Genetisk forskning – nyckeln till framtidens behandlingar

Genetisk forskning –
nyckeln till framtidens
behandlingar
Irina Golovleva
Sjukhusgenetiker
Inst. för medicinsk biovetenskap, klinisk genetik
Många gener är involverade i ögonsjukdomar, men med tanke på hur stor
hela arvsmassan är talar vi ändå om en mycket liten del. Arvsmassan hos människan
finns i form av DNA som innehåller all genetisk information. DNA
är inpackat i kromosomer (figur 1) och det finns exakt 23 par kromosomer:
22 par s.k. autosomala kromosomer och ett par könskromosomer som skiljer
män från kvinnor, XX hos kvinna och XY hos man. Kromosomerna ligger i
cellkärnan i kroppens celler, se figur 1.
Figur 1. Arvsmassans packning och plats i människokroppen.
27

DNA består av fyra byggstenar, nukleotider: adenin, tymin, cytosin och guanin.
Förr uppskattade man att det finns mellan 50 000 och 100 000 gener
men numera, när nästan hela människans genom är känt, vet man att det
korrekta antalet ligger mellan 20 000 och 30 000 gener. Av detta är inte de
120 eller 200 gener som är inblandade i ögonsjukdomar en särskilt stor andel.
Dessutom är bara 30 procent av innehållet i hela genomet gener, medan
70 procent är det man förr kallade ”junk-DNA” (”sop-DNA”). Men det
är inte riktigt sant, för där finns viktiga DNA-delar som reglerar olika proteiners
funktion. Dessutom finns åtskilliga sekvenser som man ännu inte vet
funktionen för.
Om man tittar på genernas struktur är exoner (delar av gener) viktiga för att
senare bygga upp protein. Regleringssekvenser ligger framför genen medan
intronsekvenser är DNA mellan olika exoner, se figur 2. Genom en process
som heter klyvning, splicing på engelska, tas intronerna bort. Därefter byggs
”budbärar-RNA”, mRNA, som översätts till proteiner.
Figur 2. Genstruktur i arvsmassan. Mellan ”start” och ”stop” i figuren ligger en
gen som efter klyvning kan koda för ett bestämt protein.
DNA är alltså uppbyggt av fyra nukleotider. Tre nukleotider på rad (en triplett)
bygger upp en kod, en ”bokstav”. Varje triplett översätts till en aminosyra.
Det finns därmed ganska många DNA-variationer, och det skulle vara
konstigt om det inte vore så eftersom människor är olika pga. variationer i
DNA. Det finns olika typer av variationer, både ”bra” variationer och ”dåli-
28

ga” variationer. Med ”bra” i det faller menas att när en nukleotid byts ut mot
en annan blir i slutänden båda proteinerna fungerande. Utbytet påverkar inte
funktionen och det är ingen fara för människan. ”Dåliga” utbyten däremot
resulterar i ett icke-fungerande protein. Det kallas mutationer och associeras
framför allt med olika sjukdomar.
Som ett enkelt exempel kan vi som i figur 3 tänka oss att varje ord är en
aminosyra som alltså består av tre nukleotider. I normalfallet ska DNA-koden
översättas till proteinet ”grå mus ser oss med ett öga”. Vid en mutation av typen
punktmutation, där en nukleotid byts mot en annan, t.ex. om s i ordet
oss byts mot t, innebär missens att man får proteinet ”grå mus ser ost med ett
öga”. En annan mutationstyp kallas nonsens och betyder att hela proteinet
blir kortare och inte fungerar som det ska, t.ex. ”grå mus ser”. En typ som
kallas deletion innebär att några nukleotider (bokstäver) kan vara borta, t.ex.
”grå mus med ett öga”. Slutligen finns mutationstypen insertion, som innebär
att ytterligare en nukleotid kommer in i DNA-sekvensen och då tappar
meningen/proteinet sin betydelse.
Figur 3. Förändringar i arvsmassan som ger icke-fungerande protein kallas mutationer.
Här åskådliggörs de mutationstyper som man känner till.
Dessa typer av mutationer förekommer vid olika sjukdomar. Jag tänkte ge
exempel på två som orsakas av punktmutationer. Det är viktigt att veta hur
mutationerna vid olika sjukdomar ärvs. Här koncentrerar vi oss på de två typer
som kallas autosomalt dominant och autosomalt recessiv nedärvning. Or-
29

