Pełny tekst (PDF) - Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie ...

Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011
WYKRYCIE WĘGORKA CHRYZANTEMOWCA
(APHELENCHOIDES RITZEMABOSI) W NASIONACH
SZAŁWII BŁYSZCZĄCEJ (SALVIA SPLENDENS)
ANETA CHAŁAŃSKA 1 , GABRIEL ŁABANOWSKI 1 , TADEUSZ MALEWSKI 2
1
Instytut Ogrodnictwa
Konstytucji 3 Maja 1/3, 96-100 Skierniewice
aneta.chalanska@inhort.pl
2 Muzeum i Instytut Zoologii Polskiej Akademii Nauk
Wilcza 64, 00-679 Warszawa
I. WSTĘP
W Polsce, szałwia błyszcząca – Salvia splendens Sello ex Roem. et Schult., jest rośliną
jednoroczną, ze względu na walory estetyczne uprawianą z przeznaczeniem na
rabaty. Rośliny rozmnaża się przez nasiona wysiewane na przełomie lutego i marca.
Zahartowaną rozsadę wysadza się do gruntu pod koniec maja.
Węgorek chryzantemowiec – Aphelenchoides ritzemabosi (Schwartz, 1911) Steiner
& Buhrer, 1932, jest nicieniem żerującym w tkankach miękiszowych liści i w pąkach
(Hesling i Wallace 1961). W kraju od wielu lat jest znanym i powszechnym szkodnikiem
chryzantemy (Baranowski 1976; Wojtowicz i Łabanowski 1993), truskawki
(Szczygieł 1967) oraz wielu krzewów ozdobnych uprawianych w szkółkach (Soika
i Łabanowski 2003).
Szałwia jest znana jako roślina żywicielska węgorka chryzantemowca (Goodey
1956), jednakże w Polsce nie stwierdzono dotychczas występowania tego nicienia na
omawianej roślinie. Nie zanotowano również rozprzestrzeniania się tego nicienia przez
nasiona.
II. MATERIAŁ I METODY
Typowe objawy żerowania węgorka chryzantemowca w tkankach liści szałwii
błyszczącej (S. splendens) z grupy Compacta erecta, rosnącej w gruncie zaobserwowano
wiosną 2009 roku w Skierniewicach. W próbach uszkodzonych liści pobranych do
analizy laboratoryjnej stwierdzono obecność nicieni. Jesienią 2009 roku z roślin tych
zebrano nasiona, które przechowywano przez zimę zgodnie z praktyką ogrodniczą,
następnie pod koniec lutego 2010 roku wysiano do multiplatów w szklarni. Po 6 tygo-

1096
Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011
dniach siewki przesadzono do doniczek. Obserwowano objawy żerowania nicieni, słabszy
wzrost i deformacje liści. W 2010 roku nicienie ekstrahowano zarówno z liści, jak
i nasion.
Pozyskane osobniki zakonserwowano w 4% roztworze wodnym formaldehydu. Następnie
przygotowano mikroskopowe preparaty trwałe przy użyciu metody Steinhorsta
(Steinhorst 1959). Identyfikacji gatunku dokonano przy pomocy mikroskopu świetlnego
Nikon Eclipse 80i (powiększenie 1000x) z wykorzystaniem kontrastu interferencyjnoróżniczkowego
DIC (technika Nomarskiego).
Dla potrzeb badań molekularnych część pozyskanych nicieni zakonserwowano
w mieszaninie DESS (20% dimetylosulfotlenku DMSO, 0,25 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego
EDTA, nasycony roztwór NaCl, pH 8,0) (Yodern i wsp. 2006). Izolację
DNA prowadzono na kolumienkach z dwutlenkiem krzemu przy użyciu zestawu GenElute
Mammalian Genomic DNA Purification Kit (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI),
zgodnie z instrukcją producenta. Oczyszczone DNA użyte zostało jako matryca w łańcuchowej
reakcji polimerazy (PCR).
