, versatilidade nutricional, antagonismo a diversos<br />
patógenos e produção de antibióticos, sideróforos e hormônios de crescimento vegetal<br />
(MELO & AZEVEDO, 1998).<br />
2.2 As RPCPs e <strong>sua</strong>s Interações com Plantas<br />
A rizosfera abriga uma variedade de microrganismos, que podem ser benéficos,<br />
prejudiciais ou neutros ao crescimento da planta. Entre os benéficos estão as RPCPs, cuja<br />
ação tem sido mostrada em diferentes condições de clima, solo e temperatura e em diferentes<br />
espécies de plantas (arroz, trigo, alface, milho, leguminosas etc.), como mostram os estudos<br />
de FREITAS & GERMIDA (1992a); SINDHU et al. (2002); EGAMBERDIYEVA &<br />
HÖFLICH (2003); FREITAS et al. (2003); CONG et al. (2009); entre muitos outros.<br />
Os efeitos benéficos das RPCPs têm sido observados tanto no aumento da<br />
produtividade das culturas como na redução de comunidades de microrganismos patogênicos.<br />
EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH (2003), <strong>por</strong> exemplo, perceberam que algumas espécies<br />
de Pseudomonas causaram um aumento significativo na absorção de P e K em trigo e que<br />
espécies de Mycobacterium também tiveram efeito positivo em trigo, causando maior<br />
absorção de N, P e K. Todas as espécies promoveram aumento da massa de matéria seca das<br />
raízes e da parte aérea. Posteriormente, EGAMBERDIEVA (2007) novamente detectou os<br />
3
mesmos benefícios pro<strong>por</strong>cionados <strong>por</strong> essas bactérias em milho. ROSAS et al. (2009)<br />
obtiveram resultados semelhantes com as mesmas espécies vegetais (trigo e milho) que<br />
receberam o inóculo de Pseudomonas aurantiaca. Além disso, aplicaram também<br />
fertilizantes, demonstrando que o inóculo reduziu a necessidade de fertilizantes à base de<br />
uréia, o que concorda com o trabalho de CONG et al. (2009), que conseguiram economizar 43<br />
kg ha -1 de N em arroz, com aumento da produção de 270 kg ha -1 , em duas estações chuvosas<br />
subsequentes, ajudando, além da economia, a mitigar a poluição <strong>por</strong> nitrogênio inorgânico de<br />
águas superficiais e subterrâneas.<br />
NAIMAN et al. (2009) relataram para trigo um aumento na massa de matéria seca na<br />
fase de preenchimento de grãos, em plantas que receberam inoculantes comerciais, um com P.<br />
fluorescens e dois com Azospirillum brasiliense. As plantas que receberam P. fluorescens<br />
apresentaram um aumento de 23% na biomassa da parte aérea, de 46% na massa de matéria<br />
seca da raiz e de 19% na produção de grãos em comparação com o controle.<br />
Efeitos semelhantes foram observados <strong>por</strong> outros pesquisadores, com o inóculo de<br />
várias bactérias consideradas promotoras de crescimento, como a elongação de raízes e parte<br />
aérea de canola, alface e tomate (GLICK et al., 1997; FREITAS et al., 2003); aumento da<br />
concentração de nutrientes na parte aérea e raízes de plantas e melhor eficiência na <strong>utilização</strong><br />
na <strong>utilização</strong> destes (EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH, 2003; EGAMBERDIYEVA, 2007;<br />
BARRETTI et al., 2008; REIS-JÚNIOR et al., 2008;); aumento da área foliar e massa de<br />
matéria seca e/ou fresca da parte aérea e/ou raízes (FREITAS, 1989; SINDHU et al., 1999,<br />
2002; GOMES et al., 2003; FREITAS & AGUILAR-VILDOSO, 2004; BARRETI et al.,<br />
2008; REIS-JÚNIOR et al., 2008); além de promover a germinação de sementes de grão de<br />
bico e soja (DILEEP KUMAR & DUBE, 1992); aumento do conteúdo de açúcar em beterraba<br />
(ÇAKMAKÇI et al., 2006) e aumento do número de nódulos de feijão mungo (Vigna radiata)<br />
(SINDHU et al., 1999). Mesmo em condições extremas (estresse salino ou de temperatura), os<br />
isolados de canola (colonizadores efetivos de canola) promoveram o crescimento das plantas,<br />
enquanto os introduzidos não apresentaram o mesmo desempenho (GLICK et al., 1997).<br />
ÇAKMAKÇI et al. (2006), além de observarem maior crescimento de beterraba,<br />
comprovando os efeitos benéficos da RPCPs, ainda observaram que os maiores benefícios<br />
ocorreram logo nos estádios iniciais de desenvolvimento da planta, ou seja, a rápida resposta<br />
inicial às bactérias inoculadas fez com que as folhas se expandissem antes que o esperado e<br />
que as raízes alcançassem rapidamente seu pico de desenvolvimento.<br />
Assim, muitos estudos têm comprovado a ação benéfica das RPCPs a muitas culturas e<br />
<strong>por</strong> mecanismos variados, muitos dos quais estão descritos na literatura, e cujo conhecimento<br />
4
é imprescindível para a exploração dos diferentes potenciais de cada uma das bactérias, nas<br />
várias culturas e condições ambientais.<br />
Um bom exemplo de um mecanismo foi a produção de enzimas <strong>por</strong> bactérias do<br />
gênero Pseudomonas, em trabalho realizado <strong>por</strong> SHAHAROONA et al. (2006). Em seus<br />
experimentos com milho, percebeu que muitas linhagens de Pseudomonas causaram<br />
crescimento da planta, das raízes e a biomassa geral, mesmo em níveis ótimos de N, visto que<br />
altos níveis de NO3 - na região da raiz levam ao aumento da produção de etileno, que é<br />
inibitório ao crescimento de raízes, além de ser provável que reduzam a eficiência das RPCPs.<br />
O autor chegou à conclusão de que esse resultado se deveu à atividade da ACC-deaminase<br />
produzido pelas bactérias, que baixaram os níveis de etileno, pelo “seqüestro” do ACC, um<br />
precursor do etileno, promovendo o crescimento das raízes. A linhagem de P. fluorescens foi<br />
a mais eficaz, o que pode ter sido devido à alta capacidade de colonização dessa bactéria,<br />
segundo o autor, e pela atividade das enzimas quitinase e ACC-deaminase.<br />
EGAMBERDIYEVA (2007) detectou a produção de outras enzimas (amilase, lipase,<br />
celulase e protease) <strong>por</strong> diferentes isolados de Pseudomonas e Mycobacterium, sendo que os<br />
isolados que produziram essas enzimas também inibiram o crescimento de fungos patogênicos<br />
do gênero Fusarium.<br />
Outros trabalhos relataram a produção de fitormônios <strong>por</strong> RPCPs, como<br />
DUBEIKOVSKY et al. (1993), em que dois isolados de Pseudomonas, cuja produção de<br />
ácido indol acético (AIA) foi detectada, foram inoculados em árvores de groselha. Houve um<br />
efeito estimulante no desenvolvimento <strong>radicular</strong> dessas plantas, tendo o tamanho da<br />
população do isolado inoculado na superfície <strong>radicular</strong> se correlacionado com o efeito<br />
observado. Fato semelhante foi relatado <strong>por</strong> EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH (2003), em<br />
que todos os isolados que promoveram o aumento do conteúdo de nutrientes nas plantas<br />
produziram auxinas, servindo provavelmente como um regulador que estimulou o<br />
desenvolvimento das raízes, resultando em uma melhor absorção de nutrientes e de água.<br />
Além das auxinas, a produção de citocininas foi detectada em Paenibacillus polymyxa durante<br />
<strong>sua</strong> fase estacionária de crescimento (TIMMUSK et al., 1999).<br />
Além da promoção direta de crescimento, há também vários estudos que comprovam a<br />
ação das RPCPs na supressão de microrganismos deletérios, como os estudos feitos <strong>por</strong><br />
SINDHU et al. (1999, 2002), em que espécies de Pseudomonas isoladas da rizosfera de grama<br />
foram inoculadas em solos infestados com potenciais patógenos (Aspergillus sp., Curvularia<br />
sp., Fusarium oxys<strong>por</strong>um e Rhizoctonia solani), inibindo o crescimento desses fungos; de<br />
maneira semelhante, em resultados relatados <strong>por</strong> EGAMBERDIYEVA (2007), espécies de<br />
5
Mycobacterium, Pseudomonas e Bacillus apresentaram reação antagônica contra fungo<br />
patogênico do gênero Fusarium. No Brasil, AGNANI et al. (2005) e FREITAS &<br />
PIZZINATTO (1997), entre outros, observaram também a inibição da manifestação de<br />
patógenos em plantas cítricas e em algodoeiro, respectivamente.<br />
A atividade de promoção de crescimento também pode ocorrer pela produção de<br />
sideróforos, quelantes de ferro de baixo peso molecular, excretados sob condições de<br />
deficiência de ferro. Assim, os sideróforos são ligantes específicos de Fe(III), e desempenham<br />
a função de seqüestrar e trans<strong>por</strong>tar esse íon, incor<strong>por</strong>ando-o ao metabolismo celular<br />
(BENITE et al., 2002). Dessa forma, os sideróforos produzidos pelas bactérias complexam o<br />
ferro do ambiente, tornando-o menos disponível a certos microrganismos do solo<br />
(KLOEPPER et al., 1980). No trabalho conduzido <strong>por</strong> SINDHU et al. (2002), isolados de<br />
Pseudomonas produtores de sideróforos e de antibióticos foram os responsáveis pelo<br />
antagonismo, inibindo o crescimento de vários fungos patogênicos (Aspergillus sp.,<br />
Curvularia sp., Fusarium sp. e Rhizoctonia sp.). Também se relatou a ação supressora do<br />
antibiótico fenazina-1-ácido-carboxílico produzido <strong>por</strong> Pseudomonas fluorescens contra o<br />
microrganismo patogênico Gaeumannomyces graminis (BULL et al., 1991).<br />
As RPCPS podem ainda estimular a indução de resistência sistêmica (IRS) na planta,<br />
ou seja, um aumento da capacidade defensiva das plantas contra um amplo espectro de<br />
patógenos, que é adquirida após um estímulo apropriado (RAMAMOORTHY et al., 2001).<br />
Em um estudo em que se aplicou Pseudomonas em plantas de arroz contaminadas com<br />
Rhizoctonia solani, NANDAKUMAR et al. (2001) detectaram a redução da severidade da<br />
doença causada pelo fungo e a promoção do crescimento da planta sob condições de casa de<br />
vegetação e de campo. Assim, chegou-se à conclusão que a redução da doença ocorreu pela<br />
