Skripta - laboratorní technika
07.11.2014 • Views
Share Embed Flag

Skripta - laboratorní technika

Skripta - laboratorní technika

Skripta - laboratorní technika

SHOW MORE
SHOW LESS
ePAPER READ
DOWNLOAD ePAPER
pf.jcu.cz

Create successful ePaper yourself

Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.

START NOW

LABORATORNÍ TECHNIKA<br />

PRO BIOCHEMIKY<br />

Petr Galuszka a Lenka Luhová<br />

Katedra biochemie Přírodovědecké fakulty<br />

Univerzity Palackého<br />

OLOMOUC 2005

Recenzenti<br />

Prof. Ing. Jan Káš, DrSc. – Ústav biochemie a mikrobiologie FPBT VŠCHT Praha,<br />

Doc. RNDr. Petr Zbořil, CSc. – Katedra biochemie PřF MU Brno<br />

2. vydání, Olomouc 2005<br />

© Mgr. Petr Galuszka, Ph.D., RNDr. Lenka Luhová, Ph.D., 2005<br />

Vydala Univerzita Palackého v Olomouci<br />

2

Předmluva<br />

<strong>Skripta</strong> byla sepsána jako přehledný soubor návodů pro absolvování předmětu Laboratorní<br />

<strong>technika</strong>. Praktické cvičení jsou v zimním semestru povinni navštěvovat posluchači prvních<br />

ročníků oboru biochemie a molekulární biologie na Přírodovědecké fakultě Univerzity Palackého.<br />

Náplň cvičení byla koncipována tak, aby pokryla veškeré základní laboratorní techniky a<br />

postupy ze všech chemických a biologických oborů, se kterými se bude posluchač setkávat<br />

v praktických cvičeních během svého studia. Především je zaměřena na základní postupy<br />

uplatňující se v moderní biochemické laboratoři (práce s automatickou pipetou,<br />

spektrofotometrie, chromatografie). Velký důraz při sestavování úloh byl kladen na to, aby<br />

posluchači získali všechny základní návyky nutné pro bezpečnou a efektivní práci.<br />

Skriptum je rozděleno na dvanáct samostatných laboratorních cvičení. Rozsahem odpovídá<br />

počtu hodin, které student musí absolvovat během semestru. Každé laboratorní cvičení obsahuje<br />

jeden nebo více úkolů, které jsou řešeny tak, aby je student stihl vypracovat během jednoho<br />

cvičení, tzn. zhruba za 4 hodiny čistého času. První dvě cvičení jsou úvodní a absolvují je všichni<br />

studenti společně. Dalších deset úloh je rozděleno podle náročnosti na dvě části a studenti se<br />

střídají v jejích vykonávání po týdnech. Prvních pět úloh v první půli semestru a zbylých pět<br />

náročnějších na konci semestru. Studenti většinou pracují v párech mohou však pracovat i<br />

jednotlivě, záleží na obsazenosti jednotlivého kurzu. V závěru každého cvičení je uvedena<br />

literatura, ze které autoři při sestavování čerpali, a několik otázek, na které studenti odpovídají<br />

na základě získaných dat či studia doporučené literatury. Vypracované odpovědi odevzdávají<br />

formou protokolu společně se stručným popisem a vyhodnocením cvičení.<br />

Milou povinností autorů je poděkovat svým kolegům z katedry biochemie PřF UP za cenné<br />

rady a také posluchačům oboru biochemie v letech 2001-06 a 2002-07, kteří přímo za běhu<br />

cvičení vyjadřovali své připomínky a nejasnosti, na které byl brán zřetel při konečné podobě<br />

tohoto učebního textu.<br />

V Olomouci, leden 2003<br />

Autoři<br />

3

PŘEHLED CVIČENÍ Z LABORATORNÍ TECHNIKY PRO BIOCHEMIKY<br />

1. Úvodní hodina str.5<br />

Laboratorní řád. Bezpečnost práce. Zdroje tepla v laboratoři. Měření teploty. Chemické sklo a<br />

laboratorní nádobí. Chemikálie a jejich uchovávání. Nebezpečné látky a manipulace s nimi.<br />

2. Základní úkony v biochemické laboratoři str.16<br />

Váhy a vážení. Měření objemů a pipetování. Příprava roztoků. Ředění kyselin a zásad. Pufry, jejich<br />

příprava a použití. Měření pH.<br />

3. Úprava biologického materiálu, precipitační techniky, centrifugace, dialýza a ultrafiltrace<br />

str.26<br />

Homogenizace semen ječmene, precipitace jejich proteinů síranem amonným s následnou<br />

dialýzou a ultrafiltrací na zařízení Amicon.<br />

4. Extrakce, filtrace, sublimace a práce s vakuovou rotační odparkou str.35<br />

Izolace kofeinu z čajového listí a jeho přečištění sublimací.<br />

5. Spektrofotometrická měření str.42<br />

Spektrofotometrické stanovení niklu v neznámém vzorku. Stanovení obsahu proteinů<br />

v biologickém materiálu metodou Bradfordové. Měření absorpčních spekter listových barviv.<br />

Stanovení koncentrace DNA.<br />

6. Destilace str.50<br />

Izolace silice z hřebíčku destilací s vodní parou.<br />

7. Práce s plyny a sklem str.55<br />

Určení procentuálního obsahu uhličitanu vápenatého ve vaječné skořápce jeho rozložením na oxid<br />

uhličitý. Práce se sklem a korkem.<br />

8. Sušení, chlazení a lyofilizace str.63<br />

Stanovení obsahu vody v modré skalici. Příprava bezvodého silikagelu. Teoretické seznámení<br />

s lyofilizátorem. Koncentrace roztoku proteinů pomocí gelové filtrace.<br />

9. Krystalizace, promývání na filtru, dekantace a stanovení bodu tání str.73<br />

Stanovení bodu tání (čistoty) izolovaného kofeinu. Izolace a krystalizace kyseliny citrónové<br />

z citronů. Rušená krystalizace technického síranu měďnatého.<br />

10. Chromatografie I str.79<br />

Sloupcová chromatografie na iontoměničích. Regenerace ionexu.<br />

11. Chromatografie II str.86<br />

Chromatografie karotenoidů na tenké vrstvě. Gelová chromatografie nízko- a vysokomolekulární<br />

látky.<br />

12. Práce s mikroskopem str.94<br />

Stavba rostlinné buňky v pokožce cibule. Plasmolýza, deplasmolýza, plazmoptýza. Histochemická<br />

reakce na vápník a na lignin.<br />

13. Práce s mikroorganismy ve sterilním prostředí, izolace bakteriální DNA a agarosová<br />

elektroforesa DNA<br />

str.103<br />

4

Laboratorní cvičení č. 1<br />

ÚVODNÍ HODINA<br />

LABORATORNÍ ŘÁD<br />

1) Student je povinen se seznámit před zahájením práce v laboratoři s laboratorním řádem,<br />

s bezpečnostními předpisy a s poskytováním první pomoci.<br />

2) Student je povinen přicházet do laboratoře včas a řádně připraven. Musí mít provedeny<br />

potřebné výpočty, znát vlastnosti látek, se kterými bude pracovat apod. Před zahájením<br />

cvičení vyučující ověřuje znalosti studentů. Pokud student nemá dostatečné znalosti k řešení<br />

dané úlohy, cvičení vykoná v náhradním termínu.<br />

3) Každá absence musí být omluvena. Má-li student vážné osobní důvody, pro které se nemůže<br />

zúčastnit cvičení, sdělí to vedoucímu předem. Každá zameškaná úloha musí být nahrazena. Na<br />

termínu náhradního cvičení se dohodne posluchač s vedoucím cvičení.<br />

4) Při práci v laboratoři musí mít student pracovní plášť a vhodnou obuv.<br />

5) Studenti pracují ve dvojících. Před zahájením práce zkontrolují podle přiloženého seznamu<br />

pracovní stůl a jeho vybavenost. Všechny závady zjištěné před zahájením práce nebo v jejím<br />

průběhu neprodleně hlásí vedoucímu cvičení.<br />

6) Při práci je nutné postupovat přesně podle zadané úlohy a pokynů vyučujícího. Před<br />

používáním přístrojů se musí student nejprve seznámit s jejich obsluhou.<br />

7) Průběh práce a dosažené výsledky si každý student zaznamenává do protokolárního sešitu. Po<br />

skončení cvičení předloží výsledky vedoucímu cvičení.<br />

8) Následující cvičení odevzdává každý student vypracovaný protokol, který musí obsahovat:<br />

jméno studenta, studijní kombinaci, datum, název úlohy, stručný princip úlohy, stručný<br />

pracovní postup, výsledky, diskusi a závěr (tabulky, grafy).<br />

9) Po skončení práce je student povinen dát své pracovní místo do pořádku, řádně umýt sklo a<br />

opláchnout je destilovanou vodou.<br />

10) Student smí opustit laboratoř až po kontrole dosažených výsledků a stavu pracovního stolu<br />

vyučujícím.<br />

11) Po skončení práce uzavřeme vodu a vypneme elektrické spotřebiče.<br />

12) V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit.<br />

13) Studenti jsou povinni dodržovat bezpečnostní předpisy.<br />

14) Práce s jedovatými, těkavými a páchnoucími látkami se provádí pouze ve spuštěné digestoři.<br />

15) Zvláštní opatrnosti je třeba dbát při manipulaci s otevřeným ohněm, hořlavinami, žíravinami<br />

a jedovatými látkami.<br />

16) Případné závady, nedostatky, nehody nebo poranění je nutné ihned hlásit vyučujícímu a<br />

v případě potřeby poskytnout okamžitě první pomoc.<br />

17) Práce v chemické laboratoři je zakázána těhotným ženám a matkám do konce 9. měsíce po<br />

porodu. Posluchačka je povinna vedoucímu cvičení okamžitě oznámit graviditu či nedávný<br />

porod.<br />

5

BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI<br />

1) Provádíme pouze práce podle pokynů vyučujícího a pracovního návodu.<br />

2) Seznámíme se s rozmístěním hasících přístrojů a s únikovými východy z laboratoře.<br />

3) V laboratoři nikdy nejíme, nepijeme a nekouříme. Po skončení práce si důkladně umyjeme<br />

ruce.<br />

4) K jídlu a pití (mimo laboratoř) nikdy nepoužíváme chemické sklo.<br />

5) Tašky a oblečení uložíme do skříní mimo laboratoř.<br />

6) Při práci v laboratoři vždy nosíme pracovní plášť a vhodnou obuv.<br />

7) Neprovádíme samovolné opravy nebo úpravy na elektrické instalaci a přístrojích.<br />

8) Chemikálie nikdy nezkoušíme ústy a neinhalujeme výpary.<br />

9) Nepipetujeme ústy.<br />

10) Při práci se žíravinami a jinými nebezpečnými látkami si chráníme obličej a oči ochranným<br />

štítem, ruce gumovými rukavicemi.<br />

11) Na pracovišti udržujeme pořádek a čistotu. Dbáme, abychom vnější stěny nádob nebo<br />

pracovní místo nepotřísnili chemikáliemi.<br />

12) Koncentrované kyseliny a zásady ředíme tak, že kyselinu nebo zásadu lijeme tenkým proudem<br />

po tyčince do vody za současného míchání a chlazení.<br />

13) Při provádění pokusů ve zkumavkách držíme ústí zkumavek odvrácené od obličeje (svého<br />

i spolupracovníků).<br />

14) Při práci s hořlavinami nesmí být v blízkosti otevřený oheň. Při destilaci hořlavin je nezbytné<br />

z okolí odstranit zásobní láhve hořlavin a kontrolovat průtok vody chladičem. Hořlaviny nikdy<br />

nezahříváme přímým plamenem, používáme lázně nebo topná hnízda.<br />

15) Zvýšenou pozornost věnujeme hlavně manipulaci s hořlavinami I. třídy, které mají teplotu<br />

vzplanutí do 21°C (aceton, ether, methanol, ethanol, benzín, benzen a toluen).<br />

16) Pokud vypukne požár, je každý povinen pokusit se ho zdolat vlastními silami (hasicím<br />

přístrojem, improvizovanými hasicími prostředky). Je nutno dále vypnout elektrický proud a<br />

pokusit se odstranit z okolí požáru hořlavé látky (zejména kapaliny) a nádoby se stlačenými<br />

plyny. Nelze-li požár zvládnout vlastními silami, je nutné neprodleně volat požárníky (tel.číslo<br />

150).<br />

17) Střepy a jiné odpadky s ostrými hranami musí být odkládány do nádob zvlášť k tomu<br />

určených.<br />

18) Zbytky jedů a organických rozpouštědel likvidujeme podle pokynů vyučujícího.<br />

19) Při práci s etherem dbáme úzkostlivě na bezpečnostní opatření (možnost vznícení i od<br />

horkých součástí).<br />

20) V případě nehody okamžitě informujeme vyučujícího a poskytneme první pomoc. Vedoucímu<br />

cvičení je třeba hlásit i každé nepatrném poranění, bolesti hlavy, hučení v uších apod. Ve<br />

všech případech je nutno sepsat protokol o poranění pro případ pozdějších komplikací.<br />

6

PRVNÍ POMOC PŘI NEHODĚ<br />

Při poleptání kůže silnou zásadou nebo kyselinou zasažené místo ihned důkladně omyjeme<br />

proudem vody. Při poleptání kyselinou provedeme neutralizaci roztokem hydrogenuhličitanu<br />

sodného (20 g.L -1 ), při poleptání zásadou zředěnou kyselinou octovou (5 g.L -1 ).<br />

Při zasažení oka chemikálií ihned oko vypláchneme slabým proudem vody. V případě zasažení<br />

zásadou oko vypláchneme borovou vodou (roztok kyseliny borité 30 g.L -1 ). Jedná-li se o kyselinu,<br />

použijeme k výplachu roztok boraxu (20 g.L -1 ). V každém případě je nutné vyhledat očního lékaře.<br />

