Повний текст (PDF) - Ivan Franko National University of L'viv

ВІСНИК ЛЬВІВ. УН-ТУ VISNYK OF L’VIV UNIV.
Серія біологічна. 2005. Вип. 40. С. 16-22 Biology series. 2005. Is. 40. P. 16-22
Генетика
УДК 567.809.55
ВПЛИВ МУТАГЕНІВ НА АНТИБІОТИЧНУ АКТИВНІСТЬ
STREPTOMYCES NOGALATER IMET 43 360 – ПРОДУЦЕНТА
ПРОТИПУХЛИННОГО АНТИБІОТИКА НОГАЛАМІЦИНУ
О. Громико, В. Федоренко
Львівський національний університет імені Івана Франка
вул.Грушевського, 4, Львів, 79005, Україна
e-mail: o_gromyko@franko.lviv.ua
Вивчено мінливість рівня антибіотичної активності культури
S. nogalater IMET 43 360 на повноцінних середовищах. Виявлено, що найвищий
рівень антибіотичної активності цей штам має на соєвих середовищах.
Досліджено вплив ультрафіолетового опромінення та обробки N-метил-N`нітро-N-нітрозогуанідином
на виживання й антибіотичну активність штаму
S. nogalater IMET 43 360. Оптимальними дозами для виділення мутантів у
цього штаму для ультрафіолету є опромінення протягом 90 і 100 с, за яких
виживає 1,2 і 0,4%. Для N-метил-N`-нітро-N-нітрозогуанідину такими дозами
є 5–10 мг/мл і термін обробки 20–30 хв, за яких виживання культури становить
від 14,5 до 44,0%. Доведено, що опромінення ультрафіолетом протягом
90 с найефективнішим для пошуку мутантів з підвищеним синтезом
ногаламіцину; N-метил-N`-нітро-N-нітрозогуанідин можна використати для
виділення мутантів з порушеним синтезом ногаламіцину.
Ключові слова: Streptomyces nogalater, мутагенна обробка, антибіотична активність,
ногаламіцин.
Більшість відомих антибіотиків, у тому числі й протиракових, утворюють актиноміцети.
Штам S. nogalater IMET 43 360 є продуцентом антрациклінового антибіотика
ногаламіцину, який виявляє активність проти багатьох грам-позитивних бактерій і деяких
видів пухлин [8, 9, 11–13]. Похідні ногаламіцину, наприклад 7-(R)-О-метилногарол
(меногарил) виявляють високу протипухлинну активність [11].
Для природних штамів актиноміцетів характерний низький рівень синтезу антибіотиків,
зокрема, це стосується продуцентів протипухлинних антибіотиків. Одним з головних
завдань сучасної біотехнології є створення стабільних високоактивних продуцентів
антибіотиків. У таких дослідженнях використовують мутанти зі зміненим біосинтезом
антибіотиків. Це потребує вивчення спонтанної мінливості антибіотичної активності вихідних
культур, підбору оптимальних умов обробки мутагенами та визначення їхнього
впливу на антибіотичну активність штамів. В експериментах з вивчення ефективності
мутагенів враховують чутливість штамів до них, оскільки відомо, що навіть похідні одного
штаму можуть мати різну чутливість до їхньої дії [7, 10].
Наша мета – дослідити вплив різних за механізмом дії мутагенів на виживання та
антибіотичну активність штаму S. nogalater IMET 43 360, підібрати ефективні умови мутагенної
обробки для отримання штамів з підвищеним рівнем синтезу ногаламіцину.
