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Dispositivos de filtração centrífuga Amicon® Ultra-4 - Millipore

Dispositivos de filtração centrífuga Amicon® Ultra-4 - Millipore

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Guia do utilizador<br />

<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong><br />

<strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />

para volumes <strong>de</strong> até 4 ml<br />

O dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 10K <strong>de</strong>stina-se ao diagnóstico in vitro.<br />

Os dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 3K, 30K, 50K e 100K <strong>de</strong>stinam-se<br />

apenas a fins <strong>de</strong> investigação e não a procedimentos <strong>de</strong> diagnóstico.<br />

Português<br />

Introdução<br />

Os dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 permitem a ultra<strong>filtração</strong> rápida, com capacida<strong>de</strong><br />

para factores <strong>de</strong> concentração elevados e fácil recuperação do concentrado a partir <strong>de</strong> matrizes <strong>de</strong><br />

amostras diluídas e complexas. O <strong>de</strong>sign vertical e a área <strong>de</strong> superfície <strong>de</strong> membrana disponível permitem<br />

um processamento rápido das amostras, uma elevada recuperação <strong>de</strong> amostras (tipicamente superior<br />

a 90% da solução inicial diluída) e a capacida<strong>de</strong> para uma concentração <strong>de</strong> 80 vezes. O tempo <strong>de</strong><br />

processamento típico é <strong>de</strong> 10 a 40 minutos, <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ndo do limite <strong>de</strong> peso molecular nominal (NMWL). A<br />

polarização dos solutos e a subsequente obstrução da membrana são minimizadas pelo <strong>de</strong>sign vertical e a<br />

existência <strong>de</strong> um "<strong>de</strong>adstop" (ponto morto) físico no dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> impe<strong>de</strong> a centrifugação até à<br />

secura e a potencial perda da amostra. O concentrado é recolhido a partir do reservatório <strong>de</strong> amostra do<br />

dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> com uma pipeta, enquanto o filtrado obtido por ultracentrifugação é recolhido no<br />

tubo <strong>de</strong> centrifugação fornecido. O dispositivo po<strong>de</strong> ser submetido a rotação num rotor basculante (para<br />

um <strong>de</strong>sempenho i<strong>de</strong>al) ou num rotor <strong>de</strong> ângulo fixo. Os dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 são fornecidos não<br />

estéreis e <strong>de</strong>stinam-se a uma única utilização.<br />

A linha <strong>de</strong> produtos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 inclui 5 "cutoffs" diferentes (limite <strong>de</strong> peso molecular nominal —<br />

NMWL — ou "cutoff" <strong>de</strong> peso molecular — MWCO):<br />

● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 3K — 3000 NMWL<br />

● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 10K — 10.000 NMWL<br />

● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 30K — 30.000 NMWL<br />

● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 50K — 50.000 NMWL<br />

● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 100K — 100.000 NMWL<br />

Os dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 10K estão indicados para utilização em<br />

diagnóstico in vitro para concentração <strong>de</strong> soro, urina, líquido cefalorraquidiano e outros fluidos<br />

corporais antes da análise.<br />

Os dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 3K, 30K, 50K e 100K <strong>de</strong>stinam-se apenas a fins <strong>de</strong><br />

investigação e não a procedimentos <strong>de</strong> diagnóstico.<br />

<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />

1


Aplicações<br />

● Concentração <strong>de</strong> amostras biológicas que contenham antigénios, anticorpos, enzimas, ácidos nucleicos<br />

(amostras <strong>de</strong> ADN/ARN, <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>ia simples ou dupla), microrganismos, produtos <strong>de</strong> eluição <strong>de</strong> coluna e<br />

amostras purificadas<br />

● Purificação <strong>de</strong> componentes macromoleculares que se encontram em extractos <strong>de</strong> cultura <strong>de</strong> tecidos<br />

e lisados <strong>de</strong> células, remoção <strong>de</strong> "primers" (iniciadores), <strong>de</strong> compostos <strong>de</strong> ligação ou <strong>de</strong> marcadores<br />

moleculares <strong>de</strong> uma mistura <strong>de</strong> reacção, e remoção <strong>de</strong> proteínas antes <strong>de</strong> HPLC<br />

● Dessalinização, permuta <strong>de</strong> tampões ou dia<strong>filtração</strong><br />

Materiais fornecidos<br />

O dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 é fornecido com uma tampa, um dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> e um tubo <strong>de</strong><br />

centrifugação.<br />

Tampa<br />

30,000<br />

MWCO<br />

ul<br />

500<br />

250<br />

100<br />

50<br />

4<br />

3<br />

2<br />

Dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong><br />

Tubo <strong>de</strong> centrifugação<br />

Equipamento necessário<br />

● Centrifugadora com rotor basculante (preferível) ou <strong>de</strong> ângulo fixo com poços/transportadores com<br />

capacida<strong>de</strong> para tubos <strong>de</strong> fundo cónico <strong>de</strong> 15 ml, 17 mm x 124 mm<br />

