Dispositivos de filtração centrífuga Amicon® Ultra-4 - Millipore
Dispositivos de filtração centrífuga Amicon® Ultra-4 - Millipore
Dispositivos de filtração centrífuga Amicon® Ultra-4 - Millipore
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Guia do utilizador<br />
<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong><br />
<strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />
para volumes <strong>de</strong> até 4 ml<br />
O dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 10K <strong>de</strong>stina-se ao diagnóstico in vitro.<br />
Os dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 3K, 30K, 50K e 100K <strong>de</strong>stinam-se<br />
apenas a fins <strong>de</strong> investigação e não a procedimentos <strong>de</strong> diagnóstico.<br />
Português<br />
Introdução<br />
Os dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 permitem a ultra<strong>filtração</strong> rápida, com capacida<strong>de</strong><br />
para factores <strong>de</strong> concentração elevados e fácil recuperação do concentrado a partir <strong>de</strong> matrizes <strong>de</strong><br />
amostras diluídas e complexas. O <strong>de</strong>sign vertical e a área <strong>de</strong> superfície <strong>de</strong> membrana disponível permitem<br />
um processamento rápido das amostras, uma elevada recuperação <strong>de</strong> amostras (tipicamente superior<br />
a 90% da solução inicial diluída) e a capacida<strong>de</strong> para uma concentração <strong>de</strong> 80 vezes. O tempo <strong>de</strong><br />
processamento típico é <strong>de</strong> 10 a 40 minutos, <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ndo do limite <strong>de</strong> peso molecular nominal (NMWL). A<br />
polarização dos solutos e a subsequente obstrução da membrana são minimizadas pelo <strong>de</strong>sign vertical e a<br />
existência <strong>de</strong> um "<strong>de</strong>adstop" (ponto morto) físico no dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> impe<strong>de</strong> a centrifugação até à<br />
secura e a potencial perda da amostra. O concentrado é recolhido a partir do reservatório <strong>de</strong> amostra do<br />
dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> com uma pipeta, enquanto o filtrado obtido por ultracentrifugação é recolhido no<br />
tubo <strong>de</strong> centrifugação fornecido. O dispositivo po<strong>de</strong> ser submetido a rotação num rotor basculante (para<br />
um <strong>de</strong>sempenho i<strong>de</strong>al) ou num rotor <strong>de</strong> ângulo fixo. Os dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 são fornecidos não<br />
estéreis e <strong>de</strong>stinam-se a uma única utilização.<br />
A linha <strong>de</strong> produtos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 inclui 5 "cutoffs" diferentes (limite <strong>de</strong> peso molecular nominal —<br />
NMWL — ou "cutoff" <strong>de</strong> peso molecular — MWCO):<br />
● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 3K — 3000 NMWL<br />
● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 10K — 10.000 NMWL<br />
● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 30K — 30.000 NMWL<br />
● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 50K — 50.000 NMWL<br />
● Dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 100K — 100.000 NMWL<br />
Os dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 10K estão indicados para utilização em<br />
diagnóstico in vitro para concentração <strong>de</strong> soro, urina, líquido cefalorraquidiano e outros fluidos<br />
corporais antes da análise.<br />
Os dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 3K, 30K, 50K e 100K <strong>de</strong>stinam-se apenas a fins <strong>de</strong><br />
investigação e não a procedimentos <strong>de</strong> diagnóstico.<br />
<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />
1
Aplicações<br />
● Concentração <strong>de</strong> amostras biológicas que contenham antigénios, anticorpos, enzimas, ácidos nucleicos<br />
(amostras <strong>de</strong> ADN/ARN, <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>ia simples ou dupla), microrganismos, produtos <strong>de</strong> eluição <strong>de</strong> coluna e<br />
amostras purificadas<br />