Для визначення оптимального поживного середовища, щоб вирощувати штами
S. nogalater IMET 43 360, використали вісім середовищ, склад яких наведений у табл.1.
Обробку спор штамів S. nogalater IMET 43 360 N-метил-N`-нітро-Nнітрозогуанідином
(НГ), розчиненим у трис-малеїновому буфері (рН 8), виконували
© Громико О., Федоренко В., 2005

ВПЛИВ МУТАГЕНІВ НА АНТИБІОТИЧНУ АКТИВНІСТЬ ... 17
Номер
дослі-
ду
Кількість
клонів N
Антибіотична активність штаму S. nogalater IMET43360
на різних агаризованих середовищах
Середнє
значення
ІП, М±m
Частка “плюс“варіантів,
%
Частка “мінус“варіантів,
%
Таблиця 1
Коефіцієнт
варіації CV,
%
1 130 3,3±0,2 0 0 21,2
2 96 3,9±0,3 0 0 20,5
3 89 4,1±0,4 1,2 2,3 31,7
4 112 2,4±0,2 0 3,6 20,8
5 90 3,6±0,3 2,2 1,2 25,0
7 91 4,4±0,4 1,1 4,4 31,8
9 124 4,9±0,5 4,1 1,6 26,5
14 132 5,6±0,7 4,5 2,3 26,8
Примітка. рН середовищ 7,5-8,0. Склад середовищ, г: №1: вівсяна крупа – 40, глюкоза – 10, агар –
15; №2: вівсяна крупа – 40, кукурудзяне борошно – 20, NaCl – 5, глюкоза – 10, агар – 15; №3: кукурудзяна
крупа – 20, NaCl – 5, глюкоза – 10, агар – 15; №4: курудзяна крупа – 20, триптозний
агар – 40; №5: кукурудзяна крупа – 40, триптозний агар – 40, глюкоза – 10; №7: курудзяна крупа –
20, пептон – 4, NaCl – 5, агар – 15; №9: соєва крупа – 40, триптозний агар – 40, глюкоза – 10, агар
– 15; №14: соєва крупа – 20, NaCl – 5, глюкоза – 10, агар – 15. В усіх середовихах вода водопровідна
– до 1 л.
шляхом інкубації спорової суспензії з мутагеном у концентраціях від 3 до 10 мг/мл протягом
10–30 хв. Дію мутагену припиняли відмиванням спор від НГ у цьому ж буфері
(рН 7). Спори досліджуваного штаму обробляли ультрафіолетовими (УФ) променями з
довжиною хвилі 260–280 нм. Джерелом УФ-променів була лампа Medicor BLM-12. Тривалість
обробки коливалася від 10 до 100 с. Антибіотичну активність окремих клонів на
різних поживних середовищах визначали за індексом продуктивності (ІП) – відношенням
діаметра зони пригнічення росту тест-культури до діаметра колоній за допомогою тесткультури
Sarcina lutea. Антибіотик екстрагували з агаризованого середовища за допомогою
суміші хлороформ:ацетон (2:1) протягом 24 год. Із середовища з шестиденною культурою
вирізали агарові блоки діаметром 10 мм, висотою 5 мм, подрібнювали й екстрагували
з них антибіотик у пробірках фірми Eppendorf (Німеччина) об’ємом 1,5 мл. Екстракт
переносили в нові пробірки, висушували і розчиняли в 100 мкл етанолу. Кількісно антибіотик
в екстрактах визначали спектроскопічно при довжині хвилі 480 нм за допомогою
заздалегідь побудованої калібрувальної кривої.
Рівень антибіотичної активності актиноміцетів значно залежить від складу поживних
середовищ, на яких їх вирощують [6, 9]. Перший етап роботи був присвячений підбору
таких середовищ, на яких би штам S. nogalater IMET 43 360 добре ріс і виявляв високий
рівень антибіотичної активності. Для цього ми модифікували типові склади середовищ
[6] і розробили вісім повноцінних середовищ на основі вівсяних, кукурудзяних і соєвих
круп (див. табл. 1). Ці крупи відрізняються між собою за вмістом білків, вуглеводів і
мінеральних речовин (калій, кальцій, фосфор та ін.) [6]. Зокрема, соєва крупа містить
утричі більше білка (34,9 г/100 г), який слугує джерелом азоту, ніж кукурудзяна чи вівсяна
крупи. Також у цій крупі вдвічі більше фосфору, та більше в шість разів кальцію. Калію
соєва крупа містить у чотири рази більше, ніж вівсяна і в п’ять разів більше ніж кукурудзяна
крупи. Натомість вівсяна крупа містить майже в п’ять (48,5 г/100 г), а кукурудзяна
– у сім разів (70,4 г/100 г) більше крохмалю (джерело вуглецю), ніж соєва крупа. Сере-

18 О. Громико, В. Федоренко
довища відрізнялися як за кількістю внесених круп, так і за вмістом інших складників:
триптозного агару, пептону, дріжджового екстракту, NaCl. У всі середовища, крім кукурудзяного
№4, вносили глюкозу (див. табл. 1).