Dostępna w GenBanku sekwencja DNA genu I podjednostki oksydazy cytochromowej
(COI – cytochrome oxidase gene subunit I) dla A. ritzemabosi (GenBank Acc
No GU367869) porównana została za pomocą programu BLASTn z dostępnymi w Gen-
Banku sekwencjami innych gatunków z rodzaju Aphelenchoides w celu określenia podobieństwa
między nimi. Para starterów specyficzna dla A. ritzemabosi [forward
(5_-gggctggaactagttgggta-3_) i reverse (5_-tccagctaagacaggcaaaga-3_)] służąca amplifikacji
genu I podjednostki oksydazy cytochromowej została zaprojektowana w programie
Primer3 http://frodo.wi.mit. edu/primer3 (Rozen i Skaletsky 2000).
Amplifikacja wytypowanej sekwencji przeprowadzona została przy użyciu aparatu
Rotor-Gene 6500 thermal cycler (Corbett Research, Mortlake, NSW, Australia). Startery
PCR nabyto w IBB Oligo (Warszawa). Każdą reakcję PCR przeprowadzono w 20 µl
mieszaniny reakcyjnej w składzie: 10 µl 2x SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix
(Sigma-Aldrich), 4 µl 10 µM każdego starteru, 4 µl wyizolowanego DNA, 2 µl H 2 O.
W każdej analizie obecna była próba kontrolna negatywna (bez matrycy DNA). Wstępna
denaturacja przeprowadzona została w 95°C przez 10 min., a profil termiczny następnych
40 cykli to: 95°C przez 30 s, 50°C przez 30 s i 72°C przez 30 s. Pomiary fluorescencji
prowadzono przy długości fali 510 nm, w trakcie fazy wydłużania łańcucha
DNA. Reakcję PCR zakończono po 40 cyklach. Krzywą amplifikacji mierzono w zakresie
temperatur 60–95°C co 0,1°C/s.
III. WYNIKI I DYSKUSJA
Badania mikroskopowe, jak i analizy molekularne potwierdziły obecność A. ritzemabosi
zarówno w tkankach liści, jak i w nasionach szałwii błyszczącej. Wykazano
także możliwość rozwoju populacji nicieni w rozsadzie szałwii uprawianej z porażonych
przez A. ritzemabosi nasion.
Wykorzystywana para starterów pozwoliła zaobserwować różnice w sekwencji genu
I podjednostki oksydazy cytochromowej pomiędzy A. ritzemabosi, A. xylocapae,
A. besseyi i A. fragariae (rys. 1).

Wykrycie węgorka chryzantemowca w nasionach szałwii 1097
Starter forward
A. ritzemabosi GGGCTGGAACTAGTTGGGTA
A. xylocopae .TTG...T..A.....A..T
A. besseyi .......G.....A.....T
A. fragariae ..TG...T...........T
Starter reverse
A. ritzemabosi TCTTTGCCTGTCTTAGCTGGA
A. xylocopae .....A.....T........T
A. besseyi .....A.....T..G..G...
A. fragariae .....A..G..A........T
Rys. 1. Różnice sekwencji DNA genu I podjednostki oksydazy cytochromowej (COI) A. ritzemabosi,
A. xylocapae, A. besseyi i A. fragariae dla starteru forward i starteru reverse
Fig. 1. Differences between the A. ritzemabosi, A. xylocapae, A. besseyi and A. fragariae DNA
sequence of the cytochrome oxidase gene subunit I (COI) for the primer pair
Sekwencja, na podstawie której zaprojektowano startery do przeprowadzenia reakcji
amplifikacji PCR, dla regionu COI, dla A. ritzemabosi obejmowała 248 par zasad. Do
reakcji amplifikacji użyto DNA wyizolowanego z jednego osobnika. W próbach ujemnych
nie pojawiła się krzywa amplifikacji.
