Tehnici utilizate in imunologie - PIM Copy

PETRU CIANGA
TEHNICI UTILIZATE IN IMUNOLOGIE
NOTIUNI INTRODUCTIVE

PETRU CIANGA
TEHNICI UTILIZATE IN IMUNOLOGIE
NOTIUNI INTRODUCTIVE
Editura Pim
2008

EDITURA PIM
Soseaua Stefan cel Mare nr. 11 Iasi -700498
Tel. / fax: 0232-212740
e-mail:editurapim@pimcopy.ro
www.pimcopy.ro
EDITURĂ ACREDITATĂ CNCSIS BUCUREŞTI
66/01.05.2006
Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României
CIANGA, PETRU
Tehnici utilizate în imunologie : noţiuni introductive /
Petru Cianga. - Iaşi : PIM, 2008
Bibliogr.
ISBN 978-606-520-214-6
612.017

Cuprins
Reacţia Antigen-Anticorp................................................................1
1. Legături implicate în formarea complexului antigen-anticorp.......2
2. Factori care influenţează interacţiunea dintre antigen şi anticorp..8
2.1 Caracteristici structurale...............................................................9
2.1.1 Specificitatea situsurilor de legare a antigenului.......................9
2.1.2 Reactivitatea încrucişată............................................................9
2.1.3 Accesibilitatea antigenică........................................................10
2.1.4 Structura imunoglobulinelor....................................................10
2.1.5 Valenţa antigenelor..................................................................10
2.1.6 Concentraţia de antigene şi anticorpi.......................................11
2.2 Factori fizico-chimici care afectează legarea dintre antigen şi
anticorp..............................................................................................12
2.2.1 Factori de mediu.......................................................................12
2.2.2 Concentraţia în săruri (forţa ionică).........................................12
2.2.3 Potenţialul zeta.........................................................................13
Anticorpi monoclonali....................................................................14
Reacţia de precipitare.....................................................................24
1. Precipitarea în soluţie....................................................................24
2. Precipitarea în gel..........................................................................27
2.1 Dubla imunodifuzie (Oucthterlony)............................................27
2.2 Imunodifuzia radială simplă (Mancini).......................................30
3. Imunelectroforeza.........................................................................32
3.1 Imunelectroforeza.......................................................................35
3.2 Electroforeza de imunofixare (immunofixation electrophoresis -
IFE)...................................................................................................36
3.3 Electroforeza contracurent (countercurrent electrophoresis)......37
3.4 Electroforeza în rachetă (rocket electrophoresis)........................37
3.5 Focusarea isoelectrică (isolectric focusing)................................38
Reacţia de aglutinare......................................................................40
1. Aglutinarea directă........................................................................44
2. Aglutinarea indirectă.....................................................................46
3. Aglutinarea pasivă.........................................................................47
4. Testele de inhibiţie a aglutinării....................................................48

5. Testul anti-imunoglobulinic (testul Coombs)...............................50
Teste de fază solidă - Solid phase assay.........................................52
1. RIA - Radio Immuno Assay..........................................................52
2. RIST – Radioimmunosorbent test.................................................53
3. RAST – Radioallergosorbent test.................................................54
4. ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay.........................56
4.1 ELISA indirectă..........................................................................57
4.2 ELISA sandwich.........................................................................59
4.3 ELISA competitivă.....................................................................60
4.4 ELISPOT.....................................................................................61
5. Chemiluminiscenţa........................................................................62
Imunohistochimia (Corina Cianga, Petru Cianga)..........................65
1. Noţiuni de enzimologie.................................................................67
2. Metode de colorare........................................................................70
2.1 Metoda directă.............................................................................70
2.2 Metoda indirectă în doi paşi........................................................71
2.3 Metoda indirectă în trei paşi........................................................72
3. Controale.......................................................................................73
4. Colorarea de fond (nespecifică sau background)..........................74
5. Contracolorarea.............................................................................77
6. Imunocitochimia...........................................................................77
7. Dubla/tripla coloraţie....................................................................78
Imunofluorescenţa..........................................................................80
1. Imunofluorescenţa directă............................................................82
2. Imunofluorescenţa indirectă.........................................................84
Microscopia confocală....................................................................85
Tissue FAXS....................................................................................86
Citometrie în flux (Flow cytometry)..............................................87
1. Principiu........................................................................................87
2. Sortarea particulelor......................................................................94
Aplicaţii ale citometriei în flux......................................................95
1. Imunofenotiparea.........................................................................95
2. Analiza conţinutului ADN (Ploidia ADN)...................................97