На вівсяному середовищі №1 середній ІП клонів досліджуваного штаму становив
3,3±0,2. Клонів, ІП яких перевищував би M±2s, штам не утворював, а коефіцієнт CV незначно
перевищував 20% (див. табл. 1). Використання суміші вівсяних і кукурудзяних
круп у середовищі №2 суттєво не змінило рівня і мінливість антибіотичної активності
штаму 43 360. На цих середовищах штам добре розвивав повітряний міцелій світлосірого
кольору, але утворював мало спор (близько 10 5 спор/мл).
На кукурудзяних середовищах залежно від складу антибіотична активність штаму
змінювалася. На середовищі №3 середнє значення ІП становило 4,1±0,4, частка “плюс“варіантів
була на рівні 1,2%, “мінус“-варіантів – удвічі більше. Варіабельність ознаки
антибіотикоутворення була суттєво вищою, ніж на вівсяних середовищах (CV=31,7%).
Подібні показники були у досліджуваного штаму і на середовищі №7, де замість глюкози
(джерело вуглецю) ми додавали пептон. Лише “мінус“-варіантів на цьому середовищі
було майже удвічі більше (4,4%), ніж на середовищі №3. На середовищі №4, в якому,
крім кукурудзяної крупи, був лише триптозний агар (джерело амінокислот), середній ІП
штаму 43 360 був нижчим майже удвічі, а коефіцієнт CV – більш ніж на 10% порівняно з
середовищами №3 і 7. Також на цьому середовищі у досліджуваного штаму не виникали
“плюс“-варіанти, а “мінус“-варіантів було 3,6%. Додавання глюкози до попереднього
складу (середовище №5) дещо збільшило середній ІП штаму 43 360 до 3,6±0,3. Виникало
2,2% “плюс“-варіантів, “мінус“-варіантів було втричі менше, а коефіцієнт CV зріс майже
на 5%. На кукурудзяних середовищах, які не містили триптозного агару, штам добре розвивав
повітряний міцелій білого кольору, але мав низький титр спор (близько 10 5 спор/
мл). Натомість на середовищах з триптозним агаром досліджуваний штам слабко розвивав
повітряний міцелій, а титр спор був ще нижчим.
На соєвих середовищах антибіотична активність штаму 43 360 була вищою (див.
табл.1). Середнє значення ІП коливалося від 4,9±0,5 на середовищі №9 з триптозним агаром
до 5,6±0,7 на середовищі №14 без нього. На цьому ж середовищі виникало більше
“плюс“-варіантів (4,5%), ніж на середовищі №9. Коефіцієнт CV на обох середовищах наближався
до 27%. Характер утворення повітряного міцелію і спор штаму IMET 43 360 на
цих середовищах був такий самий, як і на кукурудзяних.
У генетичних експериментах з актиноміцетами є дуже важливим високий рівень
спороутворення. З огляду на те, що штам 43 360 на досліджених повноцінних середовищах
утворював малу кількість спор ми висіяли його на мінімальне середовище Хопвуда
[10]. На цьому середовищі штам мав низьку антибіотичну активність (ІП 1,8), але добре
утворював повітряний міцелій, а титр спор був в межах 10 7 –10 8 спор/мл.
Отримані результати свідчать про високий рівень антибіотичної активності штаму
43360 на соєвих середовищах. Натомість досліджений нами раніше продуцент іншого
протипухлинного антибіотика ландоміцину Е S. globisporus 1912-2 [3] виявляв вищу антибіотичну
активність на кукурудзяних середовищах, зокрема на середовищі №7 [4].
