Önizleme - Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

Lise Öğretmenleri
Fizik, Kimya, Biyoloji, Matematik
Proje Danışmanlığı Eğitimi Çalıştayı LİSE-2 (Çalıştay 2012)
GENOTOKSİK MADDELERİN
BİTKİLER ÜZERİNE ETKİLERİ
Doç. Dr. Cüneyt AKI
ÇOMÜ FEN EDEBİYAT FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ
MOLEKÜLER BİYOLOJİ ANA BİLİM DALI
cuneytaki@comu.edu.tr

• 1. Giriş
İÇERİK
• 2. Genotoksik Maddeler ve Genotoksisite
• 3. Bitkisel Organizmalarda Genotoksisiteyi
Belirlemede Kullanılan Bazı Testler
• 3.1. Kök ucu hücreleri testi
• 3.1.1. Mitotik Analiz
• 3.1.2. Mitotik Aktivitenin Hesaplanması
• 3.2. Mikronükleus oluşumu ve analizi
• 3.3. Stamen tüyü analizi
• 4. Sonuçlar
• 5. Kaynaklar

1. GİRİŞ
• Yeryüzünde yaşayan bütün canlılar, yaşamsal
ihtiyaçlarının karşılandığı ‘çevre’ ile sürekli etkileşim
halindedir.
• Bunun bir gereği olarak da, canlılar ile çevre arasında
ekolojik bir dengenin olması kaçınılmazdır.
• Yeryüzünde bulunan tüm canlıların hayatta
kalabilmesi; temel ihtiyaçlarının karşılanabilmesi için
yaşadığı çevre ile uyum halinde olması gerekir.

• İnsan da dahil olmak üzere birçok canlı türüne ev
sahipliği yapan çevrede, canlılığı etkileyen olumlu
faktörlerin yanı sıra pek çok olumsuz faktörün de
varlığından söz etmek mümkündür.
• Çağımızın en önemli sorunlarından biri hiç kuşkusuz,
tüm canlıları, özellikle de insanı olumsuz yönde
etkileyen çevresel tehlikelerin her geçen gün
artmasıdır.

• Günümüzde artan insan nüfusu ile birlikte
sanayileşme,
endüstriyel faaliyetler,
tarımsal faaliyetlerde kullanılan kimyasallar, yakıt ve
benzeri amaçlarla kullanılan zehirli gazlar,
gıda ürünlerinde kullanılan her türlü katkı maddeleri
ve
doğaya bırakılan atık maddelerinin gittikçe artması,
başta insan sağlığı olmak üzere her türlü
organizmanın doğal dengesinin bozulmasına
neden olmaktadır.
• İnsan’ın ön plana çıktığı ve aktif olarak yer aldığı bir
çevrede ise, bu etmenlerden etkilenmesi kaçınılmazdır.

• Yapılan araştırmalar, doğal çevremize bulaştırdığımız
birçok kimyasal maddenin, kanserojenik, mutajenik ve
teratojenik etkiye sahip olduğunu ortaya koymaktadır.
• Tüm bu nedenlerden dolayı, çevremizde bulunan ve
biyolojik etkileri henüz bilinmeyen birçok sentetik ve
doğal maddenin insan sağlığı açısından kanser
oluşturma potansiyellerinin de test edilmesi
gerekmektedir.

• Bu maddelerin kullanım amaçları, etki yolları ve süreleri
göz önüne alınarak toksisite testleri dizayn edilmektedir.
• Muhtemel toksik etkiler ise;
in vivo koşullarda deney hayvanlarında veya
in vitro koşullarda hücre kültürlerinde
araştırılmaktadır (Saygı, 2003).

• Fakat, laboratuvar hayvanlarıyla yapılan kanser
oluşturmaya yönelik deneylerin çok zaman almaları ve
çok pahalı olmaları nedeniyle uygulaması zordur.
• Bu nedenle, kimyasal maddelerin kanserojenik
potansiyellerini ölçebilmek için bazı in vitro test
sistemleri geliştirilmiştir.
• Genotoksik etkiler için kısa zamanlı testler olarak bilinen
bu testlerle kimyasal maddelerin belirli genetik
sistemlerde belirli sonuçlar verip vermedikleri
ölçülmekte ve elde edilen sonuçlarla maddelerin
kanserojenik potansiyelleri arasında ilişki kurulmaktadır.