Udokumentowanie przeżycia osobników węgorka chryzantemowca w nasionach
szałwii jest nową informacją w literaturze. Jest ona zgodna z doniesieniem Browna
(1956), który wykrył A. ritzemabosi w nasionach Callistephus chinensis i wskazał, że
istnieje możliwość rozprzestrzeniania się tego gatunku poprzez nasiona. Inni autorzy
udowodnili, że osobniki węgorka chryzantemowca w suchych liściach chryzantem
mogą przeżyć nawet kilka lat. Ponadto wskazali, że porażenie upraw w roku następnym
nie następuje poprzez glebę, w której nicienie przeżywają dość krótko (około 3–4 miesięcy).
Właściwym źródłem porażenia są suche części roślinne, zwłaszcza jeżeli są
przetrzymywane w niskiej temperaturze (około 4°C). Żywe osobniki A. ritzemabosi
mogą być w nich obecne nawet po 3 latach (French i Barraclough 1962). Krusberg
(1967) wykazał, że dzieje się tak dzięki wysokiej zawartości lipidów w ciele nicieni
tego gatunku, co umożliwia im przeżycie w warunkach odwodnienia. Tak więc proces
suszenia nasion i ich przechowywania, wykorzystywany w praktyce ogrodniczej, nie
eliminuje nicieni, które do nich wniknęły. Do odbudowania populacji wystarczy jedna
samica (French i Barraclough 1961).
Węgorek chryzantemowiec poraża ponad 200 gatunków roślin, w tym zarówno
chwasty, jak i rośliny ozdobne (Goodey 1956; Sturhan 1962). Konsekwencją wysiania
nasion zawierających żywe osobniki A. ritzemabosi będzie porażenie wielu sąsiadujących
upraw. W warunkach polowych do porażenia dochodzi, gdy odległość między
roślinami nie przekracza 1 m (Hesling i Wallace 1961). W Polsce, w szkółkach roślin
ozdobnych szkody wywołane występowaniem węgorka chryzantemowca obserwuje się
od 1996 roku (Łabanowski i Soika 1996; Łabanowski i Soika 2002), a lista gatunków
i odmian roślin ozdobnych, które są żywicielami węgorka chryzantemowca wciąż się
rozszerza (Soika i Łabanowski 2003; Chałańska i Łabanowski 2010).
IV. WNIOSKI
1. A. ritzemabosi przeżywa w nasionach szałwii błyszczącej okres zimy i jest źródłem
porażenia siewek, a tym samym roślin w okresie wegetacji.

1098
Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011
2. Zastosowanie specyficznych dla A. ritzemabosi starterów amplifikujących gen I podjednostki
oksydazy cytochromowej pozwala identyfikować ten gatunek.
V. LITERATURA
Baranowski T. 1976. Badania nad szkodliwą fauną złocieni w okolicach Poznania. Rocz. Nauk
Roln., Seria E, 6: 19–23.
Brown E.B. 1956. A seed-borne attack of Chrysanthemum eelworm (Aphelenchoides ritzemabosi)
on the annual aster (Callistephus chinensis). J. Helminth. 30: 145–148.
Chałańska A., Łabanowski G. 2010. Diagnostyka nicieni liściowych z rodzaju Aphelenchoides.
Instrukcja wykrywania nicieni na podstawie uszkodzeń roślin ozdobnych. Agencja
Reklamowo-Wydawnicza Estet, 20 ss.
French N., Barraclough R.M. 1961. Observations on the reproduction of Aphelenchoides ritzemabosi
(Schwartz). Nematologica 6: 89–94.
French N., Barraclough R.M. 1962. Survival of Aphelenchoides ritzemabosi (Schwartz) in soil
and dry leaves. Nematologica 7: 309–316.
Goodey T. 1956. The Nematode Parasites of Plants Catalogued under their Hosts. Comm. Agricul.
Bur., Farn. Royal, England, 140 pp.