Очевидно, що ферментативні системи цих штамів налаштовані на розщеплення відмінних
джерел вуглецю, азоту чи інших речовин. Наприклад, для штаму 43 360 оптимальнішим
джерелом виявилася соєва крупа, основним складником якої є білки [6], а для штаму
1912-2 – кукурудзяна крупа, яка містить понад 70% крохмалю.

ВПЛИВ МУТАГЕНІВ НА АНТИБІОТИЧНУ АКТИВНІСТЬ ... 19
Отже, для вирощування штаму S. nogalater IMET 43 360 у наступних експериментах
ми використали соєве середовище № 14 (СС-14), на якому він виявив найвищу антибіотичну
активність. Для отримання спор цей штам вирощували на мінімальному середовищі
(МС).
Ми дослідили вплив УФ і НГ – мутагенів, які спричинюють виникнення широкого
спектра мутацій в актиноміцетів, на виживання штаму S. nogalater IMET 43 360.
Близько 50% спор штаму S. nogalater IMET 43 360 гинуло лише після 40 с опромінення
УФ (рис. 1). Збільшення часу опромінення на кожні 10 с поступово й незначно знижувало
його виживання, а після 90 і 100 с обробки виживало близько 1,2 і 0,4% спор цього
штаму, відповідно.
Для обробки штаму 43 360 ми використали 3–10 мг/мл НГ. Термін обробки становив
10–30 хв (рис. 2). Після 10 хв обробки НГ в концентрації 3 мг/мл виживання спор
штаму знижувалося майже на 50%. Збільшення часу обробки до 20–30 хв знижувало виживання
культури до 44,0 і 27,3%, відповідно. Подальше підвищення концентрації мутагену
також знижувало виживання спор штаму незначно. Найвища доза НГ, яку ми використали
у роботі (10 мг/мл; 30 хв), спричинювала 14,5% виживання.
В літературі описані оптимальні дози мутагенів для пошуку різноманітних мутантів
у бактерій [7]. УФ ефективний у дозах, які знижують виживання культури до 0,1–
1,0%. Натомість НГ індукує високу частоту мутацій у таких дозах, за яких виживання
знижується до 10–50%. Такими дозами УФ для штаму 43360 було опромінення протягом
90 і 100 с, за якого виживало 1,2 і 0,4% спор, відповідно. У випадку НГ усі перевірені
нами дози можна використати для пошуку мутантів, оскільки виживання за них становило
14,5–54,1%. Отримані дані свідчать про значно вищий рівень стійкості S. nogalater до
НГ і УФ порівняно з раніше нами вивченими штамами S. globisporus, S. peucetius subsp.
caesius [5], S. kanamyceticus [2].
Ми дослідили зміни антибіотичної активності штаму 43 360 після опромінення УФ
протягом 90 і 100 с (табл. 2). За 100% брали середнє значення антибіотичної активності
клонів вихідного штаму, неопроміненого УФ, що виросли на середовищі СС-14. Серед
342 клонів штаму 43360 виявили 2,6% “плюс“- і 1,2% “мінус“-варіантів. Коефіцієнт варі-
lg % виживання
2,0
1,5
1,0
0,5
-0,5
0
0 20 40 60 80 100
-1,0
Час обробки, с
Рис. 1. Вплив обробки УФ на виживання спор
штаму S. nogalater IMET 43 360.
2,0
1,5
1,0
0,5
0
0 5 10 15 20 25 30
Час обробки, хв
Рис. 2. Вплив обробки НГ у концентраціях 3 (1),
5 (2) і 10 мг/мл (3) на виживання спор
штаму S. nogalater IMET 43 360.
1
2
3

20 О. Громико, В. Федоренко
Таблиця 2
Вплив УФ-опромінення на антибіотичну активність штаму S. nogalater IMET 43 360
Показники Контроль
Час опромінення, с
90 100
Кількість досліджених клонів, N 342 282 194
Середнє значення ІП, М±m,% 100* 91,9±1,8 90,8±2,1
Частка “плюс“- варіантів, % 2,6 2,5 0
Частка “мінус“- варіантів, % 1,2 2,7 3,2
Коефіцієнт варіації, СV,% 23,6 25,6 21,4
* За 100% брали середнє значення ІП спонтанних клонів штаму 43 360 на середовищі СС-14.
