Enzimi za kloniranje.pdf
Enzimi za kloniranje.pdf
Enzimi za kloniranje.pdf
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Kolegij Genetičko inženjerstvo<br />
Program<br />
• enzimi, vektori, domaćini<br />
• dobivanje, modifikacija, obilježavanje<br />
DNA<br />
• strategije kloniranja<br />
• proizvodnja rekombinantnih proteina<br />
• genske knjižnice<br />
• mutagene<strong>za</strong><br />
• inaktivacija gena<br />
• transgenične životinje i biljke,<br />
GMO<br />
• <strong>kloniranje</strong> čitavih organi<strong>za</strong>ma<br />
• genetičko inženjerstvo u<br />
biotehnološkoj proizvodnji<br />
bioterapeutika<br />
• transgenska tehnologija u<br />
funkcijskoj genomici<br />
GM2005
Kolegij Genetičko inženjerstvo<br />
Literatura<br />
• G. Maravić. CD s predavanjima.<br />
• Desmond S. T. Nicholl, An introduction to genetic<br />
engineering, 2 nd ed., Cambridge Univeristy Press, 2003.<br />
ISBN: 0-521-00471-3. (Algoritam – 220 kn)<br />
• S. B. Primrose, R. M. Twyman, R. W. Old, Principles of gene<br />
manipulation, 6 th ed., Blackwell Science, ISBN: 0-632-05954-0.<br />
(Algoritam - 360 kn)<br />
GM2005
Kolegij Genetičko inženjerstvo<br />
<strong>Enzimi</strong> <strong>za</strong> molekularno <strong>kloniranje</strong><br />
doc. dr. sc. Gordana Maravić<br />
Zavod <strong>za</strong> biokemiju i molekularnu biologiju<br />
Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta<br />
GM2005
Genetičko inženjerstvo<br />
tehnologija<br />
koja uključuje<br />
kidanje,<br />
mijenjanje i<br />
združivanje<br />
molekula DNA<br />
pomoću<br />
enzima<br />
kao što su<br />
Restrikcijske<br />
endonukleaze<br />
jest<br />
DNA<br />
liga<strong>za</strong><br />
koristi<br />
se <strong>za</strong><br />
može se koristiti <strong>za</strong><br />
<strong>za</strong>htijeva četiri<br />
osnovna koraka<br />
stvaranje<br />
fragmenata DNA<br />
združivanje s<br />
molekulom<br />
nosačem (vektor)<br />
unošenje u<br />
stanicu domaćina<br />
odabir željenog<br />
slijeda<br />
je poznato i kao<br />
znanosti<br />
• <strong>kloniranje</strong> gena<br />
• tehnologija<br />
rekombinantne DNA<br />
• molekularno <strong>kloniranje</strong><br />
primjenjuje se u<br />
biotehnologiji<br />
medicini i<br />
farmaciji<br />
ali postavlja i neka<br />
pravna i etička<br />
pitanja<br />
proi<strong>za</strong>šlo je iz<br />
mikrobne i<br />
molekularne<br />
genetike<br />
prvi je put<br />
ostvareno<br />
1972. na<br />
sveučilištu<br />
Stanford<br />
GM2005
Razvoj genetičkog inženjerstva<br />
1900<br />
1910<br />
1920<br />
1930<br />
1940<br />
1950<br />
1960<br />
1970<br />
1980<br />
1990<br />
2000<br />
MENDELOVA ILI KLASIČNA GENETIKA 1958.<br />
1962.<br />
1965.<br />
Genetičko Mapiranje<br />
Transformacija<br />
MIKROBNA GENETIKA<br />
Molekularna genetika<br />
GENSKA MANIPULACIJA<br />
Razvoj tehnika<br />
Primjene<br />
1968.<br />
1969.<br />
1975.<br />
1978.<br />
1980.<br />
1993.<br />
GM2005
Temeljna otkrića<br />
– Nobelove nagrade<br />
• 1958. J. Lederberg, G. W. Beadle, E. Tatum<br />
• genska rekombinacija u bakerija, djelovanje gena<br />