PRECAUÇÃO: Para evitar danificar o dispositivo durante a centrifugação, verifique o espaço livre antes<br />

<strong>de</strong> a iniciar.<br />

● Pipeta com ponta <strong>de</strong> 200 microlitros (μl) para recuperação do concentrado<br />

A<strong>de</strong>quação<br />

Sugere-se a realização <strong>de</strong> estudos preliminares <strong>de</strong> recuperação e retenção para garantir a a<strong>de</strong>quação para<br />

o fim a que se <strong>de</strong>stina. Consulte a secção "Como quantificar recuperações".<br />

Armazenamento e prazo <strong>de</strong> valida<strong>de</strong> em armazém do dispositivo<br />

Armazene a 15–30 °C. O prazo <strong>de</strong> valida<strong>de</strong> em armazém é <strong>de</strong> 3 anos a partir da data <strong>de</strong> fabrico. No caso das<br />

referências UFC801008, UFC801024 e UFC801096, consulte o prazo <strong>de</strong> valida<strong>de</strong> no rótulo da embalagem.<br />

2 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4


Pré-enxaguamento<br />

As membranas <strong>de</strong> ultra<strong>filtração</strong> dos dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 contêm vestígios <strong>de</strong> glicerina. Se esta<br />

substância interferir com a análise, enxagúe previamente o dispositivo com tampão ou água Milli-Q®. Se a<br />

interferência persistir, enxagúe com NaOH 0,1 N seguido por uma segunda centrifugação com tampão ou<br />

água Milli-Q®.<br />

PRECAUÇÃO: Não permita que a membrana dos dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> seque <strong>de</strong>pois <strong>de</strong><br />

molhada. Caso não utilize o dispositivo imediatamente após o pré-enxaguamento, <strong>de</strong>ixe<br />

líquido na membrana até o dispositivo ser utilizado.<br />

Como utilizar os dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />

1. Adicione até 4 ml <strong>de</strong> amostra (3,5 ml, caso esteja a utilizar um rotor <strong>de</strong> ângulo fixo <strong>de</strong> 23°) ao<br />

dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>.<br />

2. Coloque o dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> tapado no rotor da centrifugadora (preferível rotor basculante) e<br />

contrabalance com um dispositivo semelhante.<br />

3. Quando utilizar um rotor basculante, centrifugue o dispositivo a 4000 × g no máximo durante<br />

aproximadamente 10-40 minutos.<br />

Quando utilizar um rotor <strong>de</strong> ângulo fixo, oriente o dispositivo com o painel <strong>de</strong> membrana virado<br />

para cima.<br />

No caso dos dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 3K, 10K, 30K e 50K, centrifugue o dispositivo a 7500 × g no<br />

máximo durante aproximadamente 10-40 minutos.<br />

No caso dos dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 100K, centrifugue o dispositivo a 5000 × g no máximo durante<br />

aproximadamente 10-20 minutos.<br />

NOTA: Consulte os tempos <strong>de</strong> centrifugação típicos nas figuras 1 e 2 e nas tabelas 2 e 3.<br />

4. Para recuperar o soluto concentrado, insira uma pipeta no fundo do dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> e retire a<br />

amostra com um movimento <strong>de</strong> varrimento lateral para garantir a recuperação total. O filtrado obtido<br />

por ultra<strong>filtração</strong> po<strong>de</strong> ser guardado no tubo <strong>de</strong> centrifugação.<br />

NOTA: Para uma recuperação i<strong>de</strong>al, remova a amostra concentrada imediatamente após a centrifugação.<br />

Dessalinização ou dia<strong>filtração</strong><br />

A <strong>de</strong>ssalinização, a permuta <strong>de</strong> tampões ou a dia<strong>filtração</strong> são métodos importantes para a remoção <strong>de</strong><br />

sais ou solventes em soluções que contêm biomoléculas. A remoção <strong>de</strong> sais ou a permuta <strong>de</strong> tampões<br />

po<strong>de</strong> ser conseguida no dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 através da concentração da amostra, seguida pela<br />

reconstituição do concentrado até ao volume <strong>de</strong> amostra original com qualquer solvente <strong>de</strong>sejado. O<br />

processo <strong>de</strong> "lavagem" po<strong>de</strong> ser repetido até a concentração do microssoluto contaminante ter sido<br />