det ”autosomal” betyder att sjukdomsgenen ligger på en av de 22 autosomala
kromosomerna och inte på en könskromosom. Om vi börjar med autosomalt
recessiv nedärvning, visar figur 4. det som kallas släkttavla för de tidigare generationer
som man har information om. Fyrkanterna står för män och ellipserna
för kvinnor; de mörkare är friska individer och de ljusare är sjuka. I
figuren är fyra generationer helt friska och i femte generationen kommer två
sjuka. Man kan också se att de sjukas föräldrar är kusiner, vilket ökar risken
att få sjukdomen. Vid recessiv nedärvning är föräldrarna alltid friska men bärare
av mutationen. Deras risk för att få ett sjukt barn är 25 procent.
Figur 4. Släkttavla med autosomalt recessiv nedärvning. Fyrkant = man, ellips =
kvinna, mörk = frisk, ljus = sjuk.
Nedärvningen av botniadystrofi
Ögonsjukdomen Botniadystrofi är en typiskt autosomalt recessiv sjukdom.
På släktkartan i figur 5 finns friska föräldrar med sjuka barn, som i Figur 4.
Genen för botniadystrofi finns på kromosom 15 och översätts till proteinet
CRALBP. Den punktmutation som ändrade DNA-koden gav som resultat
ett utbyte av aminosyran i position 233. Redan innan man visste att det proteinet
är associerat till ögonsjukdomar visste man dess funktion: CRALBP
är ett viktigt protein i rodopsinomsättningen (syncykeln) och fungerar som
bärare av vitamin A.
30

Figur 5. Nedärvningskarta över ögonsjukdomen botniadystrofi, en autosomalt
recessivt nedärvd sjukdom. Även här får friska föräldrar sjuka barn (mörka markeringar),
jfr Figur 4.
Figur 6 visar RLBP1-genen, som orsakar botniadystrofi. Den består av åtta
exoner och man har hittat totalt nio mutationer. Andra forskargrupper hittade
enstaka, maximalt fem, sjuka individer, men vi hittade ca 75 patienter
med just den mutation vi studerar. Vi lyckades också utveckla en ganska enkel
metod för genetisk testning, där man från blodprov kan se om en person
bär på anlaget. Vid recessivt ärvd sjukdom måste patienten bära på dubbla
anlag för att sjukdom ska uppstå. Vi kan nu erbjuda genetisk testning och
vägledning där vi bedömer risken för att familjen får barn med samma sjukdom.
Däremot kan vi inte göra någonting åt sjukdomen som sådan eftersom
det inte finns något botemedel.
Vi studerade också hur mutationen påverkar proteinet och kunde påvisa
att protein som bär på mutationen R233W binder till vitamin A betydligt
starkare än normalt protein. Det kan vara denna mekanism som orsakar botniadystrofi.
Vi har också studerat alla patienter från norra Sverige med retinitis pigmentosa.
Bland dem fann vi 65 med dubbel uppsättning av R233-mutationen
och 10 med bara enkel uppsättning av mutationen, se figur 6. Därför letade
vi efter ytterligare en mutation och lyckades identifiera den förra året. Den
ligger inte långt borta från den första, närmare bestämt i position 225. I de
familjerna kan man se ett typiskt autosomalt recessivt mönster. Föräldrarna
är friska och anlagsbärare, men bär på olika mutationer i samma gen. Deras
farfar och mormor bär också på de olika mutationerna. Om farmor och morfar
skulle ha gift sig finns risken att de skulle har fått barn med sjukdomen,
31