• 1962. F. H. C. Crick, J. D. Watson, M. H. F. Wilkins<br />
• 3D struktura DNA<br />
• 1965. F. Jacob, A. M. Lwoff, J. L. Monod<br />
• operonska teorija <strong>za</strong> gensku ekspresiju u bakterija<br />
• 1968. H. G. Khorana, R. W. Holley<br />
• otkriće genetičkog koda i njegova uloga u sintezi proteina<br />
• 1969. M. Delbrück, A. D. Hershey, S. E. Luria<br />
• struktura i replikacija virusa<br />
• 1975. D. Baltimore, R. Dulbecco, H. M. Temin<br />
• reverzna transkripta<strong>za</strong> i tumorski virusi<br />
• 1980. P. Berg, W. Gilbert, F. Sanger<br />
• tehnologija rekombinantne DNA, sekvenciranje DNA<br />
• 1993. K. B. Mullis, M. SMith<br />
• PCR, ciljana mutagene<strong>za</strong><br />
GM2005
Primjena genetičkog inženjerstva<br />
u farmaciji i medicini<br />
životinjski<br />
modeli<br />
bolesti<br />
profiliranje<br />
klonirani P450<br />
farmakogenomika<br />
genetičke<br />
bolesti<br />
dijagnostičke n.k.<br />
infektivne<br />
bolesti<br />
biljke<br />
mikrobi<br />
male<br />
terapeutske<br />
molekule<br />
dijagnostički<br />
proteini<br />
mikrobi<br />
FARMACIJA I<br />
MEDICINA<br />
terapeutski<br />
proteini<br />
životinje<br />
vakcine<br />
biljke<br />
terapeutske n.k.<br />
mikrobi<br />
DNA<br />
vakcine<br />
genska<br />
terapija<br />
popravak<br />
gena<br />
protusmislene<br />
n.k.<br />
GM2005
Razlike u genskoj ekspresiji<br />
između prokariota i eukariota<br />
Prokarioti<br />
• transkripcija i translacija odvijaju se u citosolu i usko su pove<strong>za</strong>ne<br />
• mRNA je policistronska - kodira <strong>za</strong> nekoliko polipeptida<br />
Eukarioti<br />
• geni sadrže introne i eksone<br />
• transkripcija se odvija u jezgri, a<br />
translacija u citoplazmi<br />
• nezrele molekule RNA podliježu<br />
sazrijevanju<br />
• mRNA je monocistronska - kodira<br />
<strong>za</strong> jedan polipeptid<br />
GM2005
Kontrola<br />
transkripcije kod<br />
prokariota<br />
• represija ili<br />
indukcija<br />
• lac operon<br />
GM2005
<strong>Enzimi</strong> <strong>za</strong> molekularno<br />
<strong>kloniranje</strong><br />
• Restrikcijske endonukleaze<br />
• Druge nukleaze<br />
• Metil-transferaze<br />
• Polimeraze<br />
• <strong>Enzimi</strong> koji modificiraju krajeve<br />
DNA<br />
• DNA liga<strong>za</strong><br />
GM2005
Restrikcijske endonukleaze<br />
• Dio restrikcijsko-modifikacijskog sustava bakterija<br />
• endonuklea<strong>za</strong> i metila<strong>za</strong> dijele isto mjesto prepoznavanja<br />
• metila<strong>za</strong> metilira vlastitu DNA <strong>za</strong> <strong>za</strong>štitu od djelovanja RE koja<br />
kida nemodificiranu stranu DNA<br />
• enzimi koji prepoznaju točno određeni slijed nukleotida<br />
od 4 do 8 ba<strong>za</strong> u dvolančanoj DNA i kidaju oba lanca<br />
dvostruke uzvojnice<br />
• TIP I - kidaju DNA >1000 pb dalje od mjesta prepoznavanja<br />
• TIP III - kidaju DNA 24 do 26 pb nizvodno od mjesta<br />
prepoznavanja<br />
• TIP II - kidaju DNA unutar samog mjesta prepoznavanja<br />
koje ima dvostruku rotacijsku simetriju (palindrom)<br />
GM2005
Restrikcijske endonukleaze<br />