suficientemente reduzida. Ver exemplo seguinte.<br />

30,000<br />

MWCO<br />

4<br />

3<br />

2<br />

ul<br />

500<br />

250<br />

100<br />

50<br />

4 ml <strong>de</strong><br />

1 mg/ml <strong>de</strong><br />

proteína em<br />

NaCl 100 mM<br />

Centrifugue para<br />

concentrar<br />

30,000<br />

MWCO<br />

ul<br />

500<br />

250<br />

100<br />

50<br />

4<br />

3<br />

2<br />

50 μl <strong>de</strong><br />

80 mg/ml <strong>de</strong><br />

proteína em<br />

NaCl 100 mM<br />

NaCl<br />

100 mM<br />

Adicione 3,95 ml<br />

<strong>de</strong> NaCl 10 mM ou<br />

troque <strong>de</strong> tampão<br />

<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />

30,000<br />

MWCO<br />

4<br />

3<br />

2<br />

ul<br />

500<br />

250<br />

100<br />

50<br />

4 ml <strong>de</strong> 1 mg/ml<br />

<strong>de</strong> proteína em<br />

NaCl 11,1 mM<br />

Centrifugue<br />

para concentrar<br />

30,000<br />

MWCO<br />

ul<br />

500<br />

250<br />

100<br />

50<br />

4<br />

3<br />

2<br />

50 μl <strong>de</strong><br />

80 mg/ml <strong>de</strong><br />

proteína em NaCl<br />

11,1 mM<br />

NaCl<br />

11,1 mM<br />

3


Desempenho - Concentração <strong>de</strong> ADN<br />

A Merck <strong>Millipore</strong> Ltd. <strong>de</strong>terminou que o dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 30K fornece o melhor equilíbrio entre<br />

o tempo <strong>de</strong> recuperação e <strong>de</strong> centrifugação para ADN <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>ia dupla em relação a pares <strong>de</strong> bases <strong>de</strong> 137<br />

a 1159.<br />

Tabela 1. Recuperação típica <strong>de</strong> nucleótidos para o dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 30K<br />

Tamanho do par <strong>de</strong> bases Tempo<br />

Volume<br />

<strong>de</strong> ADN <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>ia dupla <strong>de</strong> centrifugação (min) <strong>de</strong> concentrado (µl) Recuperação (%)<br />

137–1159 10 50–70 > 85<br />

Condições <strong>de</strong> centrifugação: Rotor <strong>de</strong> ângulo fixo, 5000 × g, temperatura ambiente, 2 ml <strong>de</strong> volume inicial.<br />

Desempenho - Concentração proteica<br />

Débito<br />

Os factores que influenciam o débito incluem a concentração da amostra, o volume inicial, a natureza<br />

química do soluto, a força <strong>centrífuga</strong> relativa, o ângulo do rotor da centrifugadora, o tipo <strong>de</strong> membrana e<br />

a temperatura. As figuras 1 e 2 e as tabelas 2 e 3 po<strong>de</strong>m ser usadas para estimar o tempo necessário para<br />

se obter um <strong>de</strong>terminado volume <strong>de</strong> filtrado ou concentrado para diversos marcadores proteicos. O tempo<br />

<strong>de</strong> centrifugação típico para uma amostra <strong>de</strong> 4 ml é <strong>de</strong> aproximadamente 10 a 40 minutos (<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ndo<br />

do limite <strong>de</strong> peso molecular nominal do dispositivo). Embora a maior parte da amostra seja filtrada nos<br />

primeiros 10 a 20 minutos <strong>de</strong> centrifugação, o volume <strong>de</strong> concentração mais baixo (30-75 μl) é alcançado<br />

após centrifugação durante 20 a 40 minutos.<br />

Figura 1. Volume <strong>de</strong> filtrado típico vs. tempo <strong>de</strong> centrifugação (rotor basculante)<br />

Volume <strong>de</strong> filtrado (ml)<br />

4.0<br />

3.5<br />

3.0<br />

2.5<br />

2.0<br />

1.5<br />

1.0<br />

0.5<br />

0.0<br />

0 5 10 15 20 25 30 35 40<br />

Tempo <strong>de</strong> centrifugação (min)<br />

Condições <strong>de</strong> centrifugação: 4000 × g, temperatura ambiente, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml.<br />

Marcadores proteicos utilizados: citocromo C para dispositivos 3K e 10K, BSA para dispositivos 30K e 50K,<br />

e IgG para dispositivo 100K, n = 6.<br />

4 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />

3K<br />

10K<br />

30K<br />

50K<br />

100K


Débito, continuação<br />

Figura 2. Volume <strong>de</strong> filtrado típico vs. tempo <strong>de</strong> centrifugação (rotor <strong>de</strong> ângulo fixo)<br />