2. GENOTOKSİK MADDELER VE
GENOTOKSİSİTE
• Sözcük anlamı zehir bilimi olan toksikoloji, kimyasallarla
biyolojik sistem arasındaki etkileşimleri zararlı sonuçları
yönünden incelemektedir (Başaran, 2004 ).
• Toksikoloji: Kimyasalların zararsızlık limitlerini
(sınırlarını) inceleyen bilim dalıdır ve inceleme alanlarına
göre çeşitli alt dallara ayrılmaktadır.
• Bizim toksikoloji bilimi içinde ilgilendiğimiz alt dal ise;
genotoksikolojidir.

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE
• Genotoksikoloji; çeşitli hücre genetiği teknikleriyle elde
edilen kromozomlar üzerine kimyasalların etkilerini
inceleyen bilim dalıdır.
• DNA ile toksik ajanların etkileşmesi sonucu genlerde
ortaya çıkan ve gelecek nesillere taşınan toksisite
‘genotoksisite’ olarak adlandırılmaktadır (Başaran,2004 ).
• Genotoksisiteye neden olan tüm maddeler ise
‘genotoksik maddeler’dir.

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE
• Toksik potansiyele sahip olan maddeler:
tüm ilaçlar,
temizlik ve kozmetik maddeleri,
pestisitler,
besin katkı maddeleri ve
sanayide kullanıldığında insanların maruz
kalabileceği kimyasal maddeler olarak sıralanabilir.

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE
• Bir maddenin potansiyel mutajen olup olmadığının
belirlenmesi için, kromozomal anormalliklere (anomali)
neden olup olmadığına bakılmaktadır.
• Genotoksisite çalışmalarında; etkisi araştırılan
kimyasal için
çok sayıda kromozom preparatlarının hazırlanması,
anormallik oranlarının farklı doz ve süreler için
belirlenmesi,
bu aşamada yüzlerce hücrenin mikroskopta
sayılması, incelenmesi ve istatistiksel
hesaplamalarla sonuca gidilmesi gerekmektedir.

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE
• Genotoksik potansiyel durumu kısa zamanlı testlerle ;
mutasyon,
kardeş kromatid değişimleri,
kromozom anomalileri frekansları gibi değerlerle
ölçülebilmektedir.
• Genotoksik potansiyeli belirlemek amacıyla kullanılan
testler arasında, özellikle gen mutasyonlarının
belirlenmesinde: bakteriler, funguslar, Drosophila sp.,
memeli hücreleri, bitkiler ve memelilerin kullanıldığı
testler yer almaktadır (Akı ve Karabay, 2004).

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE
• Son dönemde, çeşitli bitkiler iyi birer monitör sistem
olmaları nedeni ile genotoksik potansiyellerinin
saptanması için sıkça kullanılmaktadır.
• Bitki biyoanalizlerinde; moleküler sitogenetik
yaklaşımlar ile bitki genotoksisitesi araştırmaları
gerçekleştirilmektedir.
• DNA zararlarının ve onların moleküler şekillerinin
biyolojik sonuçlarını anlamak için, çevrenin neden
olduğu DNA değişikliklerini önlemek oldukça önemlidir.

3. BİTKİSEL ORGANİZMALARDA GENOTOKSİSİTEYİ
BELİRLEMEDE KULLANILAN BAZI TESTLER
3.1. Kök ucu hücreleri testi
3.2. Mikronükleus oluşumu ve analizi
3.3. Stamen tüyü analizi

3.1. Kök ucu hücreleri testi
• Soğan veya bakla gibi bitkisel organizmaların kök ucu
hücreleri testinde
kromozom anormalliklerinin ve
mitotik aktivitenin belirlenmesi gerekmektedir.
• Bu nedenle, mitotik analiz yöntemi uygulanmaktadır.
• Kök ucu hücreleri testinin avantajları şunlardır;
1. Kök uçları ile uğraşmak kolaydır.
2. Kök meristemi bölünen bir çok hücre içerir.
3. Kök uçları, konsantrasyonu
kimyasallarla doğrudan etkileştirilebilir.
ayarlanabilen
4. Soğan, bütün sene kolay ve ucuz elde edilebilir.
5. Soğanın kromozomları
bakımından büyüktür.
sayıca az; fakat yapı

3.1.1. Mitotik Analiz
• Mitoz bölünme, bitkinin tüm yaşamı boyunca
bölünebilme yeteneğinde olan meristematik dokularda
incelenebilir.
• Bitkilerde mitoz bölünme incelemesi için en çok;
kök ucundan,
genç yapraklardan,
küçük çiçek tomurcuklarının
petal yapraklarından yararlanılmaktadır.