• do sada je otkriveno oko 3000 RE koji prepoznaju preko 200<br />
različitih sljedova (IZOSHIZOMERI – prepoznaju isti slijed)<br />
• nomenklatura: EcoRI: Escherichia coli RYI3; I - prva izolirana RE<br />
EcoRI<br />
EcoRV<br />
GM2005
Mjesta prepoznavanja RE<br />
HaeIII PstI EcoRI<br />
5’-GGCC-3’ 5’-CTGCAG-3’ 5’-GAATTC-3’<br />
GGCC<br />
CCGG<br />
CTGCAG<br />
GACGTC<br />
GAATTC<br />
CTTAAG<br />
3’- izbočeni 5’- izbočeni<br />
tupi krajevi<br />
ljepljivi krajevi<br />
GM2005
Varijacije restrikcijskih mjesta<br />
• mnogi različiti RE proizvode kompatibilne<br />
ljepljive krajeve<br />
• AgeI (A/CCGGT) i AvaI (C/CCGGG) proizvode<br />
kompatibilne 5’ krajeve<br />
• ljepljivi krajevi mogu se spojiti ligazom –<br />
dobiveni hibridni slijed često mogu kidati RE<br />
koji prepoznaju 4 pb:<br />
• hibridni slijed ACCGGG prepoznaju:<br />
HpaII (C/CGG), NciI (CC/GGG), ScrFI (CC/NGG)<br />
GM2005
Kreiranje novih restrikcijskih<br />
mjesta<br />
GAATTC<br />
CTTAAG<br />
EcoRI<br />
XmnI<br />
(GAANN/NNTTC)<br />
GAATTAATTC<br />
CTTAATTAAG<br />
G AATTC<br />
CTTAA G<br />
DNA<br />
polimera<strong>za</strong><br />
GAATT AATTC<br />
CTTAA TTAAG<br />
DNA<br />
liga<strong>za</strong><br />
GAATTAATTC<br />
CTTAATTAAG<br />
GAATT AATTC<br />
CTTAA TTAAG<br />
G AATTC<br />
CTTAA G<br />
isto kao i EcoRI<br />
Tsp09I<br />
(/AATT)<br />
AseI<br />
(AT/TAAT)<br />
ili MseI<br />
(T/TAA)<br />
GAAT TAATTC<br />
CTTAAT TAAG<br />
GM<br />
GM2005
Aktivnost restrikcijskih enzima<br />
• ovisi o:<br />
• pH (7.2- 8.5)<br />
• Mg 2+ ionima (5-30 mM)<br />
• koncentraciji soli (mnoge RE 50-150 mM NaCl ili KCl)<br />
• BSA – stabilizira RE, štiti od razgradnje protea<strong>za</strong>ma, nespecifične<br />
adsorpcije ili štetnih faktora okoliša (toplina, površinska napetost)<br />
• glicerolu – <strong>za</strong>štita od smr<strong>za</strong>vanja na -20ºC; do 5-10%<br />
• temperaturi – većina RE ima optimalnu aktivnost na 37ºC, neki na<br />
25ºC<br />
• volumenu reakcijske smjese<br />
• viskozna otopina DNA inhibira difuziju RE i smanjuje aktivnost<br />
• razrijeđene otopine s koncentracijom DNA ispod Km smanjuju<br />
aktivnost RE<br />
• preporuča se volumen 10- 50 µL po µg DNA<br />
GM2005
Aktivnost restrikcijskih enzima<br />
• “Star activity” – neželjeno kidanje DNA na<br />
mjestima koja su slična mjestu prepoznavanja u<br />
uvjetima koji nisu optimalni <strong>za</strong> aktivnost RE:<br />
• neprikladan pH ili ionska jakost<br />
• neprikladan tip iona kofaktora (Mn 2 + naspram Mg 2+ )<br />
• povećana koncentracija glicerola, etilen-glikola<br />
• izražava se u jedinicama<br />
• 1U je količina RE koja će potpuno razgraditi 1 µg<br />
DNA <strong>za</strong> 1 h na optimalnoj temperaturi<br />
GM2005
Izrada restrikcijske karte<br />
• određivanje položaja restrikcijskih mjesta unutar fragmenta DNA<br />
kidanjem različitim restrikcijskim enzimima pojedinačno i u<br />
kombinaciji<br />
• Zadatak:<br />
• Razgradnja fragmenta DNA veličine 15 kb trima restrikcijskim enzimima<br />
daje fragmente veličina navedenih u tablici. Odredite položaj restrikcijskih<br />
mjesta u fragmentu DNA!<br />