Volume <strong>de</strong> filtrado (ml)<br />

4.0<br />

3.5<br />

3.0<br />

2.5<br />

2.0<br />

1.5<br />

1.0<br />

0.5<br />

0.0<br />

0 5 10 15 20 25 30 35 40<br />

Tempo <strong>de</strong> centrifugação (min)<br />

Condições <strong>de</strong> centrifugação: 7500 × g para dispositivos 3K, 10K, 30K e 50K, 5000 × g para dispositivo <strong>de</strong> 100K,<br />

temperatura ambiente, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml. Marcadores proteicos utilizados: citocromo C para dispositivos<br />

3K e 10K, BSA para dispositivos 30K e 50K, e IgG para dispositivo 100K, n = 6.<br />

Tabela 2. Volume <strong>de</strong> concentrado típico vs. tempo <strong>de</strong> centrifugação (rotor basculante)<br />

Tempo <strong>de</strong><br />

centrifugação (min)<br />

Dispositivo<br />

3K<br />

Dispositivo<br />

10K<br />

<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />

3K<br />

10K<br />

30K<br />

50K<br />

Volume <strong>de</strong> concentrado (μl)<br />

Dispositivo<br />

30K<br />

100K<br />

Dispositivo<br />

50K<br />

Dispositivo<br />

100K<br />

10 1369 176 73 32 264<br />

15 – 76 46 – 36<br />

20 478 58 37 30 33<br />

25 228 – – – –<br />

30 159 – – – –<br />

40 94 – – – –<br />

Condições <strong>de</strong> centrifugação: 4000 × g, temperatura ambiente, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml. Marcadores proteicos<br />

utilizados: citocromo C para dispositivos 3K e 10K, BSA para dispositivos 30K e 50K, e IgG para dispositivo 100K,<br />

n = 6 (valor médio <strong>de</strong> 3 lotes <strong>de</strong> membranas). Os volumes a sombreado foram usados para o cálculo <strong>de</strong><br />

recuperação <strong>de</strong> proteínas na tabela 5.<br />

Tabela 3. Volume <strong>de</strong> concentrado típico vs. tempo <strong>de</strong> centrifugação (rotor <strong>de</strong> ângulo fixo <strong>de</strong> 35°)<br />

Tempo <strong>de</strong><br />

centrifugação (min)<br />

Dispositivo<br />

3K<br />

Dispositivo<br />

10K<br />

Volume <strong>de</strong> concentrado (μl)<br />

Dispositivo<br />

30K<br />

Dispositivo<br />

50K<br />

Dispositivo<br />

100K<br />

10 613 97 42 23 53<br />

15 – 54 30 – 30<br />

20 170 35 22 15 26<br />

25 118 – – – –<br />

30 92 – – – –<br />

40 62 – – – –<br />

Condições <strong>de</strong> centrifugação: 7500 × g para dispositivos 3K, 10K, 30K e 50K, 5000 × g para dispositivo <strong>de</strong> 100K,<br />

temperatura ambiente, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml. Marcadores proteicos utilizados: citocromo C para dispositivos 3K<br />

e 10K, BSA para dispositivos 30K e 50K, e IgG para dispositivo 100K, n = 6 (valor médio <strong>de</strong> 3 lotes <strong>de</strong> membranas).<br />

Os volumes a sombreado foram usados para o cálculo <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> proteínas na tabela 5.<br />

5


Retenção <strong>de</strong> proteínas e recuperação do concentrado<br />

As membranas utilizadas nos dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> caracterizam-se por um limite <strong>de</strong> peso molecular<br />

nominal (NMWL), ou seja, a sua capacida<strong>de</strong> para reter moléculas acima <strong>de</strong> um peso molecular especificado.<br />

Solutos com peso molecular próximo do NMWL po<strong>de</strong>m ser apenas parcialmente retidos. A retenção na<br />

membrana <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> do tamanho molecular e da forma do soluto. Para a maioria das aplicações, o peso<br />

molecular é um parâmetro conveniente para utilizar na avaliação das características <strong>de</strong> retenção. A Merck<br />

<strong>Millipore</strong> Ltd. recomenda a utilização <strong>de</strong> uma membrana com um NMWL pelo menos duas vezes inferior ao<br />

peso molecular do soluto proteico que se preten<strong>de</strong> concentrar. Consulte a tabela 4.<br />