IRS, provavelmente pela indução de enzimas de defesa, ou diretamente pela inibição do<br />
crescimento do fungo pela produção de quitinases ou antibióticos.<br />
Semelhantemente, DUTTA et al. (2008) testaram o efeito de dois isolados de RPCPs<br />
(Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa), na indução de resistência sistêmica contra<br />
Fusarium udum em ervilhas-de-angola. Concluiu-se que essas bactérias foram capazes de<br />
induzir a resistência sistêmica na planta. Duas enzimas líticas produzidas pelo fungo,<br />
responsáveis pela superação da resistência natural das plantas hospedeiras e pela solubilização<br />
de produtos que podem ser absorvidos e usados como alimento, foram fortemente reduzidas<br />
na presença das bactérias. Além disso, os autores acharam não só que as bactérias foram<br />
capazes de induzir resistência sistêmica em ervilha-de-angola, como demonstraram que a<br />
combinação desses isolados mostrou ser ainda mais eficiente.<br />
6
Há evidências que sugerem que Pseudomonas spp. agiram sinergisticamente com<br />
espécies de Mesorhizobium sp., como os resultados obtidos <strong>por</strong> STURZ et al. (1997). Esses<br />
autores demonstraram que a inoculação conjunta de linhagens bacterianas, que<br />
individualmente inibiam o crescimento da planta, pode estimular o crescimento. Fato<br />
semelhante foi relatado nos estudos realizados <strong>por</strong> SINDHU et al. (2002), em que tanto a<br />
inoculação somente com Pseudomonas quanto a inoculação somente com Mesorhizobium<br />
resultaram em aumento da biomassa e teor de N da planta, mas uma co-inoculação de<br />
Mesorhizobium e Pseudomonas resultou em um aumento ainda maior na massa de matéria<br />
fresca do nódulo e da raiz e na massa de matéria seca da parte aérea, além de um aumento<br />
significativo do N total da planta.<br />
Estudando a ação de microrganismos – incluindo algumas espécies de Pseudomonas –<br />
quanto ao efeito de crescimento em plantas de tomate infectadas com Pythium, GRAVEL et<br />
al. (2007) mostraram o efeito estimulante de P. putida na produção de frutos e no<br />
crescimento de plantas de tomate cultivadas em sistemas hidropônicos, ou seja, uma possível<br />
reação antagonística a esse fungo patogênico. Esse estudo também mostrou que P. putida é<br />
capaz de sintetizar AIA in vitro a partir de diversos precursores, o que su<strong>por</strong>ta a teoria de que<br />
o AIA microbiano pode estar envolvido no estímulo de crescimento observado nos<br />
experimentos. Assim, chegaram à conclusão de que a capacidade de P. putida de promover<br />
crescimento deve ser um efeito sinérgico de vários modos de ação exibidos <strong>por</strong> cada<br />
microrganismo testado, incluindo a regulação de concentrações de AIA na rizosfera e a<br />
regulação da concentração de etileno dentro das raízes.<br />
Assim, de acordo com os relatos descritos na literatura, os mecanismos ou modos de<br />
ação das RPCPs podem ser sintetizados em:<br />
Mobilização de nutrientes insolúveis e consequente aumento de <strong>sua</strong> absorção pelas<br />
plantas (GOMES et al., 2003; ÇAKMAKÇI et al., 2006; BARRETTI et al., 2008);<br />
Estimulação de crescimento pela produção de fitormônios como auxinas, citocininas e<br />
giberelinas (DUBEIKOVSKY et al., 1993; TIMMUSK et al., 1999;<br />
EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH, 2003; EGAMBERDIYEVA, 2007);<br />
Antagonismo a patógenos de plantas (SINDHU et al., 2002; FREITAS & AGUILAR-<br />
VILDOSO, 2004; AGNANI et al., 2005; COSTA et al., 2006);<br />
Produção de sideróforos e antibióticos (KLOEPPER et al., 1980; BULL et al., 1991;<br />
SINDHU et al., 2002);<br />
7
Produção de enzimas hidrolíticas (FRIDLENDER et al., 1993; EGAMBERDIYEVA<br />
& HÖFLICH, 2003; EGAMBERDIYEVA, 2007);<br />
Indução de resistência sistêmica (NANDAKUMAR et al., 2001; DUTTA et al., 2008)<br />
Apesar de os efeitos benéficos das RPCPs serem conhecidos há muito tempo, com a<br />
maioria dos trabalhos apresentando resultados positivos, nem sempre esses resultados se<br />
repetem (STURTZ & CHRISTIE, 2003), e <strong>por</strong> isso não são conhecidos muitos casos do uso<br />
dessas bactérias para a produção de inoculantes.<br />
De fato, REIS-JUNIOR et al. (2008) também encontraram inconsistência em seu<br />
trabalho, pois, apesar de outros trabalhos citarem o efeito da inoculação com Azospirillum na<br />
atividade das enzimas nitrato redutase e glutamina sintetase, em seu estudo não se observou<br />
esse efeito. Essa inconsistência também pode se expressar pela obtenção de resultados in<br />
vitro que não se repetem no campo (GOMES et al., 2003).<br />
Face aos inúmeros fatores que influenciam a interação planta-bactéria, diversas podem<br />
ser as causas dessa instabilidade nos resultados. Entre as hipóteses do <strong>por</strong>quê dessas<br />
variações está a de que os isolados bacterianos não estejam colonizando a rizosfera e<br />
consequentemente não há manutenção de uma comunidade viável na zona <strong>radicular</strong> (STURZ<br />
& CHRISTIE, 2003), não havendo interação com a planta.<br />
SOTTERO et al. (2006), <strong>por</strong> exemplo, verificaram que 10 de 64 isolados de<br />
Pseudomonas testados não colonizaram a rizosfera, e que um entre eles ainda assim<br />
promoveu o crescimento. Os autores chegaram à conclusão de que se tratava de uma bactéria<br />
endofítica. As outras que não colonizaram também não promoveram o crescimento. Além<br />
disso, detectaram que a maioria das bactérias colonizou a região do colo, chegando à<br />
conclusão de que a colonização do colo já é suficiente para demonstrar que houve interação<br />
de bactérias e plantas.<br />
Já os autores KUMAR et al. (2007) relataram aumento de 144,9% na produção de<br />
milho, comparado ao controle, quando as plantas receberam inóculo de Pseudomonas<br />
corrugata, atribuindo os bons resultados ao fato de que houve o estabelecimento, na rizosfera,<br />
da bactéria inoculada, ou seja, sobreviveu em número suficiente e colonizou as raízes. Esses<br />
resultados podem, então, ser atribuídos ao fato de que, segundo os autores, Pseudomonas<br />
corrugata tem uma alta e rápida capacidade de colonização da raiz de milho.<br />
Assim, além de ser necessária uma colonização eficiente, EGAMBERDIYEVA &<br />
HÖFLICH (2003), pela análise de seus resultados e em concordância com o trabalho de<br />
FREITAS & GERMIDA (1992b), chegaram à conclusão de que para obtenção de bons<br />
8
esultados com RPCPs é necessário que as bactérias colonizem rapidamente o sistema<br />
<strong>radicular</strong>, processo influenciado pela temperatura e pelo tipo de solo, e que para aplicações<br />
práticas o sistema planta-RPCPs deve ser estabelecido para cada tipo de ambiente, já que as<br />
bactérias oriundas de uma região de clima semi-continental foram mais eficientes em<br />
temperaturas relativamente baixas, enquanto que as oriundas de regiões de clima semi-árido<br />
apresentaram resultados mais efetivos em climas relativamente mais quentes. Da mesma<br />
forma KUMAR et al. (2007) relataram que as bactérias com maior sucesso e que<br />
apresentaram maiores benefícios para o milho foram aquelas isoladas do próprio milho e de<br />
regiões com clima igual ao do local onde foram isoladas. As outras bactérias, isoladas de<br />
outras plantas, também foram inoculadas em milho, mas apresentaram benefícios menores.<br />
Há outros relatos de que os resultados provenientes da inoculação desses<br />
microrganismos podem ser grandemente influenciados pelo conteúdo de nutrientes (PAULA<br />
et al., 1992) e tipo de solo, como observados <strong>por</strong> ÇAKMAKÇI et al. (2006),<br />
EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH (2003), EGAMBERDIYEVA (2007) e FREITAS &<br />
GERMIDA (1992b), que obtiveram seus melhores resultados em solos com baixos teores de<br />
nutrientes. A deficiência de nutrientes do solo teria sido compensada pela produção<br />
microbiana de substâncias reguladoras na interface solo-raiz, o que, <strong>por</strong> <strong>sua</strong> vez, teria<br />
estimulado um melhor desenvolvimento das raízes, resultando numa melhor absorção de água<br />
e nutrientes do solo (EGAMBERDIYEVA, 2007). No Brasil, FREITAS et al. (2003)<br />
detectaram respostas diferentes no crescimento de alface de acordo com a fertilidade de<br />
diferentes substratos testados.<br />
Da mesma forma, dois diferentes tipos de substratos influenciaram a exsudação,<br />
qualitativa e quantitativamente, sendo que um deles estimulou a exsudação de ácidos e<br />
açúcares, enquanto que o outro não alterou substancialmente os padrões de exsudação<br />
(KAMILOVA et al., 2006).<br />
Assim, outros fatores podem influenciar a ação das RPCPs, pela flutuação dos fatores<br />
edáficos como temperatura (LOPER et al., 1984; SEONG et al., 1991), variação da umidade<br />
do solo (PARKE et al., 1986; HOWIE et al., 1987), do pH (HÖPER et al., 1995), tipo de solo<br />
e histórico de cultura (LATOUR et al., 1999), diferentes interações com a microbiota<br />
rizosférica predominante de determinada cultura (MILLER et al., 1989; SEONG et al., 1991;<br />
SINDHU et al., 1999), ou mais especificamente, diferentes tipos de interação com rizóbios<br />
predominantes na rizosfera de algumas leguminosas (PARMAR & DADARWAL, 1999;<br />
SINDHU et al., 1999). Sabe-se inclusive que diferentes pCO2 alteram o com<strong>por</strong>tamento de<br />
Pseudomonas spp. quanto à produção de sideróforos e quanto à frequência de produtores de<br />
9
HCN e redutores de nitrato, sendo esses fatores também alterados pelo estádio de vida da<br />
planta amostrada e fração do solo (rizosférico, não rizosférico ou raiz propriamente dita)<br />
(TARNAWSKI et al., 2006).<br />
Outra hipótese do <strong>por</strong>quê das variações nos resultados é o fato de que diferentes<br />