ації ознаки антибіотикоутворення (CV) становив 23,6%. Середнє значення антибіотичної
активності досліджуваного штаму після опромінення знизилося майже на 10%.
“Плюс“-варіанти виникали лише після 90 с опромінення, їхня частка становила 2,5%.
“Мінус“-варіанти ми виявляли після обох термінів опромінення в кількості близько 3%.
Коливання коефіцієнта CV були не суттєвими і наближалися до значення контролю.
Зміни рівня антибіотичної активності штаму 43 360 вивчали після обробки НГ у
концентраціях 5 мг/мл протягом 20 хв (виживання 39,6%) і 10 мг/мл протягом 20-30 хв
(виживання 20,1 і 14,5%, відповідно) (табл. 3). Після 20 хв обробки при концентрації НГ
5 і 10 мг/мл середнє значення ІП клонів IMET 43 360 становило близько 87%, а після 30
хв обробки 10 мг/мл НГ цей показник був меншим ще на 20% порівняно з вихідним
штамом. “Плюс“-варіанти виникали у всіх варіантах експерименту, але найбільше
(4,4%) їх було після обробки мутагеном у концентрації 10 мг/мл протягом 20 хв. Також
після цієї дози НГ значно зріс коефіцієнт CV (39,2%).
Ми виконали кількісний аналіз рівня синтезу ногаламіцину індукованими мутантами,
ІП яких перевищував середнє значення ІП S. nogalater IMET 43 360. Для цього
використали 32 УФ- і 29 НГ-індукованих мутантів. За 100% брали рівень синтезу ногаламіцину
вихідної кільтури. Виявили, що 50% УФ-індукованих мутантів перевищувало
рівень синтезу антибіотика вихідної культури на 30–50%, а майже третина мутантів
(28,1%) синтезувала на 60–100% більше. Рівень синтезу решти індукованих УФ мутантів
становив 110% щодо штаму 43 360. Серед НГ-індукованих мутантів більшість
(55,2%) синтезували ногаламіцину на 10% більше від вихідної культури, а решта мутантів
синтезували антибіотика на 30–50% більше.
Таблиця 3
Вплив обробки НГ на антибіотичну активність штаму S. nogalater IMET 43 360
Показники Контроль
Концентрація, мг/мл /час обробки, хв
5 / 20 10 / 20 10 / 30
Кількість досліджених клонів N 342 342 293 280
Середнє значення ІП, M±m, % 100* 86,4±0,3 88,2±0,4 68,8±0,3
Частка “плюс“-варіантів, % 2,6 0,6 2,7 0
Частка “мінус“-варіантів, % 1,2 3,1 4,4 2,2
Коефіцієнт варіацій CV,% 23,6 24,5 39,2 26,9
* За 100% брали середнє значення ІП спонтанних клонів штаму 43360.

ВПЛИВ МУТАГЕНІВ НА АНТИБІОТИЧНУ АКТИВНІСТЬ ... 21
Отримані дані свідчать про те, що обробка мутагенами кількісно не збільшує виникнення
“плюс“-варіантів у штаму 43 360. Кількісний аналіз рівня синтезу ногаламіцину
довів, що більшість “плюс“-варіантів штаму 43 360, а також НГ-індукованих мутантів
синтезували ногаламіцин на рівні вихідного штаму. Водночас близько 80% УФіндукованих
мутантів синтезували антибіотика на 30–100% більше, ніж штам 43 360. Ці
результати засвідчують ефективність використання УФ у пошуку штамів з підвищеним
рівнем синтезу ногаламіцину. Натомість НГ можна використати для виділення мутантів
з порушеним синтезом ногаламіцину.