Tabela 4. Retenção típica dos marcadores proteicos<br />

Marcador/Concentração<br />

Peso molecular<br />

NMWL % retenção com<br />

Dispositivo rotor basculante<br />

% retenção<br />

com rotor <strong>de</strong><br />

ângulo fixo<br />

Tempo <strong>de</strong><br />

centrifugação<br />

(min)<br />

α-quimotripsinogénio (1 mg/ml) 25.000 3K > 95 > 95 40<br />

Citocromo C (0,25 mg/ml) 12.400 > 95 > 95 40<br />

Vitamina B-12 (0,2 mg/ml) 1350 < 35 < 35 40<br />

α-quimotripsinogénio (1 mg/ml) 25.000 10K > 95 > 95 15<br />

Citocromo C (0,25 mg/ml) 12.400 > 95 > 95 15<br />

Vitamina B-12 (0,2 mg/ml) 1350 < 15 < 15 15<br />

BSA (1 mg/ml) 67.000 30K > 95 > 95 10<br />

Ovalbumina (1 mg/ml) 45.000 > 90 > 90 10<br />

Citocromo C (0,25 mg/ml) 12.400 < 20 < 20 10<br />

Vitamina B-12 (0,2 mg/ml) 1350 < 10 < 10 10<br />

BSA (1 mg/ml) 67.000 50K > 95 > 95 10 (SB), 5 (FA)<br />

Ovalbumina (1 mg/ml) 45.000 ~ 60 ~ 65 10 (SB), 5 (FA)<br />

Citocromo C (0,25 mg/ml) 12.400 < 10 < 10 10 (SB), 5 (FA)<br />

Tiroglobulina (0,5 mg/ml) 677.000 100K > 95 > 95 15<br />

IgG (1 mg/ml) 156.000 > 90 > 90 15<br />

Ovalbumina (1 mg/ml) 45.000 < 25 < 20 15<br />

Condições <strong>de</strong> centrifugação: rotor basculante (SB), 4000 × g ou rotor <strong>de</strong> ângulo fixo (FA) <strong>de</strong> 35°, 7500 × g para<br />

dispositivos 3K, 10K, 30K e 50K, 5000 x g para dispositivo 100K, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml, temperatura ambiente,<br />

n = 6 (valor médio <strong>de</strong> 3 lotes <strong>de</strong> membranas). Os volumes a sombreado foram retirados das tabelas 2 e 3.<br />

6 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4


Retenção <strong>de</strong> proteínas e recuperação do concentrado, continuação<br />

Os factores que <strong>de</strong>terminam a recuperação da amostra incluem a natureza do soluto proteico em relação<br />

ao NMWL do dispositivo escolhido, a concentração inicial e o factor <strong>de</strong> concentração. A tabela 5 mostra as<br />

recuperações típicas para os dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4.<br />

Tabela 5. Recuperação <strong>de</strong> concentrado típica<br />

Volume <strong>de</strong><br />

Marcador/<br />

Concentração<br />

Citocromo C<br />

(0,25 mg/ml)<br />

Citocromo C<br />

(0,25 mg/ml)<br />

NMWL<br />

Dispositivo<br />

Tempo <strong>de</strong><br />

centrifugação<br />

(min)<br />

concentrado (µl)<br />

Basculante Ângulo<br />

fixo<br />

Maximizar a recuperação da amostra<br />

Factor <strong>de</strong><br />

concentração (x)<br />

Basculante Ângulo<br />

fixo<br />

A baixa recuperação da amostra no concentrado po<strong>de</strong> <strong>de</strong>ver-se a perdas por adsorção, sobreconcentração<br />

ou passagem <strong>de</strong> amostra através da membrana.<br />

● As perdas por adsorção <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>m da concentração do soluto, da sua natureza hidrofóbica, da<br />

temperatura e do tempo <strong>de</strong> contacto com as superfícies do dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong>, da composição das<br />

amostras e do pH. Para minimizar as perdas, remova as amostras concentradas imediatamente após a<br />

centrifugação.<br />

● Se a concentração inicial da amostra for alta, monitorize o processo <strong>de</strong> centrifugação <strong>de</strong> modo a evitar<br />

a sobreconcentração da amostra. A sobreconcentração po<strong>de</strong> levar à precipitação e à potencial perda da<br />

amostra.<br />

● Se a amostra parecer estar a atravessar a membrana, escolha um dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 com<br />

NMWL mais baixo.<br />

<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />

Recuperação <strong>de</strong><br />

concentrado (%)<br />

Basculante Ângulo<br />

fixo<br />

3K 40 94 62 43,5 65,0 98,2 96,7<br />

10K 15 76 54 52,3 76,6 97,3 98,5<br />

BSA (1 mg/ml) 30K 10 73 42 56,1 98,6 95,8 95,0<br />

BSA (1 mg/ml) 50K 10 32 23 137,0 177,4 98,8 92,8<br />

IgG (1 mg/ml) 100K<br />

15 (SB),<br />

10 (FA)<br />

36 53 115,9 56,8 92,2 91,3<br />

Condições <strong>de</strong> centrifugação: rotor basculante (SB), 4000 × g ou rotor <strong>de</strong> ângulo fixo (FA) <strong>de</strong> 35°, 7500 × g para<br />

dispositivos 3K, 10K, 30K e 50K, 5000 x g para dispositivo 100K, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml, temperatura ambiente,<br />

n = 6 (valor médio <strong>de</strong> 3 lotes <strong>de</strong> membranas). Os volumes a sombreado foram retirados das tabelas 2 e 3.<br />