quantidades e composição dos exsudatos <strong>radicular</strong>es liberados pelas raízes poderiam levar a<br />
diferentes resultados, já que a exsudação <strong>radicular</strong> influencia diretamente o ambiente<br />
rizosférico. Há muito se sabe que plantas liberam pelas raízes uma grande variedade de<br />
substâncias orgânicas, como açúcares, aminoácidos, ácidos graxos e outros (BOWEN &<br />
ROVIRA, 1987).<br />
Segundo os estudos realizados, a quantidade e a qualidade dos exsudatos liberados<br />
pelas plantas são diretamente influenciadas <strong>por</strong> vários fatores como espécie da planta<br />
hospedeira (GRAYSTON et al., 1998; COELHO et al., 2007), estádio de desenvolvimento da<br />
planta (PILET et al., 1979), seu estado fisiológico (SANDNES et al., 2005) e <strong>por</strong> outros<br />
fatores como condições ambientais (HASSINK et al., 1991) e concentração de nutrientes,<br />
como observaram KRAFFCZYIK et al. (1984), que demonstraram que, sob diferentes<br />
concentrações de potássio, a exsudação <strong>radicular</strong> de milho foi alterada. Por isso NEHL et al.<br />
(1996) comentam que a classificação entre <strong>rizobactérias</strong> benéficas, prejudiciais e neutras pode<br />
induzir ao erro, já que o efeito das bactérias pode ser alterado de acordo com esses vários<br />
fatores.<br />
Com relação à alface, COELHO et al. (2007) verificaram que <strong>sua</strong> rizosfera favorece o<br />
estabelecimento de bactérias fluorescentes do gênero Pseudomonas, em comparação com<br />
outras plantas (salsa, rúcula, chicória e tiririca) e outra bactéria rizosférica do gênero Bacillus.<br />
Na maior parte dos resultados, as quantidades de Pseudomonas em alface, tanto crespa como<br />
lisa, foram bem maiores, em relação às outras plantas, mesmo no caso da chicória, que<br />
pertence à mesma família da alface. E esses resultados foram detectados independentemente<br />
do ambiente, ou seja, das características do solo ou condições de cultivo. Dessa forma, as<br />
autoras chegaram à conclusão de que pode ter havido uma diferença entre as exsudações das<br />
plantas, tanto na composição quanto na quantidade liberada; a composição e as quantidades<br />
das substâncias liberadas pela alface favoreceram as bactérias fluorescentes do gênero<br />
Pseudomonas, em relação à Bacillus.<br />
Em concordância com esses dados, LUGTENBERG et al. (1999) também<br />
demonstraram que nos diferentes estádios de tomateiro a composição e a quantidade dos<br />
exsudatos variavam e <strong>por</strong> isso as comunidades colonizadoras também deveriam variar. De<br />
fato, MALONEY et al. (1997), comparando a abundância e a distribuição espacial de<br />
10
comunidades de bactérias fisiologicamente diferentes que existem em diferentes <strong>por</strong>ções da<br />
raiz de tomateiro e alface, encontraram distribuições muito diferentes nas várias regiões da<br />
raiz e entre as duas culturas também, indicando diferenças qualitativas e quantitativas nas<br />
exsudações <strong>radicular</strong>es entre tomate e alface, com diferenças no desenvolvimento das plantas<br />
e diferentes morfologias <strong>radicular</strong>es.<br />
Semelhantemente, a inoculação de Pseudomonas spp. isoladas de feijão mungo (Vigna<br />
radiata) teve efeito inibitório na elongação da radícula em sementes de grão-de-bico<br />
ocorrendo parada de crescimento das plântulas após 5 dias de observação; no entanto, depois<br />
do 9º dia observou-se crescimento, mostrando que os efeitos são variados, dependendo da<br />
planta e de seu estádio de desenvolvimento (SINDHU et al., 2002). Já FREITAS &<br />
AGUILAR-VILDOSO (2004), apesar de acharem um grande número de bactérias,<br />
principalmente do gênero Pseudomonas, que promoveram o crescimento de plantas cítricas,<br />
verificaram diferentes capacidades de promoção de crescimento das plantas, dependendo das<br />
condições como espécie vegetal, estádio de desenvolvimento e ambiente (campo ou<br />
citropotes).<br />
2.3 <strong>Exsudação</strong> Radicular<br />
A exsudação de compostos orgânicos variados, pelas raízes das plantas, é um fato<br />
conhecido há muitas décadas (BOWEN & ROVIRA, 1987). Esses compostos são liberados,<br />
ativa ou passivamente, durante todas as fases do desenvolvimento das plantas, em quantidades<br />
e composições diversas, dependendo de vários fatores, como a espécie da planta e as<br />
condições de estresse às quais são submetidas (JONES, 1998). Os principais compostos<br />
exsudados são os carboidratos, os ácidos orgânicos e os aminoácidos, que são liberados<br />
passivamente, ao longo de um gradiente de concentração (BOWEN & ROVIRA, 1987;<br />
LYNCH & WHIPPS, 1990; GRAYSTON et al., 1998).<br />
Dentre os carboidratos têm sido relatados como componentes dos exsudatos glicose,<br />
frutose, maltose, ribose, xilose, arabinose, ramnose e sacarose, além de oligossacarídeos<br />
(ROVIRA, 1969; SMITH, 1970; LUGTENBERG et al., 1999; KAMILOVA et al., 2006). As<br />
quantidades variam com as espécies de plantas, fase de desenvolvimento e inclusive com o<br />
método de coleta. LUGTENBERG et al. (1999), <strong>por</strong> exemplo, detectaram, para tomate, que<br />
os açúcares glicose e frutose estavam presentes na pro<strong>por</strong>ção de 37% e 10% do total de<br />
carboidratos, respectivamente, enquanto KAMILOVA et al. (2006), detectaram esses mesmos<br />
açúcares, também em tomate, na pro<strong>por</strong>ção de 33% e 60%, respectivamente, quando os<br />
11
exsudatos foram coletados em lã de rocha (stonewool) e 37% e 58%, respectivamente, quando<br />
coletados em esferas de vidro (glass beads). Nesse mesmo trabalho as concentrações de<br />
ácidos orgânicos também variaram de acordo com o método de coleta, mas em uma pro<strong>por</strong>ção<br />
ainda maior.<br />
Os ácidos mais comumente encontrados nos exsudatos são o cítrico, acético, pirúvico,<br />
málico, malônico, butírico, lático, oxalacético, t-aconítico, succínico, fumárico e<br />
piroglutâmico (SMITH, 1970; JONES, 1998; KAMILOVA et al., 2006).<br />
Os aminoácidos parecem ser menos estudados nos exsudatos, e dentre esses<br />
compostos SMITH (1970) e ROVIRA (1969) relataram a presença de alanina, glutamina,<br />
ácido glutâmico, ácido aspártico, glicina, homoserina, leucina, isoleucina, metionina,<br />
fenilalanina, serina, treonina, tirosina, asparagina e valina.<br />
Sabe-se que as plantas são capazes de influenciar a composição de <strong>sua</strong> comunidade<br />
rizosférica pela liberação justamente dessa variedade de compostos orgânicos (GRAYSTON<br />
et al., 1998) e que esses microrganismos podem apresentar alguma especificidade, inclusive<br />
para cultivares de uma mesma espécie (CHANWAY et al., 1988; SICILIANO et al., 1998),<br />
ou ainda iniciar mudanças na bioquímica <strong>radicular</strong> (PARMAR & DARDAWAL, 1999),<br />
apoiando a hipótese de que a parceria rizobactéria-planta tem uma longa história de uma bem<br />
sucedida co-evolução (STURZ & CHRISTIE, 2003).<br />
Dessa forma, muitos estudos têm mostrado que rizosferas diferentes possuem<br />
comunidades microbianas diferentes, provavelmente devido aos diferentes padrões de<br />
exsudação (ZAK et al., 1994; GRAYSTON & CAMPBELL, 1996; GRAYSTON et al., 1998;<br />
YANG & CROWLEY, 2000).<br />
Em um estudo com exsudatos e <strong>sua</strong> influência nas comunidades rizosféricas, LANDI<br />
et al. (2006) concluíram que, dos compostos exsudados, o ácido oxálico induziu maior<br />
número de mudanças nos grupos de bactérias que habitam o ambiente rizosférico, comparado<br />
à glicose. Isso seria devido ao fato de que a glicose é decomposta <strong>por</strong> um maior número de<br />
microrganismos, em oposição ao ácido oxálico, que, <strong>por</strong> ser utilizado <strong>por</strong> um número mais<br />
restrito de espécies microbianas, modificou os grupos de microrganismos presentes na<br />
rizosfera.<br />
LUGTENBERG et al. (1999), <strong>por</strong> <strong>sua</strong> vez, trabalharam com espécies selvagens e<br />
mutantes de Pseudomonas com objetivo de desvendar a característica dos exsudatos de<br />
tomateiro e de entender seu papel na colonização <strong>radicular</strong> pelas bactérias. Assim, utilizando-<br />
se de uma espécie mutante, que era incapaz de utilizar a glicose como única fonte de carbono,<br />
chegaram à conclusão de que a habilidade de usar os açúcares exsudados não desempenha um<br />
12
papel tão im<strong>por</strong>tante na colonização <strong>radicular</strong>, havendo, <strong>por</strong>tanto, outros fatores que<br />
influenciam a colonização, como os ácidos orgânicos e polímeros, <strong>por</strong> exemplo.<br />
LANDI et al. (2006) observaram que a glicose – e não o ácido oxálico – é usada pela<br />
maioria das comunidades bacterianas do solo. Constataram também que a atividade<br />
microbiana e a composição da comunidade dependem do “pool” de compostos orgânicos de<br />
baixo peso molecular, principalmente na rizosfera.<br />
3.1 Montagem do Sistema Gnotobiótico<br />
3 MATERIAL E MÉTODOS<br />
Montou-se um sistema gnotobiótico baseado em modelo proposto <strong>por</strong> SIMONS et al.<br />
(1996), de modo que as sementes fossem colocadas no interior de tubos de vidro vedados e<br />
esterilizados, permitindo o desenvolvimento das plântulas sem que os exsudatos liberados <strong>por</strong><br />
elas fossem decompostos <strong>por</strong> microrganismos.<br />
Nesse sistema, um tubo de vidro aberto em ambas as extremidades foi fechado com<br />
uma gaze em <strong>sua</strong> extremidade inferior, para su<strong>por</strong>tar as plântulas em crescimento. Esse tubo<br />
foi encaixado em um tubo de ensaio de maior diâmetro, sendo vedado primeiramente <strong>por</strong> uma<br />
camada de algodão entre as paredes do tubo interno e externo e posteriormente pela aplicação<br />
