Vektori i domacini.pdf
Vektori i domacini.pdf
Vektori i domacini.pdf
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Kolegij Genetičko inženjerstvo<br />
<strong>Vektori</strong> i domaćini za molekularno<br />
kloniranje<br />
doc. dr. sc. Gordana Maravić<br />
Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju<br />
Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta<br />
GM2005
E. coli<br />
• Gram-negativna štapićasta bakterija<br />
• Genom veličine 4,6 Mpb; oko 4000 gena<br />
• Soj K12 izoliran 1921. i do danas se održava kao<br />
čista kultura<br />
• Laboratorijski sojevi su varijante soja K12<br />
• Odstranjen restrikcijsko-modifikacijski sustav<br />
• Modificiran sustav za rekombinaciju (recA - )<br />
• Mutirana endonukleaza I – za povećanje broja kopija<br />
plazmida<br />
• Odstranjeni geni za toksine i virulenciju<br />
• XL-1 Blue; DH5α<br />
GM2005
Osnovni tipovi vektora<br />
• Plazmidi<br />
• Bakteriofagi<br />
• Hibridni vektori<br />
• kozmidi<br />
• fagmidi<br />
• Umjetni kromosomi<br />
GM2005
Prirodni plazmidi<br />
• 3 vrste iskorištene za konstrukciju vektora:<br />
• Plazmidi za virulenciju<br />
• sadrže gene za toksine (kolicin)<br />
• većina vektora nosi ishodište replikacije iz<br />
plazmida ColE1<br />
• Konjugacijski plazmidi<br />
• F (fertility)-plazmid<br />
• kodira protein za koji se veže fag M13<br />
• Plazmidi za rezistenciju<br />
• izvor gena za rezistenciju na antibiotike<br />
GM2005
Klasifikacija plazmida<br />
• Prema sposobnosti za konjugaciju<br />
• Konjugativni – posreduju vlastiti prijenos u drugu bakterijsku<br />
stanicu putem gena tra (transfer) i mob (mobilising)<br />
• Nekonjugativni – ne mogu samostalno upravljati konjugacijom<br />
• Prema broju kopija<br />
• Nisko kopijski<br />
• Veći plazmidi s kontrolom replikacije usko povezanom s<br />
replikacijom bakterijskog kromosoma (stringent plasmids)<br />
• Obično konjugativni plazmidi<br />
• Visoko kopijski<br />
• Manji plazmidi s replikacijom neovisnom o replikaciji bakterijske<br />
genomske DNA (relaxed plasmids)<br />
• Nekonjugativni plazmidi<br />
• Prema skupini inkompatibilnosti<br />
• Inkompatibilnost –nemogućnost koegzistencije dvaju plazmida<br />
u istoj stanici<br />
GM2005
Karakteristike modernih<br />
plazmidnih vektora<br />
• Mutirano ishodište replikacije ColE1 za postizanje velikog<br />
broja kopija (do 500 kopija po stanici)<br />
• Dodatno ishodište replikacije (M13) za pripravu<br />
jednolanačane DNA<br />
• Kompleksni polilinker (višestruko mjesto za kloniranje)<br />
• Promotor uz polilinker za sintezu mRNA i ekspresiju<br />
proteina<br />
• Promotor uz polilinker za in vitro sintezu RNA<br />
• α-fragment β-galaktozidaze za α-komplementaciju<br />
• Definirani optimalni položaji i sljedovi ishodnica za PCR i<br />
sekvenciranje<br />
• Regulatorni elementi za propagaciju, selekciju i ekspresiju<br />
izvan E. coli<br />
• Sljedovi za tvorbu fuzijskih produkata<br />
GM2005
pBR322<br />
• Jedan od Jedan od prvih vektora<br />
konstruiranih u<br />
laboratoriju<br />
• Mala molekula, lako se<br />
izolira<br />
• Može primiti 5-10 kB DNA<br />
• Sadrži nekoliko<br />
jedinstvenih restrikcijskih<br />