7


Como quantificar recuperações<br />

Calcular a recuperação total, a percentagem <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> concentrado e a percentagem <strong>de</strong> recuperação<br />

<strong>de</strong> filtrado utilizando o método seguinte. O procedimento fornece um valor muito aproximado das<br />

recuperações para soluções que tenham concentrações <strong>de</strong> até, grosso modo, 20 mg/ml.<br />

NOTA: As técnicas <strong>de</strong> ensaio a<strong>de</strong>quadas incluem espectrofotometria <strong>de</strong> absorção, o radioimunoensaio, o<br />

índice refractário e a condutivida<strong>de</strong>.<br />

Procedimento <strong>de</strong> pesagem directa<br />

A <strong>de</strong>nsida<strong>de</strong> da maior parte das proteínas diluídas é quase igual à <strong>de</strong>nsida<strong>de</strong> da água (ou seja, 1 g/ml). Com<br />

esta proprieda<strong>de</strong>, os volumes <strong>de</strong> concentrado e filtrado po<strong>de</strong>m ser quantificados por pesagem e conversão<br />

das unida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> gramas para mililitros. Esta técnica é válida apenas para soluções com concentrações <strong>de</strong><br />

aproximadamente 20 mg/ml ou menos.<br />

1. Antes da utilização, pese em separado o dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> vazio, o tubo <strong>de</strong> centrifugação e um<br />

tubo vazio para recolha <strong>de</strong> concentrado.<br />

2. Encha o dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> com solução e volte a pesá-lo.<br />

3. Monte o dispositivo e centrifugue <strong>de</strong> acordo com as instruções.<br />

4. Recolha o concentrado com uma pipeta e distribua-o para o tubo <strong>de</strong> recolha <strong>de</strong> concentrado<br />

previamente pesado.<br />

5. Retire o dispositivo do tubo <strong>de</strong> centrifugação e pese o tubo <strong>de</strong> centrifugação e o tubo para recolha <strong>de</strong><br />

concentrado.<br />

6. Subtraia os pesos do dispositivo/tubos vazios para calcular os pesos do material inicial, do filtrado e do<br />

concentrado.<br />

7. Analise o material inicial, o filtrado e o concentrado para <strong>de</strong>terminar a concentração do soluto.<br />

8. Calcule as recuperações a partir dos dados do peso/volume e as concentrações medidas da seguinte<br />

forma:<br />

Wc × Cc % <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> concentrado = 100 ×<br />

Wo × Co Wf × Cf % <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> filtrado = 100 ×<br />

Wo × Co % <strong>de</strong> recuperação total = % <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> concentrado + % recuperação <strong>de</strong> filtrado<br />

W c = peso total do concentrado antes do ensaio<br />

W o = peso do material inicial original<br />

W f = peso do filtrado<br />

C c = concentração do concentrado<br />

C o = concentração do material inicial original<br />

C f = concentração do filtrado<br />

8 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4


Especificações<br />

Volume inicial máximo <strong>de</strong> amostra<br />

Rotores <strong>de</strong> centrifugadora <strong>de</strong> ângulo fixo com<br />

rotores basculantes (45° e 35°)<br />

4,0 ml<br />

Rotor <strong>de</strong> ângulo fixo (23°) 3,5 ml<br />

Volume típico final <strong>de</strong> concentrado 50-100 μl<br />

Força <strong>centrífuga</strong> relativa máxima<br />

Rotor basculante 4000 × g<br />

Rotor <strong>de</strong> ângulo fixo 7500 × g para dispositivos 3K, 10K, 30K<br />

e 50K NMWL<br />

Área <strong>de</strong> membrana activa 3 cm 2<br />

Dimensões<br />

Dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> no tubo (tapado)<br />

Comprimento: 124 mm Diâmetro: 17,3 mm<br />

Dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong><br />

Materiais <strong>de</strong> construção<br />

Comprimento: 73,4 mm Diâmetro: 17,2 mm<br />

Dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> Copolímero <strong>de</strong> estireno/butadieno<br />

5000 x g para dispositivo 100K NMWL<br />

Membrana Celulose regenerada <strong>de</strong> baixo nível <strong>de</strong> ligação <strong>Ultra</strong>cel®<br />