● Purificação <strong>de</strong> componentes macromoleculares que se encontram em extractos <strong>de</strong> cultura <strong>de</strong> tecidos<br />
e lisados <strong>de</strong> células, remoção <strong>de</strong> "primers" (iniciadores), <strong>de</strong> compostos <strong>de</strong> ligação ou <strong>de</strong> marcadores<br />
moleculares <strong>de</strong> uma mistura <strong>de</strong> reacção, e remoção <strong>de</strong> proteínas antes <strong>de</strong> HPLC<br />
● Dessalinização, permuta <strong>de</strong> tampões ou dia<strong>filtração</strong><br />
Materiais fornecidos<br />
O dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 é fornecido com uma tampa, um dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> e um tubo <strong>de</strong><br />
centrifugação.<br />
Tampa<br />
30,000<br />
MWCO<br />
ul<br />
500<br />
250<br />
100<br />
50<br />
4<br />
3<br />
2<br />
Dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong><br />
Tubo <strong>de</strong> centrifugação<br />
Equipamento necessário<br />
● Centrifugadora com rotor basculante (preferível) ou <strong>de</strong> ângulo fixo com poços/transportadores com<br />
capacida<strong>de</strong> para tubos <strong>de</strong> fundo cónico <strong>de</strong> 15 ml, 17 mm x 124 mm<br />
PRECAUÇÃO: Para evitar danificar o dispositivo durante a centrifugação, verifique o espaço livre antes<br />
<strong>de</strong> a iniciar.<br />
● Pipeta com ponta <strong>de</strong> 200 microlitros (μl) para recuperação do concentrado<br />
A<strong>de</strong>quação<br />
Sugere-se a realização <strong>de</strong> estudos preliminares <strong>de</strong> recuperação e retenção para garantir a a<strong>de</strong>quação para<br />
o fim a que se <strong>de</strong>stina. Consulte a secção "Como quantificar recuperações".<br />
Armazenamento e prazo <strong>de</strong> valida<strong>de</strong> em armazém do dispositivo<br />
Armazene a 15–30 °C. O prazo <strong>de</strong> valida<strong>de</strong> em armazém é <strong>de</strong> 3 anos a partir da data <strong>de</strong> fabrico. No caso das<br />
referências UFC801008, UFC801024 e UFC801096, consulte o prazo <strong>de</strong> valida<strong>de</strong> no rótulo da embalagem.<br />
2 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4
Pré-enxaguamento<br />
As membranas <strong>de</strong> ultra<strong>filtração</strong> dos dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 contêm vestígios <strong>de</strong> glicerina. Se esta<br />
substância interferir com a análise, enxagúe previamente o dispositivo com tampão ou água Milli-Q®. Se a<br />
interferência persistir, enxagúe com NaOH 0,1 N seguido por uma segunda centrifugação com tampão ou<br />
água Milli-Q®.<br />
PRECAUÇÃO: Não permita que a membrana dos dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> seque <strong>de</strong>pois <strong>de</strong><br />
molhada. Caso não utilize o dispositivo imediatamente após o pré-enxaguamento, <strong>de</strong>ixe<br />
líquido na membrana até o dispositivo ser utilizado.<br />
Como utilizar os dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />
1. Adicione até 4 ml <strong>de</strong> amostra (3,5 ml, caso esteja a utilizar um rotor <strong>de</strong> ângulo fixo <strong>de</strong> 23°) ao<br />
dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>.<br />
2. Coloque o dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> tapado no rotor da centrifugadora (preferível rotor basculante) e<br />
contrabalance com um dispositivo semelhante.<br />
3. Quando utilizar um rotor basculante, centrifugue o dispositivo a 4000 × g no máximo durante<br />
aproximadamente 10-40 minutos.<br />
Quando utilizar um rotor <strong>de</strong> ângulo fixo, oriente o dispositivo com o painel <strong>de</strong> membrana virado<br />
para cima.<br />
No caso dos dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 3K, 10K, 30K e 50K, centrifugue o dispositivo a 7500 × g no<br />
máximo durante aproximadamente 10-40 minutos.<br />
No caso dos dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> 100K, centrifugue o dispositivo a 5000 × g no máximo durante<br />
aproximadamente 10-20 minutos.<br />
NOTA: Consulte os tempos <strong>de</strong> centrifugação típicos nas figuras 1 e 2 e nas tabelas 2 e 3.<br />
4. Para recuperar o soluto concentrado, insira uma pipeta no fundo do dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> e retire a<br />