mjesta za kloniranje<br />
• Geni za rezistenciju na<br />
ampicilin (amp r ) i<br />
tetraciklin (tet r ) za<br />
insercijsku selekciju<br />
GM2005
Insercijska<br />
selekcija<br />
BamHI<br />
amp r gen<br />
ostaje<br />
cjelovit<br />
inaktivirani<br />
tet r gen<br />
usporedba s originalnom<br />
pločom – samo tet s imaju<br />
ugrađeni fragment<br />
pBR322<br />
plazmid s genima<br />
amp r i tet r<br />
medij s<br />
Tet<br />
BamHI fragment za<br />
kloniranje u BamHI<br />
mjesto plazmida<br />
sterilan baršunasti<br />
jastučić<br />
medij s<br />
Amp<br />
kimerni<br />
plazmid<br />
transformacija<br />
bakterija<br />
+<br />
inokulacija na<br />
medij s<br />
ampicilinom<br />
rastu samo kolonije otporne<br />
na tetraciklin (s plazmidom<br />
bez ugrađenog fragmenta)<br />
metodom replicaplating<br />
kolonije se<br />
prebacuju na medij s<br />
tetraciklinom<br />
rastu samo kolonije<br />
otporne na ampicilin<br />
GM<br />
GM2005
Rzličite mogućnosti ugradnje i<br />
selekcije<br />
GM2005
pUC18/19<br />
GM2005
pUC18/19<br />
• Mali visoko kopijski plazmidi<br />
• Razlikuju se u orijentaciji višestrukog mjesta za kloniranje<br />
• Sadrže dio lac operona koji kodira za α-fragment (Nterminalni<br />
dio) β-galaktozidaze čija se ekspresija može<br />
inducirati dodatkom IPTG u medij<br />
• Mogućnost intra alelne ili α-komplementacije s defektnim<br />
oblikom β-galaktozidaze (C-terminalni dio, ω –fragment)<br />
kodirane genomom bakterije domaćina<br />
• U prisutnosti IPTG bakterija sintetizira oba fragmenta<br />
enzima i tvori plave kolonije na mediju sa supstratom (X-<br />
Gal) za β-galaktozidazu<br />
• Ugradnja DNA u MCS unutar lacZ gena inaktivira N-<br />
terminalni fragment β -galaktozidaze i sprečava α-<br />
komplementaciju – bakterije s rekombinantnim plazmidom<br />
stvaraju bijele kolonije<br />
GM2005
Lac operon<br />
• Laktoza je prirodni<br />
supstrat za β –<br />
galaktozidazu<br />
GM2005
Lac operon<br />
• X-Gal (5-bromo-4-<br />
kloro-3-indolil- β -Dgalaktopiranozid)<br />
je<br />
supstrat za β –<br />
galaktozidazu koji<br />
stvara plavu boju<br />
GM2005
Lac operon<br />
• Alolaktoza je induktor<br />
koji se veže na represor<br />
• Nastaje djelovanjem<br />
malih količina β –<br />
galaktozidaze na laktozu<br />
GM2005
Lac operon<br />
• IPTG (Izopropil – β –<br />
D- tiogalaktozid) je<br />
derivat alolaktoze<br />
koji se ne može<br />
prevesti u produkt<br />
GM2005
Enzimska aktivnost β –galaktozidaze<br />
očituje se združenim djelovanjem<br />
dvaju polipeptidnih lanaca<br />
N-terminalni α-fragment<br />
C-terminalni ω-fragment<br />
GM2005
α-komplementacija<br />
• N-terminalni α-<br />
fragment kodiran<br />
genom lacZ iz<br />
vektora zajedno s<br />
C-terminalnim ω-<br />
fragmentom<br />
kodiranim<br />
genomom domaćina<br />
daje funkcionalni<br />
protein<br />
• Uz dodatak IPTG u<br />
medij nastaje plava<br />
boja<br />
GM2005
Plavo-bijela selekcija<br />
Vektor bez<br />
inserta<br />
Vektor s<br />
insertom<br />
Ligacija<br />
samog inserta<br />
GM2005
Bakteriofagi<br />
• Virusi koji inficiraju bakterije<br />
• DNA faga može se prepraviti tako da posluži kao<br />