men det blev inte så utan deras barn fick bara anlaget. Sedan träffades barnen
och deras pojke fick båda mutationerna, så den genen ger som resultat
ett icke fungerande protein.
Figur 6. Genen RLBP1, som orsakar ögonsjukdomen botniadystrofi, består av
åtta exoner och man har hittat totalt nio mutationer i denna gen. Umeåforskarna
har intresserat sig för mutationen vid nr 7 i figuren och utvecklat en testmetod
för den. Den nedre bilden återger testresultat från blodprov: Anlagsbärare visar
tre band, en frisk människa har två band och en sjuk bara ett band.
Man kan förstås fråga sig varför det finns så många fall av botniadystrofi i vår
region. Det finns en individ i Japan, en familj i Kina, men här har vi 75 personer.
Det finns i princip ingen slump bakom detta utan det beror på geografi,
kultur och sociala aspekter. En viktig faktor är den s.k. founder-effekten,
se figur 7, som kan förklara en stor del av de genetiska sjukdomarna i
norra Sverige.
32

Figur 7. Den s.k. founder-effekten är en viktig del av förklaringen till att ärftliga
sjukdomar koncentreras till vissa, glest befolkade områden. En människa som
bär på anlaget kommer in i en befolkning och lever där. Vid isolering av området,
t.ex. krig eller folkomflyttning, minskar befolkningen medan frekvensen av
anlagsbärare ökar. När befolkningen sedan växer på nytt ökar risken för att mutationen
sprids och andelen anlagsbärare ökar.
Genterapi en spännande möjlighet
När man har en så stor grupp av patienter som vi undrar man desto mera
kring möjligheterna att bota sjukdomen. Genterapi är förstås ett jättespännande
alternativ – att ersätta en icke-normal, muterad gen med en normal ickemuterad
är då målet. Men innan man kommer fram till att kunna testa något
sådant måste man noga studera vilken gen som orsakar sjukdomen, vilka
mutationer som finns i genen, vilken roll varje mutation spelar för proteinets
funktion och vilka celltyper som påverkas av ett icke-fungerande protein.
De som ska genomgå genterapi måste tänka på vilka fördelar man kan nå
men också vilka risker man måste ta. Den genterapi som levereras genom virus
kanske inte fungerar helt rätt. Kanske kan immunsystemet inte ta emot
genterapi. Vem är vinnare, vem kan bli förlorare och vad betyder det för patienten,
hans eller hennes familj och samhället
Man fortsätter testa genterapi på framför allt möss, men det är långt kvar
till motsvarande framsteg på människa. 2001 publicerades en artikel i Nature
Genetics om genterapi på stora hundar. Man kände till en sjukdom, Lebers
congenital amaurosis, som innebär att hundar föds blinda. Man analyserade
genomet och identifierade en recessiv mutation i genen RPE65 som faktiskt
interagerar med CRALBP. Därför behandlades hundarna med genterapi, genom
virus som bär på en normal kopia av RPE65-genen, och blinda hundar
fick faktiskt tillbaka synen. Men man gjorde ett schema, se figur 8, över den
långa vägen från forskning till behandling. I USA är kliniska prövningar på
människa med Leber congenital amaurosis fortfarande inte igång (2007).
33

Figur 8. Den långa vägen från forskning till fungerande, säker och godkänd behandling.
Ett annat sätt på vilket mutationer går i arv är autosomalt dominant nedärvning.
Här är en av den sjukes föräldrar alltid bärare av mutationen och här
finns en risk på ca 50 procent för att få ett sjukt barn. Den här typen av dominant
nedärvning har ögonsjukdomen tappdystrofi, där tapparna är påverkade.
Vi samlade DNA från två stora familjer där denna sjukdom förekom.
Det finns individer med sjukdomen i varje generation, vilket visar att tappdystrofi
har autosomal dominant nedärvning.
Med s.k. mappningsanalys och statistisk metod lyckades vi ringa in genen
PITPNM3, en ganska stor gen med 20 exoner. Man har förut visat att en liknande
gen som finns hos bananflugan, Drosophila, och i muterad form kan
orsaka fotoreceptordöd hos flugan. Med sekvensanalys, som visar nukleotidernas
ordningsföljd, kunde vi påvisa ett nukleotidutbyte och som resultat också
ett aminosyrautbyte i proteinet. Vi visade att 322 friska individer i materialet
inte hade den mutationen och var då ganska säkra på att vi funnit den mutation
som ger sjukdom hos patienterna. Den fanns hos alla sjuka i släkten.
Därmed kunde vi göra ytterligare en genetisk testning på alla patienter i den
släkten och gå vidare med att undersöka andra med liknande sjukdom.
När vi vet vilken mutation som orsakar sjukdomen vill vi naturligtvist studera
proteinet, som kan hittas i hjärna, mjälte och äggstockar. Det påverkar
tapparnas funktion. Hos fiskar finns proteinet mest i tapparna och tapparna
är också mest påverkade hos tappdystrofipatienter. I vår fortsatta forskning
34