de silicone no topo do tubo de ensaio. O tubo interno foi então tapado em <strong>sua</strong> extremidade<br />
superior com um tampão de algodão (Figura 1). Todo o sistema foi esterilizado antes de<br />
receber as sementes superficialmente desinfetadas e pré-germinadas.<br />
13
Figura 1 - Esquema de sistema gnotobiótico para coleta de exsudatos <strong>radicular</strong>es<br />
3.2 Experimentos de Coleta e Análise de Exsudatos<br />
3.2.1 Liberação e coleta dos exsudatos<br />
Neste experimento cultivaram-se plantas de alface (“Elisabeth”), chicória (“Barbarela<br />
Gigante”) e rúcula (“Lisa Mariana Gigante”), sendo que as duas últimas serviram como base<br />
para comprovar se havia diferenças significativas entre os exsudatos das três espécies.<br />
A solução nutritiva foi preparada a partir das soluções estoque a seguir, armazenadas<br />
em geladeira a 5°C:<br />
Solução A: Ca(NO3)2.4H2O ................... 270,0 g<br />
NH4NO3............................... 33,8 g<br />
Solução B: KCl....................................... 18,6 g<br />
K2SO4................................... 44,0 g<br />
KNO3.................................... 24,6 g<br />
Solução C: Mg(NO3)2.6H2O................... 142,4 g<br />
Solução D: KH2PO4................................ 17,6 g<br />
14
Solução E: MnCl2.4H2O......................... 2,34 g<br />
H3BO3.................................. 2,04 g<br />
ZnSO4.7H2O......................... 0,88 g<br />
CuSO4.5H2O........................ 0,20 g<br />
Na2MoO4.2H2O.................... 0,26 g<br />
Cada uma das soluções de A a E teve seu volume completado para 1L com água<br />
destilada.<br />
A solução nutritiva foi preparada pela adição de 3,3 mL da solução A; 2,3 mL da<br />
solução B; 1,4 mL da solução C; 4,0 mL da solução D e 0,75 mL da solução E, a 1L de água<br />
destilada. Essa solução foi transferida para dois frascos de Erlenmeyer de 500 mL; um deles<br />
recebeu 7g de ágar, para ser posteriormente vertido em placas de Petri para pré-germinação<br />
das sementes, e o outro foi colocado nos sistemas gnotobióticos para desenvolvimento das<br />
plântulas, sendo ambos esterilizados.<br />
A desinfecção superficial das sementes foi feita com uma solução de água sanitária na<br />
pro<strong>por</strong>ção de 1:3 (água sanitária:água destilada), onde as sementes foram colocadas e agitadas<br />
<strong>por</strong> 5 minutos.<br />
As plântulas foram cultivadas no sistema gnotobiótico descrito. Para isso o conjunto<br />
todo foi esterilizado, recebendo uma alíquota (3mL) da solução nutritiva também esterilizada.<br />
As sementes que sofreram desinfecção superficial como descrito anteriormente foram pré-<br />
germinadas em placas de Petri contendo a mesma solução nutritiva adicionada ao sistema<br />
gnotobiótico, no entanto com adição de ágar, até o início da emissão da radícula. Foram<br />
posteriormente colocadas no interior do sistema, em câmara de fluxo laminar, e foi mantido<br />
com adição água esterilizada, de modo que os exsudatos não fossem decompostos <strong>por</strong><br />
microrganismos.<br />
Aos 7 e 21 dias após emergência da radícula, os exsudatos foram coletados e<br />
analisados quanto a seu teor total em açúcares e proteínas. Para possibilitar as duas coletas –<br />
uma vez que o experimento é destrutivo – prepararam-se sistemas em dobro, de modo a<br />
permitir que metade fosse coletada na primeira semana e a outra metade, no final do<br />
experimento (21 dias), mantendo três repetições de cada tratamento, nas duas coletas, para<br />
cada componente do exsudato a ser analisado (açúcares e proteínas).<br />
15
3.2.2 Identificação e quantificação de carboidratos<br />
As quantidades dos principais açúcares presentes nos exsudatos foram avaliadas pelo<br />
uso de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, ou, na sigla em inglês, mais<br />
conhecida, HPLC).<br />
As amostras foram passadas <strong>por</strong> filtros de membrana de <strong>por</strong>osidade 0,33µm sendo<br />
então imediatamente analisadas. Utilizou-se um detector amperométrico pulsado, coluna de<br />
troca aniônica CarboPac PA 1 de 4x25 mm e pré coluna CarboPac PA1 de 4x50 mm, ambas<br />
da marca Dionex, loop de 20 µL e sistema de injeção automático. Como eluente empregou-se<br />
água ultrapura 18,2Ω, na vazão de 1 mL min -1 . Apenas para separação da glicose, sacarose e<br />
maltose usou-se como eluente uma solução de NaOH 200 mmol L -1 . (HORWITZ, 2002;<br />
ROGERS et al, 1999).<br />
Assim, os carboidratos encontrados nos exsudatos de alface, chicória e rúcula puderam<br />
ser analisados e comparados pelos cromatogramas obtidos, pela comparação dos tempos de<br />
retenção dos açúcares dos exsudatos com os açúcares dos padrões previamente preparados.<br />
A concentração de cada carboidrato foi calculada pela área do pico usando como<br />
padrões soluções de mistura de D(-)arabinose, D(+)galactose, D(+)glicose, sacarose, D(-)<br />
frutose, D(+)xilose, D(+)manose e maltose.<br />
3.2.3 Análise do teor de proteínas<br />
A análise de proteínas totais foi realizada pelo uso de espectrofotômetro, pelo método<br />
proposto pela Embrapa (GUEDES et al., 2007), uma adaptação do método de Lowry às<br />
condições de análise.<br />
Assim, para a análise de proteínas nos exsudatos coletados adicionou-se uma alíquota<br />
de 100 µL de cada amostra homogeneizada a tubos de ensaio contendo 400 µL de água<br />
destilada esterilizada e 500 µL de NaOH 1 mol L -1 . Os tubos foram então agitados em vórtex<br />
e aquecidos a 100°C durante 5 minutos.<br />
Passado esse período adicionaram-se a cada tubo 2,5 mL do reagente de Lowry, que<br />
contém a mistura dos seguintes reagentes nas pro<strong>por</strong>ções descritas a seguir: 50 mL de solução<br />
de carbonato de sódio (50g de Na2CO3 em 1L de água), 1 mL de solução de tartarato de sódio<br />
e potássio (20g de KNaC4H406.4H2O em 1L de água) e 1 mL de solução de sulfato de cobre<br />
(10g de CuSO4.5H2O em 1L de água). Os tubos foram novamente agitados e incubados no<br />
escuro <strong>por</strong> um período de 10 minutos.<br />
16
A seguir adicionaram-se 500 µL do reagente de Folin-Ciocalteau 1M diluído na<br />
pro<strong>por</strong>ção de 1:2 (reagente:água destilada), e as amostras foram novamente incubadas no<br />
escuro <strong>por</strong> um período de 30 minutos.<br />
Após esses procedimentos, as amostras foram submetidas à avaliação pela leitura da<br />
absorbância em espectrofotômetro, a um comprimento de onda de 750 nm.<br />
Para calibrar o aparelho foi utilizada como branco uma amostra da solução nutritiva<br />
utilizada para su<strong>por</strong>tar o crescimento das plântulas, submetida ao mesmo tratamento descrito.<br />
Para determinação da concentração das proteínas, usou-se uma curva padrão obtida<br />
pelos valores de absorbância de soluções submetidas ao mesmo tratamento descrito, contendo<br />
a proteína albumina bovina (BSA), nas seguintes concentrações (em µg mL -1 ): 7,5; 15; 22,5;<br />
30; 45; 60; 75; 90; 120 e 150.<br />
3.3 Experimento de Utilização, Pelos Isolados, dos Açúcares Contidos nos Exsudatos<br />
Neste experimento, foram selecionados os isolados de Pseudomonas sp. sobre os quais<br />
havia informações de serem favorecidos em rizosfera de alface, rúcula ou chicória (COELHO<br />
et al., 2007; CIPRIANO, 2009).<br />
Esses isolados pertencem à coleção de microrganismos do Laboratório de<br />
Microbiologia do Solo do Instituto Agronômico (Tabela 1).<br />
Prepararam-se meios de cultura aos quais foram adicionados os principais açúcares<br />
detectados, no experimento anterior, nos exsudatos <strong>radicular</strong>es de alface, chicória e rúcula.<br />
Os meios de cultura utilizados foram o meio B de King (King et al., 1954) e um meio<br />
mineral mínimo (LARPENT & LARPENT-GOURGAUD, 1975), descritos a seguir.<br />
17
Tabela 1 - Origem dos isolados de Pseudomonas utilizados nos experimentos<br />
Meio B de King:<br />
Isolado Origem<br />
LP10 alface<br />
LP12 alface<br />
LP13 alface<br />
LP16 rúcula<br />
LP17 alface<br />
LP22 chicória<br />
LP25 alface<br />
LP28 alface<br />
LP44 alface<br />
LP47 rúcula<br />
Ps852c alface<br />
Ps864c alface<br />
Ps866b alface<br />
Ps871b alface<br />
Proteose-peptona............................................. 20,0 g<br />
Glicerol............................................................ 10,0 g<br />
K2HPO4........................................................... 1,5 g<br />
MgSO4............................................................. 1,5 g<br />
Ágar................................................................. 18,0 g<br />
Água destilada................................................. 1000 mL<br />
Meio mineral mínimo:<br />
K2HPO4.............................................................. 3,0 g<br />
Na2HPO4............................................................ 6,0 g<br />
NaCl................................................................... 5,0 g<br />
NH4Cl................................................................ 2,0 g<br />
MgSO4............................................................... 0,1 g<br />
18
Açúcar*.............................................................. 8,0 g<br />
Ágar................................................................... 15,0 g<br />
Água destilada................................................... 1000 mL<br />
*Obs: Os açúcares adicionados foram os encontrados no experimento anterior, separadamente, em diferentes<br />
frascos.<br />
Tanto o meio B de King como o meio mineral mínimo foram preparados com a adição<br />
dos açúcares na concentração de 8 g L -1 , que é a concentração de açúcar recomendada na<br />
literatura consultada, e no dobro da concentração em que ele foi encontrado nos exsudatos.<br />
Os açúcares e <strong>sua</strong>s concentrações foram os seguintes: 2 mg L -1 para a arabinose, 3 mg L -1 para<br />