vektor za kloniranje<br />
• Bakterijska infekcija odvija se na dva moguća<br />
načina<br />
• Litički ciklus<br />
• Dovodi do lize stanica<br />
• Primjena - rekombinantni fag uvodi se u bakterijske stanice,<br />
dolazi do lize i na bakterijskoj ploči nastaju čista područja –<br />
plakovi iz kojih se može izolirati rekombinantna DNA<br />
• Lizogeni ciklus<br />
• Ugradnja u bakterijski genom<br />
• Primjena – stvaranje posebnih bakterijskih sojeva s novim<br />
svojstvima (npr. ekspresijski soj E.coli BL21(DE3)<br />
GM2005
• Ulazak u<br />
litički<br />
odnosno<br />
lizogeni<br />
ciklus<br />
određen je<br />
ekspresijom<br />
tzv. gena<br />
prekidača<br />
(switch<br />
genes) u vrlo<br />
ranoj fazi<br />
infekcije<br />
• Aktivacija<br />
genske<br />
transkripcij<br />
e –litički put<br />
• Represija–<br />
lizogeni put<br />
GM2005
Bakteriofag λ<br />
• fag λ ima genom veličine 48.5 kb<br />
• Mnogi od oko 50 λ gena su uključeni u<br />
rekombinaciju i lizogeni ciklus te stoga nisu<br />
nužni za umnažanje faga i litički put<br />
• Nepotrebni geni mogu se ukloniti i<br />
zamijeniti stranom DNA<br />
• Derivati faga λ: vektori EMBL3, λgt10,<br />
Charon 16A<br />
• Pogodni i za male (0-5 kb) i za velike (10-20<br />
kb) inserte<br />
GM2005
Bakteriofag λ –divlji tip<br />
• Na krajevima genoma su cos (cohesive) mjesta - asimetrični ljepljivi<br />
krajevi od 12 pb<br />
• Replikacija “kotrljajućeg kruga” stvara konkatamerne strukture –<br />
virusni enzim λ-terminaza kida DNA na cos mjestima<br />
• Pakiranje DNA veličine 37-52 kb u virusnu česticu<br />
• Umjesto nebitne regije može se ugraditi do 23 kb strane DNA<br />
GM2005
λ vektori za kloniranje<br />
• 1) Insercijski vektori<br />
cos<br />
cos<br />
EcoRI<br />
• 2) Zamjenski vektori<br />
cos<br />
cos<br />
EcoRI<br />
20Kb<br />
EcoRI<br />
GM2005
Insercijski vektor λgt10<br />
GM2005
Zamjenski vektor λEMBL3<br />
GM2005
Rekombinantna λ DNA može se<br />
pakirati in vitro u virusne čestice<br />
cos<br />
cos<br />
In vitro ekstrakt bakterijskih stanica<br />
sa sintetiziranim glavama i repovima<br />
faga i proteinima za ugradnju u<br />
virusnu česticu<br />
GM2005
Nitasti fag M13<br />
• Jednolančani DNA fag koji inficira E. coli s<br />
F faktorom<br />
• Po ulasku u stanicu sintetizira se komplementarni<br />
lanac<br />
• dvolančana kružna DNA je replikativni oblik koji<br />
se može izolirati slično kao i plazmid<br />
• Jednolančani oblik može se izolirati iz virusnih<br />
čestica<br />
• Jednolančana DNA koristi se za sekvenciranje i<br />
mutagenezu<br />
• Danas sve manje u upotrebi zbog napretka<br />
tehnologije sekvenciranja i mutageneze<br />
GM2005
Vektor derivat faga M13<br />
GM2005
Hibridni plazmid-M13 vektori –<br />
fagmidi ili fazmidi<br />
• Sadrže ishodišta<br />
replikacije iz M13 i E.coli<br />
• Nemaju gene za<br />
održavanje ciklusa faga<br />
• Ponašaju se kao plazmidi<br />
• Uz dodatak faga<br />
pomagača inducira se<br />
proizvodnja virusnih<br />
čestica s jednolančanom<br />
DNA<br />
• pKS – mogućnost plavobijele<br />
selekcije i in vitro<br />
transkripcije<br />
GM2005
Kozmidi<br />
• Mali plazmidi koji sadrže cos mjesta iz faga λ,<br />