Při poleptání sliznice v ústech provedeme důkladný výplach úst vodou a následně<br />

neutralizaci výplachem zředěnou kyselinou octovou (poleptání zásadou) nebo hydrogenuhličitanem<br />

sodným (poleptání kyselinou).<br />

Při požití louhu se doporučuje pít zředěnou kyselinu octovou (0,5 - 2,0 g.L -1 ), při požití<br />

kyseliny pijeme suspenzi oxidu hořečnatého nebo hydroxidu hlinitého ve vodě. Po požití jedů je<br />

charakter první pomoci specifický podle druhu otravy, doporučuje se vypít aspoň 0,5 l vody a<br />

vyvolat zvracení. Je vždy nutné vyhledat odborné lékařské ošetření.<br />

Hořící oděv hasíme přikrývkou nebo sprchovou vodou. Při likvidaci větších plamenů<br />

použijeme hasící přístroje. Při malých popáleninách ošetříme postižené místo mastí na spáleniny a<br />

zakryjeme sterilním obvazem. Větší popáleniny ošetří lékař.<br />

Při pořezání sklem odstraníme z povrchové rány sklo, okolí otřeme zředěným peroxidem<br />

vodíku (3%) a ovážeme sterilním obvazem. Větší zranění ošetří lékař.<br />

Nebezpečné látky v chemické laboratoři:<br />

Amoniak je značně těkavý. Páry leptají sliznice a ve vysokých koncentracích může působit<br />

smrtelně. Postižený potřebuje naprostý klid a pobyt na čerstvém vzduchu. Při nadýchání či požití<br />

je nutné podávat hodně vody s octem nebo citronem, později olivový olej s kousky ledu.<br />

S amoniakem pracujeme vždy v digestoři.<br />

Chlor, brom silně leptají dýchací orgány. Jejich účinky se projevují až po několika<br />

hodinách (kašel, dušení). Postiženého přeneseme na čerstvý vzduch a zajistíme klid. Nenutíme ho<br />

dýchat zhluboka a nikdy nezavádíme umělé dýchání. Je možné vdechovat vodní páru s amoniakem<br />

nebo ethanolem, či 2% roztokem sody. Asanace rozlitého bromu se provádí thiosíranem.<br />

Kyanovodík a kyanidy jsou prudce jedovaté látky mandlového zápachu. Páry kyanovodíku<br />

způsobují i v nepatrných koncentracích okamžitou smrt. Plyn proniká i pokožkou. Při práci<br />

s kyanovodíkem používáme vždy plynovou masku. Při otravě nutná okamžitá lékařská pomoc.<br />

Dlouhodobě zavádíme umělé dýchaní, popř. zabezpečíme vdechování kyslíku. Kyanidy působí jako<br />

inhibitory dýchacího řetězce mitochondrií. Smrtelná dávka je zhruba 200 mg. Při otravě je<br />

potřeba okamžitě vypláchnout žaludek, popř. vyvolat zvracení. Podáváme zředěný peroxid vodíku.<br />

Injekčně se podává methylenová modř a thiosíran. Páry kyanovodíku se uvolňují v kyselém<br />

prostředí z kyanidů!<br />

Oxid uhelnatý je prudce jedovatý plyn, který nelze zjistit čichem. Vytěsňuje kyslík<br />

z vazebného místa na hemoglobinu. Již po krátkém nadýchání otupuje a způsobuje smrt<br />

zadušením. Postiženého vyneseme na čerstvý vzduch a zavádíme umělé dýchání s inhalaci kyslíku.<br />

Nitrózní plyny mohou způsobit i při vdechnutí malého množství smrt. Postiženého je třeba<br />

nechat vdechovat volně kyslík a přičichávat amoniak. Nezavádíme umělé dýchaní a poskytneme<br />

absolutní klid.<br />

Oxid siřičitý vyvolává při vdechování křečovitý kašel. Postiženého je třeba přenést na<br />

čerstvý vzduch, popř. jej nechat vdechovat páry etanolu nebo kyslíku.<br />

7

Sulfan je prudce jedovatý plyn. Při nadýchání je potřeba postiženého ihned vynést na<br />

čerstvý vzduch. Dojde-li k otravě a ztížení dýchání, je nutné okamžitě inhalovat kyslík a zavádět<br />

umělé dýchání i při zdánlivé smrti.<br />

Rtuť je jedovatá nejen ve svých sloučeninách, ale i v parách a prachu. Při otravě je<br />

potřeba podávat prostředky na zvracení (mýdlová voda) a vypláchnout žaludek. Pak podávat bílek<br />

v mléce, vodnou suspenzi hořčíku s mandlovým olejem, roztok taninu nebo železný prach. Při<br />

rozlití asanovat malé kapičky sirným květem nebo posbírat mosazným plíškem. Při rozbití<br />

rtuťového teploměru je nutno vždy řádně odstranit veškerou rtuť z prostředí, jelikož ta pak<br />

může v laboratoři způsobovat dlouhodobé otravy.<br />

Olovo je nebezpečné v parách a jeho sloučeniny způsobují dlouhodobě chronickou otravu,<br />

tzv. saturnismus. Po požití je třeba podávat velké množství roztoku MgSO 4 , vyvolat zvracení a<br />

pak podávat mléko a vodu s bílkem. Po práci s kovovým olovem si vždy řádně opláchněte ruce.<br />

Methanol působí škodlivě jednak vdechováním par, jednak požitím. V první fázi vyvolá<br />

opojení později křeče. Větší dávky způsobují trvalé oslepnutí a smrt. Na rozdíl od etanolu se<br />

velice dobře vstřebává i kůži. Při práci s metanolem proto vždy pracujeme v ochranných<br />

pomůckách. Při požití metanolu se jako antidotum podává etanol, který je daleko lepším<br />

substrátem lidské alkoholdehydrogenasy a zabraňuje tak tvorbě toxického formaldehydu z<br />

metanolu.<br />

Benzen, toluen, naftalen působí škodlivě na červené krvinky. Při požití vyvolává zvracení.<br />

Je nutný klid, popř. umělé dýchaní.<br />

Fenol je značně toxická látka leptající kůži, kterou se rychle vstřebává a způsobuje<br />

celkovou intoxikaci. Potřísněnou kůži omýváme 25% alkoholem nebo glycerolem. Při práci<br />

s fenolem se vždy chráníme rukavicemi.<br />

Zvláště nebezpečnou skupinou látek, se kterými se můžete v chemické laboratoři setkat,<br />

jsou látky mutagenní a karcinogenní. Jejichž nebezpečnost tkví v tom, že nezpůsobují akutní<br />

otravy, ale dlouhodobým působením mohou vyvolat nádorové onemocnění. Při práci s těmito<br />

látkami pracujeme vždy dle daným předpisů a chráníme se ochrannými pomůckami. Mezi<br />

karcinogeny, které se často používají v biochemické laboratoři patří: benzen, styren,<br />

chloroform, ethidium bromid a akrylamid.<br />

Při práci s infekčním materiálem je nutno zachovávat všechna hygienicko-preventivní<br />

opatření, abychom nenakazili sebe ani své okolí. Za potenciálně infekční materiál je nutno<br />

považovat všechny tělesné tekutiny (moč, sliny, krev) a živočišné tkáně, případně extrakty z nich<br />

připravené.<br />

LABORATORNÍ SKLO A PORCELÁN<br />

Mezi laboratorní sklo řadíme veškerý skleněný materiál, se kterým se setkáváme<br />

v chemické laboratoři. Laboratorní sklo má vysokou odolnost k minerálním kyselinám a zásadám.<br />

Z fyzikálních vlastností skla je nejdůležitější jeho tepelná roztažnost. Obecně mají skla měknoucí<br />

při vyšších teplotách větší odolnost proti náhlým tepelným změnám. Setkáváme se především se<br />

třemi druhy skla:<br />

1) Sklo měkké – sodno-draselno-vápenaté se používá na výrobu nádobí, které není<br />

vystavováno tepelnému namáhání. Má velký koeficient roztažnosti, takže nesnese kolísání teploty.<br />

Musí se zahřívat nebo ochlazovat velmi opatrně. Má nízký bod tání a proto se dá snadno roztavit<br />

v plameni nad kahanem. Změklé sklo se pak dá lehce opracovávat.<br />

2) Sklo tvrdé - borosilikátové slouží na výrobu skleněného nádobí, které můžeme zahřívat<br />

nad plamenem. Zhotovuje se z něj veškeré varné a odměrné sklo. Borosilikátové sklo má<br />

nazelenalou barvu a vyznačuje se odolností proti praskání, vysokým bodem tání a vysokou<br />

chemickou odolností. Nejběžnější obchodní značky jsou Sial, Simax, Duran či Pyrex.<br />

8

3) Sklo křemenné – se vyznačuje vysokou chemickou a tepelnou odolnosti. Je však velice<br />

křehké a využívá se pouze ke zhotovování speciálních nádob a zařízení, např. kyvet pro<br />

spektrofotometrii (propouští UV záření).<br />

Obecnou vlastností skla je jeho křehkost. Zbytečnému praskání zamezíme řádným<br />

uchycením do svorek a lapáků s čelistmi s korkovou výztuží, popř. s navlečenými gumovými<br />

hadičkami. Při práci s agresivními látkami či ve vakuu není vhodné používat korek a gumové<br />

hadice. Pracujeme pak se zábrusovým sklem, které se dá vzájemně stavebnicově propojovat.<br />

Zábrusové baňky, chladiče, teploměry, zátky atd. jsou normalizované. Nejčastější rozměry<br />

zábrusů jsou NZ 14,5/15; NZ 29/32; NZ 40/45 (čísla znamenají průměr zábrusu v mm ve zúžené<br />

a širší části). Práce se zábrusy je rychlá a pohodlná. Zábrusy je však třeba vždy řádně promazat<br />

silikonovou vaselinou, aby nedocházelo k jejich „zatuhnutí“.<br />

Vedle skleněného nádobí používáme v chemické laboratoři velice často též nádobí a<br />

pomůcek z porcelánu (třecí a odpařovací misky, žíhací kelímky, váženky, lžičky, Bűchnerovy<br />

nálevky aj.). Tvrdý chemický porcelán má vysokou mechanickou a chemickou odolnost. Je citlivý na<br />

údery a lehce se tříští hlavně při prudkých změnách teploty. Je stálý proti vzdušnému kyslíku i za<br />

žáru, vodu povrchově neváže a je v ní i za vysokých teplot nerozpustný. Chemickým činidlům<br />

vzdoruje asi stejně dobře jako chemické sklo. Chemický porcelán může být drsný či glazurovaný.<br />

Glazura jeho vlastnosti nijak výrazně neovlivňuje.<br />

Chemické nádobí čistíme ihned po práci, dokud nečistoty a zbytky chemikálií na stěnách<br />

ještě nezaschly. Zpravidla si vystačíme s postupy známými z domácnosti, tj. použití saponátového<br />

prostředku a důkladné omytí vodou. V laboratoři však nezapomene na poslední krok, kterým je<br />

řádné vypláchnutí destilovanou vodou. Pokud na stěnách ulpěly kousky ve vodě nerozpustných<br />

nečistot použijeme mechanických pomůcek jako jsou kartáče, útržky filtračního papíru nebo<br />

jemný písek. Toto mechanické čištění však nesmí sklo poškrábat, i nepatrné škrábnutí může<br />

způsobit při zahřívání prasknutí skla. Když ani mechanické čištění nevede k odstranění nečistot,<br />

přichází na řadu chemické čištění. Použijeme rozpouštědlo, které čištěný materiál nekoroduje a<br />

ve kterém je nečistota rozpustná. Nejčastěji se využívají v laboratoři dostupné minerální<br />

kyseliny. Při této činnosti dbáme na dodržování bezpečnostních předpisů a používáme ochranné<br />

pomůcky. Vysokou čistící schopnost má tzv. kyselina chromsírová, což je dichroman sodný<br />

rozpuštěný v koncentrované kyselině sírové. Sklo se do této směsi namočí přes noc a ráno se pak<br />

důkladně opláchne v roztoku detergentu, pod tekoucí vodou a nakonec ve vodě destilované.<br />

Chromsírová směs se po čase vyčerpá, což se projeví zeleným zbarvením (redukce dichromanu na<br />

ion chromitý). Taková směs je pak málo účinná a musí se připravit nová.<br />

Zvláštní nároky jsou kladeny na sklo používané v molekulárně biologické laboratoři, kde se<br />

velice často pracuje s bakteriálními kmeny a jinými mikroorganismy a je velké riziko bakteriální<br />

kontaminace z okolí. Proto se snažíme používat pro manipulaci s těmito organismy pouze sterilní<br />

plasty na jedno použití. Pokud je nutno použít skleněné či jiné dražší nádobí, musí se předem<br />

sterilizovat ve speciálních tlakových nádobách (autoklávy) a následně vysušit v sušárně na 105°C.<br />

Zvláštní péče je pak věnována sklu, které se používá pro manipulaci s RNA. Hrozí totiž nebezpečí<br />

kontaminace ribonukleasami, což jsou degradační enzymy RNA, které jsou velice stabilní a<br />

odolávají i běžné sterilizaci. Sklo se proto před sterilizaci namáčí do roztoku jejich inhibitoru<br />

diethyl pyrokarbonátu.<br />

CHEMICKÉ NÁDOBÍ A APARATURY<br />

Mezi základní vybavení každé chemické laboratoře patří baňky a kádinky. Kádinky mají<br />

rovné dno a na horním okraji mohou mít zobáček. Mohou být i kalibrovány, ale tato kalibrace<br />

slouží pouze k orientačním účelům, rozhodně podle ní nelze odměřovat přesné objemy. Baňky mají<br />

tvar členitější, rozdělený na vlastní baňku a hrdlo. Dno mohou mít jak rovné, tak kulaté, ty se pak<br />

používají hlavně pro práci za sníženého tlaku. Baňky a kádinky jsou převážně tenkostěnné,<br />