• Kromozom sayımı yapabilmek için kullanılan
materyalde mitotik indeks yüksek olmalıdır.
• Yani, bölünmekte olan hücrelerin oranı yüksek
olmalıdır.
• Bazı bitkilerde, mitozun periyodik değişim gösterdiği
saptanmıştır.
• Bu bitkilerde, günün belirli saatlerinde mitotik
indeksin daha yüksek olduğu bulunmuştur.

3.1.2. Mitotik Aktivite (indeks)nin Hesaplanması
• Meristematik hücrelerdeki mitotik safhaların sitolojik
olarak gözlenmesi ile mitotik aktivite (indeks)
hesaplanabilmektedir.
• Mitotik aktivite, bölünen hücrelerin bölünmeyen
meristematik hücrelere göre oranıdır.
• Genellikle kromozom sayımı çalışmalarında ve
toksikolojik çalışmalarda kullanılmaktadır.
• Eğer, bir kimyasal madde ile uygulama varsa, maddenin
bölünme oranı üzerinde ne şekilde etkili olduğu
konusunda bilgi vermektedir.

• Mitotik indeks % olarak şu formül ile hesaplanmaktadır;
Mitotik indeks
(%)
Bölünen HücreSayisi
ToplamHücreSayisi
x100

• Mitotik indeks dışında ayrıca, M/T+A oranı da
hesaplanmaktadır.
• Bu katsayının yüksek değerde olması (yani 1’ den büyük
olması) ve anafaz + telofaz frekansının azalması,
karyokinetik iğ ipliklerinin inaktive olduğunu
göstermektedir.

Allium cepa L. Mitoz Bölünme Kontrol Fotoğrafları;
a. mitotik profaz safhası (kontrol grubu) b. mitotik profaz safhası (kontrol grubu)
c. mitotik profaz ve metafaz safhası (kontrol grubu) d. mitotik metafaz ve telofaz safhası (kontrol grubu)

• Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan
çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).
Kutup Kayması
Anafazda Kutup kayması
Anafazda kutup kayması
Telofazda kutup kayması

Metafazda tabla kayması
Metafazda tabla kayması
Metafazda tabla kayması
• Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan
çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

Multipolar kutup oluşumu
Anafazda tripolar oluşumu
Anafazda tetrapolar oluşumu
• Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan
çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

Kalgın Kromozom
Anafazda kalgın kromozom
Anafazda kalgın kromozom ve
kutup kayması
• Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan
çekimleri aşağıda verilmiştir (Çördük, 2006).

• Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan
çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).
Anafazda köprü oluşumu
Anafazda köprü oluşumu
Anafazda köprü oluşumu
Anafazda kalgın kromozom, Kutup kayması ve
köprü oluşumu

• Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan
çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).
Kromozom Kırıkları
Anafazda Kromozom kırıkları
Anafazda kromozom kırıkları
Düzensiz kromozom ve
kromozom kırıkları

Telofazda Enine Bölünme
Telofazda enine bölünme
• Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan
çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

• Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan
çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).
Anafazda kromozom kırığı ve
metafazda halka kromozom oluşumu
Poliploidi
Allium cepa L. türünün kromozom sayısı 2n=16’dır.

3.2. Mikronükleus oluşumu ve analizi
• Mikronükleuslar (MN): hücrenin mitoz bölünmesi
sırasında metafaz safhasından anafaz safhasına geçiş
aşamasında oluşmaktadır.
• Esas çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom ya da
asentrik kromozom parçacıklarından köken alan
oluşumlardır.
• Mikronükleus, oluşumu için hücre bölünmesine
gereksinim duymaktadır.

• Mikronükleus tekniğinin uygulanabilmesi için sitokinezi
blok metodu kullanılmaktadır.
• Sitokinezi blok metodu: Cytochalasin-B (Cyt-B) ile, mitoz
geçiren hücrelerde sitokinezi durdurma esasına
dayanmaktadır.
• Heddle ve Countryman’in (1976) kriterlerine göre:
1. Mikronükleusun çapının, esas çekirdeğin 1/3’ünden
küçük olması;
2. Boya alma yoğunluğunun, esas çekirdek ile aynı
olması gerekmektedir.

• MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde
oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom
düzensizliklerinin indirekt göstergesi olarak
değerlendirilmektedir.
• Anöploidiyi uyaran ajanlar,
sentromer bölünme hatalarına ve
iğ iplikçiklerinde fonksiyon bozukluklarına yol
açarak;
klastojenler ise, kromozom kırıkları oluşturarak MN
oluşumuna katkıda bulunmaktadırlar.

• Bu tür belirlemeler aynı şekilde bitkilerde polen ana
hücrelerinde de kolaylıkla yapılabilmektedir.
• Mikronukleuslar, Tradescantia bitkisinde de polen ana
hücrelerinde mayoz bölünmenin erken tetrad safhasında
görülmektedir.
• Analizi için, farklı uygulama metodları kullanılarak çeşitli
kimyasalların ya da zararlı ışınların genotoksik
potansiyelleri hakkında bilgiler elde edilebilmektedir.

Tradescantia’da mayoz bölünmenin tetrad safhasındaki mikronukleuslar (Ma ve diğ., 1994b).

• Mikronükleus testi sitogenetik hasarın tespitinde
kromozom analizine göre;
kolay uygulanabilmesi,
daha fazla sayıda hücre sayılması ve
istatistiksel yönden daha anlamlı sonuçlar elde
edilmesi gibi avantajları sağlamasıyla yaygın kullanım
alanı bulan bir teknik olmuştur .

• Tradescantia pallida H. bitkisinde gerçekleştirilen
mikronükleus analizinde Brilliant Black maddesinin dört
farklı konsantrasyonu uygulanmıştır (İlhan ve Akı, 2009).
• Mikronükleusların, mayoz bölünmenin erken tetrad
safhasında oluştuğu görülmüştür.
• Uygulanan maddelerin konsantrasyon artışlarına bağlı
olarak mikronükleusların artış gösterme eğilimine sahip
olduğu belirlenmiştir.

3.3. Stamen Tüyü Analizi
• Kimyasalların genotoksisitesini test etmede kullanılan, bitkilerde
özel lokus mutasyon analizleri bulunmaktadır.
• Bunlar bir ya da iki lokusta heterozigot olan özel oluşturulmuş test
strainleri veya klonlar üzerine temellenir.
• Bu durum, test bileşiklerinin uygulanmasından kısa bir süre sonra
somatik mutasyonların ortaya çıkmasına neden olur.
• Somatik mutasyonlar;
yapraklar (soya fasülyesi, tütün, yonca, mısır),
çiçek petalleri,
stamen tüyleri (Tradescantia) üzerindeki farklı renklerdeki
doku bölgeleri olarak ifade edilir (Akı ve Karabay, 2004).

• Stamen tüyü analizinde ‘somatik resesif mutasyonların’
varlığı, pembe renkli mitotik hücrelerin oluşumu ile
ortaya çıkmaktadır.
Stamen tüyü hücrelerinde mutasyon (Ma ve diğ., 1994a).
Tradescantia pallida H.

• Kontrol gruplarını ve Sunset Yellow boya maddesinin dört
farklı konsantrasyonunun uygulandığı uygulama
gruplarını içeren Tradescantia pallida H. bitkisinin stamen
tüyü analizi sonuçlarına bakıldığında, stamen tüyü
hücrelerinde pembe renkli somatik mutasyonların
oluştuğu gözlenmiştir (İlhan ve Akı, 2009).
• Mutasyonların oluşma frekansı ise, uygulanan boya
maddesinin konsantrasyonuna bağlı olarak artış
göstermiştir.

Tradescantia pallida H. stamen tüyü kontrol grubu fotoğrafları
(İlhan ve Akı,2009).
a. b. c.