BamHI EcoRI PstI<br />
BamHI<br />
EcoRI<br />
BamHI<br />
PstI<br />
EcoRI<br />
PstI<br />
14 12 8 11 8 7 6<br />
1 3 7 3 6 5 5<br />
1 1 3 3<br />
BamHI<br />
EcoRI<br />
PstI<br />
1<br />
GM2005
Izrada restrikcijske karte<br />
0 3 6 9 12 15 kb<br />
14 kb 1 kb<br />
BamHI<br />
12 kb 3 kb<br />
3 kb 12 kb<br />
EcoRI<br />
EcoRI<br />
BamHI<br />
3 kb 11 kb 1 kb<br />
EcoRI + BamHI<br />
EcoRI PstI BamHI<br />
3 kb 5 kb 6kb 1 kb<br />
EcoRI + BamHI + PstI<br />
GM2005
Izrada restrikcijske karte<br />
• Zadatak: Linearni fragment DNA veličine 100 kb obrađen<br />
je polinukleotid-kinazom uz dodatak radioaktivnog ATP.<br />
Razgradnja s EcoRI daje fragmente veličina: 8*, 10, 15, 23<br />
i 44* kb. Razgradnja s BamHI daje fragmente veličina: 11*,<br />
14, 16, 24.5 i 34.5* kb. Razgradnja istovjetnog<br />
neradioaktivnog fragmenta s oba enzima daje fragmente<br />
veličina 3, 4.5, 5.5, 7, 8, 9.5, 10.5, 17.5 i 34.5 kb.<br />
Odredite položaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!<br />
EcoRI<br />
BamHI<br />
8 10 23<br />
15 44<br />
8 3 7 17.5 5.5 10.5 4.5 9.5 34.5<br />
11 24.5<br />
16 14<br />
34.5<br />
GM2005
Druge nukleaze<br />
Nuklea<strong>za</strong> Bal 31<br />
• 3’- egzonuklea<strong>za</strong> +<br />
endonuklea<strong>za</strong><br />
•prisutna u višoj<br />
koncentraciji skraćuje<br />
DNA s oba kraja<br />
Egzonuklea<strong>za</strong> III<br />
• stvara 5’ istaknute<br />
krajeve<br />
Egzonuklea<strong>za</strong> λ<br />
• stvara 3’ istaknute<br />
krajeve<br />
DNa<strong>za</strong> I<br />
•nasumično kida jl ili dl<br />
DNA<br />
Nuklea<strong>za</strong> S1<br />
• kida isključivo jl DNA ili<br />
RNA<br />
RNa<strong>za</strong> - kida RNA<br />
5’<br />
3’<br />
5’<br />
3’<br />
GM2005
Metil-transferaze<br />
• mnogi laboratorijski sojevi E. coli sadrže metiltransferaze<br />
Dam (GA*TC) i Dcm (CC*AGG i CC*TGG<br />
• ako je DNA izolirana iz takvog soja, bit će otporna na<br />
djelovanje nekih RE jer mjesta prepoznavanja sadrže<br />
metilirane nukleotide<br />
• MboI i Sau3A prepoznaju isti slijed GATC, no MboI ne kida DNA iz<br />
Dam + i Dcm + soja<br />
• metilacija utječe na učinkovitost transformacije<br />
• DNA iz Dam + soja teže će transformirati Dam - bakteriju<br />
• inicijacija replikacije ihibirana je kad je plazmid metiliran<br />
na Dam mjestima<br />
• Dam-modificirani plazmid može se replicirati samo jednom u Dam -<br />
soju i nakon toga replikacija prestaje<br />
GM2005
DNA liga<strong>za</strong><br />
• popravlja jednolančani lom u okosnici šećer-fosfat<br />
između dviju susjednih nukleotida u molekuli DNA<br />
T4 DNA liga<strong>za</strong><br />
ATP<br />
PPi<br />
P<br />
P P OH P P<br />
Enzim-AMP Enzim AMP<br />
A<br />
P<br />
P<br />
P P OH P P<br />
P P P P P<br />
B B B B B B<br />
B B B B B B<br />
B B B B B B<br />
B B B B B B<br />
B B B B B B<br />
B B B B B B<br />
P P P P P<br />
P P P P P<br />
P P P P P<br />
GM2005
DNA liga<strong>za</strong><br />
• u molekularnom kloniranju najčešće se koristi DNA<br />
liga<strong>za</strong> iz bakteriofaga T4 (T4 DNA liga<strong>za</strong>)<br />