9

1 2 3 4 5 6<br />

7 8 9 10 11 12<br />

13 14 15 16 17 18 19 20<br />

21 22 23 24 25 26 27 28<br />

Obrázek 1: Laboratorní nádobí: 1/ kádinka s výlevkou, 2/ kádinka bez výlevky, 3/destilační<br />

baňka se zábrusem a kulatým dnem, 4/ destilační baňka se zábrusem a plochým dnem, 5/<br />

hruškovitá baňka, 6/ Erlenmeyerova baňka se zábrusem, 7/ baňka trojhrdlá, 8/ titrační baňka, 9/<br />

frakční baňka, 10/ baňka odsávací, 11/ odměrná baňka, 12/ dělicí nálevka kulovitá, 13/ dělící<br />

nálevka hruškovitá, 14/ nálevka s dlouhým stonkem, 15/ nálevka s krátkým stonkem, 16/ násypka,<br />

17/ Büchnerova nálevka, 18/ skleněná frita pro vakuovou filtraci, 19/ promývačka, 20/ láhev se<br />

šroubovacím uzávěrem, 21/ úzkohrdlá zábrusová láhev, 22/ zkumavka, 23/ zkumavka se<br />

šroubovacím uzávěrem, 24/ centrifugační kyveta, 25/ Petriho miska, 26/ krystalizační miska,<br />

27/ odpařovací miska, 28/ hodinové sklo.<br />

10

jednou z vyjímek je silnostěnná baňka odsávací. Slouží k filtraci za sníženého tlaku a je určená<br />

pouze k tomuto účelu, v žádném případě v ní nelze provádět nějaké chemické reakce, plnit<br />

horkými kapalinami nebo zahřívat. Baňka konického tvaru se nazývá Erlenmayerova. Baňku<br />

s postranním tubusem nazýváme frakční.<br />

Slovem nálevka označujeme v laboratoři větší počet pomůcek. Obyčejné nálevky slouží<br />

k přelévání kapalin a jednoduchým filtracím. Pro urychlení filtrace se používají nálevky<br />

s žebrovaným vnitřním povrchem nebo dlouhým a úzkým stonkem. Tzv. dělící nálevky se používají<br />

k řadě procesů, jako je extrakce, sušení, přikapávání atd. Velmi často používanou je, z porcelánu<br />

vyrobená, Büchnerova nálevka mající dírkované dno, na které se při filtraci vkládá kolečko<br />

filtračního papíru. Podobně vypadají i skleněné frity, které mají místo dírkovaného dna<br />

sintrované sklo propouštějící rozpouštědla. Zábrusové láhve na čištění plynů se nazývají<br />

promývačky. Zásobní láhve na chemikálie se dělí podle typu hrdla na reagenční láhve se<br />

šroubovacím víkem, sloužící především k uchovávání kapalin a širokohrdlé se zábrusovou zátkou<br />

tzv. prachovnice, ve kterých přechováváme pevné látky. K přechovávání malých množství pevných<br />

látek používáme lékovky. Protáhlá neuzavíratelná skleněná nádobka se nazývá zkumavka, slouží<br />

k provádění chemických reakcí v malých objemech. V poslední době jsou velmi populární plastové<br />

zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Nádoby podobného tvaru, většinou také šroubovací,<br />

používáme k centrifugaci a nazýváme je kyvety. Bývají zhotovovány většinou z tvrzených plastů.<br />

Hodinová skla slouží k přikrývání nádob, k sušení, vážení a přenášení vzorků pevných látek.<br />

Analogicky můžeme využívat i dvoudílné Petriho misky, jež se hlavně používají pro kultivace<br />

mikroorganismů. Odpařovací misky bývají většinou vyrobeny z porcelánu. Nejsou vhodné<br />

k přímému zahřívání v plameni stejně jako misky krystalizační. Pro odpařování roztoku používáme<br />

vždy vodní lázeň. K drcení a roztírání pevných vzorků slouží třecí misky s tloučkem. Jediným<br />

porcelánovým nádobím, které snáší přímý oheň, jsou žíhací kelímky.<br />

Chemické sklo většinou nepoužíváme samostatně, ale sestavujeme ho do různých aparatur,<br />

např. aparatura na destilaci, sublimaci apod. Aparatury sestavujeme na kovových stojanech nebo<br />

kovových klecích. Na svislé tyče stojanů a klecí připevňujeme kruhy, svorky nebo držáky pomocí<br />

svorek (obr. 2). Na kovové kruhy zpravidla pokládáme azbestové síťky, na které stavíme kádinky<br />

v případě jejich zahřívání kahanem. Kruhy pro zahřívání nikdy nezaměňujeme s kruhy filtračními,<br />

které jsou vyloženy dřevěnou nebo umělohmotnou vložkou a slouží k držení nálevky při filtraci<br />

nebo dělící nálevky při dělení kapalin. Kruh na stojanu se často nahrazuje trojnožkou.<br />

K upevňování skleněných součástí malého průměru používáme tzv. klemy, což jsou držáky s malým<br />

obvodem ramen. Pro uchycování chladičů pak používáme chladičové držáky s velkým rozpětím<br />

ramen. Klemy a držáky se nesmějí nikdy dotýkat skleněných částí aparatury přímo kovem. Bývají<br />

vyloženy korkem nebo potaženy gumovou hadicí. Při sestavování jakékoli aparatury musíme dbát<br />

na to, aby v aparatuře nenastalo pnutí, které by při zahřátí vedlo k prasknutí některé ze<br />

skleněných součástí. Při sestavování aparatury ze zábrusového skla nikdy neopomeneme zábrusy<br />

řádně promazat vazelinou.<br />

Obrázek 2: Sestavování aparatur. A – nesprávné uchycení křížové spojky, B – správné uchycení,<br />

C – chladičový držák, D – klema.<br />

11

ZDROJE TEPLA V CHEMICKÉ LABORATOŘI<br />

V laboratořích, do kterých je zaveden plyn, nám jako zdroj pro zahřívání může sloužit<br />

plynový kahan. Kahan je jednoduché zařízení sloužící k tvorbě směsi vzduchu a plynu, která se<br />

spaluje a vytváří na konci trubice plamen. Podle způsobu, jakým je k plynu přiváděn a mísen<br />

vzduch, rozlišujeme tři typy kahanů: Bunsenův, Tecluho a Mékerův. Pokud je do plynu přiváděno<br />

dostatečné množství vzduchu hoří nesvítivým plamenem, který je výhřevnější než plamen svítivý,<br />

jež získáme zamezením přívodu vzduchu. Z toho plyne pravidlo, že čím více vzduchu smísíme<br />

s plynem, tím výhřevnější plamen získáme. U Bunsenova a Mékerého kahanu se přívod vzduchu<br />

reguluje otáčením pohyblivého prstence, který odkrývá nebo zakrývá otvory v těle kahanu.<br />

Kahany zapalujeme vždy při uzavřeném přívodu vzduchu. V laboratoři často narazíme i na kahan<br />

lihový, který má daleko nižší výhřevnost než kahany plynové. Výhodou však je jeho velikost a<br />

jednoduchost. Lze ho použít všude tam, kde potřebujeme vzorky či chemické reakce jen zahřát.<br />

Používá se hlavně při zkumavkových reakcích a pro sterilizaci materiálu při práci<br />

s mikroorganismy.<br />

V současné době se však jako hlavní zdroje tepla v chemických laboratořích využívají<br />

elektrické vařiče a topná hnízda. Na elektrický vařič pokládáme vždy azbestovou síťku. Topná<br />

hnízda používáme hlavně na zahřívání destilačních baněk. Jde o elektrický vařič, u kterého je<br />

elektricky vyhřívaná speciální tkanina vytvarovaná do polokoule tak, aby obalila destilační baňku.<br />

Existuje několik typů topných hnízd podle velikosti zahřívané baňky. U topného hnízda lze kromě<br />

regulace příkonu většinou regulovat i to, zda je vyhřívaná pouze spodní část baňky, nebo baňka<br />

celá. Při práci s topnými hnízdy je třeba hlavně dávat pozor, aby do hnízda nevnikla kapalina<br />

(voda). Dojde-li k tomu, neprodleně přístroj vypneme.<br />

Protože každé přímé zahřívání klade vysoké nároky na materiál nádob, je výhodné předávat<br />

teplo zdroje prostřednictvím různých lázní. Podle materiálu, který tvoří podstatu lázně je možné<br />

dělení na vzdušné, vodní, olejové, pískové, kovové a solné. Vzdušné lázně se moc často nepoužívají<br />

vzhledem k tomu, že vzduch je ze všech materiálů nejméně vodivý. Nejjednodušší formou vzdušné<br />

lázně je prázdná kovová nádoba zahřívána kahanem nebo vařičem. Nejčastěji používáná je lázeň<br />

vodní, která je vhodná k zahřívání látek až do bodu varu vody a k destilaci kapalin vroucích<br />

přibližně do 80°C. Nejjednodušší vodní lázní je obyčejný hrnec, který je vyhříván elektrickým<br />

vařičem. V laboratoři se lze setkat i se speciálními vodními lázněmi, které mají různě nastavitelné<br />

otvory pro zahřívání odlišných velikostí baněk a odpařovacích misek. Pro zahřívání nad teplotu<br />

varu vody se nejčastěji používají lázně olejové. Náplní může být buď olej minerální, který lze<br />

použít do teploty 250°C, nebo silikonový použitelný až do teplot okolo 400°C. Vzhledem k teplotní<br />

roztažnosti je nutno olejem naplnit nádobu sloužící jako obal lázně jen asi do poloviny, jinak by při<br />

zvýšení teploty mohl olej přetéci. Při zahřívání je nutno do olejové lázně vždy vložit teploměr a<br />

průběžně kontrolovat teplotu, aby nedošlo k jejímu přehřátí. Obvykle platí, že teplota lázně, má<br />

být o 20-30°C vyšší než žádaná teplota reakční směsi. Je důležité, aby se do olejové lázně<br />

nedostala voda. Při teplotě nad 100°C by pak došlo k prskání a pěnění oleje, který by mohl<br />

způsobit popáleniny osobě pracující s lázní nebo požár. Solné a kovové lázně slouží k zahřívání nad<br />

300°C. Používá se směs několika solí, např. dusičnan sodný a draselný o bodu tání 219°C a<br />

nízkotající slitiny, jako je Woodoův kov s bodem tání 65°C. Vždy je však důležité vyjmout baňku<br />

před ztuhnutím lázně. Výhodou těchto lázní je vysoká tepelná vodivost použitých materiálů. Od<br />

používání písečných lázni se už v podstatě v dnešní době ustoupilo.<br />

K žíhání a tavení většího množství látek nám slouží elektrické odporové pece. Pro syntézy<br />

v proudu plynu nebo reakce ve vakuu užíváme pece trubkové, pro žíhání v kelímcích nám slouží<br />

kelímkové pícky a pro tavení většího množství látek pece muflové.<br />

12

VAKUUM A JEHO ZDROJE<br />

V laboratorní praxi je velmi často třeba pracovat za sníženého tlaku. Sníženého tlaku -<br />

vakua se využívá hlavně při destilaci, filtraci či sušení, kde výrazně ovlivňuje těkavost látek.<br />

Vakuum je stav uzavřeného prostoru, ve kterém je tlak plynu nebo páry nižší než tlak<br />

atmosférický okolního prostředí.<br />

Zařízení vytvářející vakuum nazýváme vývěvou. V laboratoři se můžeme setkat s vývěvami<br />

několika typů, které se liší tlakem, proti kterému čerpají, mezní hodnotou vakua a sacím výkonem.<br />

Nejjednodušším typem vývěvy je vývěva vodní. Jedná se o zúženou trubici, kterou tryská proud<br />

vody. V okolí ústí trysky je vzduch strháván ve směru proudu vody a je zde napojena odvodná<br />

hadice, která se druhým koncem napojuje na evakuovanou aparaturu. Vodní vývěva pracuje tedy<br />

přímo proti atmosférickému tlaku. Mezní tlak vakua je dán tenzí vodní páry (pro vodu o teplotě<br />

10°C to je 1333 Pa). Mezi vodní vývěvu a aparaturu vždy zařazujeme pojistnou nádobu<br />

(promývačku), aby nedošlo při poklesu tlaku vody v potrubí ke vniknutí vody do aparatury. Vývěvy<br />

dále mohou být rotační olejové nebo mechanické, jejich konstrukce je již složitější. Základním<br />

stavebním prvkem rotační olejové vývěvy je rotor se šoupátkem, které rozděluje prostor mezi<br />

rotorem a pláštěm na dvě části. Otáčením rotoru se jeden prostor zvětšuje a nasává vzduch a<br />

druhý prostor se zároveň zmenšuje a vzduch je vytlačován za součinnosti ventilu z vývěvy.<br />

Hlavním pravidlem při práci s vývěvou je, že vždy po skončení práce nejdříve znovu zavzdušníme<br />

aparaturu a až poté vypneme zdroj vakua. Zabráníme tím vniknutí vody do aparatury, či nasátí<br />

agresivních látek do vývěvy a její poškození.<br />

MĚŘENÍ TEPLOTY<br />

Pro měření teploty byla přijata mezinárodní teplotní stupnice, definovaná pomocí bodu<br />

tuhnutí vody a varu vody. Další pevné body mezinárodní stupnice jsou: bod varu síry – 444,6°C,<br />

bod tání stříbra – 960,8°C a bod tání zlata – 1062,4°C. Všechny tyto teploty jsou definovány za<br />

atmosférického tlaku jedné atmosféry. Teplotu měříme teploměry, které mohou být trojího typu:<br />

dilatační, odporové a termočlánky.<br />

Dilatační teploměry využívají roztažnosti kapalných, popřípadě pevných či plynných látek.<br />

