Mutageneza i strategije kloniranja.pdf
Mutageneza i strategije kloniranja.pdf
Mutageneza i strategije kloniranja.pdf
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Kolegij Genetičko inženjerstvo<br />
<strong>Mutageneza</strong> i <strong>strategije</strong> <strong>kloniranja</strong><br />
doc. dr. sc. Gordana Maravić<br />
Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju<br />
Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta<br />
GM2005
Dva pristupa istraživanju<br />
funkcije gena<br />
Mutantni fenotip<br />
Mutantni gen<br />
Nukleotidni slijed u DNA<br />
Slijed aminokiselina u<br />
proteinu<br />
GENETIKA<br />
Slijed aminokiselina u<br />
proteinu<br />
Nukleotidni slijed u DNA<br />
Mutantni gen<br />
Mutantni fenotip<br />
OBRNUTA GENETIKA<br />
GM<br />
GM2005
<strong>Mutageneza</strong><br />
• Proces stvaranja mutacija u molekuli DNA<br />
• Mutacije:<br />
• Točkaste (jednostruke, višestruke)<br />
• Delecije<br />
• insercije<br />
• 2 osnovna tipa mutageneze:<br />
• Nasumična (random)<br />
• Ciljana (site-directed)<br />
GM2005
Nasumična mutageneza<br />
• Tehnike uvođenja nasumičnih mutacija:<br />
• Kemijska mutageneza (npr. hidroksilamin)<br />
• Bakterijski soj mutator (nemogućnost<br />
popravka pogrešaka u DNA)<br />
• Transpozoni (nehomologna rekombinacija)<br />
• Transpozoni su prikladni genetički elementi za<br />
mutaciju bakterijskog genoma – mutantna<br />
mjesta su označena transpozonom jer oni nose<br />
selektivni biljeg<br />
GM2005
Insercija transpozona in vivo<br />
transformacija<br />
transpozon<br />
kompetentne<br />
stanice<br />
transformirana<br />
bakterijska stanica<br />
insercija u genom<br />
insercijski klonovi GM<br />
GM2005
Insercija<br />
transpozona<br />
in vitro<br />
GM2005
Nasumična mutageneza<br />
• Prednosti:<br />
• nasumičnost – nisu nužne pretpostavke<br />
• Nedostaci:<br />
• Nasumičnost – nije usmjerena na određena<br />
mjesta<br />
• Gen kloniran u vektor – cijeli plazmid je meta<br />
za mutacije (ori, MCS, selektivni biljeg...)<br />
• Moguće su višestruke mutacije<br />
• Teška selekcija i odabir zanimljivih mutacija<br />
GM2005
Ciljana mutageneza<br />
• Uz uporabu sintetičkih oligonukleotida<br />
koji sadrže mutacije<br />
• PCR mutageneza<br />
• metoda megaishodnice<br />
• delecije<br />
• Uporabom restrikcijskih endonukleaza<br />
• uporabom egzonukleaza<br />
• Homologna rekombinacija<br />
GM2005
Ciljana mutageneza uz oligonukleotid<br />
(oligonucleotide-directed mutagenesis)<br />
• produljenje<br />
oligonukleotida s<br />
mutacijom na<br />
kalupu<br />
jednolančane DNA<br />
(primer extension)<br />
• detekcija<br />
mutanata<br />
hibridizacijom u<br />
visoko specifičnim<br />
uvjetima<br />
GM2005
Nedostaci metode produljenja<br />
ishodnice<br />
• Uporaba jednolančane DNA<br />
• Rezultat in vitro mutageneze je mješavina<br />
mutantnih, hibridnih i plazmida divljeg tipa<br />
• Transformirane bakterije s mogućnošću popravka<br />
krivo sparenih baza eliminiraju hibride i tako još<br />
više smanjuju udio mutanata – potrebno koristiti<br />
specijalne sojeve bakterija<br />
• Moguće je poboljšati prinos mutantnih plazmida<br />
kidanjem hibrida i plazmida divljeg tipa RE koje<br />
propoznaju metiliranu DNA – dodatni korak u<br />
protokolu<br />
GM2005
Zamjena dijela gena sintetičkim<br />
mutiranim fragmentom<br />
(“zamjena kasete”)<br />
ciljni gen<br />
sintetički<br />
fragment DNA s<br />
mutacijom<br />
restrikcijski<br />
enzim<br />
DNA<br />
ligaza<br />
rekombinantni<br />
plazmid<br />
rekombinantni<br />
plazmid sadrži<br />
gen sa željenom<br />
mutacijom<br />
GM2005
