You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Kolegij Genetičko inženjerstvo<br />
<strong>Genska</strong> <strong>terapija</strong> – <strong>1.</strong> <strong>dio</strong><br />
doc. dr. sc. Gordana Maravić<br />
Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju<br />
Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta<br />
GM2005
<strong>Genska</strong> <strong>terapija</strong><br />
• Prijenos terapeutskog gena u oboljelo tkivo<br />
• Više vrsta:<br />
• Transplantacija gena (kod delecija)<br />
• Korekcija gena (ispravljanje mutacije)<br />
• Povećavanje ekspresije ciljnog gena<br />
• Ciljano uništenje pojedinih stanica unosom<br />
gena ubojice<br />
• Ciljana inhibicija genske ekspresije<br />
GM2005
Bolesti kod kojih se može<br />
primijeniti genska <strong>terapija</strong><br />
Bolest<br />
Defekt<br />
CIljna stanica<br />
• Teška kombinirana<br />
imunodeficijencija<br />
• Hemofilija<br />
• Cistična fibroza<br />
• Rak<br />
• Neurološke bolesti<br />
• Kar<strong>dio</strong>vaskularne<br />
bolesti<br />
• Autoimune bolesti<br />
• Infektivne bolesti<br />
• Adenozin-deaminaza<br />
4<br />
• Faktor VIII, IX<br />
• Gubitak gena CFTR<br />
• Više uzroka<br />
• Parkinson, Alzheimer<br />
• Ateroskleroza<br />
• Dijabetes<br />
• AIDS, hepatitis B<br />
• Stanice koštane srži, T-<br />
limfociti<br />
• Jetra, mišić, fibroblasti<br />
• Zračni jastučići - pluća<br />
• Više tipova stanica<br />
• Izravno u mozak<br />
• Endotel krvnih žila<br />
• MHC, β2-mikroglobulin<br />
• T-limfociti, makrofagi<br />
GM2005
Problemi s genskom terapijom<br />
• Kratkotrajna<br />
• Vrlo teško je postići dugotrajan učinak bez<br />
integracije u genom, a čak i tada<br />
• Imuni odgovor<br />
• Reducira učinkovitost, onemogućava opetovanu<br />
terapiju<br />
• Problemi s virusnim vektorima<br />
• Toksičnost, imuni i upalni odgovor, mogućnost<br />
povratka sposobnosti za izazivanje bolesti<br />
• Višegenske bolesti<br />
• Kombinirani učinak više gena – teško liječenje<br />
GM<br />
GM2005
Klinička ispitivanja genske terapije<br />
Infektivne bolesti<br />
13 %<br />
Ljudi<br />
Ostalo 2%<br />
Markiranje<br />
gena<br />
7 %<br />
Monogenske bolesti<br />
9 %<br />
Rak 69%<br />
GM2005
Dva tipa genske terapije<br />
• in vivo<br />
• ex vivo<br />
GM2005
GT ex vivo<br />
GM2005
GT in vivo vs. ex vivo<br />
in vivo<br />
• Genetički materijal<br />
unosi se izravno u<br />
tijelo pacijenta<br />
• Prilično nasumičan<br />
proces, mala<br />
mogućnost kontrole<br />
• Jedina mogućnost za<br />
tkiva koja se ne mogu<br />
uzgajati in vitro<br />
ex vivo<br />
• Genetički materijal unosi<br />
se najprije u stanice u<br />
kulturi<br />
• kontroliran proces,<br />
selekcija stanica s<br />
transgenom<br />
• Stanice su obično<br />
autologne – uzimaju se iz<br />
pacijenta i modificirane<br />
vraćaju natrag<br />
GM2005
Način unosa DNA ovisi o<br />
namjeni genske terapije<br />
• Zamjena gena – visoko učinkoviti virusni<br />
vektori<br />
• Monogenske bolesti – cistična fibroza, teška<br />
kombinirana imunodeficijencija, hemofilija<br />
• Kratkotrajna ekspresija – izravni unos DNA<br />
• poticaj imunog odgovora<br />
• Prijenos putem liposoma – učiniti stanice<br />
osjetljivijima za ra<strong>dio</strong>terapiju<br />
GM2005
Poželjna svojstva vektora za<br />