Nejčastěji používané jsou teploměry rtuťové. Dovolují měřit teplotu od –38,9°C do 650°C. Pro<br />

měření nízkých teplot se teploměry plní toluenem (-80°C až 100°C), etanolem (-100°C až 70°C),<br />

petroléterem (-150°C až 120°C) či pentanem (-190°C až 20°C). Pro vyšší teploty se pak používá<br />

jako náplň kapalné galium (do 1000°C) a cín (do 1500°C).<br />

Odporové teploměry využívají závislosti odporu vodiče na teplotě. Těmito teploměry lze<br />

měřit teplotu s přesnosti na tisíciny stupně.<br />

Termočlánky jsou založeny na termoefektu – dva dráty ze dvou různých kovů spojené na<br />

obou koncích dávají vznik elektrického proudu, jsou-li oba spoje udržovány na rozdílné teplotě.<br />

Příkladem nejčastěji používaných termočlánku je: měď – konstantan (do 600°C), železo –<br />

konstantan (do 900°C), platina – platinarhodium ( do 1600°C).<br />

VODA V BIOCHEMICKÉ LABORATOŘI<br />

Vzhledem k tomu, že obyčejná tekoucí voda obsahuje značné množství solí, je pro jakékoli<br />

pokusy v biochemické laboratoři nepoužitelná. Používáme ji pouze tehdy, když nepřichází do styku<br />

s ostatními reagenciemi, tedy jako rozpouštědlo, např. pro chlazení.<br />

Základním způsobem úpravy vody je destilace. Každá biochemická laboratoř bývá vybavena<br />

vlastní destilační aparaturou. Destilovaná voda postačí pro většinu biochemických operací, ale pro<br />

některé speciální účely nemusí být její čistota vhodná. Obsahuje především některé kationty,<br />

které se do ní dostávají ze součástí destilační aparatury, skla a elektrod. Její kvalitu lze zvýšit<br />

13

opakovanou destilací tzv. redestilací, která se provádí ve speciální aparatuře z křemenného skla<br />

neuvolňující kationty.<br />

Pro speciální účely, např. v laboratoři molekulární biologie, kde vadí i sebemenší<br />

kontaminace vody, se používá voda deionizovaná, která se ještě následně sterilizuje v autoklávu.<br />

Příprava deionizované vody je založená na kombinaci několika separačních metod vedoucí<br />

k odstranění jednotlivých skupin kontaminantů. Souprava je většinou složená z dílčích separátorů<br />

odstraňujících hrubší nečistoty (filtry), ionty (iontoměniče), nepolární látky (adsorbent) a jako<br />

poslední bývá zapojen membránový filtr. Některé aparatury pracují i na principu reverzní osmózy.<br />

Jednotlivé filtry je však nutno po několika měsících provozu vyměňovat a příprava deionizované<br />

vody není proto levnou záležitostí.<br />

Hlavním kritériem čistoty vody je její specifická vodivost. U běžně destilované vody se<br />

pohybuje okolo hodnoty 10 µS.cm -1 . Deionizovaná voda pak mívá tuto hodnotu ještě o řád nižší.<br />

Připravenou destilovanou či deionizovanou vodu skladujeme převážně v plastových nádobách.<br />

Skleněné nádoby nejsou pro dlouhodobější uskladnění vhodné, jelikož se do vody zpětně uvolňují<br />

některé kationty. A pokud to podmínky dovolují, skladujeme vodu v chladu a ve tmě, čímž<br />

zabráníme možné kontaminaci autotrofními mikroorganismy.<br />

CHEMIKÁLIE A JEJICH UCHOVÁVÁNÍ<br />

Jako výchozí látky pro práci v laboratoři používáme většinou průmyslově vyráběné<br />

chemikálie opatřené výrobcem štítkem udávající nám základní informace o dané chemikálii.<br />

Chemikálie jsou dodávány výrobcem ve vhodném obalu, proto se snažíme je dále<br />

nerozdělovat do obalů jiných. Pokud je to nutné, vždy použijeme vhodný obal a dodržujeme<br />

základní pravidla. Látky kapalné uchováváme v láhvích s dvojím uzávěrem. Látky hygroskopické<br />

chráníme proti vzdušné vlhkosti utěsněním víčka, např. parafilmem. Hydroxidy a jejich roztoky<br />

neskladujeme v zábrusových lahvích. Látky citlivé na světlo skladujeme v tmavých nádobách a ve<br />

tmě. Skladování chemikálií v laboratoři má svůj pevný řád, který vychází z bezpečnostních<br />

pravidel, a proto vždy používanou chemikálii vracíme na původní místo. Usnadníme tím i práci<br />

kolegům, kteří budou s danou chemikálii následně pracovat. Důraz je kladen především na<br />

hořlaviny a látky výbušné, které nikdy nesmí být uskladněny pohromadě ve větším množství. Jedy<br />

skladujeme ve speciálních železných skříních pod zámkem. Pozor dáváme taky na uskladnění<br />

těkavých látek v uzavřených prostorách (lednice), skladujeme je tak, aby nedocházelo<br />

k uvolňování jejích par.<br />

Na štítku chemikálie je především její název, sumární vzorec, množství, čistota a<br />

molekulová hmotnost. Dále mohou být uvedeny některé důležité fyzikální vlastnosti a<br />

bezpečnostní informace (obr. 3 a 4). U pevných látek bývá uvedená forma např. krystalický<br />

(crystalisatum), bezvodý (anhydricum), práškový (pulveratum). Podle rostoucí čistoty (tzn.<br />

klesajícího obsahu nečistot) chemikálie dělíme na:<br />

a) technické chemikálie<br />

- surové (crudum)<br />

- technické (technicum)<br />

- čištěné (purum)<br />

b) čisté chemikálie<br />

- čisté (purissimum)<br />

- pro analýzu (p.a., per analysi)<br />

- chemický čisté (purissimum speciale)<br />

14

Chemikálie o vyšší čistotě jsou pak označeny přímo účelem, pro který slouží, např. pro UV<br />

spektrofotometrii, molekulární biologii atd. S čistotou chemikálií však prudce roste jejich cena,<br />

proto chemikálie o vysoké čistotě používáme jen pro tyto speciální účely a je-li to nezbytně<br />

nutné.<br />

Obrázek 3: Příklad štítku chemikálie firmy Sigma. A – název chemikálie, B – katalogové číslo, C<br />

– informace o čistotě a fyzikální vlastnosti, D – doporučená manipulace a podmínky skladování, E –<br />

údaje o riziku, F – minimální obsah, I – piktogram označující rizika, L – sumární vzorec a<br />

molekulová hmotnost.<br />

Obrázek 4: Piktogramy používané pro označení nebezpečných chemikálií.<br />

15

Laboratorní cvičení č. 2<br />

ZÁKLADNÍ ÚKONY V BIOCHEMICKÉ LABORATOŘI<br />

VÁHY A VÁŽENÍ<br />

Ke stanovení váhového množství látky užíváme v chemické laboratoři váhy. Princip vážení<br />

je znám po staletí: jde o srovnávací metodu, kdy se srovnává neznámá hmotnost nějakého<br />

předmětu (navažovací lodička, mikrozkumavka se vzorkem) se známou hmotností standardu<br />

(závaží). Mechanické zařízení řešilo toto srovnání pomocí docílení rovnováhy na páce a mělo tvar<br />

známých miskových vah, které vešly v obecné povědomí i jako symbol používaný pro zobrazování<br />

spravedlnosti. Až do nedávna byly i nejpřesnější analytické váhy postaveny na stejném principu a<br />

vážení obsahovalo postupné přidávání závaží různé (i velmi malé) velikosti. Takový postup byl<br />

samozřejmě zejména pro začátečníky velmi zdlouhavý a možnosti chyb četné.<br />

V současné době patří všechny formy dvoumiskových vah historii a v laboratoři se<br />

setkáváme výhradně s vahami jednomiskovými používající promítací stupnice na stínítko a tedy<br />

zapojených do elektrické sítě. Existují dva rozdílné typy vah lišící se váživostí tzn. maximální<br />

hmotností, kterou můžeme vážit, a přesností, se kterou na nich můžeme hmotnost stanovit:<br />

1) Váhy technické mají podle provedení váživost od 100 g do několika kilogramů. Přesnost<br />

nebývá větší než 5.10 -2 g.<br />

2) Váhy analytické mají váživost obvykle 100 g a přesnost v řádu 10 -4 g.<br />

K orientačnímu zjištění hmotnosti předmětů, které budeme dále vážit přesněji, a ke<br />

zjišťování výtěžků čistících operací používáme tzv. předvážky. Slouží k vážení předmětů do<br />

200 g s přesností ± 0,1 g. V dnešní době se už používají převážně elektronické typy s digitálním<br />

displayem. Jejich forem je řada a procházejí stále vývojem od jednodušších s mechanickoelektrickým<br />

snímačem hmotností přes snímače, kdy je měřen elektrický signál potřebný k vrácení<br />

misky po zatížení do nulové polohy pomocí servomotorku, až k snímačům tenzometrickým.<br />

V našem praktiku nalezneme dva typy analytických vah: robusnější mechanické a moderní<br />

elektronické. K účelům cvičení z laboratorní techniky budeme používat především mechanické<br />

jednomiskové váhy. Jejich princip je znázorněn na obrázku 5. Je zřejmé, že jde vlastně o<br />

klasické jednoramenné váhy pouze upravené pro co nejsnazší obsluhu. Podstatou jejich funkce je<br />

rovnováha na vahadlu, které je zpravidla z lehké slitiny. Aby pohyb vahadla mohl být co<br />

nejjemnější, je jeho osou břit, tj. trojboký hranol z velmi tvrdého materiálu (achát) spočívající<br />

hranou na vyleštěné podložce. Je patrné, že jakékoli prudké pohyby vahadla by v tomto<br />

uspořádání kladly na břit extrémní nároky a velice brzy by byl břit opotřebován. Proto je v<br />

klidovém stavu břit z podložky zvednut a mechanismus spočívá v pevných lůžkách. Tomuto stavu<br />

říkáme aretace. Je pravidlem, že veškeré manipulace, jako je vkládání vzorku do vah či přidávání<br />

nebo ubírání závaží, provádíme výhradně na zaaretovaných vahách. Odaretování, tj. spuštění břitu<br />

na podložku, lze provést pouze v situaci, kdy očekáváme na vahadle rovnováhu. Tento úkon je<br />

nutné provádět pomalu a jemně. Váhy jsou konstruovány tak, že při odaretování se zapojí<br />

elektrický proud a rozsvítí se stinítko, na které je promítána stupnice.<br />

16

Obrázek 5: Schéma jednomiskových vah (B – břit, V – vahadlo, Z – závaží, M – miska, P – protizávaží,<br />

S – stupnice).<br />

Z obrázku 5 je zřejmé, že na jedné straně vahadla je upevněná miska a závěs, na kterém<br />

jsou ovladatelná závaží až do hodnoty váživosti, na straně druhé pak pevné protizávaží. Je-li<br />

miska vah prázdná, je miska se závěsem a závažími právě vyvážená protizávažím a po odaretování<br />

se na světelné stupnici promítne nula. Pokud tomu tak není, jde nejčastěji o malou změnu polohy<br />

zrcátek promítající stupnice, kterou lze při odaretovaných vahách upravit korigačním šroubem na<br />

pravé zadní straně vah.<br />

Pokud na misku vah vložíme nějaký předmět, je rovnováha porušena a k jejímu obnovení<br />

musíme ze závěsu vyzvednout odpovídající závaží. K tomu slouží ovládací mechanismum na levé<br />

dolní straně skříně vah. Skládá se ze tří soustředných šroubů. Pravým vnitřním ovládáme desítky<br />

gramů, středním jednotky a vnějším levým pak desetiny gramů. Hodnoty sejmutých závaží se<br />

ukazují v okénku stupnice. Pokud jsou sejmuta závaží zhruba odpovídající skutečné hmotnosti<br />

váženého předmětu, ukáže se hodnota setin a tisícin na světelné stupnici po odaretování vah.<br />

Desetitisíciny odečteme na základě nonia, tzn. že pravý malý šroub vedle stupnice desetitisícin<br />

nastavíme tak, aby ryska na světelné stupnici byla vyrovnána s nejbližší možnou hodnotou tisícin.<br />

Na stupnici desetitisícin pak odečteme danou hodnotu.<br />

Pro veškeré vážení platí základní pravidlo: chemikálie (kapalné ani pevné) nesmí přijít do<br />

přímého styku s miskami vah! Veškerá manipulace s chemikáliemi (přidávání a ubírání) se musí<br />

provádět zásadně mimo váhy. Případné nečistoty na vahách je třeba okamžitě odstranit<br />

štětečkem.<br />

ÚKOL č. 1: Určete průměrnou hmotnost a chybu měření váženého předmětu<br />

POSTUP<br />

Na analytických vahách postupně určete hmotnost deseti stejných předmětů (porcelánový<br />

kelímek, mikrozkumavka, kyveta) a určete aritmetickou průměrnou hmotnost jednoho předmětu a<br />

chybu měření. Vážení provádějte následovně:<br />

1/ Stanovte, případně upravte, nulovou polohu vah. Aretační šroub má dvě polohy. Váhy jsou plně<br />

odaretovány až ve druhé spodní poloze!<br />

2/ Vážený předmět zvažte na předvážkách na desetiny gramů.<br />

3/ Vážený předmět vložte na misku zaaretovaných vah a nastavte závaží souhlasně s hodnotou<br />

získanou na předvážkách.<br />

17

4/ Opatrně odaretujte. Pokud dojde k prudkému pohybu světelné stupnice a stupnice se dostane<br />

mimo rozsah, váhy zpátky zaaretujte a nastavte závaží o desetinu gramu vyšší či nižší.<br />

5/ Toto provádějte tak dlouho, až se vám podaří světelnou stupnici nastavit v jejím rozsahu.<br />