PCR mutageneza:<br />
metoda s 4 ishodnice<br />
1. PCR reakcija<br />
2. PCR reakcija<br />
3. PCR reakcija<br />
GM2005
PCR mutageneza:<br />
metoda megaishodnice<br />
• Prva PCR reakcija uz<br />
oligonukleotid s<br />
mutacijom služi za<br />
dobivanje dugačke<br />
ishodnice<br />
• U drugoj PCR reakciji<br />
produkt prve reakcije<br />
služi kao jedna od<br />
ishodnica<br />
GM2005
PCR mutageneza:<br />
uvođenje jedinstvenog restrikcijskog<br />
mjesta za selekciju mutanata<br />
gen s ciljnim<br />
mjestom za mutaciju<br />
(u plazmidu)<br />
mnogo kopija<br />
plazmida s<br />
mutacijom na<br />
željenom mjestu<br />
unutar gena<br />
denaturacija i<br />
vezanje ishodnice<br />
mnogo PCR ciklusa<br />
uz željenu<br />
mutaciju<br />
ishodnica uvodi<br />
i jedinstveno<br />
restrikcijsko<br />
mjesto<br />
Transformacija bakterija:<br />
kolonije koje sadrže plazmid s<br />
novim restrikcijskim mjestom<br />
sadrže i mutirani gen<br />
GM2005
Kombinacija<br />
pristupa<br />
• PCR mutageneza cijelog plazmida<br />
uz 2 mutagene ishodnice:<br />
• Sinteza mutantnog oblika – PCR uz<br />
proofreading termostabilnu DNA<br />
polimerazu<br />
• Uklanjanje hibrida i plazmida<br />
divljeg tipa uporabom RE DpnI<br />
(kida metiliranu DNA)<br />
• Transformacija bakterija<br />
• Prednosti:<br />
• Učinkovitost >80%<br />
• Jednostruke i višestruke mutacije<br />
• Priprava mutanata u jednom danu<br />
• Komercijalno dostupan komplet<br />
(Stratagene QuikChange ® sitedirected<br />
mutagenesis kit)<br />
GM2005
Uvođenje delecija<br />
Uporaba<br />
restrikcijske<br />
endonukleaze<br />
i ponovno<br />
povezivanje<br />
DNA-ligazom<br />
Postupna<br />
delecija<br />
jednog<br />
kraja DNA<br />
egzonukleazom<br />
GM2005
Inaktivacija gena insercijskom<br />
mutagenezom<br />
Ciljni gen<br />
Genomska DNA<br />
EcoRV<br />
Gen izoliran i umnožen<br />
metodom PCR i kloniran u<br />
vektor<br />
EcoRV<br />
Tet R<br />
EcoRV<br />
Amp R Kaseta s genom za rezistenciju na<br />
antibiotik ugrađuje se u<br />
jednistveno restrikcijsko mjesto<br />
unutar ciljnog gena<br />
Tet R<br />
Amp R<br />
GM2005
Inaktivacija genomske kopije gena<br />
homolognom rekombinacijom<br />
• E. coli:<br />
oprez u odabiru<br />
soja – u mnogim<br />
sojevima<br />
uklonjeni su<br />
elementi za<br />
homolognu<br />
rekombinaciju<br />
• S. cerevisiae:<br />
uz uporabu<br />
prikladnih<br />
kaseta<br />
(selektivni<br />
biljezi za<br />
kvasac) vrlo<br />
učinkovita<br />
homologna<br />
rekombinacija<br />
Tet R<br />
Amp R<br />
inaktivirani ciljni gen<br />
kloniran u vektor<br />
• rekombinacija homolognih<br />
regija<br />
• selekcija kolonija koje<br />
pokazuju rezistenciju na<br />
tetraciklin<br />
Ekspresija<br />
funkcionalnog<br />
proteina je<br />
onemogućena<br />
genomska DNA<br />
genomska DNA<br />
GM2005
Serijsko kloniranje<br />
• spajanjem fragmenata iz<br />
različitih izvora mogu se<br />
konstruirati potpuno nove<br />
molekule DNA<br />
• dobivanje gena bez eksona<br />
• spajanje fragmenata<br />
jednog gena iz različitih<br />
klonova u genskoj knjižnici<br />
• proteinsko inženjerstvo –<br />
stvaranje proteina s novim<br />
svojstvima<br />
GM2005
Usmjereno<br />
kloniranje<br />
Veliki fragment<br />
Ciljna DNA<br />
Razgradnja s<br />
HindIII i BamHI<br />
Razgradnja s HindIII i<br />
BamHI<br />
Mali se fragment<br />
odbacuje<br />
Ciljna DNA spaja se s<br />
vektorom u samo jednoj<br />
mogućoj orijentaciji<br />
• Često je potrebno<br />
ugraditi stranu DNA u<br />
točno određenoj<br />
orijentaciji s obzirom na<br />
promotor i sl.<br />
• To je moguće ostvariti<br />
razgradnjom vektora i<br />