a glicose e 5 mg L -1 para a frutose.<br />
Assim, os isolados foram repicados para placas de Petri contendo os meios de cultura<br />
preparados como descrito, para avaliação de <strong>utilização</strong> de cada açúcar. O meio B de King foi<br />
utilizado apenas como um controle do crescimento dos isolados.<br />
3.4 Experimento de Avaliação de Colonização das Raízes pelos Isolados<br />
Os isolados (Tabela 1) foram repicados a partir das culturas-estoque mantidas em meio<br />
B de KING et al. (1954), cobertas com óleo mineral, a 5°C, e usados para preparo de<br />
suspensões. Assim, transferiram-se duas “alçadas” de cada isolado cultivado em meio B de<br />
King, em tubo inclinado, para frascos de Erlenmeyer com volume de 25 mL contendo 18 mL<br />
de solução de MgSO4 a 0,01 mol L -1 , sendo agitados em agitador mecânico <strong>por</strong> 30 minutos.<br />
As sementes foram pré germinadas em placas de Petri contendo a mesma solução<br />
nutritiva adicionada ao sistema gnotobiótico, no entanto com adição de agar, até o início da<br />
emergência da radícula. Assim, 15 sementes pré-germinadas de cada espécie vegetal (alface,<br />
chicória e rúcula) foram imersas em frascos de Erlenmeyer contendo as suspensões dos 14<br />
isolados separadamente, sendo ali mantidas <strong>por</strong> cerca de 30 minutos.<br />
Decorrido esse tempo as sementes foram transferidas para o sistema gnotobiótico,<br />
cada um recebendo 5 sementes que haviam sido imersas nas suspensões dos diferentes<br />
isolados. Foram montados 3 tubos para cada sistema planta-isolado, ou seja, 2 para avaliação<br />
vi<strong>sua</strong>l da colonização, medição das raízes e para obtenção da massa de matéria fresca, e um<br />
para plaqueamento das raízes. Foram colocados em incubadora (BOD) com fotoperíodo de 12<br />
horas a 26+2°C, <strong>por</strong> um período de 10 dias.<br />
19
Após dez dias, as plântulas foram analisadas quanto à colonização, pelo plaqueamento<br />
das raízes e pela análise vi<strong>sua</strong>l dos sistemas gnotobióticos. Avaliou-se a colonização pela<br />
coleta das plântulas, separação asséptica das raízes e posterior plaqueamento em meio B de<br />
King. Nas placas com raízes colonizadas deveria haver crescimento bacteriano.<br />
O número de unidades formadoras de colônias (UFCs) nas suspensões das bactérias<br />
inoculadas foi estimado. A partir das suspensões bacterianas usadas na bacterização das<br />
sementes, prepararam-se diluições seriadas, em solução de MgSO4 a 0,01 mol L -1 .<br />
Posteriormente, procedeu-se o plaqueamento de 0,1 mL de algumas diluições em meio B de<br />
King, incubação a 28°C <strong>por</strong> 24 horas e contagem do número de UFCs/mL. As plântulas<br />
também foram avaliadas quanto ao comprimento e massa de matéria seca das raízes.<br />
3.5 Análise de Variância<br />
Os resultados da composição dos exsudatos em açúcares e proteínas foram submetidos<br />
ao cálculo de média e desvio padrão.<br />
Os resultados obtidos da massa de matéria seca das plantas que receberam os<br />
diferentes isolados foram submetidos à análise de variância e posteriormente ao teste de Scott-<br />
Knott ao nível de 5%.<br />
4.1 Construção do Sistema Gnotobiótico<br />
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO<br />
O silicone e o algodão de vedação fecharam muito bem o sistema, de forma que pôde<br />
ser esterilizado e mantido nessa condição durante todo o experimento. No entanto, o sistema<br />
tem uma limitação de tempo, para as condições dos experimentos realizados, em torno de 21<br />
dias, e uma eva<strong>por</strong>ação de água que pôde ser solucionada com adição de água destilada e<br />
esterilizada.<br />
O sistema foi construído de modo a ter a vantagem da ausência de microrganismos,<br />
impedindo a decomposição dos exsudatos, pois os microrganismos podem agir como drenos<br />
(BOWEN & ROVIRA, 1976; VAN HEES et al., 2002) ou fontes (RÓZYCKI, 1985; WELCH<br />
et al., 2002) dos compostos orgânicos liberados, ou podem ainda estimular as raízes a<br />
20
aumentar <strong>sua</strong> exsudação (MEHARG & KILLHAM, 1991, 1995). Assim, para o objetivo<br />
proposto, a ausência de microrganismos foi fundamental.<br />
Este sistema, em especial, tem a vantagem de coletar os exsudatos em meio líquido,<br />
visto que, segundo NEUMANN & ROMHELD (2001), quando se usam meios sólidos para<br />
estudar exsudatos <strong>radicular</strong>es, ocorrem interações – adsorção dos exsudatos ao substrato –, o<br />
que pode ser um problema, principalmente na quantificação de seus componentes. Este<br />
método, <strong>por</strong> <strong>sua</strong> vez, é simples e reprodutível, pode ser feito em grande escala, e foi criado<br />
para que os exsudatos fossem liberados em solução nutritiva, facilitando a análise, pois não<br />
foi necessária a lavagem de substrato para coleta dos exsudatos.<br />
CASPERSEN et al. (2004) também construíram um sistema gnotobiótico para estudar<br />
exsudação de carbono dissolvido (COD) <strong>por</strong> alface, destacando como principal problema a<br />
perda de água do sistema <strong>por</strong> eva<strong>por</strong>ação da solução nutritiva, o que afetaria a concentração<br />
de compostos orgânicos e inorgânicos na solução nutritiva. No entanto também resolveram o<br />
problema pela substituição ou adição de solução nutritiva.<br />
Em dois diferentes sistemas gnotobióticos montados (CASPERSEN et al., 2004;<br />
SANDNES et al., 2005), percebeu-se que o pH da solução nutritiva diminui com o passar do<br />
tempo (até 21 dias). CASPERSEN et al. (2004) ainda alertam que as quantidades de carbono<br />
orgânico dissolvido encontradas podem ter sido subestimadas devido à água aderida ao<br />
sistema <strong>radicular</strong>. No entanto, seus resultados condizem com outros encontrados na literatura<br />
(HAGGQUIST et al., 1984; DOUSSET et al., 2001 apud CASPERSEN et al., 2004). Além<br />
disso, segundo JONES & DARRAH (1992; 1993a, b), ocorre um equilíbrio de concentração<br />
de compostos orgânicos entre a solução e a raiz, em um volume finito de solução nutritiva<br />
axênica, devido à absorção <strong>radicular</strong> de compostos orgânicos de baixo peso molecular, como<br />
açúcares e aminoácidos. Portanto, na solução nutritiva ao redor das raízes, a concentração de<br />
compostos que são liberados e reabsorvidos pelas raízes pode refletir a quantidade real<br />
liberada no momento da amostragem.<br />
4.2 Composição de Açúcares dos Exsudatos<br />
Pela análise dos exsudatos no HPLC, detectou-se a presença de uma grande variedade<br />
de açúcares em diferentes concentrações. Foram identificados apenas aqueles que possuíam<br />
padrões já utilizados no laboratório, ou seja, arabinose, galactose, xilose, manose, frutose e<br />
uma provável mistura dos açúcares glicose, sacarose e maltose. Estes três últimos<br />
apresentaram um tempo de retenção muito próximo, sendo difícil separá-los. No entanto, com<br />
21
a realização de um teste utilizando como eluente uma solução de NaOH 200 mM, apenas com<br />
esses três açúcares, constatou-se que, quando presente, a quantidade de sacarose era<br />
desprezível, e a presença de maltose não pôde ser confirmada, não podendo também ser<br />
desprezada. Por isso, os dados referem-se à quantidade de glicose somada à maltose<br />
(glicose+maltose). Os açúcares presentes em maiores quantidades foram a arabinose, a<br />
glicose+maltose e a frutose. Os demais açúcares encontrados, mas em quantidades muito<br />
baixas foram a galactose, a xilose, a manose e a sacarose.<br />
Pode-se perceber que houve diferenças nas exsudações dos açúcares entre as plantas e<br />
em cada planta nos diferentes períodos de amostragem, como pode ser observado na figura 2.<br />
De maneira geral, observa-se que a exsudação de arabinose aos 7 dias foi maior do que<br />
aos 21, para as três espécies de plantas. Comparando-se a exsudação aos sete dias entre as<br />
três plantas, nota-se que a rúcula exsudou esse açúcar em concentração significativamente<br />
maior do que as outras duas, que não diferiram entre si. Aos 21 dias, a alface exsudou menos<br />
e a rúcula, mais, tendo as três diferido entre si.<br />
Para a mistura glicose + maltose, dentro de cada espécie vegetal, a exsudação foi<br />
também maior aos sete dias que aos 21, para todas as espécies. Aos sete dias, a exsudação da<br />
chicória foi significativamente menor do que a das outras duas plantas, que não diferiram<br />
entre si. Já aos 21 dias todas as plantas diferiram entre si, vindo em ordem decrescente:<br />
rúcula, alface e chicória.<br />
Quanto à frutose, <strong>sua</strong> presença nos exsudatos de alface e chicória foi maior, dentro de<br />
cada espécie, aos sete que aos 21 dias, enquanto que na rúcula não se observou nenhuma<br />
diferença. Comparando-se as plantas entre si, aos sete dias a exsudação não diferiu, mas aos<br />
21 dias foi significativamente maior na rúcula, depois na alface e, finalmente, na chicória.<br />
22
Concentração (µg.mg -1 )<br />
Concentração (µg.mg -1 )<br />
Concentração (µg.mg -1 )<br />
0,25<br />
0,20<br />
0,15<br />
0,10<br />
0,05<br />
0,00<br />
0,35<br />
0,30<br />
0,25<br />
0,20<br />
0,15<br />
0,10<br />
0,05<br />
0,00<br />
1,00<br />
0,80<br />
0,60<br />
0,40<br />
0,20<br />
0,00<br />
Arabinose<br />
Arabinose<br />
Glicose + Maltose<br />
Glicose+ Maltose<br />
Frutose<br />
Frutose<br />
Figura 2 - Concentração de arabinose, glicose+maltose e frutose em exsudatos de<br />
alface, rúcula e chicória aos sete e vinte e um dias após emergência da radícula, em condições<br />
gnotobióticas. Cada valor é a média de 3 repetições. Os dados foram expressos em µg do<br />
açúcar <strong>por</strong> mg de massa de matéria seca da planta.<br />
Alface 7 dias<br />
Alface 21 dias<br />
Rúcula 7 dias<br />