amostra com um movimento <strong>de</strong> varrimento lateral para garantir a recuperação total. O filtrado obtido<br />
por ultra<strong>filtração</strong> po<strong>de</strong> ser guardado no tubo <strong>de</strong> centrifugação.<br />
NOTA: Para uma recuperação i<strong>de</strong>al, remova a amostra concentrada imediatamente após a centrifugação.<br />
Dessalinização ou dia<strong>filtração</strong><br />
A <strong>de</strong>ssalinização, a permuta <strong>de</strong> tampões ou a dia<strong>filtração</strong> são métodos importantes para a remoção <strong>de</strong><br />
sais ou solventes em soluções que contêm biomoléculas. A remoção <strong>de</strong> sais ou a permuta <strong>de</strong> tampões<br />
po<strong>de</strong> ser conseguida no dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 através da concentração da amostra, seguida pela<br />
reconstituição do concentrado até ao volume <strong>de</strong> amostra original com qualquer solvente <strong>de</strong>sejado. O<br />
processo <strong>de</strong> "lavagem" po<strong>de</strong> ser repetido até a concentração do microssoluto contaminante ter sido<br />
suficientemente reduzida. Ver exemplo seguinte.<br />
30,000<br />
MWCO<br />
4<br />
3<br />
2<br />
ul<br />
500<br />
250<br />
100<br />
50<br />
4 ml <strong>de</strong><br />
1 mg/ml <strong>de</strong><br />
proteína em<br />
NaCl 100 mM<br />
Centrifugue para<br />
concentrar<br />
30,000<br />
MWCO<br />
ul<br />
500<br />
250<br />
100<br />
50<br />
4<br />
3<br />
2<br />
50 μl <strong>de</strong><br />
80 mg/ml <strong>de</strong><br />
proteína em<br />
NaCl 100 mM<br />
NaCl<br />
100 mM<br />
Adicione 3,95 ml<br />
<strong>de</strong> NaCl 10 mM ou<br />
troque <strong>de</strong> tampão<br />
<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />
30,000<br />
MWCO<br />
4<br />
3<br />
2<br />
ul<br />
500<br />
250<br />
100<br />
50<br />
4 ml <strong>de</strong> 1 mg/ml<br />
<strong>de</strong> proteína em<br />
NaCl 11,1 mM<br />
Centrifugue<br />
para concentrar<br />
30,000<br />
MWCO<br />
ul<br />
500<br />
250<br />
100<br />
50<br />
4<br />
3<br />
2<br />
50 μl <strong>de</strong><br />
80 mg/ml <strong>de</strong><br />
proteína em NaCl<br />
11,1 mM<br />
NaCl<br />
11,1 mM<br />
3
Desempenho - Concentração <strong>de</strong> ADN<br />
A Merck <strong>Millipore</strong> Ltd. <strong>de</strong>terminou que o dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 30K fornece o melhor equilíbrio entre<br />
o tempo <strong>de</strong> recuperação e <strong>de</strong> centrifugação para ADN <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>ia dupla em relação a pares <strong>de</strong> bases <strong>de</strong> 137<br />
a 1159.<br />
Tabela 1. Recuperação típica <strong>de</strong> nucleótidos para o dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 30K<br />
Tamanho do par <strong>de</strong> bases Tempo<br />
Volume<br />
<strong>de</strong> ADN <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>ia dupla <strong>de</strong> centrifugação (min) <strong>de</strong> concentrado (µl) Recuperação (%)<br />
137–1159 10 50–70 > 85<br />
Condições <strong>de</strong> centrifugação: Rotor <strong>de</strong> ângulo fixo, 5000 × g, temperatura ambiente, 2 ml <strong>de</strong> volume inicial.<br />
Desempenho - Concentração proteica<br />
Débito<br />
Os factores que influenciam o débito incluem a concentração da amostra, o volume inicial, a natureza<br />
química do soluto, a força <strong>centrífuga</strong> relativa, o ângulo do rotor da centrifugadora, o tipo <strong>de</strong> membrana e<br />
a temperatura. As figuras 1 e 2 e as tabelas 2 e 3 po<strong>de</strong>m ser usadas para estimar o tempo necessário para<br />
se obter um <strong>de</strong>terminado volume <strong>de</strong> filtrado ou concentrado para diversos marcadores proteicos. O tempo<br />
<strong>de</strong> centrifugação típico para uma amostra <strong>de</strong> 4 ml é <strong>de</strong> aproximadamente 10 a 40 minutos (<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ndo<br />
do limite <strong>de</strong> peso molecular nominal do dispositivo). Embora a maior parte da amostra seja filtrada nos<br />