Tubo <strong>de</strong> filtrado Polipropileno<br />

Tampa e revestimento do<br />

filtrado<br />

Polietileno<br />

<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />

9


Compatibilida<strong>de</strong> química<br />

Os dispositivos <strong>de</strong> centrifugação <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> <strong>de</strong>stinam-se a ser utilizados com fluidos biológicos e<br />

soluções aquosas. Antes <strong>de</strong> utilizar, verifique a compatibilida<strong>de</strong> química entre a amostra e o dispositivo.<br />

Tabela 6. Compatibilida<strong>de</strong> química dos dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong><br />

Ácidos Concentração Concentração<br />

Ácido acético ≤ 50%* Ácido nítrico ≤ 10%<br />

Ácido clorídrico ≤ 1,0 M Ácido sulfâmico ≤ 3%<br />

Ácido fórmico ≤ 5%* Ácido sulfúrico ≤ 3%<br />

Ácido fosfórico ≤ 30% Ácido tricloroacético (TCA) ≤ 10%*<br />

Ácido láctico ≤ 50% Ácido trifluoroacético (TFA) ≤ 30%*<br />

Bases<br />

Hidróxido <strong>de</strong> amónio ≤ 10% Hidróxido <strong>de</strong> sódio ≤ 0,5 M<br />

Álcoois<br />

Etanol ≤ 70% Metanol ≤ 60%<br />

Isopropanol ≤ 70% n-butanol ≤ 70%<br />

Detergentes<br />

Desoxicolato <strong>de</strong> sódio ≤ 5% Detergente Tergazyme® ≤ 1%<br />

Do<strong>de</strong>cilssulfato <strong>de</strong> sódio (SDS) ≤ 0,1% Surfactante Noni<strong>de</strong>t P-40 ≤ 2%<br />

Detergente Alconox® ≤ 1,0% Surfactante Triton® X-100 ≤ 0,1%<br />

Detergente CHAPS ≤ 0,1% Surfactante Tween® 20 ≤ 0,1%<br />

Detergente Lubrol® PX ≤ 0,1%<br />

Solventes orgânicos<br />

Acetato <strong>de</strong> etilo não recomendado Formal<strong>de</strong>ído ≤ 5%<br />

Acetona não recomendado Piridina não recomendado<br />

Acetonitrilo ≤ 20% Tetracloreto <strong>de</strong> carbono não recomendado<br />

Benzeno não recomendado Tetraidrofurano não recomendado<br />

Clorofórmio não recomendado Tolueno não recomendado<br />

Dimetilssulfóxido (DMSO) ≤ 5%*<br />

Diversos<br />

Carbonato <strong>de</strong> sódio ≤ 20% Mercaptoetanol ≤ 0,1 M<br />

Cloridrato <strong>de</strong> guanidina ≤ 6 M Polietilenoglicol ≤ 10%<br />

Dietilpirocarbonato ≤ 0,2% Sulfato <strong>de</strong> amónio Saturado<br />

Ditiotreitol (DTT) ≤ 0,1 M Tampão fosfato (pH 8,2) ≤ 1 M<br />

Fenol ≤ 1% Tampão Tris (pH 8,2) ≤ 1 M<br />

Glicerina ≤ 70% Ureia ≤ 8 M<br />

Imidazol ≤ 100 mM<br />

* O contacto com este composto químico po<strong>de</strong> provocar a passagem <strong>de</strong> materiais para fora das peças<br />

componentes. Recomenda-se o uso <strong>de</strong> brancos <strong>de</strong> solvente para <strong>de</strong>terminar se os materiais lixiviáveis<br />

apresentam a possibilida<strong>de</strong> <strong>de</strong> interferir com o ensaio.<br />

10 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4


Rotulagem <strong>de</strong> produto para diagnóstico in vitro<br />

A tabela seguinte <strong>de</strong>fine os símbolos que se encontram nos rótulos do dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 10K.<br />

Símbolo Definição Símbolo Definição<br />

V<br />

Informações para encomenda do produto<br />

Esta secção contém uma lista dos números <strong>de</strong> referência dos dispositivos <strong>de</strong> ultra<strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>.<br />