Rúcula 21 dias<br />
Chicória 7 dias<br />
Alface 7 dias<br />
Alface 21 dias<br />
Rúcula 7 dias<br />
Rúcula 21 dias<br />
Chicória 7 dias<br />
Chicória 21 dias<br />
Alface 7 dias<br />
Alface 21 dias<br />
Rúcula 7 dias<br />
Rúcula 21 dias<br />
Chicória 7 dias<br />
Chicória 21 dias<br />
Chicória 21 dias<br />
23
Além disso, a chicória diferenciou-se <strong>por</strong> ser a única a exsudar sacarose em<br />
quantidades traço na avaliação feita aos sete dias, enquanto que xilose e manose e a galactose<br />
estavam presentes em todas as plantas, também em quantidades traço. A rúcula, diferenciou-<br />
se <strong>por</strong> ser a única a exsudar galactose em quantidades traço, aos 21 dias, enquanto nenhuma<br />
das plantas exsudou sacarose, xilose e manose neste período (dados não mostrados).<br />
De maneira geral, a glicose+maltose e a arabinose tiveram exsudações estatisticamente<br />
diferentes nas plantas na comparação entre os dois períodos amostrados. Além disso, o açúcar<br />
presente em maiores concentrações em todas as plantas foi a frutose. Estes dados concordam,<br />
em parte, com o trabalho de KAMILOVA et al. (2006), que também encontraram a frutose<br />
como o principal constituinte dos exsudatos de tomate, pepino e pimenta, além da<br />
glicose+maltose, embora em diferentes quantidades entre as plantas, como no presente<br />
trabalho, e como foi visto também <strong>por</strong> LUGTENBERG et al. (1999).<br />
Todavia, KAMILOVA et al. (2006) encontraram diferentes concentrações dos<br />
mesmos açúcares, nas diferentes culturas, assim como nos diferentes períodos, sendo que a<br />
quantidade total de açúcares aumentou com o passar do tempo (14 para 21 dias), o que difere<br />
dos resultados aqui apresentados, pois quando houve diferenças entre os períodos amostrados,<br />
a maior exsudação ocorreu sempre aos 7 dias.<br />
Essa alteração na concentração de substâncias componentes dos exsudatos vegetais<br />
também foi detectada <strong>por</strong> GRAYSTON et al. (1996), que observou uma mudança da<br />
composição de ácidos orgânicos encontrados nos exsudatos de árvores, assim como um<br />
aumento do carbono orgânico dissolvido, com o passar do tempo, comprovando o papel do<br />
estádio de desenvolvimento e da biomassa da muda nos aspectos quantitativo e qualitativo da<br />
exsudação <strong>radicular</strong>.<br />
Assim, tanto a composição quanto a concentração de açúcares exsudados variou de<br />
acordo com a espécie e com a idade da planta, e essas diferenças devem influenciar a<br />
composição da microbiota rizosférica e a colonização <strong>radicular</strong> ao longo do desenvolvimento<br />
da planta, como observado <strong>por</strong> LUGTENBERG et al. (1999), em plantas de tomate, e <strong>por</strong><br />
BAUDOIN et al. (2003), que encontraram diferentes estruturas das comunidades bacterianas,<br />
quantitativa e qualitativamente, de acordo com o estádio de desenvolvimento da planta de<br />
milho e com a região da raiz. MALONEY et al. (1997) obteve resultados semelhantes ao<br />
estudar as diferentes comunidades presentes em diferentes <strong>por</strong>ções das raízes de plantas de<br />
tomate e alface, encontrando também diferenças na composição e quantidade de exsudatos<br />
liberados pelas diferentes plantas.<br />
24
Sabe-se, <strong>por</strong> exemplo, que as espécies fluorescentes de Pseudomonas são favorecidas<br />
em rizosfera de alface em comparação com as outras duas espécies (rúcula e chicória)<br />
(COELHO et al., 2007). Sabe-se também, pelo amplo estudo realizado <strong>por</strong> STANIER et al.<br />
(1966), que a maioria das espécies fluorescentes de Pseudomonas sp. são capazes de utilizar a<br />
glicose e a frutose como única fonte de carbono e energia, mas não possuem a mesma<br />
capacidade com relação aos outros açúcares estudados (arabinose, maltose, sacarose, xilose e<br />
manose). Neste mesmo estudo, <strong>por</strong> exemplo, dos 274 isolados estudados, 99% usaram glicose<br />
e 91% utilizaram frutose, enquanto nenhum utilizou a arabinose e apenas 1% utilizou a<br />
maltose como única fonte de carbono e energia.<br />
Dessa forma, os açúcares estudados presentes nos exsudatos de alface em maior<br />
concentração parecem não serem os únicos responsáveis pela aparente “preferência” das<br />
bactérias do grupo fluorescente do gênero Pseudomonas pela rizosfera de alface, conforme<br />
observaram COELHO et al. (2007). De fato, LUGTENBERG (1999) concluiu que a<br />
habilidade em usar os açúcares exsudados não desempenha um papel tão im<strong>por</strong>tante na<br />
colonização <strong>radicular</strong>, concluindo que outros fatores parecem influenciar a colonização, como<br />
os ácidos orgânicos e polímeros.<br />
Adicionalmente, KAMILOVA et al. (2006) mostraram que os exsudatos de tomate,<br />
pepino e pimenta continham muito mais ácidos orgânicos que açúcares, e que o ácido cítrico<br />
predomina completamente sobre os outros encontrados, sendo a maior fonte de carbono<br />
encontrada nos exsudatos. No entanto não se sabe se essa alta concentração de ácidos é um<br />
fator im<strong>por</strong>tante na rápida colonização <strong>radicular</strong> inicial, necessária para o estabelecimento do<br />
isolado. Essa possível im<strong>por</strong>tância não foi avaliada neste trabalho.<br />
4.3 Concentração de Proteínas dos Exsudatos<br />
Os valores médios da concentração de proteínas encontrados nos exsudatos de alface,<br />
chicória e rúcula, nos diferentes períodos de coleta, podem ser vistos na figura 3. Os dados<br />
foram transformados de mg/mL para µg/mg, devido à massa de matéria seca das plantas.<br />
25
Figura 3 - Valores médios do conteúdo de proteína nos exsudatos de alface, chicória e rúcula,<br />
aos 7 e 21 dias de coleta. Dados expressos em µg de proteínas <strong>por</strong> mg de massa de matéria<br />
seca da planta.<br />
Concentração (µg.mg -1 )<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
Não houve diferenças significativas no teor de proteínas presentes no exsudato entre<br />
os diferentes períodos em cada planta, e também entre as plantas. Não foi objetivo deste<br />
trabalho identificar as proteínas exsudadas e, <strong>por</strong>tanto, não se conhece a composição de<br />
proteínas e de aminoácidos. Podem ser proteínas diferentes, que influenciariam de diversas<br />
maneiras a microbiota que se utiliza dos exsudatos. No entanto, se se considerar apenas a<br />
quantidade total de proteínas, não foi possível detectar diferenças entre as exsudações das três<br />
espécies vegetais que pudessem explicar diferenças de colonização.<br />
Não se encontraram dados na literatura acerca da composição de proteínas dos<br />
exsudatos <strong>radicular</strong>es. No entanto alguns pesquisadores (ROVIRA, 1969; SMITH, 1970)<br />
citam <strong>sua</strong> composição em aminoácidos. Segundo esses autores, os aminoácidos juntamente<br />
com os açúcares e ácidos orgânicos compreendem a maior parte dos exsudatos <strong>radicular</strong>es,<br />
enquanto as proteínas e mucilagem compreendem a menor parte. As proteínas geralmente são<br />
exsudadas juntamente com pequenas moléculas, como sinalizadores, ou seja, auxiliando na<br />
comunicação entre raízes, entre raiz e microrganismos ou ainda entre microrganismos<br />
(WALKER et al., 2003).<br />
5<br />
0<br />
Proteína<br />
Proteína<br />
Alface 7 dias<br />
Alface 21 dias<br />
Rúcula 7 dias<br />
Rúcula 21 dias<br />
Chicória 7 dias<br />
Chicória 21 dias<br />
26
4.4 Utilização, pelos Isolados Bacterianos, dos Açúcares Contidos nos Exsudatos<br />
Pode-se observar pela tabela 3 que todos os isolados cresceram no meio B de King<br />
(KING et al., 1954), um meio próprio para evidenciação do crescimento de Pseudomonas do<br />
grupo fluorescente, pela emissão de fluorescência pelos isolados sob luz com comprimento de<br />
onda próximo ao ultravioleta. O meio B é de composição complexa e tem outras substâncias<br />
que podem fornecer energia às bactérias. Já no meio mínimo, os açúcares são a única forma<br />
que os microrganismos têm de obter energia. No meio B, dada <strong>sua</strong> composição, outras<br />
substâncias podem ter concorrido para permitir o crescimento das bactérias, não apenas o<br />
açúcar, como, <strong>por</strong> exemplo, um eventual produto da decomposição da proteose peptona, que<br />
serve como fonte principalmente de aminoácidos e nitrogênio, mas também como fonte de<br />
carbono, enxofre, vitaminas e elementos traço.<br />
Como houve crescimento de todos os isolados, em todas as concentrações de açúcares<br />
no meio B, mas não no meio mínimo, considera-se que este último foi o meio de cultura<br />
adequado para diferenciar a eventual <strong>utilização</strong> de açúcares pelas bactérias. No meio mineral<br />
mínimo (M) com adição dos açúcares arabinose, glicose e frutose em alta concentração, ou<br />
seja, 8 g L -1 (A8, G8 e F8), a maioria dos isolados cresceu, demonstrando a <strong>utilização</strong> dos<br />
açúcares, principalmente da glicose (Tabela 3).<br />
No entanto, no meio mineral mínimo com adição dos açúcares arabinose, glicose e<br />
frutose nas concentrações encontradas nos exsudatos, ou seja, 2 mg L -1 , 3 mg L -1 e 5 mg L -1 ,<br />
respectivamente (A2, G3 e F5), nenhum dos isolados cresceu, mostrando que, pelo menos<br />
com tais concentrações, nenhum deles utiliza esses açúcares como única fonte de carbono e<br />
energia.<br />
Já na concentração mais alta, 6 dos 14 isolados (LP16, LP17, LP25, LP28, LP44 e<br />
Ps871b) utilizaram a arabinose como única fonte de energia, mas não nas concentrações<br />
encontradas nos exsudatos; apenas 1 isolado não usou a frutose (Ps852c) e todos os isolados<br />
usaram a glicose, mas novamente não nas concentrações utilizadas nos exsudatos.<br />
