Animacije i zadaci.pdf
Animacije i zadaci.pdf
Animacije i zadaci.pdf
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Kolegij Genetičko inženjerstvo<br />
<strong>Animacije</strong> i <strong>zadaci</strong><br />
doc. dr. sc. Gordana Maravić<br />
Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju<br />
Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta<br />
GM2005
Biološke animacije<br />
• http://www.rvc.ac.uk/review/DNA_1/Index.cfm<br />
• http://bcs.whfreeman.com/lodish5e/<br />
• http://www.dnalc.org/cloning.html<br />
• http://en.sciencegeneration.com/biotkit.php?biokit_id=1&i=1#<br />
• http://www.mhhe.com/biosci/genbio/maderhuman<br />
6/student/olc/vrl_animation-quizzes.html<br />
• http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/T<br />
ransgenicCrops/animation.html<br />
GM2005
Zadatak 1<br />
• Razgradnja fragmenta DNA veličine 15 kb trima<br />
restrikcijskim enzimima daje fragmente veličina<br />
navedenih u tablici. Odredite položaj restrikcijskih<br />
mjesta u fragmentu DNA!<br />
BamHI EcoRI PstI<br />
BamHI<br />
EcoRI<br />
BamHI<br />
PstI<br />
EcoRI<br />
PstI<br />
14 12 8 11 8 7 6<br />
1 3 7 3 6 5 5<br />
1 1 3 3<br />
BamHI<br />
EcoRI<br />
PstI<br />
1<br />
GM2005
Rješenje zadatka 1<br />
0 3 6 9 12 15 kb<br />
14 kb 1 kb<br />
BamHI<br />
12 kb 3 kb<br />
3 kb 12 kb<br />
EcoRI<br />
EcoRI<br />
BamHI<br />
3 kb 11 kb 1 kb<br />
EcoRI + BamHI<br />
EcoRI PstI BamHI<br />
3 kb 5 kb 6kb 1 kb<br />
EcoRI + BamHI + PstI<br />
GM2005
Zadatak 2<br />
• Linearni fragment DNA veličine 100 kb obrađen je<br />
polinukleotid-kinazom uz dodatak radioaktivnog ATP.<br />
Razgradnja s EcoRI daje fragmente veličina: 8*, 10, 15, 23<br />
i 44* kb. Razgradnja s BamHI daje fragmente veličina: 11*,<br />
14, 16, 24.5 i 34.5* kb. Razgradnja istovjetnog<br />
neradioaktivnog fragmenta s oba enzima daje fragmente<br />
veličina 3, 4.5, 5.5, 7, 8, 9.5, 10.5, 17.5 i 34.5 kb.<br />
Odredite položaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!<br />
EcoRI<br />
BamHI<br />
8 10 23<br />
15 44<br />
8 3 7 17.5 5.5 10.5 4.5 9.5 34.5<br />
11 24.5<br />
16 14<br />
34.5<br />
GM2005
• Zadatak 3:<br />
Koliko je pojedinačnih klonova potrebno za<br />
izradu genomske knjižnice ljudskog<br />
genoma u različitim vektorima ako je<br />
vjerojatnost pojavljivanja svakog gena u<br />
knjižnici 99%?<br />
Plazmidni vektori<br />
stabilni inserti do 5 kb<br />
• N = ln (1-P) / ln (1-f)<br />
• Za ljudski genom i standardni<br />
plazmidni vektor:<br />
• P –99% ili0.99<br />
• f – 5 kb/4,400,000 kb =<br />
1.14 x 10 -6<br />
N = [ln 0.01]/[ln 0.99999886]<br />
= -4.6/-1.14 x 10 -7<br />
= 40 350 877 pojedinačnih<br />
klonova<br />
GM2005
• Za ljudski genom i standardni<br />
kozmid:<br />
• P –99% ili0.99<br />
• f – 35 kb/4,400,000 kb = 7.95<br />
x 10 -6<br />
N = [ln 0.01]/[ln 0.99999205]<br />
= -4.6/-7.95 x 10 -6<br />
= 578 616 pojedinačnih klonova<br />
Inserti 20 – 35 kb<br />
GM2005
• Za ljudski genom i standardni YAC:<br />
• P –99% ili0.99<br />
• f – 500 kb/4,400,000 kb = 1.4 x 10 -4<br />
N = [ln 0.01]/[ln 0.999886]<br />
= -4.6/-1.4 x 10 -4<br />
= 40 350 pojedinačnih klonova<br />
GM2005
Zadatak 4<br />
• Želite proučavati izozim piruvat-kinaze specifičan<br />
za jetru. Enzim je pročišćen (Mw 62 000) i<br />
dobiven je peptidni slijed amino-kraja proteina.<br />
Razgradnjom kimotripsinom dobiven je kraći oblik<br />