Vyčkejte až do ustálení rovnováhy.<br />

6/ Poté dolaďte šroubem na desetitisíciny gramu rysku souhlasně se stupnicí a odečtěte získanou<br />

hodnotu s přesností na čtyři desetinná místa.<br />

Nezapomínejte vždy při odaretovaných vahách zavírat obě boční dvířka, aby nebyla rovnováha<br />

rušena okolním prouděním vzduchu.<br />

7/ Váhy zaaretujte a vyjměte vážený předmět. Po skončeném vážení je třeba vrátit všechna<br />

závaží zpět a překontrolovat nulovou polohu vah.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Při měření se můžete dopustit nahodilých a systematických chyb. Zatímco systematické<br />

chyby mohou být zapříčiněny například nevhodným postupem při měření, špatnou kalibrací apod. a<br />

nelze je odstranit opakovaným měřením za stále stejných podmínek, chyby nahodilé můžete<br />

výpočtem konečné hodnoty z dostatečně velkého počtu měření z větší části eliminovat.<br />

Opakovaným měřením se vliv nahodilých chyb zmenší.<br />

Měřenou veličinu označíte A, při n počtu měření naměříte postupně hodnoty A 1 až A n .<br />

Nejlepším odhadem veličiny A je pak průměr nalezených hodnot Â.<br />

 =<br />

n<br />

∑<br />

i=<br />

1<br />

n<br />

Ai<br />

Čím je n větší, tím se hodnota  více blíží správné hodnotě A. Jestliže je odchylka každého<br />

měření od této střední hodnoty označená x i :<br />

x i<br />

A − Â<br />

= i<br />

pak je střední chybu výsledku (aritmetického průměru) definovaná takto:<br />

δ =<br />

n<br />

∑<br />

i=<br />

1<br />

x<br />

2<br />

i<br />

n −1<br />

a výsledek se píše ve tvaru:<br />

A = Â ± δ<br />

Výsledky měření zapište do tabulky a určete aritmetickou průměrnou hmotnost jednoho<br />

předmětu a střední chybu výsledku.<br />

MĚŘENÍ OBJEMŮ KAPALIN<br />

K odměřování objemů kapalin slouží odměrné válce, pipety, byrety, pyknometry a odměrné<br />

baňky.<br />

Odměrné válce (obr. 6-1) se používají jen k přibližnému odměřování kapalin.<br />

Na přesnější měření objemů se používají pipety (buď pouze pro určitý objem, obr. 6-2,<br />

nebo dělené obr. 6-3,4) a byrety u nichž je možno kohoutkem nebo pomocí tlačky regulovat<br />

vytékání kapaliny (obr. 6-5). Všechny tyto nádoby jsou kalibrovány na vylití, tzn., že z nich vyteče<br />

18

přesně vyznačený objem. Při plnění pipet je třeba vždy dbát toho, aby ústí pipety bylo stále<br />

ponořeno pod hladinou kapaliny. Při jeho vynoření nad hladinu dochází k nasátí vzduchu do pipety,<br />

což může zapříčinit i vniknutí kapaliny do úst. Po nasátí kapaliny nad rysku označující požadovaný<br />

objem uzavřeme horní konec pipety ukazovákem – ne palcem. A opatrným uvolňováním prstu po<br />

kapkách vypouštíme kapalinu. Při odečítání je nutno mít oko ve stejné úrovni se značkou.<br />

Odečítáme vždy spodní okraj menisku.<br />

1 2 3 4 5 6 7<br />

Obrázek 6: Pomůcky k měření objemů. 1. kalibrovaný odměrný válec, 2. odměrné baňky, 3.<br />

pipeta, 4. pipeta dělená, 5. byrety, 6. automatická pipeta, 7. automatická pipeta multikanálová.<br />

Jedovaté kapaliny a koncentrované kyseliny a zásady nenasáváme nikdy do pipety ústy, ale<br />

používáme speciální násadky či gumové balónky. Jelikož je pipeta kalibrována na vylití, nikdy se<br />

nevyfukuje, ale její obsah se nechá pouze vytéct a její špička se otře o dno nebo o stěnu<br />

nádobky, do které kapalinu odměřujeme.<br />

V současné době se v biochemické či molekulárně biologické laboratoři se skleněnými<br />

pipetami téměř nesetkáváme, plně je nahradily pipety automatické (obr. 2-6,7) umožňující<br />

přesnější a pohodlnější odměření daného objemu. Jsou vhodné i pro pipetování mikrolitrových<br />

objemů. Automatické pipety jsou vyráběny pro různé rozsahy objemů (5-1 mL, 1000-200 µL, 200-<br />

20 µL, 20-2 µL a 2-0,2 µL). Objem se nastavuje otočením šroubu na stupnici. Nasávání a<br />

vypouštění kapaliny přes nasaditelnou špičku je ovládáno pístem, který má tři polohy – klidovou,<br />

pro nasávání a pro vypouštění (obr. 7).<br />

klidová poloha poloha pro nasávání poloha pro vypouštění<br />

Obrázek 7: Polohy automatické pipety při nasávání a vypouštění kapaliny.<br />

19

Byrety, sloužící k regulovanému odběru kapalin při titracích (obr. 6-5), jsou skleněné<br />

trubice opatřené dělícími značkami. Před výtokem je umístěn kohoutek nebo pružná tlačka s<br />

hadičkou. Některé byrety mají pro lepší odečítání objemu zadní stěnu z bílého skla s modrým<br />

pruhem ve středu.<br />

Odměrné baňky (obr. 6-2), stejně jako pyknometry (nádobky pro stanovování hustoty), jsou<br />

kalibrovány na dolití – to znamená, že při jejich naplnění obsahují právě požadovaný objem. Hrdlo<br />

odměrných baněk je poměrně úzké, po celém obvodu opatřené ryskou. I zde je třeba plnit tak,<br />

aby se spodní okraj menisku dotýkal rysky a při plnění mít oko v úrovní rysky. Podobně jako<br />

odměrné válce i odměrné baňky se vyrábějí v objemech od 5 mL do 2 L. Odměrné baňky se<br />

používají k přípravě roztoků o přesné koncentraci. Vlastní směšovaní složek roztoku provádíme při<br />

ne zcela zaplněné baňce a teprve po úplné homogenizaci a vyrovnání teplot (teplota na kterou je<br />

baňka kalibrována, je uváděna na plášti baňky - většinou 20°C) opatrně doplňujeme rozpouštědlem<br />

po rysku.<br />

ÚKOL č. 2: Práce s automatickou pipetou<br />

Seznamte se se sadou automatických pipet a vyzkoušejte si princip, na kterém fungují.<br />

Připravte tři suché 25 mL kádinky. Kádinku předem zvažte na analytických vahách, a poté do ní<br />

napipetujte pipetou z rozsahem 1-5 mL desetkrát po jednom mililitru destilované vody a opět<br />

zvažte. Stejně postupujte s pipetou o rozsahu 1000-100 µL. Pipetujte 10x po 200 µL a 10x po<br />

400 µL. Do třetí zvážené kádinky, pak pipetujte 10x po 100µL a 10x po 20µL pipetou s rozsahem<br />

200-20 µL.<br />

Uvědomte si, jakou hustotu má destilovaná voda, a vypočítejte, jaké hmotnosti by měly mít<br />

kádinky s vodou. Pokud jste nedosáhli požadované hmotnosti, zopakujte pipetování znovu po<br />

konzultaci s vedoucím cvičení.<br />

PŘÍPRAVA PUFRŮ A MĚŘENÍ pH<br />

Výběr vhodného pufru se řídí především požadovanou hodnotou pH, iontovou silou, možnými<br />

interakcemi s ostatními komponentami reakční směsi apod. Má-li mít pufr dostatečnou pufrační<br />

kapacitu, musíme vybrat takovou slabou kyselinu nebo zásadu, jejíž pK a se neodlišuje od<br />

požadované hodnoty pH o více než 1. Pufrační kapacita závisí také na celkové koncentraci<br />

(molaritě) pufru. Očekáváme-li například, že pH roztoku v průběhu reakce bude klesat (např. při<br />

studiu lipasové reakce, kdy jsou do roztoku uvolňovány ionty H + disociací vznikajících mastných<br />

kyselin), pak volíme pufr o vyšší koncentraci a s pK a pod hodnotou pH, v níž začínáme pokus.<br />

Složení vhodného pufru lze nalézt v laboratorních příručkách. Podle tabulek smícháme<br />

příslušné (obvykle dva) roztoky pro dosažení nominální hodnoty pH. Vždy je nutné skutečnou<br />

hodnotu pH měřením ověřit a případně ji upravit roztokem kyseliny nebo zásady. Jednodušší je<br />

připravit pufr prostou úpravou pH roztoku zvolené soli, kyseliny nebo báze. Pro jeho požadovanou<br />

hodnotu vybereme vhodnou slabou kyselinu nebo zásadu (ev. je v návodu pro práci s daným<br />

materiálem určena) a vypočteme navážku tak, abychom získali potřebný objem pufru o zvolené<br />

koncentraci. Navážené množství rozpustíme v menším objemu vody (asi 80 % konečného objemu).<br />

Pak nastavíme požadované pH roztokem silné (v některých případech i slabé) kyseliny či zásady a<br />

nakonec doplníme vodou na vypočtený objem. Pouze při užití pufrů o více složkách (pokrývajících<br />

široké rozmezí pH) nelze takto postupovat a musíme je namíchat podle tabulky, zkontrolovat a<br />

eventuálně upravit pH.<br />

Většina pufrů podléhá mikrobiální kontaminaci (nejen organické kyseliny, ale i např. fosfát<br />

zplesniví při 0-4 o C během týdne). Pro některé účely je lze konzervovat (azid, toluen, thymol),<br />

20

většinou jsou ale uchovávány v chladničce bez konzervace. Takto skladujeme jen menší množství<br />

připraveného pufru, které brzy spotřebujeme (maximálně do týdne). Připravíme-li si větší<br />

množství pufru do zásoby, uchováváme ho zmrazený v plastové láhvi. Před použitím je nutno<br />

rozmrazit celé množství pufru a roztok zamíchat. Po odebrání potřebného objemu je možné<br />

zbytek opět zmrazit. Popřípadě můžeme pufry autoklávovat. Při manipulaci s takto ošetřenými<br />

roztoky musíme dodržovat sterilní podmínky a pufr zpětně nekontaminovat, např. nesterilní<br />

špičkou automatické pipety.<br />

Hodnotu pH roztoku ovlivňuje jeho ředění, zejména v extrémních hodnotách stupnice (pod<br />

3 a nad 11), v rozmezí fyziologických hodnot již méně. Proto se raději vyhneme přípravě<br />

koncentrovanějších zásobních roztoků, z nichž bychom pak ředěním připravovali pracovní roztok.<br />

Také teplota ovlivňuje pH pufru změnou pK a slabé kyseliny nebo báze. Tabelované hodnoty pH<br />

jsou obvykle vztaženy na 18, 20 nebo 25 o C. V biochemii často pracujeme za chladu, kdy se pH<br />

může lišit od hodnoty nastavené při přípravě pufru za teploty místnosti. Např. měření pH<br />

závislosti enzymové reakce by mohlo být více či méně zkresleno, pokud se podstatně liší teplota<br />

experimentu od teploty, při které byl pufr připraven. V případě nutnosti lze upravit hodnotu pH<br />

za příslušné teploty.<br />

Běžné pufry užívané v biochemických laboratorních postupech pokrývají neutrální až mírně<br />

alkalickou oblast o pH 6,0 – 9,0. Některé operace se provádějí v prostředích více kyselých či<br />

bazických. Nejběžnější kyseliny a báze, užívané k přípravě pufrů v biochemii, jsou v přehledu<br />

uvedeny v tabulce 1. Vedle požadované hodnoty pH se výběr složek řídí také jejich možnými<br />

specifickými vlivy na reakční směs. Někdy může dojít k vysrážení některých komponent směsi<br />

pufrem (K + -chloristanem, soli železa a Ca 2+ -fosfátem, komplexy borátů se sacharidy apod.), k<br />

interakci složek pufru s bílkovinami (Cl - iont s albuminem), k reakci s analytickými činidly a k<br />

inhibici enzymů (v některých případech barbituráty). Naopak někdy mohou být složky pufru<br />

využity jako substráty (citrát, acetát) aj. Pro biochemické účely se používají vedle běžných<br />

anorganických a organických látek i speciální kyseliny a báze, vhodné pro jejich inertnost k dalším<br />

složkám reakčních směsí (viz vysvětlivky pod tabulkou 1).<br />

Koncentrace H + iontů v roztoku se stanovuje spektrálními či elektrochemickými metodami.<br />

První z nich využívají toho, že změna pH vyvolá v některých organických sloučeninách<br />

(acidobazických indikátorech) změnu struktury lišící se spektrálními vlastnostmi (absorpce či<br />

fluorescence). Ve druhém případě se využívá změny elektrochemického potenciálu vlivem pH.<br />

Nejjednodušší spektrální metody měření pH jsou vizuální metody, kdy se sleduje změna<br />

zbarvení indikátoru při změně pH. K této změně dochází u jednotlivých indikátorů v určité oblasti<br />

pH (nalezneme v chemických laboratorních tabulkách). Pro stanovení hodnoty pH musíme vybrat<br />

indikátor, u kterého dochází k barevné změně v přesně definovaném intervalu pH. Jsou vhodné<br />

pro indikaci dosažení požadované hodnoty pH, pro indikaci bodu ekvivalence při acidobazických<br />

titracích, kontrolu udržování pH apod. Používají se ve formě vodného či ethanolického roztoku<br />

(0,04 - 0,10 %), který se přikápne ke sledovanému vzorku. Pro universální použití slouží směsi<br />

indikátorů pokrývající svými barevnými přechody celou škálu pH nebo její část, která nás zajímá.<br />

Užívají se ve formě papírků napuštěných příslušnou směsí indikátorů. Souprava je doplněna<br />

barevnou stupnicí, s kterou porovnáváme zbarvení papírku po namočení do vzorku a ustálení<br />

zbarvení.<br />

Barevný přechod indikátoru můžeme přesněji sledovat pomocí spektrofotometrických<br />

přístrojů. To umožňuje též kvantifikovat barevný přechod při změně pH (stanovení pK a ). Tento<br />

způsob však není běžně užíván, je omezen na speciální případy (např. měření pH uvnitř buněk a<br />

organel nebo v nevodných rozpouštědlech). Při použití fluorescenčních indikátorů jsme zcela<br />

odkázáni na měření pomocí přístrojů – fluorimetrů. Tento způsob nemá visuální alternativu.<br />