Deve-se considerar que a planta está liberando uma grande variedade de compostos<br />
orgânicos (BOWEN & ROVIRA, 1987; GRAYSTON et al., 1998), e, <strong>por</strong>tanto, que as<br />
bactérias irão colonizar a raiz pela <strong>utilização</strong> de vários compostos dos exsudatos mesmo que<br />
as concentrações de açúcares encontradas nos exsudatos analisados neste trabalho sejam<br />
consideradas baixas. A glicose foi o único açúcar utilizado, no meio mínimo, <strong>por</strong> todos os<br />
isolados – seguida pela frutose, que apenas um isolado não utilizou. Como o crescimento<br />
ocorreu no meio mínimo, pode-se definir a <strong>utilização</strong> da glicose realmente como fonte de<br />
27
energia. Observou-se que, de maneira geral, este foi o segundo açúcar liberado em maiores<br />
concentrações pelas plantas, ficando atrás apenas da frutose. Bioquimicamente, é o açúcar de<br />
mais fácil decomposição, que pode ser utilizado pela maioria das bactérias como única fonte<br />
de carbono e energia (STANIER et al., 1966).<br />
Tabela 3 - Utilização, pelos isolados bacterianos, dos açúcares arabinose (A), glicose (G) e<br />
frutose (F) contidos nos exsudatos e em concentrações adequadas.<br />
K M<br />
Isolados A2 A8 F5 F8 G3 G8 A2 A8 F5 F8 G3 G8<br />
LP10 + + + + + + - - - + - +<br />
LP12 + + + + + + - - - + - +<br />
LP13 + + + + + + - - - + - +<br />
LP16 + + + + + + - + - + - +<br />
LP17 + + + + + + - + - + - +<br />
LP22 + + + + + + - - - + - +<br />
LP25 + + + + + + - + - + - +<br />
LP28 + + + + + + - + - + - +<br />
LP44 + + + + + + - + - + - +<br />
LP47 + + + + + + - - - + - +<br />
Ps852c + + + + + + - - - - - +<br />
Ps864c + + + + + + - - - + - +<br />
Ps866b + + + + + + - - - + - +<br />
Ps871b + + + + + + - + - + - +<br />
Obs.: K= meio B de King; M=meio mineral mínimo; A2=arabinose 2 mg/L; G3=glicose 3 mg/L; F5=frutose 5<br />
mg/L; A8=arabinose 8g/L; G8=glicose 8g/L; F8=frutose 8g/L.<br />
Crescimento simbolizado <strong>por</strong> + e não-crescimento, <strong>por</strong> - .<br />
Nos registros de crescimento dos isolados no meio mínimo observa-se que houve<br />
confirmação do que foi observado <strong>por</strong> GRAYSTON et al. (1998). Os autores relataram que<br />
diferentes comunidades, de diferentes rizosferas, têm padrões característicos de <strong>utilização</strong> das<br />
fontes de carbono. Isso leva ao fato de que diferentes plantas devem possuir diferentes<br />
28
comunidades rizosféricas, tanto quanto ao número de microrganismos, quanto à presença das<br />
populações. Neste trabalho, com Pseudomonas, observou-se que os isolados utilizaram todas<br />
as fontes de carbono adicionadas, mas houve diferenças na <strong>utilização</strong> entre os isolados<br />
estudados.<br />
A <strong>utilização</strong> diferencial de fontes de carbono entre as culturas sugere que a<br />
disponibilidade de variadas fontes de carbono nas rizosferas pode definir a proliferação de<br />
comunidades particulares de microrganismos (GRAYSTON et al., 1998), conforme também<br />
observado <strong>por</strong> COELHO et al. (2007). Nesse último trabalho sugeriu-se que a diversidade de<br />
microrganismos encontrada nas diferentes espécies de plantas – entre as quais se incluíam as<br />
espécies estudadas neste trabalho – poderia ser explicada pela variação de compostos de<br />
carbono exsudados pelas plantas.<br />
Neste trabalho, os isolados se com<strong>por</strong>taram de maneira diferente: seis deles foram<br />
capazes de utilizar os três açúcares, sete utilizaram glicose e frutose mas não arabinose e<br />
apenas um usou somente a glicose como única fonte de carbono e energia. Assim, devem<br />
colonizar diferentes rizosferas, que os beneficiem com a exsudação dos compostos<br />
preferencialmente utilizados. Os isolados que conseguem crescer na presença de maior<br />
número de açúcares têm vantagem competitiva na rizosfera em comparação com outros<br />
isolados que utilizam uma gama menor de açúcares.<br />
Sendo assim, a estrutura da comunidade seria característica de cada ambiente<br />
rizosférico. MALONEY et al. (1997), estudando a rizosfera de alface e tomate, verificaram<br />
que dois im<strong>por</strong>tantes fatores que influenciam as populações bacterianas e a estrutura das<br />
comunidades rizosféricas são: as interações competitivas entre os microrganismos e os<br />
aspectos fisiológicos com respeito à afinidade <strong>por</strong> substratos. Assim, o crescimento de<br />
diferentes populações em determinadas regiões da raiz dependeria das quantidades de carbono<br />
liberados <strong>por</strong> essas regiões, característica que varia espacialmente na rizosfera e entre as<br />
plantas, e da forma como os microrganismos utilizam essas fontes de carbono.<br />
Utilizando métodos mais apurados como os moleculares, utilizando primers<br />
específicos, BERG & SMALLA (2009), em <strong>sua</strong> revisão, relataram que as espécies de plantas<br />
e <strong>sua</strong>s posições filogenéticas podem influenciar na composição da comunidade rizosférica.<br />
Por exemplo, espécies de gramíneas monocotiledôneas mostraram alta similaridade em <strong>sua</strong>s<br />
comunidades rizosféricas, como demonstrado também em outros estudos citados.<br />
Assim existem muitos estudos que visam determinar a estrutura de comunidades<br />
rizosféricas de diferentes plantas e o <strong>por</strong>quê da variação ou não, e têm apontado para fatores<br />
29
como esses – espécie da planta e zona da raiz, compostos exsudados – ou ainda o tipo de solo,<br />
além de alguns outros fatores (RIDDER-DUINE et al., 2005; MARSCHNER et al., 2001).<br />
4.5 Colonização das Raízes pelos Isolados<br />
Pela análise vi<strong>sua</strong>l dos sistemas gnotobióticos contendo as plântulas de alface, chicória<br />
e rúcula, cujas sementes haviam sido colocadas em suspensões de bactérias, foi possível<br />
observar a colonização de todas as raízes, ou seja, em todos os casos havia uma fina película<br />
branca translúcida ao redor das raízes. Apenas os controles, ou seja, as plantas que não<br />
receberam o inóculo não apresentaram película e a solução nutritiva se encontrava totalmente<br />
transparente.<br />
Pelo plaqueamento das raízes também se constatou a colonização de todas as raízes,<br />
como pode ser exemplificado pela figura 4. Sob luz com comprimento de onda visível,<br />
observa-se a área imediatamente ao redor de cada raiz, totalmente colonizada. Sob luz com<br />
comprimento de onda próximo ao ultravioleta essas colônias apresentaram-se fluorescentes,<br />
em todos os casos, já que se tratava de espécies fluorescentes do gênero Pseudomonas.<br />
O teste de observação da colonização no sistema gnotobiótico e o teste de<br />
plaqueamento das raízes em meio B têm uma característica em comum: nos dois casos as<br />
bactérias estavam na presença de exsudatos <strong>radicular</strong>es. De certa forma, a colonização de<br />
todas as raízes <strong>por</strong> todos os isolados mostra que o ambiente tinha condições ideais de<br />
temperatura, luminosidade, entre outras características, pois o ambiente era controlado. Além<br />
disso, possuía compostos usados como fontes de energia pelos isolados, para crescimento e<br />
consequente colonização de toda a raiz, vindos exclusivamente dos exsudatos <strong>radicular</strong>es, ou<br />
seja, a composição dos exsudatos das três espécies de plantas foi satisfatória para manter o<br />
crescimento dos isolados.<br />
Assim, embora a composição observada dos exsudatos não seja idêntica para as três<br />
plantas estudadas, os isolados puderam se beneficiar de todas, utilizando os exsudatos<br />
liberados para seu crescimento.<br />
Também há o fato de que os isolados vieram de diferentes plantas: 11 isolados de<br />
alface, 2 de rúcula e 1 de chicória. No entanto, tiveram sucesso em colonizar todas as raízes,<br />
mostrando que não são específicas das espécies de plantas de onde foram obtidos, como<br />
mostram também os resultados obtidos <strong>por</strong> SOTTERO et al. (2006), em que isolados obtidos<br />
de plantas variadas foram benéficas em alface, embora essa especificidade exista em alguns<br />
casos, como mostram os trabalhos de CHANWAY et al. (1988) e SICILIANO et al. (1998).<br />
30
Figura 4 - Raízes de alface colonizadas ou não (controle) <strong>por</strong> isolado de Pseudomonas. a. Sob<br />
luz com comprimento de onda próximo ao ultravioleta, onde se observa a emissão de<br />
fluorescência; b. Sob luz com comprimento de onda visível; neste caso pode-se ver com mais<br />
detalhe as raízes e as colônias ao redor; c. Controle, raízes não colonizadas.<br />
31
No entanto, sabe-se também que as bactérias do gênero Pseudomonas são conhecidas<br />
<strong>por</strong> estarem presentes em ambientes variados, podendo se utilizar de um amplo espectro de<br />
compostos orgânicos, além de poderem se desenvolver em meio com apenas um composto<br />
orgânico como fonte de carbono e energia (STANIER et al., 1966; BUCHANAN &<br />
GIBBONS, 1974).As plantas avaliadas quanto à presença de uma fina película ao redor das<br />
raízes, como explicado anteriormente, também foram secas em estufa, de onde se obteve a<br />
massa de matéria seca total, cujas médias podem ser vistas na tabela 4.<br />
Em alface e rúcula observa-se que não houve diferença significativa entre os<br />
tratamentos, ou seja, a massa de matéria seca alcançada <strong>por</strong> estas plantas foi semelhante,<br />
independente do isolado inoculado e não diferiu do controle sem inoculação (Tabela 4).<br />
Em chicória, no entanto, houve diferença entre os tratamentos. As plantas que<br />
receberam os isolados LP10, LP17, LP22, LP28, LP47, Ps852c e Ps871b foram as que<br />
apresentaram as maiores massas. Ressalta-se que entre estes isolados está o que foi isolado de<br />