enzima vrlo slične veličine (Mw 60 000), kao i<br />
slijed još jednog oligopeptida. Koristeći navedene<br />
informacije predložite sondu koja bi se mogla<br />
koristiti za pretraživanje knjižnice i nalaženje<br />
gena za piruvat-kinazu. Objasnite vaš izbor.<br />
• Peptid 1 : Met-Ala-His-Val-Arg-Arg-Ala-Ser-Val<br />
• Peptid 2: Glu-Ser-Arg-Trp<br />
GM2005
Rješenje zadatka 4<br />
Peptid 1 :<br />
Met-Ala-His-Val-Arg-Arg-Ala-Ser-Val<br />
Br. kodona: 1 4 2 4 6 6 4 4 4<br />
Peptid 2:<br />
Glu-Ser-Arg-Trp<br />
Br. kodona: 2 4 6 1<br />
Dio peptida 1 - manji broj mogućih kombinacija za<br />
odabir oligonukleotida<br />
GM2005
Zadatak 5<br />
• Koimunoprecipitacijom želite istražiti koji<br />
dio molekule imunoglobulina (Ig) stupa u<br />
interakciju s ciljnim proteinom te ste stoga<br />
izradili nekoliko delecijskih mutanata<br />
molekule Ig uz dodatak Flag epitopa na N-<br />
kraj proteina. Koja je svrha dodavanja Flag<br />
epitopa? Zašto ne koristiti samo anti-Ig<br />
protutijela za koimunoprecipitaciju?<br />
GM2005
Rješenje zadatka 5<br />
• Flag epitop omogućava specifično prepoznavanje<br />
rekombinantnih mutantnih oblika molekule Ig<br />
• Anti-Ig protutijela bi se mogla vezati na epitope<br />
koji stupaju u interakciju s ciljnim proteinom te<br />
tako onemogućiti stvaranje kompleksa – lažni<br />
negativni rezultat<br />
• Delecijom pojedinih dijelova molekule Ig gube se<br />
pojedini epitopi pa postoji mogućnost da anti-Ig<br />
protutijela ne prepoznaju neki od mutanata<br />
GM2005
Zadatak 6<br />
Nedavno ste klonirali Idh gen iz laboratorijskog štakora i<br />
pokušavate identificirati isti gen u vrsti divljeg glodavca<br />
iz južne Amerike. Kojim ćete redoslijedom provesti<br />
sljedeće postupke?<br />
A. Odabrati klon koji hibridizira sa sondom koja se temelji na<br />
nukleotidnom slijedu štakorskog gena Idh<br />
B. Uzgojiti transformirane stanice na selektivnom mediju<br />
C. Povezati genomsku i vektorsku DNA uporabom DNA ligaze<br />
D. Pokidati genomsku i vektorsku DNA restrikcijskim enzimom<br />
E. Hibridizirati klonove obilježenom sondom koja se temelji na<br />
nukleotidnom slijedu štskorskog gena Idh<br />
F. transformirati bakterijske stanice rekombinantnim<br />
plazmidima<br />
Odgovor:<br />
D -C -F -B -E -A<br />
GM2005
Zadatak 7<br />
• Plazmid pBR322 često se koristi kao vektor za kloniranje.<br />
Sadrži gene za rezistenciju na ampicilin i tetraciklin kao<br />
selektivne biljege. U jednom je pokusu gen ubačen u<br />
restrikcijsko mjesto unutar gena za rezistenciju na<br />
ampicilin i stanice E. coli su transformirane<br />
rekombinantnim vektorom. Da bi se odredilo koje stanice<br />
sadrže vektor s kloniranim genom kolonije su uzgajane na<br />
mediju sa i bez antibiotika. Dobiveni su sljedeći rezultati:<br />
bez antibiotika<br />
+ tetraciklin + tetraciklin+ampicilin<br />
GM<br />
GM2005
Zadatak 7<br />
• Koje kolonije ne sadrže ni “prazni” niti plazmid s<br />
ugrađenim genom? Zašto?<br />
Kolonije 3, 5 i 7 jer rastu isključivo na podlozi bez<br />
antibiotika što ukazuje na nedostatak gena za rezistenciju<br />
na antibiotike, a time i na nedostatak plazmida.<br />
• Koje kolonije sadrže samo “prazni” plazmid? Objasnite!<br />
Kolonije 2, 4, 8 i 9 jer im gen za ampicilin nije inaktiviran<br />
ugradnjom strane DNA pa mogu rasti na podlozi s oba<br />
antibiotika.<br />