21

Tabulka 1: Přehled nejčastěji užívaných pufrů v biochemii.<br />

Kyselina Báze rozsah pH<br />

KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 6,0 – 8,0<br />

HCl Tris a 6,8 – 8,6<br />

HCl Imidazol 6,0 – 8,0<br />

MES b NaOH 5,2 – 7,2<br />

MOPS c NaOH 5,2 – 7,1<br />

TES d NaOH 6,5 – 8,5<br />

HEPES e NaOH 6,5 – 8,5<br />

HCl 5,5-diethylbarbituran-Na 6,8 – 9,6<br />

Kys boritá Tetraboritan-Na 7,0 – 9,3<br />

Tricin f NaOH 7,2 – 9,1<br />

Hcl Glycin 1,1 – 3,7<br />

Glycin NaOH 8,2 – 10,0<br />

Kys. citronová NaOH, KOH 2,2 – 6,2<br />

NaHCO 3 Na 2 CO 3 9,0 – 11,0<br />

Na 2 HPO 4 NaOH 11,0 – 12,0<br />

NaClO 4 NaOH 1,8 – 12,0<br />

HCl NaOH 2,0 – 12,0<br />

Kys. citronová Na 2 HPO 4 2,2 – 8,0<br />

a Tris(hydroxymetyl)aminometan, b kyselina 2-(N-morfolino)etansulfonová, c kyselina 3-(N-morfolino)propansulfonová<br />

d kyselina N-Tris(hydroxymetyl)metyl-2-aminoetansulfonová, e kyselina N-2-hydroxyetylpiperazin-N ’ -2-etansulfonová<br />

f N-Tris(hydroxymetyl)metylglycin<br />

Potenciometricky se pH určuje měřením potenciálu vhodné elektrody. Prakticky se užívá<br />

pouze skleněná elektroda. Její tělo je tvořeno skleněnou trubičkou, responsivním elementem je<br />

tenká skleněná membrána obvykle tvaru baničky na spodním konci. Je naplněna standardním<br />

vnitřním roztokem (0,1 M HCl), v němž je ponořena argentchloridová elektroda (Ag drátek<br />

pokrytý vrstvičkou AgCl). Pro speciální účely mohou mít elektrody různý tvar, např. ploché<br />

k měření pH na povrchu gelu, jehlové, mikroelektrody pro měření v mikrozkumavkách aj.<br />

Při práci s pH-metrem se řídíme návodem výrobce. Obecný postup a zásady práce, zejména<br />

zacházení s elektrodou, lze shrnout do několika bodů:<br />

1) S elektrodou manipulujeme opatrně. Skleněná banička je velmi tenká a křehká. Míchá-li se<br />

měřený roztok, dbáme na to, aby byla mimo dosah pohybujícího se míchadla (ověříme<br />

předem). To bývá aktuální při malých objemech vzorku.<br />

2) Před každým vyjmutím elektrody z roztoku odpojíme její elektrický obvod příslušným<br />

tlačítkem na pH-metru.<br />

3) Elektroda, kterou používáme, nesmí vyschnout. Uchováváme ji ponořenu v pufru o pH, při<br />

kterém nejčastěji měříme. Pokud se s ní denně nepracuje, kontrolujeme ji a doplňujeme<br />

22

odpařenou vodu. Nemá-li se s ní pracovat delší dobu (např. přes prázdniny), je lépe ji omýt<br />

destilovanou vodou a po uschnutí vysušit a bezpečně uložit.<br />

4) Suchou elektrodu (novou nebo dlouhodobě uloženou) je nutno před užitím připravit dle návodu<br />

výrobce. Obvykle se máčí několik hodin v 0,1 M HCl.<br />

5) Referenční kalomelová elektroda může být samostatná nebo kombinovaná se skleněnou. Její<br />

těleso tvaru skleněné trubičky je vyplněno vnitřním roztokem (KCl o různé koncentraci,<br />

obvykle nasycený roztok) a vodivé spojení s vnějším měřeným roztokem zajišťuje (nejde-li o<br />

otevřenou elektrodu) průlinčitá přepážka (frita). Ta je u samostatné elektrody na spodním<br />

konci. U kombinované elektrody tvoří referenční elektroda plášť kolem skleněné a frita je<br />

umístěna na boku tohoto pláště nad baničkou skleněné elektrody. V horní části tělesa<br />

kalomelové elektrody je uzavřený otvůrek, jímž v případě potřeby doplňujeme vnitřní roztok<br />

tak, aby bylo zajištěno vodivé spojení s vývodem na konektor. V případě, že máme nasycenou<br />

kalomelovou elektrodu, se tímto otvůrkem doplňuje pevný KCl tak, aby na dně kalomelové<br />

elektrody vždy bylo možno zahlédnout několik krystalů.<br />

6) Před měřením je nutno přístroj s elektrodou kalibrovat. Elektrodu vyjmeme z roztoku,<br />

v kterém je uchovávána (nezapomeneme rozpojit obvod), opláchneme destilovanou vodou,<br />

odsajeme přebytek vody (filtračním papírem nebo buničitou vatou) a ponoříme do<br />

standardního pufru o pH nejbližším tomu, který bude mít měřený roztok (obvykle bývá<br />

k disposici sada standardních pufrů o pH 4, 7 a 9). Současně ponoříme i referentní elektrodu.<br />

Používáme-li kombinovanou elektrodu, zkontrolujeme, zda je boční vývod referentní<br />

elektrody zcela ponořen pod hladinu. Nastavíme teplotní korekci na teplotu pufru<br />

a kalibračním knoflíkem nastavíme na stupnici nebo digitálním výstupu hodnotu pH<br />

standardního pufru. Elektrodu pak vyjmeme a po opláchnutí ji ponoříme do měřeného vzorku.<br />

Jeho pH nám ukáže výchylka či digitální výstup pH-metru. Kalibraci je nutno provádět vždy<br />

po zapnutí přístroje nebo měníme-li pH měřených vzorků o více než 1. Též při dlouhodobých<br />

měřeních ji občas zkontrolujeme.<br />

7) Některé přístroje umožňují nebo dokonce vyžadují kalibraci na dva pufry, v tomto případě<br />

můžeme pracovat v širším rozmezí pH, aniž bychom vždy znovu museli přístroj kalibrovat.<br />

Zvolíme si vhodné pufry ohraničující oblast, v které hodláme pracovat. Na jeden z nich<br />

nastavíme výchozí hodnotu. Po ponoření elektrod do druhého pufru nastavíme jeho hodnotu<br />

jiným knoflíkem, kterým nastavujeme směrnici závislosti potenciálu na pH. Ta by měla být -<br />

59 mV.pH -1 , její podstatný pokles indikuje malou citlivost elektrody a je třeba zvážit její<br />

výměnu, event. úpravu.<br />

ÚKOL č. 3: Připravte 1/4 litru 0,1M Tris/acetátového pufru o pH 7,6 a 1/4 litru 0,02M K-<br />

fosfátového pufru, pH 7,0<br />

POSTUP<br />

1/ Vypočtěte hmotnost Tris báze - tris(hydroxymetyl)aminomethan (M r = 121,14), potřebné na<br />

přípravu 250 mL pufru o koncentraci 0,1 mol.L -1 .<br />

2/ Odvažte toto množství na předvážkách na jedno desetinné místo do 500 mL kádinky.<br />

3/ Do kádinky přilijte asi 400 mL destilované vody, vložte elektromagnetické míchadlo a na<br />

elektromagnetické míchačce míchejte až do úplné homogenizace roztoku.<br />

4/ Podle návodu nakalibrujte pH metr a poté upravte pH roztoku na hodnotu 7,6 pomocí<br />

koncentrované kyseliny octové. Přídavky kyseliny provádějte pomocí Pasteurovy pipety za stálého<br />

míchání roztoku.<br />

23

5/ Až se hodnota pH stabilizuje (asi jednu minutu je konstantní) vyjměte elektrodu, řádně ji<br />

opláchněte a vraťte ji do ochranného obalu s roztokem.<br />

6/ Pufr z kádinky přelijte kvantitativně pomocí nálevky do 500 mL odměrné baňky a opatrně<br />

doplňte objem po rysku střičkou s destilovanou vodou.<br />

7/ Hotový pufr přelijte do zásobní láhve.<br />

Stejně postupujte při přípravě 250 mL 0,02 M K-fosfátového pufru, navážky kyselého (KH 2 PO 4,<br />

M r = 136,09) a bazického (K 2 HPO 4, M r = 174,18) fosforečnanu si vypočítejte podle následující<br />

tabulky:<br />

Tabulka 2: Příprava K-fosfátového pufru. Na 0,2 M pufr je třeba smíchat: x mL 0,2 M<br />

bazického roztoku fosforečnanu a y mL 0,2 M kyselého roztoku fosforečnanu.<br />

pH x 0.2 M K 2 HPO 4 (mL) y 0.2 M KH 2 PO 4 (mL)<br />

6,0 12,3 87,7<br />

6,5 31,5 68,5<br />

7,0 61,0 39,0<br />

7,5 84,0 16,0<br />

8,0 94,7 5,3<br />

Hodnotu pH pufru zkontrolujte na pH metru a případnou odchylku od pH 7,0 upravte kyselinou<br />

fosforečnou nebo hydroxidem draselným.<br />

PŘÍPRAVA ROZTOKŮ<br />

Základním pravidlem pro jakoukoli přípravu roztoků, vzorků pro analýzu nebo pro účely<br />

preparace nebo čištění sloučenin je, že se rozpouštěná látka přidává do vody a nikdy naopak. Při<br />

přípravě odměrných roztoků přenášíme kvantitativně navážku nebo odměřené množství kapaliny<br />

do vody, která zaujímá asi 1/3 – 1/2 objemu baňky. Kvantitativní přenesení znamená, že navážku<br />

krystalické látky sklepneme do malé nálevky zasunuté do hrdla odměrné baňky, spláchneme<br />

větším množstvím destilované vody ze střičky, vodou ze střičky dále do nálevky vydatně<br />

opláchneme navažovací lodičku a nakonec nálevku vypláchneme vodou ze střičky po celém vnitřním<br />

povrchu. Rozpouštění můžeme urychlovat pouze mícháním krouživým pohybem celé odměrné<br />

baňky, nikdy ne tyčinkou nebo míchadlem. Teprve po úplném rozpuštění navážky a vyrovnání<br />

teploty baňky s okolím můžeme baňku doplnit po rysku destilovanou vodou (poslední kapky<br />

přidáváme pipetou). Pokud je látka, jejíž roztok připravujeme, kapalná, funkci navažovací lodičky<br />

může převzít malý odměrný válec, který se pak rovněž do odměrné baňky vyplachuje. Pokud<br />

kapalnou složku do vody v odměrné baňce pipetujeme, jsme problémů s kvantitativním přenesením<br />

vzorku ušetřeni. Po doplnění odměrné baňky po rysku nezapomeneme obsah důkladně promíchat.<br />

Naplněnou baňku uzavřeme čistou, suchou, v současné době nejčastěji polyethylenovou zátkou a<br />

několikrát obrátíme dnem vzhůru a zpět. Zátku přitom stále v hrdle baňky přidržujeme palcem.<br />

ÚKOL č. 4: Příprava koncentrační řady roztoku kyseliny askorbové pro kinetická měření<br />

Při biochemických experimentech se často setkáte s potřebou připravit sestupnou<br />

koncentrační řadu roztoků o přesných koncentracích, jako třeba při měření kinetických<br />

parametrů různých enzymových systémů, kdy se měří enzymatická aktivita při různé koncentraci<br />

substrátu v reakční směsi. Jako příklad lze uvést měření Michaelisovy konstanty K M , což je<br />

konstanta udávající koncentraci substrátu za daných podmínek, při které enzymová reakce<br />

probíhá polovinou maximální rychlosti. Pro toto stanovení je nutno změřit aktivitu enzymu při<br />

24

ůzných (minimálně pěti) koncentracích substrátu, které jsou v rozmezí maximálně jednoho<br />

řádu. Pro vyhodnocení lze použít několik různých způsobů, jedno z nejznámějších je vyhodnocení<br />

podle Lineweavera a Burka, které vychází z linearizovaného dvojitého reciprokého vynesení<br />

závislosti koncentrace substrátu na reakční rychlosti (aktivitě) enzymu. Převrácená hodnota<br />

průsečíku přímky se zápornou osou x pak udává hodnotu Michaelisovy konstanty.<br />

Pro lepší a přesnější vyhodnocování je proto vhodné sestavit koncentrační řadu tak, aby<br />

převrácené hodnoty výsledné koncentrace substrátu v reakční směsi byly celá čísla s lineárními<br />

rozestupy např. 1,2,3,4… Vzhledem k tomu je pak nutno přizpůsobit a připravit zásobní roztoky<br />

jednotlivých koncentrací substrátu. Nižší koncentrace se většinou připraví ředěním roztoku o<br />

nejvyšší koncentraci.<br />

Zamyslete se nad přípravou koncentrační řady roztoku kyseliny askorbové (M r = 176,1) tak,<br />

aby konečné hodnoty koncentrací resp. jejich převracené hodnoty byly v intervalu od 1-5. Jako<br />

výchozí roztok si připravte 20 mM roztok a počítejte s tím, že budete dávat 50 µL zásobního<br />

roztoku kyseliny askorbové do reakční směsi o celkovém objemu 1 mL. Doplňte následující<br />

tabulku:<br />

číslo<br />

roztoku<br />

destilovaná<br />

voda<br />

(mL)<br />

k.askorbová<br />

20 mmol.L -1<br />

(mL)<br />

k. askorbová –<br />

zásobní roztok<br />

(mmol.L -1 )<br />

k.askorbová<br />

konečná konc.<br />

v reakční směsi<br />

[S] (mmol.L -1 )<br />

1 1,0<br />

2 2,0<br />

3 3,0<br />

4 4,0<br />

5 5,0<br />

převrácená hodnota<br />

konečné konc. k.<br />

askorbové<br />

[1/S]<br />

Jinou a pravděpodobně přesnější metodou sestavení této kalibrační řady je postupné<br />

rozřeďování roztoku o vyšší koncentraci na roztok o koncentraci nižší. Použijete sadu 5<br />

odměrných baněk. Do první připravte roztok o nejvyšší koncentraci, jeho vypočtený podíl pak<br />

pipetou přeneste do druhé odměrné baňky a doplňte po rysku. Stejně postupujte k nejnižší<br />

koncentraci. Tuto metodu proveďte prakticky a připravte výše uvedenou koncentrační řadu<br />

kyseliny askorbové použitelnou pro kinetické měření a vyhodnocení podle Lineweavera a Burka.<br />