• povezivanje krajeva DNA nastalih razgradnjom<br />
restrikcijskim enzimima<br />
• tupi krajevi teže se povezuju od ljepljivih krajeva<br />
• optimalna temperatura reakcije je 37ºC, no pri toj<br />
su temperaturi vodikove veze između ljepljivih<br />
krajeva nestabilne<br />
• ljepljivi krajevi – 3 h na 22ºC ili 16 h na 16ºC (moderna<br />
varijanta – 5 min. na sobnoj temperaturi u posebnom<br />
puferu)<br />
• tupi krajevi – 4-16 h na 22ºC<br />
GM2005
Tvorba rekombinantne<br />
molekule DNA<br />
EcoRI<br />
EcoRI<br />
5’-AATTC<br />
G<br />
5’-AATTC<br />
G<br />
G<br />
CTTAA-5’<br />
DNA liga<strong>za</strong><br />
G<br />
CTTAA-5’<br />
GAATTC<br />
CTTAAG<br />
GAATTC<br />
CTTAAG<br />
GM2005
Polimeraze<br />
• DNA-polimera<strong>za</strong> I<br />
• polimerazna, 3’5’ i 5’3’ egzonukleazna aktivnost<br />
• “Nick” translacija<br />
• lom jednog lanca dl DNA nastaje spontano ili<br />
djelovanjem niskih koncentracija DNaze u reakcijskoj<br />
smjesi<br />
• DNA polimera<strong>za</strong> I dodaje nove dNTP i razgrađuje lanac<br />
5’3’ egzonukleaznom aktivnošću – jl lom (“nick”)<br />
tako se pomiče uzduž molekule DNA<br />
• visoko obilježena molekula DNA nastaje dodatkom<br />
jednog radioaktivno obilježenog dNTP (obično dATP<br />
obilježen radioaktivnim fosforom – 32 P ili 33 P)<br />
GM2005
Obilježavanje DNA<br />
“nick” translacijom<br />
Ako je jedan od dNTP<br />
u reakcijskoj smjesi<br />
radioaktivno<br />
obilježen,<br />
djelovanjem DNApolimeraze<br />
I nastaje<br />
visoko obilježena<br />
molekula DNA<br />
DNA-polimera<strong>za</strong> I<br />
jednolančani lom<br />
(nick)<br />
mjesto jl loma<br />
GM2005
Polimeraze<br />
• Klenowljev fragment<br />
• dio DNA-polimeraze I kojem nedostaje 5’3’<br />
egzonukleazna aktivnost<br />
• u reakcijskim uvjetima 3’5’ egzonukleazna<br />
aktivnost je suprimirana<br />
• uporaba pri sekvenciranju Sangerovom dideoksi<br />
metodom i <strong>za</strong> obilježavanje DNA metodom<br />
produljenja ishodnice (primer extension,<br />
oligolabelling)<br />
GM2005
Obilježavanje DNA metodom<br />
produljenja ishodnice<br />
• denaturacija —<br />
jednolančana DNA<br />
5’<br />
3’<br />
• dodatak ishodnice —<br />
slobodan 3’-OH kraj<br />
5’<br />
HO<br />
3’<br />
5’<br />
• Klenowljev fragment<br />
DNA-polimeraze I<br />
nastavlja sintezu<br />
komplementarnog lanca<br />
produžujući ishodnicu –<br />
ugradnja radioaktivnog<br />
dATP daje obilježenu<br />
molekulu s vrlo visokom<br />
specifičnom aktivnošću<br />
DNA-polimera<strong>za</strong> I (Klenow)<br />
ishodnica<br />
ishodnica<br />
GM2005
Polimeraze<br />
• Reverzna transkripta<strong>za</strong><br />
• RNA-ovisna DNApolimera<strong>za</strong><br />
• nema egzonukleazne<br />
aktivnosti<br />
• koristi se <strong>za</strong> dobivanje<br />
cDNA iz mRNA<br />
GM2005
<strong>Enzimi</strong> koji modificiraju<br />
krajeve DNA<br />
• Alkalna fosfata<strong>za</strong><br />
• bakterijska alkalna fosfata<strong>za</strong> (BAP)<br />
• AP iz goveđeg crijeva<br />
(CIP – calf intestinal phosphatase)<br />
• uklanja fosfatnu skupinu s 5’-kraja DNA<br />