primeiros 10 a 20 minutos <strong>de</strong> centrifugação, o volume <strong>de</strong> concentração mais baixo (30-75 μl) é alcançado<br />
após centrifugação durante 20 a 40 minutos.<br />
Figura 1. Volume <strong>de</strong> filtrado típico vs. tempo <strong>de</strong> centrifugação (rotor basculante)<br />
Volume <strong>de</strong> filtrado (ml)<br />
4.0<br />
3.5<br />
3.0<br />
2.5<br />
2.0<br />
1.5<br />
1.0<br />
0.5<br />
0.0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35 40<br />
Tempo <strong>de</strong> centrifugação (min)<br />
Condições <strong>de</strong> centrifugação: 4000 × g, temperatura ambiente, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml.<br />
Marcadores proteicos utilizados: citocromo C para dispositivos 3K e 10K, BSA para dispositivos 30K e 50K,<br />
e IgG para dispositivo 100K, n = 6.<br />
4 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />
3K<br />
10K<br />
30K<br />
50K<br />
100K
Débito, continuação<br />
Figura 2. Volume <strong>de</strong> filtrado típico vs. tempo <strong>de</strong> centrifugação (rotor <strong>de</strong> ângulo fixo)<br />
Volume <strong>de</strong> filtrado (ml)<br />
4.0<br />
3.5<br />
3.0<br />
2.5<br />
2.0<br />
1.5<br />
1.0<br />
0.5<br />
0.0<br />
0 5 10 15 20 25 30 35 40<br />
Tempo <strong>de</strong> centrifugação (min)<br />
Condições <strong>de</strong> centrifugação: 7500 × g para dispositivos 3K, 10K, 30K e 50K, 5000 × g para dispositivo <strong>de</strong> 100K,<br />
temperatura ambiente, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml. Marcadores proteicos utilizados: citocromo C para dispositivos<br />
3K e 10K, BSA para dispositivos 30K e 50K, e IgG para dispositivo 100K, n = 6.<br />
Tabela 2. Volume <strong>de</strong> concentrado típico vs. tempo <strong>de</strong> centrifugação (rotor basculante)<br />
Tempo <strong>de</strong><br />
centrifugação (min)<br />
Dispositivo<br />
3K<br />
Dispositivo<br />
10K<br />
<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />
3K<br />
10K<br />
30K<br />
50K<br />
Volume <strong>de</strong> concentrado (μl)<br />
Dispositivo<br />
30K<br />
100K<br />
Dispositivo<br />
50K<br />
Dispositivo<br />
100K<br />
10 1369 176 73 32 264<br />
15 – 76 46 – 36<br />
20 478 58 37 30 33<br />
25 228 – – – –<br />
30 159 – – – –<br />
40 94 – – – –<br />
Condições <strong>de</strong> centrifugação: 4000 × g, temperatura ambiente, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml. Marcadores proteicos<br />
utilizados: citocromo C para dispositivos 3K e 10K, BSA para dispositivos 30K e 50K, e IgG para dispositivo 100K,<br />
n = 6 (valor médio <strong>de</strong> 3 lotes <strong>de</strong> membranas). Os volumes a sombreado foram usados para o cálculo <strong>de</strong><br />
recuperação <strong>de</strong> proteínas na tabela 5.<br />
Tabela 3. Volume <strong>de</strong> concentrado típico vs. tempo <strong>de</strong> centrifugação (rotor <strong>de</strong> ângulo fixo <strong>de</strong> 35°)<br />
Tempo <strong>de</strong><br />
centrifugação (min)<br />
Dispositivo<br />
3K<br />
Dispositivo<br />
10K<br />
Volume <strong>de</strong> concentrado (μl)<br />
Dispositivo<br />
30K<br />
Dispositivo<br />
50K<br />
Dispositivo<br />
100K<br />
10 613 97 42 23 53<br />
15 – 54 30 – 30<br />
20 170 35 22 15 26<br />
25 118 – – – –<br />
30 92 – – – –<br />
40 62 – – – –<br />
Condições <strong>de</strong> centrifugação: 7500 × g para dispositivos 3K, 10K, 30K e 50K, 5000 × g para dispositivo <strong>de</strong> 100K,<br />
temperatura ambiente, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml. Marcadores proteicos utilizados: citocromo C para dispositivos 3K<br />
e 10K, BSA para dispositivos 30K e 50K, e IgG para dispositivo 100K, n = 6 (valor médio <strong>de</strong> 3 lotes <strong>de</strong> membranas).<br />
Os volumes a sombreado foram usados para o cálculo <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> proteínas na tabela 5.<br />
5
Retenção <strong>de</strong> proteínas e recuperação do concentrado<br />
As membranas utilizadas nos dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> caracterizam-se por um limite <strong>de</strong> peso molecular<br />
nominal (NMWL), ou seja, a sua capacida<strong>de</strong> para reter moléculas acima <strong>de</strong> um peso molecular especificado.<br />