Hesling J.J., Wallace H.R. 1961. Observations on the biology of chrysanthemum eelworm Aphelenchoides
ritzema-bosi (Schwartz) Steiner in florists’ chrysanthemum. Ann. Appl. Biol. 49:
195–203.
Krusberg L.R. 1967. Analyses of total lipids and fatty acids of plant-parasitic nematodes and host
tissues. Comp. Biochem. Physiol. 21: 83–90.
Łabanowski G., Soika G. 1996. Najgroźniejsze szkodniki w szkółkach roślin ozdobnych. Prog.
Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 36 (1): 184–190.
Łabanowski G., Soika G. 2002. Aktualne problemy w ochronie roślin ozdobnych przed szkodnikami.
Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 42 (1): 188–195.
Rozen S., Skaletsky H.J. 2000. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.
p. 365–386. In: „Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular
Biology” (S. Krawetz, S.A. Misener, eds.). Humana Press, Totowa, 512 pp.
Soika G., Łabanowski G. 2003. Zagrożenie upraw szkółkarskich roślin ozdobnych przez węgorka
chryzantemowca i próba jego zwalczania. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 43 (2):
936–939.
Steinhorst J.W. 1959. A rapid method for the transfer of nematodes from fixative to anhydrous
glycerin. Nematologica 4: 67–69.
Sturhan D. 1962. Über neue Wirtspflanzen der Blattäichen Aphelenchoides fragariae und
A. ritzemabosi, mit Bemerkungen zu den Wirtspflanzenkreisen beider Nematodenarten. Anz.
Schädlingsk. 35: 65–67.
Szczygieł A. 1967. Wstępna ocena szkodliwości nicieni z rodzaju Aphelenchoides dla truskawek
w Południowej Polsce. Prace Inst. Sad. 11: 211–224.
Wojtowicz M., Łabanowski G. 1993. Wpływ nematocydów na wzrost złocieni i rozwój węgorka
chryzantemowca (Aphelenchoides ritzemabosi). Zesz. Nauk. ISiK 1: 139–146.
Yoder M., Tandingan De Ley I., King I.W., Mundo-Ocampo M., Mann J., Blaxter M., Poiras L.,
De Ley P. 2006. DESS: a versatile solution for preserving morphology and extractable DNA
of nematodes. Nematology 83: 367–376.

Wykrycie węgorka chryzantemowca w nasionach szałwii 1099
ANETA CHAŁAŃSKA, GABRIEL ŁABANOWSKI, TADEUSZ MALEWSKI
DETECTION OF APHELENCHOIDES RITZEMABOSI (SCHWARTZ)
IN SCARLET SAGE (SALVIA SPLENDENS) SEEDS
SUMMARY
Characteristic damage caused by feeding leaf nematodes were recorded on sage plants of
Compacta erecta group growing in the field in spring 2009. Nematological analysis showed the
Aphelenchoides ritzemabosi presence in collected leaves. Seeds were sampled in the autumn from
sage plants and then used for seedlings’ production in the next vegetation season. Collected seeds
were stored over the winter and then sown into plastic boxes in the glasshouse conditions in February
2010. In April seedlings were replanted into larger pots. They already had symptoms such
as weak growth and partial leaf deformations. These were the typical symptoms of damage caused
by foliar nematodes which were later found in the field during the vegetation period. The analysis
of leaves confirmed A. ritzemabosi presence. Further investigation showed also the presence of
nematodes in seeds. In Poland, this was the first record leaf damages caused by A. ritzemabosi on
Salvia splendens.
Comparison of Aphelenchoides cytochrome oxidase gene subunit I (COI) allowed to design
primers for molecular identification of A. ritzemabosi. The primer pair reproducibly amplified the
COI region of A. ritzemabosi, generating a 248-bp product using total genomic DNA extracted
from individual nematodes.
Key words: Aphelenchoides ritzemabosi, scarlet sage, cytochrome oxidase gene subunit I (COI)