gensku terapiju<br />
• Visoki titar (>10 8 čestica/ml)<br />
• Laka i reproducibilna metoda<br />
proizvodnje<br />
• Precizno i stabilno uvođenje transgena<br />
• Vektor ne bi smio inducirati imuni<br />
odgovor po unosu u organizam<br />
• Kontrolirana ekspresija transgena<br />
(on/off sustav) – regulatorni elementi<br />
unutar transgena<br />
• Specifičnost za pojedine tipove stanica<br />
GM<br />
GM2005
Metode unosa terapeutskih<br />
konstrukata DNA<br />
• Unos gole DNA<br />
• Jednostavnom iglom i špricom – tumorsko tkivo<br />
• Genskim pištoljem – epiderma, neprikladno za tumore<br />
• Unos liposomima – dopremanje do ciljnog tkiva<br />
intravaskularnim, intratrahealnim, intraperitonealnim,<br />
intrakolonskim putem<br />
• Unos putem bioloških vektora<br />
• Genetički modificirani virusi - ne mogu se replicirati u<br />
domaćinu<br />
• Trenutno najučinkovitija metoda prijenosa DNA u genskoj<br />
terapiji<br />
GM2005
Unos gole DNA<br />
• Intramuskularno, intravaskularno<br />
• produžena in vivo ekspresija niskog stupnja<br />
• Jednostavno i jeftino, ali ne i univerzalno<br />
• DNA vakcine<br />
• Infektivne bolesti – tradicionalne vakcine još<br />
uvijek učinkovitije<br />
• Rak<br />
• Povećanje postojećeg imuno-odgovora<br />
• Poticaj imuno odgovora prema neprepoznatom ili slabo<br />
antigenom tumoru<br />
• Mišićna distrofija – biolistika<br />
• Cistična fibroza - liposomi<br />
GM2005
DNA vakcina za malariju –<br />
današnji pokušaji<br />
• T-limfociti prepoznaju stanicu s parazitom malarije<br />
• Proizvodnja INF-γ i stimulacija prezentacije antigena<br />
GM2005
DNA vakcina za malariju –<br />
imunološki važne komponente<br />
patogena<br />
• Nekoliko peptidnih epitopa koje prepoznaju T-<br />
limfociti<br />
• Čitavi protein TRAP (thrombospondin related<br />
adhesion protein)<br />
DNA vakcina koja kodira<br />
za imuno-prepoznatljiv<br />
produkt: poticaj<br />
imunološkog odgovora<br />
prikladnom<br />
prezentacijom antigena<br />
GM2005
Biolistika – primjenjiva i na<br />
stanicama sisavaca<br />
• Genski pištolj – plazmidna DNA se<br />
taloži na čestice zlata ili<br />
volframa promjera 1-3 µm<br />
• Okidanje – pod tlakom helija ili<br />
pod visokim naponom<br />
• Snimka pod<br />
svjetlosnim<br />
elektronskim<br />
mikroskopom:<br />
• Čestice zlata<br />
obavijene s DNA<br />
nakon upucavanja u<br />
kožu<br />
GM2005
Duchennova mišićna distrofija<br />
• X-vezana recesivna bolest, 1/3500<br />
muške djece<br />
• Odsutnost distrofina, membranskog<br />
proteina koji čini oko 0.01% proteina<br />
skeletnog mišića<br />
• Oslabljeni mišići, gubitak mišićne mase<br />
• Najprije zahvaćeni mišići udova i trupa<br />
– invalidska kolica do 12. godine života<br />
• Srčana aritmija ili otkazivanje srca – u<br />
10% slučajeva<br />
• Smrt u dobi od 10. do 20. godine života<br />
zbog plućnih problema<br />
GM2005
Normalni i MD mišić<br />
Detekcija distrofina<br />
monoklonskim protutijelima:<br />
miofibrili su obavijeni tamno<br />
obojenim distrofinom<br />
Distrofina nema;<br />
Povećano vezivno tkivo;<br />
povećan promjer miofibrila<br />
GM2005
Distrofin<br />
• Povezuje<br />
unutarstanični<br />
citoskelet i aktinske<br />
filamente s<br />
vanstaničnim<br />
matriksom<br />
• Čitavi kompleks<br />
stabilizira membranu<br />
• Laminin 2α2 –<br />