Solutos com peso molecular próximo do NMWL po<strong>de</strong>m ser apenas parcialmente retidos. A retenção na<br />
membrana <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> do tamanho molecular e da forma do soluto. Para a maioria das aplicações, o peso<br />
molecular é um parâmetro conveniente para utilizar na avaliação das características <strong>de</strong> retenção. A Merck<br />
<strong>Millipore</strong> Ltd. recomenda a utilização <strong>de</strong> uma membrana com um NMWL pelo menos duas vezes inferior ao<br />
peso molecular do soluto proteico que se preten<strong>de</strong> concentrar. Consulte a tabela 4.<br />
Tabela 4. Retenção típica dos marcadores proteicos<br />
Marcador/Concentração<br />
Peso molecular<br />
NMWL % retenção com<br />
Dispositivo rotor basculante<br />
% retenção<br />
com rotor <strong>de</strong><br />
ângulo fixo<br />
Tempo <strong>de</strong><br />
centrifugação<br />
(min)<br />
α-quimotripsinogénio (1 mg/ml) 25.000 3K > 95 > 95 40<br />
Citocromo C (0,25 mg/ml) 12.400 > 95 > 95 40<br />
Vitamina B-12 (0,2 mg/ml) 1350 < 35 < 35 40<br />
α-quimotripsinogénio (1 mg/ml) 25.000 10K > 95 > 95 15<br />
Citocromo C (0,25 mg/ml) 12.400 > 95 > 95 15<br />
Vitamina B-12 (0,2 mg/ml) 1350 < 15 < 15 15<br />
BSA (1 mg/ml) 67.000 30K > 95 > 95 10<br />
Ovalbumina (1 mg/ml) 45.000 > 90 > 90 10<br />
Citocromo C (0,25 mg/ml) 12.400 < 20 < 20 10<br />
Vitamina B-12 (0,2 mg/ml) 1350 < 10 < 10 10<br />
BSA (1 mg/ml) 67.000 50K > 95 > 95 10 (SB), 5 (FA)<br />
Ovalbumina (1 mg/ml) 45.000 ~ 60 ~ 65 10 (SB), 5 (FA)<br />
Citocromo C (0,25 mg/ml) 12.400 < 10 < 10 10 (SB), 5 (FA)<br />
Tiroglobulina (0,5 mg/ml) 677.000 100K > 95 > 95 15<br />
IgG (1 mg/ml) 156.000 > 90 > 90 15<br />
Ovalbumina (1 mg/ml) 45.000 < 25 < 20 15<br />
Condições <strong>de</strong> centrifugação: rotor basculante (SB), 4000 × g ou rotor <strong>de</strong> ângulo fixo (FA) <strong>de</strong> 35°, 7500 × g para<br />
dispositivos 3K, 10K, 30K e 50K, 5000 x g para dispositivo 100K, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml, temperatura ambiente,<br />
n = 6 (valor médio <strong>de</strong> 3 lotes <strong>de</strong> membranas). Os volumes a sombreado foram retirados das tabelas 2 e 3.<br />
6 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4
Retenção <strong>de</strong> proteínas e recuperação do concentrado, continuação<br />
Os factores que <strong>de</strong>terminam a recuperação da amostra incluem a natureza do soluto proteico em relação<br />
ao NMWL do dispositivo escolhido, a concentração inicial e o factor <strong>de</strong> concentração. A tabela 5 mostra as<br />
recuperações típicas para os dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4.<br />
Tabela 5. Recuperação <strong>de</strong> concentrado típica<br />
Volume <strong>de</strong><br />
Marcador/<br />
Concentração<br />
Citocromo C<br />
(0,25 mg/ml)<br />
Citocromo C<br />
(0,25 mg/ml)<br />
NMWL<br />
Dispositivo<br />
Tempo <strong>de</strong><br />
centrifugação<br />
(min)<br />
concentrado (µl)<br />
Basculante Ângulo<br />
fixo<br />
Maximizar a recuperação da amostra<br />
Factor <strong>de</strong><br />
concentração (x)<br />
Basculante Ângulo<br />
fixo<br />
A baixa recuperação da amostra no concentrado po<strong>de</strong> <strong>de</strong>ver-se a perdas por adsorção, sobreconcentração<br />
ou passagem <strong>de</strong> amostra através da membrana.<br />
● As perdas por adsorção <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>m da concentração do soluto, da sua natureza hidrofóbica, da<br />
temperatura e do tempo <strong>de</strong> contacto com as superfícies do dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong>, da composição das<br />
amostras e do pH. Para minimizar as perdas, remova as amostras concentradas imediatamente após a<br />
centrifugação.<br />
● Se a concentração inicial da amostra for alta, monitorize o processo <strong>de</strong> centrifugação <strong>de</strong> modo a evitar<br />
a sobreconcentração da amostra. A sobreconcentração po<strong>de</strong> levar à precipitação e à potencial perda da<br />
amostra.<br />
● Se a amostra parecer estar a atravessar a membrana, escolha um dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 com<br />
NMWL mais baixo.<br />
<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />
Recuperação <strong>de</strong><br />
concentrado (%)<br />
Basculante Ângulo<br />
fixo<br />
3K 40 94 62 43,5 65,0 98,2 96,7<br />
10K 15 76 54 52,3 76,6 97,3 98,5<br />
BSA (1 mg/ml) 30K 10 73 42 56,1 98,6 95,8 95,0<br />
BSA (1 mg/ml) 50K 10 32 23 137,0 177,4 98,8 92,8<br />
IgG (1 mg/ml) 100K<br />
15 (SB),<br />
10 (FA)<br />
36 53 115,9 56,8 92,2 91,3<br />
Condições <strong>de</strong> centrifugação: rotor basculante (SB), 4000 × g ou rotor <strong>de</strong> ângulo fixo (FA) <strong>de</strong> 35°, 7500 × g para<br />
dispositivos 3K, 10K, 30K e 50K, 5000 x g para dispositivo 100K, volume inicial <strong>de</strong> 4 ml, temperatura ambiente,<br />
n = 6 (valor médio <strong>de</strong> 3 lotes <strong>de</strong> membranas). Os volumes a sombreado foram retirados das tabelas 2 e 3.<br />
7
Como quantificar recuperações<br />
Calcular a recuperação total, a percentagem <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> concentrado e a percentagem <strong>de</strong> recuperação<br />
<strong>de</strong> filtrado utilizando o método seguinte. O procedimento fornece um valor muito aproximado das<br />
recuperações para soluções que tenham concentrações <strong>de</strong> até, grosso modo, 20 mg/ml.<br />
NOTA: As técnicas <strong>de</strong> ensaio a<strong>de</strong>quadas incluem espectrofotometria <strong>de</strong> absorção, o radioimunoensaio, o<br />
índice refractário e a condutivida<strong>de</strong>.<br />
Procedimento <strong>de</strong> pesagem directa<br />
A <strong>de</strong>nsida<strong>de</strong> da maior parte das proteínas diluídas é quase igual à <strong>de</strong>nsida<strong>de</strong> da água (ou seja, 1 g/ml). Com<br />
esta proprieda<strong>de</strong>, os volumes <strong>de</strong> concentrado e filtrado po<strong>de</strong>m ser quantificados por pesagem e conversão<br />
das unida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> gramas para mililitros. Esta técnica é válida apenas para soluções com concentrações <strong>de</strong><br />
aproximadamente 20 mg/ml ou menos.<br />
1. Antes da utilização, pese em separado o dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> vazio, o tubo <strong>de</strong> centrifugação e um<br />
tubo vazio para recolha <strong>de</strong> concentrado.<br />
2. Encha o dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> com solução e volte a pesá-lo.<br />
3. Monte o dispositivo e centrifugue <strong>de</strong> acordo com as instruções.<br />
4. Recolha o concentrado com uma pipeta e distribua-o para o tubo <strong>de</strong> recolha <strong>de</strong> concentrado<br />
previamente pesado.<br />
5. Retire o dispositivo do tubo <strong>de</strong> centrifugação e pese o tubo <strong>de</strong> centrifugação e o tubo para recolha <strong>de</strong><br />
concentrado.<br />
6. Subtraia os pesos do dispositivo/tubos vazios para calcular os pesos do material inicial, do filtrado e do<br />
concentrado.<br />
7. Analise o material inicial, o filtrado e o concentrado para <strong>de</strong>terminar a concentração do soluto.<br />
8. Calcule as recuperações a partir dos dados do peso/volume e as concentrações medidas da seguinte<br />
forma:<br />
Wc × Cc % <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> concentrado = 100 ×<br />
Wo × Co Wf × Cf % <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> filtrado = 100 ×<br />
Wo × Co % <strong>de</strong> recuperação total = % <strong>de</strong> recuperação <strong>de</strong> concentrado + % recuperação <strong>de</strong> filtrado<br />
W c = peso total do concentrado antes do ensaio<br />
W o = peso do material inicial original<br />
W f = peso do filtrado<br />
C c = concentração do concentrado<br />
C o = concentração do material inicial original<br />
C f = concentração do filtrado<br />
8 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4
Especificações<br />
Volume inicial máximo <strong>de</strong> amostra<br />
Rotores <strong>de</strong> centrifugadora <strong>de</strong> ângulo fixo com<br />
rotores basculantes (45° e 35°)<br />
4,0 ml<br />
Rotor <strong>de</strong> ângulo fixo (23°) 3,5 ml<br />
Volume típico final <strong>de</strong> concentrado 50-100 μl<br />
Força <strong>centrífuga</strong> relativa máxima<br />
Rotor basculante 4000 × g<br />