Doporučená literatura:<br />

Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.<br />

Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.<br />

25

Laboratorní cvičení č. 3<br />

ÚPRAVA BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU, PRECIPITAČNÍ TECHNIKY, DIALÝZA,<br />

CENTRIFUGACE, ULTRAFILTRACE.<br />

ÚPRAVA BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU<br />

K biochemickým studiím se používá nejrůznější biologický materiál, který příroda<br />

poskytuje. Vzhledem k jeho různorodosti je <strong>technika</strong> zpracování mnohdy velmi odlišná a řídí se<br />

účelem, k jakým studiím má být použit. Způsob zpracování materiálů bývá často odlišný podle<br />

toho, zda má být výchozí surovinou pro izolaci, detekci nějaké sloučeniny či skupiny látek nebo<br />

zda chceme studovat jejich metabolismus.<br />

Má-li být izolována nějaká látka nebo skupina látek z biologického materiálu (např. vitamín,<br />

bílkovina, sacharid apod.) je důležité zvolit vhodnou výchozí surovinu. Pro izolaci se hodí nejlépe<br />

takový biologický materiál, v kterém je požadovaná látka v nejvyšší koncentraci, je dostupný a<br />

jeho cena přijatelná. Vybraný živočišný, rostlinný nebo mikrobiální materiál je třeba v prvním<br />

kroku zhomogenizovat. Rozrušení rostlinných a živočišných buněk nedělá obvykle potíže. Jinak<br />

však je tomu při izolacích z buněk mikroorganismů. Buněčná stěna mikroorganismů je velmi<br />

rezistentní a její narušení vyžaduje zvláštní postupy, viz níže.<br />

1) Mletí<br />

Suchý materiál může být rozemlet v různých typech mlýnků. Semena se melou v kulových<br />

mlýnech nebo mlýnech s otočnými noži. K mletí živočišných materiálů se velmi dobře hodí masový<br />

strojek. Tkáň se v něm řeže a drtí. Hrubost nebo jemnost lze regulovat vložením vhodné<br />

destičky, kterou se rozemletý materiál protlačuje. Všechny uvedené strojky a mlýnky většinou<br />

může nahradit běžný univerzální kuchyňský robot, který je vybaven mixerem, mlýnkem, masovým<br />

strojkem i struhadly.<br />

2) Homogenizace<br />

Na rozdíl od mletí nasucho je v biochemické práci chápána homogenizace jako důkladné<br />

rozmělnění materiálu za přídavku vody nebo vhodných pufru či fyziologických roztoků.<br />

Pro homogenizaci malých množství je nejvhodnější roztírání materiálu ve třecí misce za<br />

přídavku mořského písku, skelného prachu nebo jiného abraziva. Tužší materiály se před<br />

homogenizací zmrazí kapalným dusíkem, který je učiní křehčími k rozmělnění. Homogenizaci lze<br />

rovněž provést ve výkonném mixeru.<br />

K narušení buněčné stěny a membrány mikroorganismů, tzv. desintegraci, se používá ještě<br />

některých speciálních metod. Např. působení chemických činidel (detergenty), působení enzymů<br />

štěpích polysacharidy buněčných stěn (lysozym, celulasa), krátké působení ultrazvuku, opakované<br />

zmrazování a rozmrazování. Přehled nejužívanějších homogenizačních technik je uveden v tabulce<br />

3.<br />

PRECIPITAČNÍ METODY<br />

V počátečních fázích izolací biopolymerů jsou většinou používány méně pracné metody<br />

fázové separace, jako jsou precipitace (frakcionace), dialýza či vsádková adsorpce. Tyto metody<br />

nemají zpravidla velké rozlišení, umožňují však snadné a rychlé zakoncentrování preparátu po<br />

základní extrakci biologického materiálu. Srážení se provádí pomocí neutrálních solí, změnou pH,<br />

organickými rozpouštědly či teplotou.<br />

26

Tabulka 3: Přehled nejpoužívanějších homogenizačních technik.<br />

METODA PŘÍKLAD POUŽITÍ PRINCIP<br />

Šetrné<br />

lyse buněk erythrocyty porušení buněčné membrány osmotickým<br />

tlakem<br />

působení enzymů bakterie štěpení buněčné stěny specifickými<br />

enzymy<br />

působení chemikálií extrakce kvasinek toluenem částečná solubilizace buněčné stěny<br />

homogenizace jaterní tkáň mechanické porušení buněk protlačováním<br />

úzkou štěrbinou<br />

mletí svalová tkáň, semena působení střižných sil, mechanické<br />

porušení tkáně<br />

Střední<br />

mixování v nožových<br />

mixeréch<br />

živočišná a rostlinná pletiva<br />

působení střižných sil<br />

mletí s abrazivy rostlinné tkáně, bakterie mechanické porušení buněk<br />

Intenzivní<br />

ultrazvuk buněčné suspenze náhle změny tlaku a teploty při zániku<br />

vznikajících mikrobublin<br />

kuličkový mlýn buněčné suspenze mechanické porušení buněk rychlou vibrací<br />

skleněných kuliček<br />

Rozpustnost proteinu ve vodných roztocích závisí na jejich solvatačním obalu, tj. vrstvě<br />

molekul vody a iontů, které obalují jejich molekuly. Přičinou solvatačních obalu jsou<br />

elektrostatické síly mezi polárními strukturami proteinů a dipóly vody. Rozpustnost proteinů se<br />

s rostoucí koncentrací solí zpravidla nejprve zvyšuje (vsolovací efekt), prochází maximem a<br />

posléze klesá (vysolovací efekt). Vsolování je způsobeno vytvořením iontového oblaku kolem<br />

ionizovaných skupin biopolymerů – dochází ke snížení interakce nabitých skupin biopolymerů mezi<br />

sebou a zvýšení interakcí s rozpouštědlem. Dalším přídavkem neutrální soli se snižuje tloušťka<br />

solvatačního obalu a efektivní koncentrace vody, a tím se snižuje i rozpustnost proteinu.<br />

Charakter závislosti rozpustnosti na koncentraci soli je určen nejen typem biopolymeru, ale i<br />

typem soli a hodnotou pH. Nejnižší je rozpustnost v izoelektrickém bodě, tj. hodnota pH, při<br />

které má molekula biopolymeru neutrální náboj.<br />

Při frakcionaci organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou (methanol, ethanol, aceton) se<br />

využívá rozdílná rozpustnost proteinů v těchto rozpouštědlech a ve vodě. Zvyšováním koncentrace<br />

organického rozpouštědla se zmenšuje i solvatační obal kolem molekul proteinů, což nakonec vede<br />

k jejich vysrážení. Frakcionace organickými rozpouštědly se může kombinovat se změnami<br />

koncentrace solí, pH a teploty.<br />

1) Tepelná denaturace<br />

Tato metoda se používá zejména při izolaci některých termostabilních enzymů<br />

v počátečních fázích purifikačního procesu. Často se do roztoku přidává substrát, koenzym nebo<br />

inhibitor příslušného enzymu, neboť přítomnost těchto látek vede ke tvorbě komplexů enzym –<br />

ligand, které se zpravidla vyznačují zvýšenou odolností vůči denaturačním vlivům. Roztok je<br />

27

zahřát po jistou dobu na určitou teplotu, pak je rychle ochlazen v ledové lázni a koagulované<br />

balastní biopolymery, zejména termolabilní proteiny, se odstraní centrifugací nebo filtrací. Jako<br />

příklad můžeme uvést přípravu kvasničné alkoholdehydrogenasy, kdy se extrakt v prostředí<br />

pyrofosfátového pufru zahřeje po dobu 15 minut na teplotu 55°C na vodní lázní a balastní<br />

proteiny se odstraní centrifugací.<br />

2) Vysolování neutrálními solemi<br />

Precipitovatelnost určitého proteinu z vodného roztoku je závislá na druhu použité soli,<br />

iontové síle, hodnotě pH, teplotě a koncentraci proteinů. Při vysolovacím efektu se uplatňuje<br />

daleko více povaha aniontu než kationtu. Dvojmocné a vícemocné anionty precipitují proteiny<br />

většinou mnohem účinněji než anionty jednomocné. Nejčastěji používanou solí pro vysolování<br />

biopolymerů je síran amonný. Jeho výhodou je značná rozpustnost (např. ve srovnání s Na 2 SO 4 ),<br />

která je jen nepatrně závislá na teplotě, a malý denaturační vliv. Doporučuje se používat<br />

dostatečně čistý síran amonný bez obsahu kovových iontů, které by mohly interagovat s proteiny<br />

a katalyzovat některé oxidační reakce. Jiné soli se používají jen ve speciálních případech, např.<br />

síran hořečnatý k izolaci γ-globulinové frakce ze séra nebo chlorid sodný k precipitaci<br />

fibrinogenu. Díky své velké kapacitě a tlumivé schopnosti by byly fosforečnany ideálními<br />

srážedly, ale pro svou špatnou rozpustnost se v praxi používají jen velmi omezeně. Často<br />

používanou solí pro precipitaci některých enzymů je i chlorid manganatý.<br />

Tabulka 4: Tabulka uvádí množství pevného síranu amonného, které je třeba přidat k<br />

jednomu litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech saturace roztoku síranem<br />

amonným.<br />

Výsledná koncentrace síranu amonného (% saturace)<br />

10 15 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100<br />

0 56 84 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 610 662 713 767<br />

10 28 57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 540 592 640 694<br />

15 28 57 88 107 120 153 185 220 256 294 333 373 415 459 506 556 605 657<br />

20 29 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 471 520 569 619<br />

25 30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 436 485 533 583<br />

30 19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 401 449 496 546<br />

33 12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 378 426 472 522<br />

35 31 63 94 129 164 200 238 278 319 364 411 457 506<br />

40 31 63 97 132 168 205 245 285 328 375 420 469<br />

45 32 65 99 134 171 210 250 293 339 383 431<br />

50 33 66 101 137 176 214 256 302 345 392<br />

55 33 67 103 141 179 220 264 307 353<br />

60 34 69 105 143 183 227 269 314<br />

65 34 70 107 147 190 232 275<br />

70 35 72 111 153 194 237<br />

75 36 74 115 155 198<br />

80 38 77 117 157<br />

85 39 77 118<br />

90 38 77<br />

95 39<br />

Výchozí koncentrace síranu amonného (% saturace)<br />

Vlastní precipitace se provádí tak, že se do roztoku biopolymerů sůl zpravidla přidává po<br />

malých dávkách v pevném stavu nebo jako nasycený vodný roztok za stalého míchání, aby nedošlo<br />

k lokálnímu přesycení. Vysolování probíhá při konstantní teplotě, chlazení není vždy nezbytné.<br />

Optimální koncentrační rozsah pro frakcionaci daného proteinu je nutno najít empiricky.<br />

Množství síranu amonného, potřebného k dosažení určitého stupně nasycení, lze snadno zjistit<br />

z tabulky 4. Po přidání takového množství síranu amonného, které odpovídá 30% množství<br />

potřebného ke vzniku nasyceného roztoku této soli (v praxi označováno jako 30% nasycení), se<br />

28

srážejí nukleové kyseliny a poměrně málo proteinů. Mezi 30 – 75% nasycení pak precipituje<br />

většina proteinů. V tomto rozmezí je třeba nasycení zvyšovat po poměrně malých dávkách. Po<br />

přidání příslušného množství soli se roztok biopolymeru míchá ještě asi 20 minut a precipitát se<br />

oddělí centrifugací. Pokud je daný biopolymer obsažen v precipitátu, lze po rozpuštění sraženiny<br />

získat jeho koncentrovaný roztok. Síran amonný se z roztoku oddělí většinou dialýzou, gelovou<br />

chromatografií nebo ultrafiltrací.<br />

3) Srážení biopolymerů ostatními látkami<br />

Poměrně starou metodou je precipitace biopolymerů organickými rozpouštědly. Tyto látky<br />

snižují dialektrickou konstantu prostředí, tím přispívají ke snížení rozpustnosti a k vysrážení<br />

biopolymeru (zvyšují se elektrostatické interakce mezi nabitými skupinami biopolymeru a<br />

molekuly se pak snáze shlukují do precipitujících agregátů). Při izolaci nukleových kyselin se<br />

používá srážení koncentrovaným ethanolem (pro kvantitavní odstranění nukleových kyselin<br />

z roztoku se často používají ribonukleasy a deoxyribonukleasy). Při separaci proteinů se<br />

organická rozpouštědla využívají málo, je zde nebezpečí denaturace, které se snižuje udržováním<br />

roztoku při teplotě 0°C. Ethanolová precipitace má výhodu v tom, že odpadá potřeba dialýzy.<br />

Kromě ethanolu se především pro frakcionaci plazmových (sérových) proteinů používá methanol,<br />

aceton a ether. Při separaci citlivějších proteinů jsou organická rozpouštědla nahrazována<br />

některými kyselinami, jako je kyselina kaprylová, rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát) a<br />

nebo organickými polymery, např. polyethylenglykolem. Ke zvýšení specifičnosti srážení je možné<br />

do roztoku přidat nějaké specifické ligandy bílkovin, např. kofaktory nebo zinečnaté ionty.<br />