plazmidno ishodište replikacije i selektivni biljeg<br />
• U bakterijskoj stanici ponašaju se kao plazmidi<br />
• Razgradnjom restrikcijskim enzimima i ugradnjom<br />
strane DNA u višestruko mjesto za kloniranje stvaraju<br />
se konkatamerne strukture povezane na cos mjestima<br />
• Uz dodatak ekstrakta za in vitro pakiranje mogu se<br />
dobiti virusne čestice koje sadrže rekombinantni<br />
kozmid<br />
• Virusnim česticama se inficiraju bakterijske stanice u<br />
kojima se kozmidi ponovno ponašaju kao plazmidi<br />
GM2005
Primjer suvremenog kozmidnog<br />
vektora<br />
GM2005
Kloniranje u kozmidne<br />
vektore<br />
amp r<br />
ori<br />
restrikcijsko<br />
mjesto<br />
strana DNA<br />
cos<br />
razgradnja<br />
amp r<br />
ori<br />
cos<br />
ligacija<br />
amp r<br />
ori<br />
cos<br />
amp r<br />
ori<br />
cos<br />
GM2005
Kvasac kao modelni eukariot<br />
• jednostavan za uzgoj u laboratoriju - vrijeme<br />
diobe 1.5-2 h na 30°C<br />
• haploidni i diploidni životni ciklus<br />
• diploidnost omogućava mutacije esencijalnih gena koji<br />
bi bili letalni u haploidnom soju<br />
• geni iz različitih sojeva mogu se kombinirati križanjem<br />
• može se uzgajati fermentacijom na glukozi ili<br />
respiracijom na izvoru ugljika kao što je glicerol<br />
ili etanol što nije moguće kod viših eukariota –<br />
idealan za studij mitohondrijskih proteina<br />
potrebnih za stanično disanje<br />
GM2005
Kvasac kao modelni eukariot<br />
• mnoge značajke karakteristične za više eukariote<br />
očuvane su u kvascu<br />
• Replikacija DNA, sinteza i procesiranje RNA, sinteza<br />
proteina, usmjeravanje proteina u organele i<br />
translokacija kroz staničnu membranu, jezgrine pore,<br />
mitohondriji, ER, peroksisomi, prijenos signala,<br />
citoskelet, regulacija staničnog ciklusa<br />
• laboratorijski sojevi kvasca – geni koji služe kao<br />
selektivni biljezi na kvaščevim vektorima su<br />
inaktivirani<br />
• selektivni biljezi kvasca – geni za proizvodnju<br />
pojedinih aminokiselina i nukleotida: his3, ura3,<br />
trp1, leu2, ade2<br />
GM2005
Eukariotski vektori<br />
• mnogi su eukariotski geni izolirani kloniranjem u<br />
E. coli, no za različite primjene genetičkog<br />
inženjerstva (proizvodnja proteina u eukariotskim<br />
stanicama, kreiranje novih biljaka, genska<br />
terapija, itd.) potrebni su vektori za ekspresiju<br />
gena u različitim vrstama eukariotskih stanica<br />
• većina eukariotskih vektora su tzv. shuttle<br />
vektori - vektori prenositelji<br />
• sadrže ishodište replikacije i selektivni biljeg za E. coli<br />
i željenu eukariotsku stanicu<br />
• konstrukcija i analiza rekombinantne DNA obavlja se u<br />
E. coli zbog jednostavnosti i dostupnosti mnogih<br />
razvijenih metoda<br />
GM2005
Kvaščev shuttle vektor<br />
GM2005
Kvaščevi vektori<br />
• YIp – yeast<br />
integrative plasmid<br />
(kvaščev integrativni<br />
plazmid)<br />
• ne može opstati kao<br />
neovisni plazmid u<br />
stanici kvasca jer<br />
nema ishodišta<br />
replikacije<br />
• za uvođenje gena u<br />
kvaščev kromosom<br />
GM2005
Kvaščevi vektori<br />
• YEp – yeast episomal<br />
plasmid (kvaščev<br />
episomalni plazmid)<br />