Rotor <strong>de</strong> ângulo fixo 7500 × g para dispositivos 3K, 10K, 30K<br />
e 50K NMWL<br />
Área <strong>de</strong> membrana activa 3 cm 2<br />
Dimensões<br />
Dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> no tubo (tapado)<br />
Comprimento: 124 mm Diâmetro: 17,3 mm<br />
Dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong><br />
Materiais <strong>de</strong> construção<br />
Comprimento: 73,4 mm Diâmetro: 17,2 mm<br />
Dispositivo <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> Copolímero <strong>de</strong> estireno/butadieno<br />
5000 x g para dispositivo 100K NMWL<br />
Membrana Celulose regenerada <strong>de</strong> baixo nível <strong>de</strong> ligação <strong>Ultra</strong>cel®<br />
Tubo <strong>de</strong> filtrado Polipropileno<br />
Tampa e revestimento do<br />
filtrado<br />
Polietileno<br />
<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />
9
Compatibilida<strong>de</strong> química<br />
Os dispositivos <strong>de</strong> centrifugação <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong> <strong>de</strong>stinam-se a ser utilizados com fluidos biológicos e<br />
soluções aquosas. Antes <strong>de</strong> utilizar, verifique a compatibilida<strong>de</strong> química entre a amostra e o dispositivo.<br />
Tabela 6. Compatibilida<strong>de</strong> química dos dispositivos <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong><br />
Ácidos Concentração Concentração<br />
Ácido acético ≤ 50%* Ácido nítrico ≤ 10%<br />
Ácido clorídrico ≤ 1,0 M Ácido sulfâmico ≤ 3%<br />
Ácido fórmico ≤ 5%* Ácido sulfúrico ≤ 3%<br />
Ácido fosfórico ≤ 30% Ácido tricloroacético (TCA) ≤ 10%*<br />
Ácido láctico ≤ 50% Ácido trifluoroacético (TFA) ≤ 30%*<br />
Bases<br />
Hidróxido <strong>de</strong> amónio ≤ 10% Hidróxido <strong>de</strong> sódio ≤ 0,5 M<br />
Álcoois<br />
Etanol ≤ 70% Metanol ≤ 60%<br />
Isopropanol ≤ 70% n-butanol ≤ 70%<br />
Detergentes<br />
Desoxicolato <strong>de</strong> sódio ≤ 5% Detergente Tergazyme® ≤ 1%<br />
Do<strong>de</strong>cilssulfato <strong>de</strong> sódio (SDS) ≤ 0,1% Surfactante Noni<strong>de</strong>t P-40 ≤ 2%<br />
Detergente Alconox® ≤ 1,0% Surfactante Triton® X-100 ≤ 0,1%<br />
Detergente CHAPS ≤ 0,1% Surfactante Tween® 20 ≤ 0,1%<br />
Detergente Lubrol® PX ≤ 0,1%<br />
Solventes orgânicos<br />
Acetato <strong>de</strong> etilo não recomendado Formal<strong>de</strong>ído ≤ 5%<br />
Acetona não recomendado Piridina não recomendado<br />
Acetonitrilo ≤ 20% Tetracloreto <strong>de</strong> carbono não recomendado<br />
Benzeno não recomendado Tetraidrofurano não recomendado<br />
Clorofórmio não recomendado Tolueno não recomendado<br />
Dimetilssulfóxido (DMSO) ≤ 5%*<br />
Diversos<br />
Carbonato <strong>de</strong> sódio ≤ 20% Mercaptoetanol ≤ 0,1 M<br />
Cloridrato <strong>de</strong> guanidina ≤ 6 M Polietilenoglicol ≤ 10%<br />
Dietilpirocarbonato ≤ 0,2% Sulfato <strong>de</strong> amónio Saturado<br />
Ditiotreitol (DTT) ≤ 0,1 M Tampão fosfato (pH 8,2) ≤ 1 M<br />
Fenol ≤ 1% Tampão Tris (pH 8,2) ≤ 1 M<br />
Glicerina ≤ 70% Ureia ≤ 8 M<br />
Imidazol ≤ 100 mM<br />
* O contacto com este composto químico po<strong>de</strong> provocar a passagem <strong>de</strong> materiais para fora das peças<br />
componentes. Recomenda-se o uso <strong>de</strong> brancos <strong>de</strong> solvente para <strong>de</strong>terminar se os materiais lixiviáveis<br />
apresentam a possibilida<strong>de</strong> <strong>de</strong> interferir com o ensaio.<br />
10 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4
Rotulagem <strong>de</strong> produto para diagnóstico in vitro<br />
A tabela seguinte <strong>de</strong>fine os símbolos que se encontram nos rótulos do dispositivo <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 10K.<br />
Símbolo Definição Símbolo Definição<br />
V<br />
Informações para encomenda do produto<br />
Esta secção contém uma lista dos números <strong>de</strong> referência dos dispositivos <strong>de</strong> ultra<strong>filtração</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>.<br />
Consulte a secção Assistência Técnica para obter informações dos contactos. Po<strong>de</strong>rá adquirir estes<br />
produtos on-line em www.millipore.com/products.<br />
Volume<br />
inicial<br />
(ml)<br />
Dispositivo médico para diagnóstico<br />
in vitro N<br />
