Pełny tekst (PDF) - Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie ...
Pełny tekst (PDF) - Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie ...
Pełny tekst (PDF) - Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
1096<br />
<strong>Progress</strong> <strong>in</strong> <strong>Plant</strong> <strong>Protection</strong>/<strong>Postępy</strong> w <strong>Ochronie</strong> Rośl<strong>in</strong> 51 (3) 2011<br />
dniach siewki przesadzono do doniczek. Obserwowano objawy żerowania nicieni, słabszy<br />
wzrost i deformacje liści. W 2010 roku nicienie ekstrahowano zarówno z liści, jak<br />
i nasion.<br />
Pozyskane osobniki zakonserwowano w 4% roztworze wodnym formaldehydu. Następnie<br />
przygotowano mikroskopowe preparaty trwałe przy użyciu metody Ste<strong>in</strong>horsta<br />
(Ste<strong>in</strong>horst 1959). Identyfikacji gatunku dokonano przy pomocy mikroskopu świetlnego<br />
Nikon Eclipse 80i (powiększenie 1000x) z wykorzystaniem kontrastu <strong>in</strong>terferencyjnoróżniczkowego<br />
DIC (technika Nomarskiego).<br />
Dla potrzeb badań molekularnych część pozyskanych nicieni zakonserwowano<br />
w mieszan<strong>in</strong>ie DESS (20% dimetylosulfotlenku DMSO, 0,25 M kwasu etylenodiam<strong>in</strong>otetraoctowego<br />
EDTA, nasycony roztwór NaCl, pH 8,0) (Yodern i wsp. 2006). Izolację<br />
DNA prowadzono na kolumienkach z dwutlenkiem krzemu przy użyciu zestawu GenElute<br />
Mammalian Genomic DNA Purification Kit (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI),<br />
zgodnie z <strong>in</strong>strukcją producenta. Oczyszczone DNA użyte zostało jako matryca w łańcuchowej<br />
reakcji polimerazy (PCR).<br />
Dostępna w GenBanku sekwencja DNA genu I podjednostki oksydazy cytochromowej<br />
(COI – cytochrome oxidase gene subunit I) dla A. ritzemabosi (GenBank Acc<br />
No GU367869) porównana została za pomocą programu BLASTn z dostępnymi w Gen-<br />
Banku sekwencjami <strong>in</strong>nych gatunków z rodzaju Aphelenchoides w celu określenia podobieństwa<br />
między nimi. Para starterów specyficzna dla A. ritzemabosi [forward<br />
(5_-gggctggaactagttgggta-3_) i reverse (5_-tccagctaagacaggcaaaga-3_)] służąca amplifikacji<br />
genu I podjednostki oksydazy cytochromowej została zaprojektowana w programie<br />
Primer3 http://frodo.wi.mit. edu/primer3 (Rozen i Skaletsky 2000).<br />
Amplifikacja wytypowanej sekwencji przeprowadzona została przy użyciu aparatu<br />
Rotor-Gene 6500 thermal cycler (Corbett Research, Mortlake, NSW, Australia). Startery<br />
PCR nabyto w IBB Oligo (Warszawa). Każdą reakcję PCR przeprowadzono w 20 µl<br />
mieszan<strong>in</strong>y reakcyjnej w składzie: 10 µl 2x SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix<br />
(Sigma-Aldrich), 4 µl 10 µM każdego starteru, 4 µl wyizolowanego DNA, 2 µl H 2 O.<br />
W każdej analizie obecna była próba kontrolna negatywna (bez matrycy DNA). Wstępna<br />
denaturacja przeprowadzona została w 95°C przez 10 m<strong>in</strong>., a profil termiczny następnych<br />
40 cykli to: 95°C przez 30 s, 50°C przez 30 s i 72°C przez 30 s. Pomiary fluorescencji<br />
prowadzono przy długości fali 510 nm, w trakcie fazy wydłużania łańcucha<br />
DNA. Reakcję PCR zakończono po 40 cyklach. Krzywą amplifikacji mierzono w zakresie<br />
temperatur 60–95°C co 0,1°C/s.<br />
III. WYNIKI I DYSKUSJA<br />
Badania mikroskopowe, jak i analizy molekularne potwierdziły obecność A. ritzemabosi<br />
zarówno w tkankach liści, jak i w nasionach szałwii błyszczącej. Wykazano<br />
także możliwość rozwoju populacji nicieni w rozsadzie szałwii uprawianej z porażonych<br />
przez A. ritzemabosi nasion.<br />
Wykorzystywana para starterów pozwoliła zaobserwować różnice w sekwencji genu<br />
I podjednostki oksydazy cytochromowej pomiędzy A. ritzemabosi, A. xylocapae,<br />
A. besseyi i A. fragariae (rys. 1).
Change language