3. Investigarea unor molecule solubile............................................99
4. Medicina reproducerii.................................................................100
5. Cross-match................................................................................100
6. Biologia celulară.........................................................................101
7. Analiza proliferării celulare........................................................101
8. Analiza morţii celulare prin apoptoză.........................................104
9. Analiza citotoxicităţii celulare....................................................104
10. Microbiologie............................................................................105
11. Botanică....................................................................................106
12. Farmacologie.............................................................................106
Histocompatibilitatea în transplant............................................107
Tiparea tisulară (tiparea HLA I şi II)........................................110
1. Citometria în flux.......................................................................110
2. Microlimfocitotoxicitatea sau citotoxicitatea
dependentă de complement (CDC).................................................110
3. Metode de biologie moleculară...................................................112
3.1 Metoda SSP - sequence-specific priming.................................113
3.2 Metoda SSOP - sequence-specific oligonucleotide probing.....114
3.3 SBT – sequence-based typing...................................................116
4. Cultura limfocitară mixtă............................................................116
Cross-match (X-match)................................................................117
Evaluarea funcţionalităţii componentelor sistemului imun......120
1. Limfocitele B..............................................................................120
1.1 Teste in vivo..............................................................................120
1.2 Teste in vitro.............................................................................122
2. Limfocitele T..............................................................................122
2.1 Teste in vivo..............................................................................122
2.2 Teste in vitro.............................................................................124
3. Celulele NK (natural killer)........................................................126
4. Fagocite.......................................................................................127
5. Bazofile.......................................................................................130
6. Sistemul complement (SC).........................................................131
Modele experimentale animale....................................................134
1. Animale inbred (singenice).........................................................135
2. Animale congenice......................................................................136
3. Animale chimerice (chimeras)....................................................138

4. Şoareci SCID (severe combined immunodeficiency–
imunodeficienţa severă combinată)...............................................140
5. Şoareci nuzi.................................................................................141
6. Şoareci transgenici......................................................................143
7. Şoareci knock out (KO)..............................................................145
8. Şoareci knock-in.........................................................................146
Tehnici de biologie moleculară (manipulare a acizilor nucleici şi
producţie de proteine)
Metode de manipulare a genelor.................................................149
1. Extragerea ADN din ţesuturi şi culturi de celule........................149
2. Extragerea ARN-ului din ţesuturi sau culturi de celule..............151
3. Electroforeza ADN în gel...........................................................152
3.1 Electroforeza în gel de agaroză.................................................153
3.2 Electroforeza în gel de poliacrilamidă......................................156
3.3 Electroforeza în câmp electric pulsatil .....................................157
4. Southern blot...............................................................................157
5. Northern blot...............................................................................161
Metode de evidenţiere a secvenţelor nucleotidice în celule şi
ţesuturi...........................................................................................161
1. Hibridizarea in situ......................................................................161
2. FISH – Fluorescence in situ hybridization..................................168
3. CISH – Chromogenic in situ hybridization.................................169
Manipularea enzimatică a ADN-ului..........................................170
1. Digestia cu enzime de restricţie..................................................170
2. Utilizarea ligazelor în ingineria genetică....................................171
3. Amplificarea prin PCR................................................................172
4. RT-PCR (reverse transcription-PCR).........................................177
5. Real time PCR – PCR în timp real..............................................178
6. Secvenţierea ADN.......................................................................179
Metode de introducere a ADN-ului recombinant în bacterii şi
celule eucariote
1. Vectori.........................................................................................182
1.1 Plasmide....................................................................................182
1.2 Virusuri.....................................................................................186

1.3 Bacteriofagi...............................................................................187
1.4 Cosmide....................................................................................188
1.5 Cromosomi bacterieni artificiali...............................................188
1.6 Cromosomii artificiali din drojdii (YACs)................................188
2. Transformarea bacteriană şi purificarea ADN-ului
din plasmide....................................................................................189
Producerea proteinelor în gazde bacteriene
1. Inducerea sintezei proteice în gazde bacteriene..........................192
2. Purificarea proteinelor.................................................................193
2.1 Filtrarea în gel (cromatografie de excludere)............................194
2.2 Purificarea proteinelor cu ajutorul răşinilor
schimbătoare de ioni.......................................................................195
2.3 Tehnologia Ni-NTA (nichel-acid nitriloacetic)........................195
3. Inhibitori de proteaze..................................................................199
4. Metode de caracterizare a produsului genelor manipulate..........201
4.1 Electroforeza proteinelor...........................................................206
4.2 Western blot..............................................................................203
4.3 Caracterizarea funcţională prin analiza asocierii cu
alte proteine.....................................................................................205
4.4 Alte metode de analiză funcţională...........................................206
4.4.1 Analiza Farwestern................................................................206
4.4.2 Imunoprecipitarea..................................................................206
4.5 Surface plasmon resonance (SPR)............................................208
Bibliografie....................................................................................213