Volume <strong>de</strong><br />
concentrado<br />
final (μl) Produto<br />
0,5 15–20 Dispositivo<br />
<strong>Amicon®</strong><br />
<strong>Ultra</strong>-0,5<br />
Tubos <strong>de</strong> colheita<br />
<strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-0,5<br />
2 15–70 Dispositivoprélançamento<br />
<strong>Amicon®</strong><br />
<strong>Ultra</strong>-2<br />
4 50–100 Dispositivo<br />
<strong>Amicon®</strong><br />
<strong>Ultra</strong>-4<br />
15 150–300 Dispositivo<br />
<strong>Amicon®</strong><br />
<strong>Ultra</strong>-15<br />
Qtd./<br />
emb. 3K 10K 30K 50K 100K<br />
8<br />
24<br />
96<br />
500<br />
UFC500308<br />
UFC500324<br />
UFC500396<br />
UFC5003BK<br />
96 UFC50VL96<br />
UFC501008<br />
UFC501024<br />
UFC501096<br />
UFC5010BK<br />
UFC503008<br />
UFC503024<br />
UFC503096<br />
UFC5030BK<br />
<strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4<br />
UFC505008<br />
UFC505024<br />
UFC505096<br />
UFC5050BK<br />
UFC510008<br />
UFC510024<br />
UFC510096<br />
UFC5100BK<br />
24 UFC200324PL UFC201024PL UFC203024PL UFC205024PL UFC210024PL<br />
8<br />
24<br />
96<br />
8<br />
24<br />
96<br />
UFC800308<br />
UFC800324<br />
UFC800396<br />
UFC900308<br />
UFC900324<br />
UFC900396<br />
UFC801008*<br />
UFC801024*<br />
UFC801096*<br />
UFC901008*<br />
UFC901024*<br />
UFC901096*<br />
Data <strong>de</strong> fabrico<br />
h Número <strong>de</strong> referência M Fabricante<br />
D Não reutilizar l Limites <strong>de</strong> temperatura<br />
H Prazo <strong>de</strong> valida<strong>de</strong> d Produto não estéril<br />
g Código <strong>de</strong> lote C<br />
Marcação <strong>de</strong> conformida<strong>de</strong> CE<br />
UFC803008<br />
UFC803024<br />
UFC803096<br />
UFC903008<br />
UFC903024<br />
UFC903096<br />
UFC805008<br />
UFC805024<br />
UFC805096<br />
UFC905008<br />
UFC905024<br />
UFC905096<br />
UFC810008<br />
UFC810024<br />
UFC810096<br />
UFC910008<br />
UFC910024<br />
UFC910096<br />
* Os dispositivos <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4 e -15 10K <strong>de</strong>stinam-se<br />
ao diagnóstico in vitro. Todos os outros dispositivos estão<br />
indicados apenas para utilização em investigação.<br />
11
Aviso<br />
A informação contida neste documento está sujeita a alteração sem aviso prévio e não <strong>de</strong>ve ser interpretada<br />
como um compromisso por parte da Merck <strong>Millipore</strong> Ltd. (“<strong>Millipore</strong>”) ou <strong>de</strong> uma empresa filial. Nem<br />
a Merck <strong>Millipore</strong> Ltd. nem nenhuma das suas filiais assume a responsabilida<strong>de</strong> por quaisquer erros que<br />
possam aparecer neste documento.<br />
Assistência técnica<br />
Para mais informações, contacte os escritórios mais próximos. As informações <strong>de</strong> contacto a nível mundial<br />
actualizadas estão disponíveis no site da Internet, www.millipore.com/offices. Po<strong>de</strong>rá ainda ace<strong>de</strong>r à<br />
página <strong>de</strong> assistência técnica em www.millipore.com/techservice.<br />
Garantia normal<br />
A garantia aplicável aos produtos listados nesta publicação po<strong>de</strong> ser encontrada em<br />
www.millipore.com/terms (nos “Termos e condições <strong>de</strong> venda” aplicáveis à sua transacção comercial).<br />
Fabricado na Irlanda<br />
Merck <strong>Millipore</strong> Ltd.<br />
Tullagreen,<br />
Carrigtwohill,<br />
Co. Cork, IRL<br />
O logótipo M é uma marca comercial da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha.<br />
<strong>Millipore</strong>, Amicon, Milli-Q e <strong>Ultra</strong>cel são marcas registadas da Merck KGaA.<br />
Alconox e Tergazyme são marcas registadas da Alconox, Inc.<br />
Lubrol é uma marca registada <strong>de</strong> Imperial Chemical Industries PLC.<br />
Noni<strong>de</strong>t é uma marca registada da Royal Dutch/Shell Group.<br />
Triton é uma marca registada da Union Carbi<strong>de</strong> Corp.<br />
Tween é uma marca registada da ICI Americas Inc.<br />
© 2012 EMD <strong>Millipore</strong> Corporation. Todos os direitos reservados.<br />
PR03521TR, Rev. A, Português, 03/12<br />
12 <strong>Dispositivos</strong> <strong>de</strong> <strong>filtração</strong> <strong>centrífuga</strong> <strong>Amicon®</strong> <strong>Ultra</strong>-4