• sprečavanje neželjene ligacije (recirkulari<strong>za</strong>cija<br />
plazmida razgrađenog jednim restrikcijskim<br />
enzimom)<br />
• koristi se i prije uporabe polinukleotid kinaze<br />
prilikom obilježavanja DNA<br />
GM2005
<strong>Enzimi</strong> koji modificiraju<br />
krajeve DNA<br />
• Polinukleotid-kina<strong>za</strong> (PNK)<br />
• prenosi terminalnu fosfatnu skupinu ATP-a na slobodnu<br />
OH skupinu na 5’-kraju DNA (DNA se prethodno<br />
defosforilira uporabom AP)<br />
• služi <strong>za</strong> radioaktivno obilježavanje krajeva DNA (i RNA)<br />
PNK<br />
HO<br />
OH<br />
HO<br />
OH<br />
HO<br />
OH<br />
HO<br />
OH<br />
ATP<br />
GM2005
<strong>Enzimi</strong> koji modificiraju<br />
krajeve DNA<br />
• Terminalna transfera<strong>za</strong> (TT)<br />
(terminalna deoksinukleotidil-transfera<strong>za</strong>)<br />
• opetovano dodaje nukleotide na slobodan 3’-kraj<br />
• najbolje radi na istaknutim 3’-krajevima, no reakcijski<br />
uvjeti mogu se prilagoditi i <strong>za</strong> tupe i 3’-uvučene krajeve<br />
• uglavnom se koristi <strong>za</strong> dodatak homopolimera na kraj<br />
molekule DNA<br />
GM2005
komercijalno<br />
dostupni<br />
i<br />
različitih<br />
tipova<br />
stanica<br />
Za kidanje, modifikaciju<br />
i združivanje DNA<br />
potrebni su<br />
pročišćeni<br />
iz<br />
enzimi<br />
3 glavne skupine<br />
katalitičke<br />
proteinske<br />
molekule<br />
Restrikcijske<br />
endonukleaze<br />
kidaju DNA na<br />
specifičnim<br />
mjestima<br />
i koriste se <strong>za</strong><br />
Stvaranje<br />
fragmenata<br />
DNA<br />
Izradu<br />
restrikcijskih<br />
karata<br />
Nukleaze<br />
Endo-<br />
RE<br />
DNA<strong>za</strong> I<br />
S1<br />
enzimi koji<br />
modificiraju DNA<br />
Egzo-<br />
Bal 31<br />
Exo III<br />
Exo λ<br />
Polimeraze<br />
DNA pol I<br />
Klenow<br />
RT<br />
<strong>Enzimi</strong> koji<br />
djeluju na<br />
krajevima<br />
AP<br />
PNK<br />
TT<br />
DNA liga<strong>za</strong><br />
spaja molekule<br />
DNA<br />
tvorbom<br />
Fosfodiesterskih<br />
ve<strong>za</strong><br />
i<br />
tvori<br />
rekombinantnu<br />
DNA<br />
GM2005
Spajanje dvaju fragmenata DNA<br />
pomoću homopolimernih repova<br />
5’<br />
3’<br />
3’<br />
5’<br />
5’<br />
3’<br />
3’<br />
5’<br />
3’A(A) n A 5’ 5’<br />
n A3’ 5’<br />
3’T(T) n T<br />
5’<br />
T(T) n T3’<br />
Egzonuklea<strong>za</strong> λ<br />
Egzonuklea<strong>za</strong> λ<br />
5’ 3’<br />
5’ 3’<br />
3’ 5’<br />
3’<br />
5’<br />
Terminalna<br />
Terminalna<br />
transfera<strong>za</strong> + dATP<br />
transfera<strong>za</strong> + dTTP<br />
T(T) n T<br />
A(A) n A<br />
A(A) n A<br />
T(T) n T<br />
GM2005
Linkeri (poveznice)<br />
• Ukoliko fragment DNA nema prikladnih restrikcijskih mjesta,<br />
na krajeve DNA mogu se dodati kratki odsječci DNA sa<br />
željenim mjestima koje prepoznaju RE:<br />
• Linkeri (poveznice)<br />
• komplementarni oligomeri tupih krajeva dobiveni kemijskom sintezom<br />
CCGAATTCGG<br />
GGCTTAAGCC<br />
DNA liga<strong>za</strong><br />
CCGAATTCGG<br />
GGCTTAAGCC<br />
CCGAATTCGG<br />
GGCTTAAGCC<br />
EcoRI<br />
5’-AATTCGG<br />
GCC<br />