strane DNA dvjema<br />
restrikcijskim<br />
endonukleazama<br />
• Na taj se način strana<br />
DNA može ugraditi u<br />
vektor na samo jedan<br />
način<br />
GM2005
Geni “izvjestitelji”<br />
(reporter genes)<br />
• Omogućavaju praćenje ekspresije ciljnog gena<br />
(vrijeme, mjesto, razina...)<br />
• Regulatorni elementi ciljnog gena povezuju se s<br />
genom čiji je produkt lako pratiti unutar stanice<br />
• Kao geni izvjestitelji najčešće se koriste:<br />
• β-galaktozidaza<br />
• Autofluorescentni proteini<br />
• Zeleni fluorescentni protein (green fluorescent protein – GFP)<br />
• Crveni fluorescentni protein (red fluorescent protein – RFP)<br />
• Luciferaza<br />
• β-glukuronidaza (GUS)<br />
GM2005
Reporter gene<br />
makes it easy<br />
to watch<br />
GM2005
Gen izvjestitelj – luciferaza (luc)<br />
• Izoliran iz krijesnice<br />
Photinus pyralis<br />
• protein luciferaza<br />
• monomer veličine 62 kDa<br />
• Katalizira ATP-ovisnu<br />
oksidativnu<br />
dekarboksilaciju<br />
luciferina što emitira<br />
svjetlo valne duljine 560<br />
nm<br />
• Kvalitativna detekcija<br />
• Luminometrija<br />
• Kvantitativna detekcija<br />
• Uporabom fotografskog<br />
filma<br />
Protein luc<br />
Ekspresija<br />
luciferaze u<br />
duhanu<br />
GM2005
Gen izvjestitelj – β-glukuronidaza (gusA)<br />
• Izoliran iz E. coli<br />
• Protein β-glukuronidaza<br />
• Tetramer podjedinica<br />
veličine 74 kDa<br />
• Hidrolizira molekule β-<br />
glukuronida<br />
• Detekcija<br />
• tvorba plavog precipitata<br />
nakon kidanja bezbojnog<br />
supstrata X-Gluc (5-<br />
bromo-4-kloro-3-indolilβ-glukuronid)<br />
Transgenska zrnca peluda<br />
koja pokazuju β-<br />
glukuronidaznu aktivnost<br />
X-Gluc<br />
GM2005
Gen izvjestitelj – zeleni fluorescentni<br />
protein (green fluorescent protein-GFP)<br />
• Izoliran iz meduze<br />
Aequorea victoria<br />
• GFP protein<br />
• Monomer veličine 27 kDa<br />
• Nakon apsorpcije svjetla<br />
vlane duljine 395 nm,<br />
emitira se zeleno svjetlo<br />
valne duljine 508 nm uz<br />
potrošnju kisika<br />
(bioluminiscencija)<br />
• Kvalitativna detekcija<br />
• Luminometrija<br />
• Kvantitativna detekcija<br />
• Uporabom fotografskog<br />
filma<br />
Aequorea victoria<br />
GFP<br />
GM2005
Vektor za fuziju s GFP<br />
HeLa stanice koje<br />
eksprimiraju GFP i RFP<br />
GM2005
Praćenje lokalizacije proteina<br />
u stanici uz fuziju s genom<br />
izvjestiteljem<br />
• Ciljni gen se spaja s genom izvjestiteljem (GFP) i<br />
rekombinantni vektor se unosi u stanice u kulturi<br />
• Fluorescencija upućuje na ekspresiju proteina u pojedinim<br />
staničnim odjeljcima (jezgra, citoplazma, membrana...)<br />
1<br />
4<br />
2<br />
5<br />
3<br />
6<br />
Ekspresija različitih<br />
GFP-fuzijskih<br />
proteina u kvascu:<br />
1 - jezgra<br />
2 - periferija jezgre<br />
3 - ER<br />
4 - vrh pupa<br />
5 - mitohondrij<br />
6 - lipidne čestice<br />
GM<br />
GM2005
Primjeri uporabe fluorescentnih gena<br />
Francuski znanstvenici proizveli su kunića koji<br />
fluorescira zeleno ugradnjom gena GFP.<br />
Japanski znanstvenici na Sveučilištu u Osaki<br />
proizveli su fluorescirajuće miševe.<br />
Znanstvenici Nacionalnog instituta za obrazovanje<br />
u Singapuru proizveli su fluorescirajuće orhideje.<br />
Tvrtka Prolume u SAD koristi GFP za proizvodnju fluorescirajuće<br />
hrane i pića, uključujući i glazure za rođendanske torte.<br />
GM2005
Primjeri uporabe fluorescentnih gena<br />
Ovaj je komarac proizveden na Imperial College u<br />
Londonu. Dugoročni cilj je modificirati insekte tako<br />
da ne mogu prenositi i širiti malariju.<br />