• Koje kolonije sadrže plazmid s ugrađenim genom? Zašto?<br />
Kolonije 1 i 6 jer rastu na podlozi s tetraciklinom dok na<br />
podlozi s oba antibiotika ne mogu rasti jer im je gen za<br />
rezistenciju na ampicilin inaktiviran ugradnjom strane DNA.<br />
GM2005
Zadatak 8<br />
• Plazmid je razgrađen restrikcijskim enzimima EcoRI<br />
i HindIII. Razgradnja s EcoRI daje fragmente veličine<br />
30, 15 i 5 kb, razgradnja s HindIII daje fragment<br />
veličine 50 kb, a razgradnja s oba enzima daje<br />
fragmente veličine 20, 15, 10 i 5 kb. Odredite<br />
položaj restrikcijskih mjesta na plazmidu.<br />
2 mogućnosti:<br />
GM2005
Zadatak 9<br />
• Na slici je prikazana restrikcijska mapa<br />
za EcoRI gena X:<br />
1 kb 0.7 kb 2 kb<br />
• Nacrtajte obrazac dobiven elektroforezom u<br />
agaroznom gelu<br />
• za mutantni gen kojem nedostaje EcoRI mjesto<br />
koje daje fragmente veličine 1 i 0.7 kb (mutA)<br />
• Za mutantni gen koji sadrži novo EcoRI mjesto<br />
unutar fragmenta od 2 kb kao što je označeno na<br />
slici (mut B)<br />
1.7 kb 0.3 kb mutB<br />
GM2005
Rješenje zadatka 9<br />
2.0<br />
1.0<br />
0.7<br />
gen X mutA mutB<br />
1.7<br />
0.3<br />
• MutA ima samo<br />
jedno EcoRI<br />
mjesto i daje dva<br />
fragmenta<br />
veličine 2 i 1.7<br />
kb<br />
• MutB daje 4<br />
fragmenta<br />
veličine 1.7, 1,<br />
0.7 i 0.3 kb zbog<br />
dodatnog EcoRi<br />
mjesta<br />
GM2005
Zadatak<br />
10<br />
• Koje od restrikcijskih<br />
endonukleaza<br />
navedenih u tablici<br />
kreiraju tupe krajeve?<br />
• Koje su od njih<br />
izoshizomeri (enzimi<br />
koji imaju isto mjesto<br />
prepoznavanja, ali ne<br />
kidaju nužno na istom<br />
mjestu)?<br />
• koje su od njih<br />
izokaudameri (kreiraju<br />
identične krajeve)?<br />
GM2005
Rješenje zadatka 10<br />
• Tupe krajeve kreiraju:<br />
• AluI, EcoRV, HaeIII, MspI, PvuII<br />
• Izoshizomeri:<br />
• HpaII i MspI<br />
• Izokaudameri:<br />
• BamHi i BglII<br />
• HpaII i TaqI<br />
• SalI i XhoI<br />
GM2005
Zadatak 11<br />
• Fragment DNA dobiven razgradnjom genomske<br />
DNA restrikcijskim enzimom EcoRI združen je s<br />
plazmidnim vektorom lineariziranim istim RE tako<br />
da može doći do spajanja ljepljivih krajeva.<br />
Smjesi je dodana T4 DNA ligaza. Navedite sve<br />
moguće produkte ligacijske reakcije!<br />
• Odgovor:<br />
• Linearne molekule DNA nastale povezivanjem isključivo<br />
fragmenta, isključivo vektora te kombinacijom vektora<br />
i fragmenta – svaka u dvije moguće orijentacije<br />
• Kružne molekule DNA nastale povezivanjem isključivo<br />
fragmenta, isključivo vektora te kombinacijom vektora<br />
i fragmenta – svaka u dvije moguće orijentacije<br />
GM2005
Zadatak 12<br />
• Slijed nukleotida u višestrukom mjestu za<br />
kloniranje sadrži mjesta prepoznavanja RE<br />
BamHI, EcoRI, PstI i SalI. Označite položaj<br />
ovih mjesta na nukleotidnom slijedu:<br />
-GAATTCGGATCCGTCGACCTGCAG-<br />
EcoRI BamHI SalI PstI<br />
GM2005
Zadatak 13<br />
• Genom kvasca Saccharomyces cerevisiae<br />
velik je 13.5x10 6 pb. Ako je genomska<br />
knjižnica izrađena u fagu λ koji može primiti<br />
inserte veličine 16 kb, koliko individualnih<br />
klonova je potrebno pretražiti da bi se sa<br />
sigurnošću od 99% našao određeni fragment?<br />
• Odgovor:<br />
• N=ln(1-P)/ln(1-f); P=0.99; f=16 kb/13.5x10 3 kb<br />
• N=3838-3883<br />
GM2005
Change language