kongenitalna MD (k.6)<br />
• Sarkoglikani –4 tipa MD<br />
• Distrofin – Duchennova<br />
i Beckerova MD<br />
GM2005
Duchennova mišićna distrofija:<br />
intramuskularni unos DNA<br />
biolistikom<br />
• Problem – gen za distrofin i mRNA su<br />
preveliki za unos putem vektora<br />
• Nativni gen 2.4 Mb<br />
• mRNA 14 kb<br />
• IDEJA: distrofin zadržava <strong>dio</strong> funkcije<br />
i kada mu nedostaje velik <strong>dio</strong> gena<br />
(Beckerov fenotip – puno blaži od<br />
potpune DMD)<br />
GM2005
Delecijske varijante distrofina za GT<br />
ABD=<br />
actin-binding domains<br />
Veći <strong>dio</strong> ponavljajućih sljedova nalik spektrinu<br />
može se izostaviti da bi distrofin još uvijek bio<br />
funkcionalan.<br />
Scott Harper et al., 2002.<br />
GM<br />
GM2005
GT s minigenom za distrofin u<br />
miševima s DMD fenotipom<br />
DMD miševi s preuranjenim stop kodonom u eksonu 23:<br />
nema distrofina!<br />
tretirani GT<br />
netretirani<br />
GM2005
Rezultati <strong>1.</strong> faze kliničke<br />
studije genske terapije MD<br />
• 5. lipnja 2003. Francuska udruga mišićnih<br />
distrofičara i Transgene objavili su rezultate <strong>1.</strong> faze<br />
kliničkih ispitivanja genske terapije Duchennove i<br />
Beckerove mišićne distrofije<br />
• 9 pacijenata u 3 skupine:<br />
• Jedna injekcija – 200 µg plazmida s genom za distrofin<br />
• Jedna injekcija – 600 µg plazmida s genom za distrofin<br />
• 2 injekcije – 2x600 µg plazmida s genom za distrofin<br />
• Ispitani uzorci mišića pokazuju:<br />
• Ekspresija distrofina prisutna u 1-10% mišićnih vlakana za<br />
skupinu 1 i 2; potpuna ekspresija u skupini 3!<br />
• Nema imune reakcije niti popratnih učinaka!!<br />
GM2005
Liposomi<br />
• Nastaju spontanom agregacijom lipidnih molekula u<br />
vodenom okružju<br />
• Kationski liposomi vežu negativno nabijenu DNA<br />
• Tako omotana DNA zaštićena je od razgradnje<br />
• Lipofektin, lipofektamin – služe i za transfekciju stanica u<br />
kulturi<br />
Pozitivno nabijene lipidne glave<br />
GM2005
Modificirani liposomi<br />
• Nedostatak jednostavnih liposoma - vrlo se brzo<br />
uklanjaju iz cirkulacije putem makrofaga iz jetre<br />
• Dodatak površinskih liganada smanjuje<br />
degradaciju liposoma:<br />
• Monosijalogangliozidi<br />
• Polioksietileni<br />
• Kolesterol<br />
• Glukuronska kiselina<br />
• Produljeni polu-život liposoma zbog reducirane<br />
opsonizacije (omatanja) proteinima iz plazme<br />
GM2005
Kokleati – višeslojni liposomi<br />
• Dugotrajna i<br />
jednostavna pohrana –<br />
barem godinu dana kao<br />
liofilizirani prah na<br />
sobnoj temperaturi<br />
• Trajne vezikule –<br />
preživljavaju višestruke<br />
fuzije s membranom<br />
• Preživljavanje u gastrointestinalnom<br />
traktu –<br />
prikladni za oralnu<br />
primjenu<br />
liposom<br />
kokleat<br />
GM2005
Imunoliposomi<br />
• Za aktivno usmjeravanje<br />
DNA<br />
• Na površini nose specifična<br />
protutijela<br />
• Protutijela na unutarstanični<br />
miozin usmjeravaju<br />
imunoliposome na područja<br />
srčanog mišića zahvaćena<br />
infarktom<br />
• Protutijela na molekule<br />
specifične za tumore<br />
usmjeravaju imunoliposome<br />
na stanice tumora<br />
GM2005
Liposomi mogu poslužiti kao<br />
tumor-specifične vezikule čak i<br />
bez posebnog usmjeravanja<br />