• izveden iz prirodnog<br />
kvaščevog plazmida 2µ<br />
• može se autonomno<br />
replicirati ili ugraditi u<br />
kvaščev genom<br />
• visoko kopijski vektor –<br />
20-100 kopija po stanici<br />
• za povećanu ekspresiju<br />
gena u kvascu<br />
YEp24<br />
GM2005
Kvaščevi vektori<br />
• YCp – yeast centromeric<br />
plasmid (kvaščev<br />
centromerni plazmid)<br />
• sadrži centromerne<br />
sljedove<br />
• ponaša se kao minikromosom<br />
• mitotički stabilan u odsutnosti<br />
selektivnog pritiska<br />
• segregacija tijekom mejoze<br />
• nizak broj kopija po stanici<br />
(1-3)<br />
• za ekspresiju ciljano<br />
mutiranih gena u prirodnim<br />
koncentracijama<br />
GM2005
<strong>Vektori</strong> za kloniranje u biljaka<br />
• najčešće se koriste virus mozaične bolesti duhana i<br />
plazmid Ti (tumor inducing) iz bakterije Agrobacterium<br />
tumefaciens<br />
• Agrobacterium tumefaciens uzrokuje tumore u biljaka<br />
integracijom 8 gena s plazmida Ti u genom biljke<br />
• biljni vektori temeljeni na plazmidu Ti nemaju gene koji<br />
uzrokuju tumor, ali nose gene za integraciju klonirane<br />
DNA u genom biljke<br />
• rekombinantni vektor se uvodi u biljku namakanjem<br />
sjemenki u kulturi Agrobacterium tumefaciens ili se<br />
ubacuje u stanice od kojih u kulturi nastaje cijela biljka<br />
• selektivni biljezi omogućuju selekciju samo onih stanica<br />
koje nose plazmidnu DNA<br />
GM2005
GM2005
<strong>Vektori</strong> za stanice sisavaca<br />
• Simian virus 40 (SV40)<br />
• mali tumorski DNA virus<br />
• za kloniranje malih fragmenata DNA<br />
• uzrokuje prolaznu (transientnu) ekspresiju klonirane DNA<br />
• Retrovirus<br />
• jl RNA virus<br />
• sadrži gen za reverznu transkriptazu koja sintetizira dl DNA<br />
na kalupu RNA<br />
• DNA se ugrađuje u genom domaćina<br />
• inficira stanice koje se aktivno dijele<br />
• Adenovirus<br />
• dl DNA virus<br />
• s vrlo velikom učinkovitošću inficira mnoge tipove stanica s<br />
malom vjerojatnošću uzrokovanja bolesti<br />
• ne mora inficirati samo stanice koje se aktivno dijele<br />
GM2005
Retrovirusni vektori<br />
• koriste se u genskoj terapiji<br />
• delecija esencijalnih gena gag, pol<br />
i env onemogućava replikaciju<br />
virusa, no virus ostaje infektivan<br />
• umjesto gena gag, pol i env<br />
ugrađuje se strana DNA<br />
(ekspresijska kaseta)<br />
• za proizvodnju rekombinantnih<br />
virusnih čestica koriste se posebne<br />
stanične linije<br />
• rekombinantni virusi ubacuju se u<br />
ciljnu stanicu, gdje se nakon<br />
reverzne transkripcije u citosolu,<br />
DNA nasumično ugrađuje u stanični<br />
genom i potom eksprimira<br />
GM2005
Adenovirusni vektori<br />
• delecija ranog gena E1<br />
onemogućava replikaciju virusa<br />
• ako je potrebno više mjesta za<br />
insert – delecija ranog gena E3<br />
• za proizvodnju rekombinantnih<br />
virusnih čestica koriste se stanične<br />
linije s funkcionalnim E1 genom<br />
• rekombinantni virusi ulaze u ciljnu<br />
stanicu putem specifičnih<br />
receptora<br />
• dl DNA ulazi u jezgru gdje djeluje<br />
izvan kromosoma i eksprimira<br />
produkt iz ekspresijske kasete<br />
GM2005
Change language