vill vi studera hur det muterade proteinet fungerar och vilka mekanismer
som står bakom sjukdomen. Vi vill också göra en modell av sjukdomen på
bananfluga, fisk eller mus.
Arbetet har gjorts av många studenter som genom åren har passerat klinisk
genetik. Det är gjort i samarbete mellan oftalmiatrik och medicinsk/klinisk
genetik. Marie Burstedt skrev avhandling om en botniadystrofi, Ola Sandgren
kläcker idéer, träffar patienter och samlar blodprover, gästforskaren Konstantin
Kadzhaev jobbade också med botniadystrofi medan Linda Köhn identifierade
sjukdomsgenen hos patienter med tappdystrofi.
Sverker Olofsson: Vi har haft tio Forskningens dag och väldigt ofta kommer
man in på det här med gener och då dyker ordet genterapi upp. Det betyder
alltså att byta ut en dålig gen mot en bättre
Irina Golovleva: Ja, det är tanken. Men det finns fler möjligheter, t.ex. kan
man hämma eller sätta något på den felaktiga genen för att den inte ska fungera
längre utan bara den normala som stoppas in.
Sverker Olofsson: Det är ju lätt när man följer de här resonemangen att
undra var genen egentligen sitter. Var plockar man ut den och sätter in den
nya Hur går det till att byta ut den där skadade genen
Irina Golovleva: En normal gen måste produceras på laboratoriet. Det kan
göras från vilken frisk människa som helst som inte bär på en mutation. Sedan
måste man också ”leverera” en normal gen på rätt sätt. Om man tar in en gen
som endast finns i näthinneepitelet och stoppar in den i någon annan vävnad
fungerar det inte alls. Det är jätteviktigt att leverera till rätt celler.
Sverker Olofsson: Men hur får man generna, är det med dropp Sprutar
man in dem eller opererar man Hur fixar man det
Irina Golovleva: Man kan spruta in dem, men då måste man veta att de
hamnar rätt. Ett alternativ är att ta bort celler från kroppen, injicera friska gener
i dem och sedan stoppa tillbaka dem. Det finns också andra möjligheter,
men för det mesta använder man spruta i form av någon lösning.
Sverker Olofsson: Du som håller på med det här, ser du en framtid där
rätt mycket av hälsovården kommer att handla om att fixa och trixa med generna
35

Irina Golovleva: Jag vill inte vara skeptisk, men det är i så fall ett jättelångt
perspektiv. Alla sjukdomar kan inte botas med genterapi på grund av
att vi ändå vet så lite. De bästa kandidaterna är de sjukdomar som orsakas
av en enda gen.
Sverker Olofsson: Men man kan säga att de här hundarna som blev seende
kan alltså vara människor om ett visst antal år
Irina Golovleva: Ja, så kan det bli för i USA är det redan igång. Prekliniska
studier är utförda och man förbereder sig för kliniska prövningar.
Sverker Olofsson: Fem år, tio år
Irina Golovleva: Jag vill vara optimist och säger fem år, åtminstone för fas
ett och två, men sista stadiet med kliniska prövningar ska göras på 3 000 människor.
Det blir jättesvårt att hitta en så stor grupp med en ögonsjukdom.
36