Liposomi lakše ulaze u krvne žile s oštećenim<br />
endotelom – tumorska tkiva<br />
GM2005
Liposomi u genskoj terapiji<br />
PREDNOSTI<br />
• Jeftiniji od virusnih<br />
vektora<br />
• Ne izazivaju imuni<br />
odgovor<br />
• Iznimno prikladni<br />
za dopremu DNA u<br />
pluća putem<br />
aerosola – cistična<br />
fibroza<br />
NEDOSTACI<br />
• potrebno 100-<br />
1000 puta više<br />
DNA da bi se<br />
postigla ista<br />
učikovitost kao<br />
kod virusnih<br />
vektora<br />
• nisu prikladni za<br />
tretman mnogih<br />
bolesti<br />
GM2005
Cistična fibroza<br />
• Vrlo česta bolest u bijelaca (1 na 2000 rođenih)<br />
• Defekt u genu CFTR<br />
• Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator<br />
• Nepravilno provođenje natrijevih i kloridnih iona u<br />
epitelnim stanicama mnogih organa<br />
• Znojne žlijezde – previše slanog ekskreta<br />
• Probavni sustav – opstipacija<br />
• Oštećenje pankreasa – dovodi do dijabetesa<br />
• Gusti mukozni sekret u plućima – osjetljivost na<br />
infekcije, konstantni kašalj, glavni uzrok smrtnosti<br />
GM2005
Pluća u cističnoj fibrozi<br />
Normalne alveole<br />
CF – proširene kripte ispunjene<br />
mukusom i bakterijama<br />
CF pluća ne<br />
kolabiraju nakon<br />
smrti<br />
CF pluća<br />
GM2005
CF pluća su osjetljiva na<br />
infekcije<br />
• Pseudomonas aeruginosa lako kolonizira<br />
mukus – konstantna aktivacija neutrofila<br />
Mukus štiti bakterije i<br />
promovira hipermutacije<br />
Neutrofili ne mogu<br />
eliminirati bakterije –<br />
konstantna upala i<br />
oštećenje plućnog tkiva<br />
GM2005
Gušterača u cističnoj fibrozi<br />
Normalna gušterača<br />
CF gušterača – proširene<br />
kripte ispunjene mukusom<br />
• Enzimi gušterače ne mogu napustiti žlijezdu što dovodi do<br />
oštećenja<br />
• Proizvodi se manje inzulina – dijabetes<br />
• Među bolesnicima koji dožive 25 godina – 1/3 s<br />
poremećenom tolerancijom na glukozu i 1/3 s dijabetesom<br />
GM2005
Liječenje cistične fibroze<br />
Učestala uporaba antibiotika za suzbijanje bakterijskih infekcija<br />
Staphylococcus aureus,<br />
Haemophilius influenzae,<br />
Aspergillus fumigatus<br />
- ista slika ...<br />
GM2005
CFTR gen - kromosom 7:<br />
27 eksona; protein od 1480 a.k.<br />
ATP binding domain<br />
GM2005
CFTR produkt<br />
• Delecija F508<br />
• 50% pacijenata<br />
homozigoti<br />
• 30% heterozigoti<br />
(normalna<br />
verzija/delecija)<br />
• Nastaje nepotpuno<br />
smotani oblik osjetljiv<br />
na razgradnju<br />
proteazama<br />
• Rapidna degradacija<br />
prije ulaska u Golgijev<br />
aparat<br />
GM2005
<strong>Genska</strong> <strong>terapija</strong> cistične fibroze<br />
• Siječanj 1995. – tretman<br />
liposomima – intranazalni<br />
sprej<br />
• 12 pacijenata – privremeno<br />
olakšanje u 20% pacijenata<br />
• Maksimum – 3. dan,<br />
prestanak – 7. dan<br />
• Nema imunološke reakcije<br />
• 2000. g. - mjesečne<br />
aplikacije također uzrokuju<br />
poboljšanje<br />
GM2005
Višestruke doze prijenosa gena<br />
• Prijenos gena detektiran nakon svake doze:<br />
Doza 1 56% (5/9) DNA 60%<br />
Doza 2 66% (6/9) mRNA 44%<br />
Doza 3 66% (6/9) protein 28%<br />
funkcija 22%<br />
• Prijenos gena CFTR putem kationskog<br />
lipidnog nosača značajno utječe na kliničku<br />
sliku bolesti<br />
GM2005
Change language