CCG<br />
GGCTTAA-5’<br />
GM2005
Adaptori<br />
• Adaptori<br />
• sintetički oligomeri koji s jedne strane imaju tupi kraj<br />
kojim se adaptor veže na željenu molekulu DNA, a s<br />
druge ljepljivi kraj koji omogućava izravno povezivanje<br />
s kompatibilnim ljepljivim krajem vektora (ili neke<br />
druge DNA)<br />
5’-GATCCCCGGG<br />
GGGCCC<br />
BamHI adaptor<br />
DNA liga<strong>za</strong><br />
5’-GATCCCCGGG<br />
GGGCCC<br />
CCCGGG<br />
GGGCCCCTAG-5’<br />
GM2005
Načini dobivanja fragmenata DNA<br />
• mehaničkim kidanjem (soniciranjem)<br />
• razgradnjom restrikcijskim enzimima<br />
(potpuna i djelomična)<br />
• sintetičkim putem (oligonukleotidi)<br />
• prevođenjem mRNA u cDNA pomoću<br />
reverzne transkriptaze<br />
• umnažanjem lančanom reakcijom<br />
polimeraze<br />
GM2005
PCR u kloniranju:<br />
di<strong>za</strong>jn posebnih ishodnica<br />
• dodavanje kratkih odsječaka nekomplementarnih kalupu<br />
na 5’-kraj ishodnice<br />
• mjesta prepoznavanja RE<br />
• sljedovi <strong>za</strong> lakše pročišćavanje proteina (6x-His tag)<br />
5’ 3’<br />
3’<br />
5’<br />
5’<br />
3’<br />
CTTAAGCCGG 5’<br />
5’GCGCAAGCTT<br />
3’<br />
HindIII<br />
5’ GCGCAAGCTT<br />
3’ CGCGTTCGAA<br />
EcoRI<br />
GAATTCGGCC<br />
CTTAAGCCGG<br />
5’<br />
GM2005
PCR u kloniranju:<br />
di<strong>za</strong>jn posebnih ishodnica<br />
• ako je poznat samo dio a.k. slijeda proteina, a želimo<br />
izolirati gen:<br />
• <strong>za</strong> degenerirani kodon sintetizira se miješana ishodnica sa svim<br />
kombinacijama nukleotida na 3. mjestu<br />
a.k. slijed<br />
Phe-Leu-Pro-Ser-Ala-Lys-Trp-Ala-Tyr-Asp-Pro<br />
broj kodona po a.k. 2 6 4 6 4 2 1 4 2 2 4<br />
Sinte<strong>za</strong> miješane ishodnice<br />
Ala Lys Trp Ala Tyr Asp Pro<br />
broj kombinacija<br />
GCA AAA TGG GCA TAC GAC CC<br />
G<br />
C<br />
T<br />
G G<br />
C<br />
T<br />
T T<br />
4 X 2 X 1 X 4 X 2 X 2 X 1 = 128<br />
GM2005
PCR u kloniranju:<br />
di<strong>za</strong>jn posebnih ishodnica<br />
• ako je poznat samo dio a.k. slijeda proteina, a želimo<br />
izolirati gen:<br />
• umjesto 3. mjesta u ishodnicu se ugrađuje inozin koji se jednako<br />
dobro sparuje sa svim nukleotidima<br />
a.k. slijed<br />
Phe-Leu-Pro-Ser-Ala-Lys-Trp-Ala-Tyr-Asp-Pro<br />
broj kodona po a.k. 2 6 4 6 4 2 1 4 2 2 4<br />
Uporaba inozina kao<br />
degenerirane baze<br />
Ala Lys Trp Ala Tyr Asp Pro<br />
GCI AAA TGG GCI TAC GAC CC<br />
G T T<br />
broj kombinacija<br />
1 X 2 X 1 X 1 X 2 X 2 X 1 = 8<br />
GM2005
Polimeraze s mogućnošću<br />
popravka ugradnje krive baze<br />
• Taq polimera<strong>za</strong> nema 3’5’ egzonukleaznu<br />
aktivnost – ugradnja pogrešnog nukleotida<br />
<strong>za</strong>ustavlja sintezu<br />
• standardni PCR ne može učinkovito umnožiti odsječke<br />
puno dulje od 3 kb<br />
• dodatkom “proofreading” polimeraze omogućava se<br />
vjerna i učinkovita sinte<strong>za</strong> duljih fragmenata<br />
• Tma (Thermotoga maritima)<br />
• Deep Vent TM (Pyrococcus sp.)<br />
• Tli (Thermococcus litoralis)<br />
• Pfu (Pyrococcus furiosus)<br />
• Pwo (Pyrococcus woesi)<br />
GM2005
Change language