Consulte a secção Assistência Técnica para obter informações dos contactos. Po<strong>de</strong>rá adquirir estes<br />

produtos on-line em www.millipore.com/products.<br />

Volume<br />

inicial<br />

(ml)<br />

Dispositivo médico para diagnóstico<br />

in vitro N<br />

Volume <strong>de</strong><br />

concentrado<br />

final (μl) Produto<br />

0,5 15–20 Dispositivo<br />

<strong>Amicon®</strong><br />

<strong>Ultra</strong>-0,5<br />

Tubos <strong>de</strong> colheita<br />

<strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-0,5<br />

2 15–70 Dispositivoprélançamento<br />

<strong>Amicon®</strong><br />

<strong>Ultra</strong>-2<br />

4 50–100 Dispositivo<br />

<strong>Amicon®</strong><br />

<strong>Ultra</strong>-4<br />

15 150–300 Dispositivo<br />

<strong>Amicon®</strong><br />

<strong>Ultra</strong>-15<br />

Qtd./<br />

emb. 3K 10K 30K 50K 100K<br />

8<br />

24<br />

96<br />

500<br />

UFC500308<br />

UFC500324<br />

UFC500396<br />

UFC5003BK<br />

96 UFC50VL96<br />

UFC501008<br />

UFC501024<br />

UFC501096<br />

UFC5010BK<br />

UFC503008<br />

UFC503024<br />

UFC503096<br />

UFC5030BK<br />

<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />

UFC505008<br />

UFC505024<br />

UFC505096<br />

UFC5050BK<br />

UFC510008<br />

UFC510024<br />

UFC510096<br />

UFC5100BK<br />

24 UFC200324PL UFC201024PL UFC203024PL UFC205024PL UFC210024PL<br />

8<br />

24<br />

96<br />

8<br />

24<br />

96<br />

UFC800308<br />

UFC800324<br />

UFC800396<br />

UFC900308<br />

UFC900324<br />

UFC900396<br />

UFC801008*<br />

UFC801024*<br />

UFC801096*<br />

UFC901008*<br />

UFC901024*<br />

UFC901096*<br />

Data <strong>de</strong> fabrico<br />

h Número <strong>de</strong> referência M Fabricante<br />

D Não reutilizar l Limites <strong>de</strong> temperatura<br />

H Prazo <strong>de</strong> valida<strong>de</strong> d Produto não estéril<br />

g Código <strong>de</strong> lote C<br />

Marcação <strong>de</strong> conformida<strong>de</strong> CE<br />

UFC803008<br />

UFC803024<br />

UFC803096<br />

UFC903008<br />

UFC903024<br />

UFC903096<br />

UFC805008<br />

UFC805024<br />

UFC805096<br />

UFC905008<br />

UFC905024<br />

UFC905096<br />

UFC810008<br />

UFC810024<br />

UFC810096<br />

UFC910008<br />

UFC910024<br />

UFC910096<br />

* Os dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 e -15 10K <strong>de</strong>stinam-se<br />

ao diagnóstico in vitro. Todos os outros dispositivos estão<br />

indicados apenas para utilização em investigação.<br />

11


Aviso<br />

A informação contida neste documento está sujeita a alteração sem aviso prévio e não <strong>de</strong>ve ser interpretada<br />

como um compromisso por parte da Merck <strong>Millipore</strong> Ltd. (“<strong>Millipore</strong>”) ou <strong>de</strong> uma empresa filial. Nem<br />

a Merck <strong>Millipore</strong> Ltd. nem nenhuma das suas filiais assume a responsabilida<strong>de</strong> por quaisquer erros que<br />

possam aparecer neste documento.<br />

Assistência técnica<br />

Para mais informações, contacte os escritórios mais próximos. As informações <strong>de</strong> contacto a nível mundial<br />

actualizadas estão disponíveis no site da Internet, www.millipore.com/offices. Po<strong>de</strong>rá ainda ace<strong>de</strong>r à<br />

página <strong>de</strong> assistência técnica em www.millipore.com/techservice.<br />

Garantia normal<br />

A garantia aplicável aos produtos listados nesta publicação po<strong>de</strong> ser encontrada em<br />

www.millipore.com/terms (nos “Termos e condições <strong>de</strong> venda” aplicáveis à sua transacção comercial).<br />

Fabricado na Irlanda<br />

Merck <strong>Millipore</strong> Ltd.<br />

Tullagreen,<br />

Carrigtwohill,<br />

Co. Cork, IRL<br />

O logótipo M é uma marca comercial da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha.<br />

<strong>Millipore</strong>, Amicon, Milli-Q e <strong>Ultra</strong>cel são marcas registadas da Merck KGaA.<br />

Alconox e Tergazyme são marcas registadas da Alconox, Inc.<br />

Lubrol é uma marca registada <strong>de</strong> Imperial Chemical Industries PLC.<br />

Noni<strong>de</strong>t é uma marca registada da Royal Dutch/Shell Group.<br />

Triton é uma marca registada da Union Carbi<strong>de</strong> Corp.<br />

Tween é uma marca registada da ICI Americas Inc.<br />

© 2012 EMD <strong>Millipore</strong> Corporation. Todos os direitos reservados.<br />

PR03521TR, Rev. A, Português, 03/12<br />

12 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4

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