Одержані мутанти з підвищеним рівнем синтезу ногаламіцину можуть бути перспективними
в експериментах зі створення промислового продуцента цього антибіотика.
__________________
1. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А. и др. Определитель актиномицетов.
М.: Наука, 1983. 244 с.
2. Голець Л.М. Генетичний контроль біосинтезу канаміцину культурою Streptomyces
kanamyceticus: Автореф. дис. … канд. біол. наук. 1997. 24 с.
3. Громико О., Басілія Л., Кириченко Н., Федоренко В. Отримання і характеристика
стрептоміцин-резистентних мутантів продуцента протипухлинного антибіотика
ландоміцину Е Streptomyces globisporus 3-1 // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 2000.
Вип. 26. С. 46–53.
4. Громико О., Басілія Л., Федоренко В. Вплив мутагенів на антибіотичну активність
Streptomyces globisporus 1912 – продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину
Е // Наук. вісн. ЛДАВМ ім. С.З. Гжицького. 2003. Т. 5 (№ 2). Ч. 3. С. 45–52.
5. Дубицька Л. Конструювання та селекція штаму Streptomyces peucetius subsp.
сaesius продуцента даунорубіцину та доксорубіцину: Автореф. дис. … канд. біол.
наук. 2002. 18 с.
6. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник. М.:
Агропромиздат, 1990. 240 с.
7. Стрельчук С.И. Основи єкспериментального мутагенеза. К.: Вища школа,
1981. С. 265.
8. Bhruyan B.K., Dietz A. Fermentation, Taxonomic, and Biologycal Stadies of
Nogalamycin // Antimicrobal Agents and Chemotherapy. 1965. P. 836–844.
9. Dekleva M.L., Titus J.A, Strohl W.R. Nutrient effects on anthracycline production
by Streptomyces peucetius in a different medium // Can J Microbiol. 1985. Vol. 31.
P. 287–294.
10. Hopwood D.A., Bibb M.J., Chater K.F. et al. Genetic manipulation of Streptomyces. A
laboratory manual. The John Innes Foundation. Norwich, 1985. 356 p.
11. Li H., Krueger W. The biochemical pharmacology of nogalamycin and its derivatives //
Pharmac. Ther. 1991. Vol. 51. P. 239–255.
12. Wiley P.F., Kelly R.B., Caron E.L. et al. Structure of Nogalamycin // J. of the American
Chemical Society. 1977. Vol. 99. № 2. P. 542–549.
13. Wiley P.F., Mackellar F.A., Caron E.L. et al. Isolation, Characterization and Degradation
of Nogalamycin // Tetrahedron Letters. 1986. No. 6. P. 663–668.

22 О. Громико, В. Федоренко
MUTAGANE INFLUENCE ON ANTIBIOTICAL ACTIVITY
OF STREPTOMYCES NOGALATER IMET43360 – PRODUCER
OF ANTICANCER ANTIBIOTIC NOGALAMYCIN
O.Gromyko, V.Fedorenko
Ivan Franko National University of L’viv
Grushevskogo str.4, L’viv 79005, Ukraine
v_fedorenko@franko.lviv.ua
Variability of antibiotical activity of S. nogalater IMET43360 culture at
the different complete medias have been studied. The highest level of antibiotics
production was shown to be on the soybean media. Influence of UV irradiation
and N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine on the surviving and antibiotical
activity of S. nogalater IMET43360 strain. The optimal conditions for S. nogalater
IMET43360 mutants screening are UV irradiation during 90 and 100 seconds
with percentage of surviving 1,2 and 0,4% of spores. For NG such doses
are 5–10 mg and incubation during 20–30 minutes with percentage of surviving
from 14,5 to 44% of spores. It was proved that UV irradiation during 90 seconds
is the most effective way of mutants with increased level of nogalamycin production
obtaining. N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine can be used for
screening of mutants with altered synthesis of antibiotic.
Key words: Streptomyces nogalater, mutagene treating, antibiotical activity,
nogalamycine.
Стаття надійшла до редколегії 02.03.2005
Прийнята до друку 27.04.2005