chicória (LP22). Ao mesmo grupo pertence o controle, mostrando que esses isolados não<br />
beneficiaram as plântulas em seu crescimento. Semelhantemente, a maioria dos isolados<br />
utilizados <strong>por</strong> SOTTERO et al. (2006) não promoveram crescimento. Há também dois grupos<br />
intermediários, composto <strong>por</strong> quatro – LP13, LP16, Ps864c e Ps866c – e um – LP 25 –<br />
isolados. Por fim houve dois tratamentos – LP12 e LP44 – em que as plantas praticamente não<br />
se desenvolveram. Com exceção do primeiro grupo, que não diferiu do controle, em todos os<br />
outros observou-se efeito deletério das bactérias sobre as plântulas. SINDHU et al. (2002)<br />
também detectou efeito inibitório de Pseudomonas spp. na elongação de raízes de grão-de-<br />
bico e interrupção do crescimento das plântulas. De forma semelhante, FREITAS et al (2003)<br />
utilizou um isolado de Pseudomonas (Ps 91) em experimentos com alface, sendo que em<br />
alguns casos este isolado com<strong>por</strong>tou-se beneficamente, e em outros mostrou-se patogênico,<br />
dependendo do substrato utilizado.<br />
Em geral notou-se que não houve estímulo ao crescimento das plântulas pelos isolados<br />
bacterianos. No entanto, notou-se um efeito patogênico de alguns isolados, como se sabe que<br />
é possível ocorrer. Porém, deve-se considerar que a massa de matéria fresca foi obtida quando<br />
as plântulas eram ainda muito jovens (10 dias), e pode ser que nesse período ainda não fosse<br />
possível observar a promoção de crescimento. Pode acontecer, <strong>por</strong> exemplo, de ocorrer parada<br />
de crescimento numa fase muito inicial do desenvolvimento da planta e <strong>sua</strong> retomada num<br />
período posterior, como demonstrado <strong>por</strong> SINDHU et al. (2002). Além disso, um número<br />
maior de repetições poderia resultar em dados mais homogêneos e em um menor coeficiente<br />
de variação.<br />
32
Tabela 4 - Valores médios de massa de matéria seca total (mg) de alface, chicória e rúcula<br />
que receberam inóculo de diferentes isolados.<br />
Isolado Espécie vegetal<br />
Alface Chicória Rúcula<br />
Controle 1,20 a 1,16 a 1,14 a<br />
LP10 1,26 a 1,10 a 1,64 a<br />
LP12 1,02 a 0,10 d 1,48 a<br />
LP13 1,08 a 0,76 b 0,88 a<br />
LP16 0,98 a 0,86 b 1,46 a<br />
LP17 1,38 a 1,06 a 1,66 a<br />
LP22 1,08 a 1,22 a 1,70 a<br />
LP25 1,66 a 0,52 c 1,36 a<br />
LP28 0,76 a 1,08 a 1,78 a<br />
LP44 0,96 a 0,10 d 1,42 a<br />
LP47 1,24 a 1,28 a 1,32 a<br />
Ps852c 1,44 a 1,10 a 1,72 a<br />
Ps864c 1,20 a 0,96 b 1,56 a<br />
Ps866c 1,34 a 0,88 b 2,02 a<br />
Ps871b 1,26 a 1,26 a 1,56 a<br />
CV (%) 40,51 24,84 43,98<br />
Médias seguidas de mesma letra minúsculas nas colunas não diferem entre si pelo teste de Scott-Knot ao nível<br />
de 5%.<br />
4.6 Considerações Finais<br />
Dessa forma, em geral, com o sistema gnotobiótico proposto foi possível analisar a<br />
composição dos exsudatos, pelo menos em açúcares, embora se saiba que na natureza essa<br />
composição pode ser um pouco modificada devido à presença de microrganismos e outros<br />
fatores, como o substrato ou a composição de nutrientes no solo (KAMILOVA et al., 2006;<br />
GRAYSTON et al., 1996; ROVIRA, 1969).<br />
33
A frutose, a glicose e a arabinose, nessa ordem, foram os açúcares encontrados em<br />
maior concentração para as três espécies de plantas, resultado semelhante ao encontrado <strong>por</strong><br />
KAMILOVA et al. (2006) em seu trabalho, embora em concentrações frequentemente<br />
diferentes entre as plantas e períodos de amostragem, ainda que em algumas ocasiões as<br />
exsudações tenham sido estatisticamente semelhantes.<br />
Todos os isolados colonizaram as raízes de alface, chicória e rúcula, independente de<br />
serem oriundos de diferentes plantas, embora a maioria tenha sido originado de alface. Claro,<br />
a vi<strong>sua</strong>lização de crescimento abundante no meio de cultura deve ser principalmente resultado<br />
do próprio meio, o B de King. No entanto, na vi<strong>sua</strong>lização macroscópica do crescimento de<br />
uma película ainda no interior do sistema gnotobiótico, a indicação de crescimento ocorreu<br />
para todos os isolados. Não é possível, com os dados obtidos, concluir pela exsudação de<br />
açúcares como o principal diferencial na colonização de raízes de alface <strong>por</strong> bactérias do<br />
grupo fluorescente de Pseudomonas sp. em relação a chicória e rúcula.<br />
No entanto, se se considerar a tabela 4, com os valores de matéria seca das plantas, a<br />
coluna que apresenta os dados referentes à chicória, são os únicos em que os isolados tiverem<br />
efeitos significativamente diferentes entre si, as bactérias provenientes de alface nem sempre<br />
tiveram o melhor efeito na chicória; no entanto, a única bactéria obtida de chicória esteve no<br />
grupo das maiores plântulas. Todavia, isso pode ser considerado apenas evidências, sendo<br />
necessários mais estudos a respeito. RIDDER-DUINE et al. (2005) não encontraram uma<br />
forte dependência entre comunidade rizosférica e a espécie da planta como também mostram<br />
os resultados de GRAYSTON et al. (1998). Neste trabalho, quando se avaliou o crescimento<br />
bacteriano em meios de cultura com os açúcares encontrados, houve algumas diferenças entre<br />
os isolados. O efeito das bactérias sobre a chicória, especificamente, parece ter revelado<br />
algumas evidências de que, ainda que não se tenham dados definitivos, estudos mais<br />
detalhados, incluindo tanto outras substâncias na análise de exsudação como mais isolados<br />
provenientes de cada planta, poderão trazer luz a esse aspecto. A concentração de proteínas de<br />
maneira geral, também não apresentou diferenças. Mas também se sabe que a composição dos<br />
exsudatos influencia diretamente a microbiota que colonizará a raiz (GRAYSTON et al.,<br />
1998; LANDI et al, 2006). Portanto, há necessidade de aprofundar os estudos.<br />
Seis isolados utilizaram os 3 açúcares presentes em maior quantidade (glicose, frutose<br />
e arabinose) e 7 utilizaram os dois açúcares presentes em maior quantidade (frutose e glicose).<br />
Ou seja, pelo menos quanto aos açúcares presentes, 13 dos 14 isolados utilizam pelo menos 2<br />
dos 3 açúcares presentes em maiores quantidades. KAMILOVA et al. (2006) também<br />
atestaram a <strong>utilização</strong> do ácido cítrico, a maior fonte de carbono encontrado nos exsudatos das<br />
34
plantas avaliadas em seu trabalho (tomate, pepino e pimenta), pelos quatro isolados de<br />
Pseudomonas selecionados <strong>por</strong> serem bons colonizadores das raízes das mesmas plantas. Esse<br />
é um fato im<strong>por</strong>tante, visto que a <strong>utilização</strong> dos principais componentes exsudados seria uma<br />
im<strong>por</strong>tante característica para uma colonização eficiente da rizosfera<br />
Assim, embora os açúcares sozinhos pareçam explicar a colonização diferencial dos<br />
isolados em algumas situações mas não em outras, podem ser um dos fatores que influencie,<br />
visto que uma composição parecida resultou em uma colonização aparentemente semelhante.<br />
Talvez se a composição de açúcares e proteínas apresentasse diferenças significativas entre as<br />
plantas, a colonização fosse diferente. Pode ser, ainda, que no campo os mesmos isolados<br />
colonizem diferentemente as mesmas plantas, devido a fatores como a presença de outros<br />
organismos já existentes no solo, <strong>por</strong> si só um ambiente muito mais complexo<br />
(DEVLIEGHER et al., 1995).<br />
Embora a composição de exsudatos das plantas realmente tenha um efeito seletivo nas<br />
bactérias que colonizam <strong>sua</strong> rizosfera, para RIDDER-DUINE et al. (2005) o que irá<br />
determinar a colonização rizosférica, é o conjunto de bactérias competitivas que habitam o<br />
solo não rizosférico, ou seja, as bactérias presentes no solo não rizosférico, mas que têm<br />
capacidade de utilizar os compostos exsudados pelas plantas, tais como os açúcares,<br />
aminoácidos e ácido orgânicos mais comuns.<br />
Neste trabalho, os isolados colonizaram as raízes de todas as plantas, e influenciaram<br />
na massa de matéria seca obtida. Na comparação feita entre os isolados, em alface e rúcula<br />
todos obtiveram efeitos semelhantes, mas em chicória a influência foi diferente. Vários<br />
isolados podem colonizar as raízes, mas os efeitos obtidos serão diferentes.<br />
Assim, os açúcares ou proteínas sozinhos parecem não explicar a colonização<br />
preferencial de Pseudomonas em raízes de alface, como relatado <strong>por</strong> COELHO et al. (2007),<br />
embora esse efeito não tenha sido observado neste trabalho. Aqui, a composição parecida dos<br />
exsudatos, parece ter favorecido uma colonização semelhante. É im<strong>por</strong>tante lembrar que<br />
houve um número limitado de componentes analisados, o que pode levar a conclusões menos<br />
fundamentadas.<br />
35
5 CONCLUSÕES<br />
Frutose, glicose+maltose e arabinose foram os açúcares encontrados em maiores<br />
concentrações nos exsudatos de alface, chicória e rúcula<br />
De maneira geral, a exsudação de açúcares foi maior no estádio inicial de<br />
desenvolvimento, para as três plantas estudadas.<br />
As proteínas estavam presentes em concentrações semelhantes nas diferentes plantas e<br />
diferentes períodos.<br />
Nenhum isolado utilizou os açúcares, em meio de cultura, nas concentrações<br />
encontradas nos exsudatos.<br />
As raízes de todas as plantas foram colonizadas <strong>por</strong> todos os isolados,<br />
independentemente da planta de origem.<br />
Os açúcares sozinhos, na quantidade e na composição em que foram avaliados, ou as<br />
proteínas nas quantidades encontradas, não explicaram a colonização preferencial de<br />
Pseudomonas em raízes de alface.<br />
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