Tradescantia pallida H. stamen tüyü Sunset Yellow
uygulama grubu fotoğrafları (İlhan ve Akı,2009) .
a. b.
a. 10 ppm’lik uygulama b. 200 ppm’lik uygulama

Tradescantia pallida H. stamen tüyü Sunset Yellow
uygulama grubu fotoğrafları (İlhan ve Akı,2009) .
c. d.
c. 1000 ppm’lik uygulama d. 2000 ppm’lik uygulama

SONUÇLAR
• İnsanların da bulunduğu canlılar içerisinde, doğal ya da
insan kaynaklı olarak bulunan ve ekolojik dengeler
üzerinde potansiyel tehlike niteliğindeki tüm genotoksik
maddeler üzerinde gerçekleştirilen ve gerçekleştirilecek
olan araştırmalar sayesinde; bu maddelerin genotoksik
potansiyelleri ve canlı sistemlerde meydana getirmiş
olduğu genetik hasarların bazıları saptanmış, bazılarının
etkileri ise halen saptanmayı beklemektedir.

• Bilimsel araştırmalarda model organizma olarak
genellikle bitkisel ya da hayvansal organizmalar
kullanılmaktadır.
• Günümüze kadar yapılan çalışmalar sonucunda
bitkisel ve hayvansal organizmalardan elde edilen
veriler göz önüne alınarak insan sağlığı ile ilgili
bağlantılı çalışmaların yapılması konuyu daha anlamlı
hale getirecektir.

• Bu doğrultuda, kullanılan genotoksik potansiyele sahip
olan maddelerin;
Diğer ülkelerde olduğu gibi insanları doğrudan
etkileyen gıda ve gıda bağlantılı sektörlerde
kontrollerinin daha iyi şekilde yapılması,
İnsan sağlığını tehdit etmeyecek düzeyde uygun
miktarlarda kullanılabilmesi,
Canlı sistemleri üzerinde genotoksik ve kanserojenik
etkileri ispatlanmış olanların tamamen yasaklanması
yönünde girişimlerde bulunulması düşünülmektedir.

KAYNAKLAR
• Akı C., Güneysu E., Acar O. 2009. Effects of Industrial Wastewater on Total Protein and the Peroxidase
Activity in Plants.African Journal of Biotechnology. Vol. 8 (20), pp. 5545-5548.
• Akı,C., Karabay Ü. 2004. Genetik Laboratuvarı Uygulama Kitabı. Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi
Yayınları, No.38, Çanakkale.
• Başaran, A. A. 2004. Farmakognozide tek hücre jel elektroforezi uygulamaları. 14. Bitkisel
• İlaç Hammaddeleri Toplantısı, Bildiriler, 29-31 Mayıs 2002, Eskişehir, Eds.K.H.C.Başer ve N.Kırımer, ISBN
975-94077-2-8.
• Çördük. N., Akı C., 2006. Çanakkale Kanyak Fabrikası Atık Suyunun Vicia faba L. Kök Ucu Mitozu Üzerine
Etkisi ve Total Protein Değişimleri. 26-30 Haziran 2006 XVIII. Ulusal Biyoloji Kongresi Kuşadası-AYDIN.(Poster
bildiri).
• Gönüz A., Kesercioğlu T., Akı C. 2009. Sitotaksonomide Temel İlkeler Çanakkale Onsekiz Mart Üniv.
Yayınları No:93,ISBN 978-975-8100-99-6.
• Ilhan D., Aki C. 2010. Mutagenicity of Sunset Yellow and Brilliant Black in Vicia faba L. and Allium cepa L.
Fresenius Environmental Bulletin, Vol.19, No:5, pp 769-772.
• İlhan D., 2006, Bazı Genotoksik Bileşiklerin Bitkilerde Genetiksel Etkilerinin Belirlenmesi, Çanakkale Onsekiz
Mart Üniversitesi.
• İlhan D., Akı C. Evaluation of Genetic Effects of Some Genotoxic Compounds in Tradescantia pallida H. With
Micronucleus and Stamen-Hair Mutation Test. Fresenius Environmental Bulletin, Vol.18, No:10, pp. 1828-1831.
• Kırımlı R., Akı C. Bazı Fungusit ve İnsektisitlerin Vicia faba L. ve Capsicum Annuum L. türlerinin kök ucu
mitozu üzerine etkileri
• Sık L, Acar O, Akı C. 2009 Genotoxic Effects of Industrial Wastewater on Allium cepa L. African Journal of
Biotechnology, Vol. 8 (9), pp. 1919-1923,
• Topaktaş M, Rencüzoğulları E, 2010. Sitogenetik. Genişletilmiş ve Düzeltilmiş 2. Baskı. Nobel Bilim ve
Araştırma Merkezi Yayınları, No: 99, 176 s.