Na Sveučilištu u Singapuru znanstvenici su<br />
modificirali ribicu (Zebrafish) uporabom<br />
fluorescentnih gena iz meduza i crvenih moruzgvi.<br />
Ribice fluoresciraju u prisutnosti zagađivača vode<br />
i tako djeluju kao sustav upozorenja.<br />
Znanstvenici na Svučilištu u Floridi dizajniraju<br />
genetički modificirane biljke koje će fluorescirati<br />
zeleno u određenim uvjetima tla. Mogle bi se<br />
koristiti i kao senzori u svemirskim misijama.<br />
GM2005
Kvaščev sustav dvaju hibrida<br />
(yeast two-hybrid system)<br />
• Za detekciju protein-protein interakcija<br />
• Koristi regulaciju GAL1 promotora pomoću proteina GAL4<br />
GAL4<br />
UAS G<br />
GAL1 lacZ<br />
Protein GAL4:<br />
domena koja veže DNA<br />
domena za aktivaciju<br />
transkripcije<br />
UAS G<br />
–<br />
upstream activating sequence<br />
uzvodni slijed za aktivaciju<br />
kvaščevih GAL gena na koji se<br />
veže protein GAL4<br />
GM2005
vector 1 vector 2<br />
Transformacija kvasca – 2<br />
vektora:<br />
Vektor 1 – sadrži gen “mamac” (bait) spojen s<br />
genom za domenu koja veže DNA proteina<br />
GAL4 (DB)<br />
Vektor 2 – genska knjižnica željenog organizma<br />
ili tipa stanice gdje su pojedini geni (target)<br />
spojeni s genom za<br />
aktivacijsku<br />
domenu proteina<br />
GAL4 (AD)<br />
GM2005
ON<br />
Aktivacija gena izvjestitelja<br />
upućuje na interakciju<br />
između dvaju proteina<br />
OFF<br />
GM2005
Traženje važnih genskih regija<br />
• Interakcije između proteina i DNA – ključni<br />
elementi u kontroli genske ekspresije<br />
• Važno je znati koji sljedovi DNA vežu regulatorne<br />
proteine<br />
• Metode<br />
• Delecijska analiza promotora uz fuziju s genom<br />
izvjestiteljem<br />
• Metoda usporavanja/pomaka u gelu (Gel<br />
retardation/shift assay)<br />
• Metoda zaštite DNazom/DNA otisak prsta (DNase<br />
protection assay; DNA footprinting)<br />
GM2005
Delecijska analiza kontrolnih<br />
genskih regija<br />
• Ciljna kontrolna<br />
područja povezuju se s<br />
genom izvjestiteljem -<br />
lacZ<br />
• Izradi se više delecijskih<br />
mutanata (npr.<br />
uporabom Bal 31<br />
nukleaze ili<br />
restrikcijskom<br />
razgradnjom)<br />
• Ukoliko se regulatorni<br />
proteini vežu na ciljna<br />
područja, dolazi do<br />
ekspresije lacZ –<br />
detekcija uz dodatak X-<br />
gal<br />
1 2 3 4 5 P lacZ<br />
GM2005
Metoda pomaka u gelu<br />
• Temelji se na svojstvu<br />
molekule DNA da se sporije<br />
kreće u gelu pod utjecajem<br />
električne struje kad je u<br />
kompleksu s proteinom<br />
• Izradi se set restrikcijskih<br />
fragmenata ciljne DNA<br />
• Pojedinačni fragmenti<br />
razdvajaju se u gelu bez i u<br />
kompleksu s proteinom<br />
• Kontrolna DNA (bez proteina)<br />
kreće se brže od kompleksa<br />
• Na isti se način mogu<br />
istraživati i interakcije<br />
između proteina i RNA<br />
(dobivanje RNA – in vitro<br />
transkripcija)<br />
slobodni<br />
protein<br />
Identifikacija minimalnog<br />
slijeda DNA za vezanje proteina<br />
slobodna DNA<br />
kompleks<br />
GM2005
Metoda zaštite DNazom<br />
• Temelji se na činjenici da je<br />
dio molekule DNA koji je u<br />
kompleksu s proteinom<br />
zaštićen od razgradnje s<br />
DNazom I<br />
• Ciljni fragment DNA obilježi<br />
se radioaktivno i pomiješa s<br />
regulatornim proteinom<br />
• DNA se podvrgava<br />
ograničenoj razgradnji s<br />
DNazom I<br />
• smjesa dobivenih fragmenata<br />
razdvaja se u gelu – u<br />
području koje je zaštićeno<br />
vezanjem proteina nema<br />
fragmenata DNA – dobivamo<br />
“otisak prsta” veznog mjesta<br />
unutar molekule DNA<br />
GM2005
Change language