V poslední době se také začal pro některé kyselé proteiny používat bazický protamin sulfát,<br />

nízkomolekulární protein izolovaný z rybího spermatu. Princip kyselé či bazické frakcionace<br />

spočívá v pomalém okyselení či zalkalizování roztoku biopolymerů na určitou hodnotu pH pomocí<br />

silné kyseliny či zásady, na které se ponechá po určitou dobu (1 hod) a po odstranění vysrážených<br />

balastů vrátí na původní hodnotu.<br />

Pokud nám jde o kvantitativní oddělení biopolymerů z roztoku, tzn. deproteinizaci,<br />

použijeme drastičtějších metod srážení. Lze využít např. srážecí schopnost iontů těžkých kovů<br />

(Hg 2+ , Pb 2+ , Cd 2+ ) nebo složitějších aniontů, které tvoří s proteiny těžko rozpustné komplexy<br />

(kyseliny trichloroctová, pikrová, chloristá, fosfowolframová atd.). Tyto metody používáme tehdy<br />

když se nezajímáme o biopolymery, ale naopak o nízkomolekulární složky biologického materiálu.<br />

CENTRIFUGACE<br />

Centrifugace čili odstřeďování patří k nejběžnějším operacím v biochemické laboratoři.<br />

Dovoluje oddělit složky suspenze nebo emulze na základě rozdílných hustot. Bývá často rychlejší<br />

a pohodlnější než filtrace a v některých případech vede i k lepšímu oddělení pevné a kapalné fáze.<br />

Kromě nahrazení nebo doplnění filtrace, zvláště je-li suspendovaná látka velmi jemná, špatně<br />

filtrovatelná a filtrace zdlouhavá, má odstřeďování v biochemii i jiný význam. Slouží k některým<br />

speciálním preparativním a analytickým účelům (např. izolace mitochondrií diferenční<br />

centrifugací). Dále je to příprava buněčných struktur gradientovou centrifugací a z analytických<br />

aplikací pak především stanovení relativních molekulových hmotností sloučenin a stanovení čistoty<br />

izolovaných preparátů.<br />

Při odstřeďování působí na sedimentující částice odstředivá síla (P), kterou lze vyjádřit<br />

vztahem:<br />

P = m.r.ω 2<br />

kde m je hmotnost částice, r je poloměr otáčení a ω je úhlová rychlost. Pro praktické výpočty se<br />

však zavádí veličina relativní odstředivé zrychlení R, které udává, kolikrát je toto zrychlení větší<br />

než zemské gravitační zrychlení g a je dána vztahem:<br />

R = 1,118.r.N 2 .10 -5<br />

29

kde N je počet otáček za minutu a r je poloměr otáčení v cm. Je nutno ji uvádět jako hlavní<br />

charakteristiku centrifugace. Ze vzorce je zřejmé, že pouhý údaj počtu otáček za minutu<br />

necharakterizuje proces centrifugace.<br />

Aby se nemuselo v každém případě vypočítávat relativní odstředivé zrychlení, výrobci<br />

často dodávají k odstředivkám diagramy, z nichž se hodnota R snadno odvodí. Běžně se relativní<br />

odstředivé zrychlení odečítá také z univerzálního nomogramu, viz obrázek 8.<br />

Existuje celá řada typu centrifug, které se liší velikostí (od malých stolních až po<br />

velkoobjemové průmyslové odstředivky), dosahovaným zrychlením a tvarem rotorů (výkyvné a<br />

úhlové). Ve výkyvných rotorech jsou kyvety uloženy v pouzdrech, která jsou volně zavěšena<br />

v čepech vlastního rotoru a kyvety jsou během odstřeďování ve vodorovné poloze. Naproti tomu<br />

v úhlových rotorech jsou kyvety fixovány v určitém úhlu (45 - 50°) k ose otáčení.<br />

Zvláštní kategorii tvoří ultracentrifugy, na nichž lze dosáhnout relativního odstředivého<br />

zrychlení 100.000 x g a více. Liší se od běžných centrifug zejména tím, že prostor s rotorem musí<br />

být při odstřeďování evakuován. Používají se pro dělení biopolymerů a subcelulárních částic<br />

v hustotním gradientu sacharosy nebo cesných solí. Tyto techniky lze provádět jak v analytickém,<br />

tak i v preparativním měřítku. Analytické centrifugy jsou navíc opatřeny optickým zařízením<br />

umožňujícím sledovat rozhraní tvořená jednotlivými sedimentujicími látkami.<br />

Obrázek 8: Nomogram na výpočet relativní odstředívé síly R.<br />

RPM počet otáček za<br />

minutu (revolutions per<br />

minute)<br />

xg relativní odstředivé<br />

zrychlení (R)<br />

poloměr rotoru – vzdálenost<br />

osy rotoru od středu dna<br />

kyvety (v mm)<br />

RPM<br />

xg<br />

poloměr rotoru<br />

Pro většinu prací preparačních i analytických jsou požadovány centrifugy chlazené. Chlazení<br />

centrifug je zajišťováno chladicími agregáty, zabudovanými do jediného provozního celku<br />

s centrifugou a je ovládáno termostatem. Protilehlé kyvety (u vysokootáčkových centrifug lépe<br />

všechny kyvety) musejí být staticky a dynamicky vyváženy. Z bezpečnostních důvodu i z hlediska<br />

ochrany centrifugy je nutno klást na vyvažování kyvet zvýšenou pozornost. Každá nepřesnost<br />

v dynamickém i statickém vyvážení se mnohonásobně projeví zvětšením odstředivého tlaku na<br />

30

jednu stranu osy. Osa se nerovnovážným zatížením snadno ohne nebo se poškodí ložisko. Při<br />

chodu odstředivky se při nepřesném vyvážení projevují silné vibrace. Statického vyvážení se<br />

dosáhne tak, že se na technických váhách s přesnosti na jeden gram vyváží protilehlá pouzdra<br />

s kyvetami naplněnými suspenzí určenou k centrifugaci. Daleko větší pozornost je třeba klást<br />

dynamickému vyvážení protilehlých kyvet. Protilehlé kyvety musí mít stejnou velikost, hmotnost a<br />

stejně umístěné těžiště. To znamená, že protilehlé kyvety musí být naplněny stejnou suspenzí,<br />

přesněji řečeno suspenzi o stejné hustotě. Nelze tedy například při precipitaci síranem amonným<br />

kyvetu s tímto roztokem vyvážit kyvetou s destilovanou vodou.<br />

DIALÝZA<br />

Tato separační <strong>technika</strong> využívá difúze nízkomolekulárních látek membránou nepropustnou<br />

pro velké molekuly a částice z roztoku o vyšší koncentraci do roztoku o koncentraci nižší.<br />

V okamžiku, kdy se koncentrace látek procházejících membránou na obou stranách membrány<br />

vyrovnají, proces se zastaví. Molekuly proteinů neprocházejí pro svou velikost otvory dialyzačních<br />

membrán. Dialýza umožňuje v biochemii např. snadné oddělení solí od roztoků proteinů (při<br />

vysolování proteinů síranem amonným), uplatňuje se i při krystalizaci proteinů. Nejčastěji se<br />

využívá tam, kde chceme vysokomolekulární látky zbavit nízkomolekulárních nečistot.<br />

Dříve se používaly pro dialýzu membrány typu: kolodium, celofán, pergamen anebo i<br />

membrány zvířecího původu (střeva, vaječná blanka, různé měchýře). Nyní jsou komerčně<br />

dostupné umělé membrány s vhodnou velikosti pórů ve tvaru dlouhé trubice různého průměru,<br />

běžným laboratorním slangem nazývané dialyzační střeva. Potřebný díl dialyzační trubice se<br />

odstřihne a na jednom konci pevně zaváže nebo uzavře speciální svorkou. Před naplněním novou<br />

trubici vždy pořádně propláchneme a necháme chvíli namočenou v destilované vodě, je třeba<br />

vymýt glycerol, kterým jsou trubice impregnovány. Po naplnění preparátem určeným k dialýze se<br />

uzavře i druhý konec trubice a vloží se do nádoby s vodou nebo pufrem o nízké iontové síle.<br />

Snažíme se, aby dialýza byla co nejrychlejší. Rychlost dialýzy závisí na koncentračním spádu.<br />

(zpočátku je rychlejší, postupně se zpomaluje), který je především ovlivněn poměrem objemů vně<br />

a uvnitř membrány. Dále rychlost tohoto procesu závisí na teplotě, na počtu a velikostí pórů<br />

v membráně, na síle membrány, na elektrických interakcích mezi membránou a difundujícími<br />

částicemi a na velikosti plochy membrány. Míchání a obvykle i výměna kapaliny velmi zrychlují<br />

postup dialýzy. Protože dialýza trvá zpravidla desítky hodin, provádí se obvykle přes noc při<br />

teplotě 0 - 4°C, aby se zabránilo denaturaci proteinů a množení mikroorganismů.<br />

ULTRAFILTRACE<br />

Podobně jako dialýza, používá se ultrafiltrace pro separaci či zakoncentrování<br />

rozpuštěných látek s molekulovou hmotností vyšší než 10 -4 . Ultrafiltrace je proces, při kterém<br />

rozpouštědlo a rozpuštěné látky až do určité kritické velikosti procházejí membránou na základě<br />

tlakového gradientu (obr. 9), určujícím faktorem je pórovitost membrány. Při ultrafiltraci<br />

můžeme využívat buď pozitivní nebo negativní tlak. Pozitivního tlaku dosahujeme inertním plynem,<br />

převážně dusíkem a udržujeme ho nad filtrovaným roztokem (retentát). Roztoky se filtrují pod<br />

tlakem 0,05 až 0,5 MPa anebo působením odstředivé síly v centrifuze. Naopak negativní tlak<br />

udržujeme pomocí vakua, které působí v prostoru již přefiltrovaného roztoku (difuzát).<br />

Rozpouštědlo a rozpuštěné látky s menšími relativními molekulovými hmotnostmi než jsou póry v<br />

membráně procházejí do ultrafiltrátu. Látky s vyššími molekulovými hmotnostmi se pak nad<br />

membránou postupně zahušťují. Zakoncentrovaný retentát můžeme zředit čistým rozpouštědlem<br />

a pokračovat v ultrafiltraci. Tím se postupně snižuje podíl nízkomolekulárních látek v retentátu.<br />

Při tomto způsobu dialýzy, nazývaném diafiltrace, se požadovaného výsledku dosáhne za 1/10 až<br />

1/100 času potřebného pro konvenční dialýzu.<br />

31

Hlavním požadavkem na membránový filtr je, aby s dostatečnou rychlosti propouštěl<br />

rozpouštědlo (vodu) a nízkomolekulární látky a aby jeho póry měly standardní rozměr. Tyto<br />

vlastnosti nemají klasické celofánové či celulosové membrány používané pro klasickou filtraci či<br />

dialýzu, jejichž stěna má šířku 0,1 – 1,0 mm. Proto se membránové filtry zhotovují z anizotropních<br />

polymerů se šířkou stěny 0,1 – 1,5 µm. S takovými filtry by se však těžko manipulovalo, a proto se<br />

připevňují na podpůrný materiál, který má obvykle podobné chemické složení a jeho póry jsou<br />

podstatně větší než póry ultrafiltru. Průměr pórů membránových filtrů se pohybuje v rozmezí od<br />

0,1 do 50 nm.<br />

Obrázek 9: Zařízení pro ultrafiltraci.<br />

1/ elektromagnetické míchadlo<br />

2/ zásobník na dusík<br />

3/ ocelová láhev s dusíkem<br />

4/ regulátor tlaku<br />

5/ elektromagnetické míchadlo<br />

6/ tlakový zabezpečovací ventil<br />

7/ přívodová hadice dusíku<br />

8/ ultrafiltrační cela<br />

9/ svírací stojan<br />

10/ odtok difuzátu<br />

11/ kontrola rychlosti míchání<br />

V biochemických laboratořích se nejčastěji setkáváme s ultrafiltračními celami a filtry<br />

firmy Amicon (obr. 10). Tato firma dodává filtry s póry o průměru 0,2 - 20 nm, které umožňují<br />

dělit látky s relativními molekulovými hmotnostmi od 500 do 300.000 Da. Podle typů jsou odolné<br />

vůči vodě a různým organickým rozpouštědlům, dá se s nimi pracovat až do teploty 200°C a lze je<br />

vystavit působení zředěných kyselin, hydroxidů a oxidačních látek. Při správném zacházení se<br />

mohou ultrafiltry používat mnohonásobněkrát za sebou. Pro účinnou ultrafiltraci musíme zajistit,<br />

aby se zadržované molekuly nehromadily na povrchu filtru a nezacpávaly jeho póry, toho<br />

dosáhneme kontinuálním mícháním nebo probubláváním.<br />

Obrázek 10: Ultrafiltrační cela Amicon 8200.<br />

1/ víko<br />

2/ nádoba na retentát<br />

3/ nosič membrány s odvodnými kanálky<br />

4/ spodní šroub<br />

5/ stojan na celu<br />

6/ magnetické míchadlo<br />

7-8/ těsnění<br />

9-10/ přívod dusíku<br />

11/ odvod difuzátu<br />

32

ÚKOL č. 5: Homogenizace semen ječmene, precipitace jejich proteinů síranem amonným<br />

s následnou dialýzou a ultrafiltrací na zařízení Amicon<br />

Nabobtnaná semena obilnin jsou vhodným zdrojem pro studium enzymů aktivních v raných<br />

fázích vývoje rostlin, zejména pro vysoké aktivity a snadnou finanční dostupnost. V naší<br />

laboratoři se ze semen ječmene a pšenice izoluje cytokinin dehydrogenasa (EC 1.5.99.12), enzym<br />

odbourávající rostlinné hormony cytokininy s nenasyceným postranním řetězcem, např.<br />

isopentenyladenin či zeatin. Naklíčený ječmen (slad) je také výborným zdrojem amylas, enzymů<br />

významných v technologické praxi, především v lihovarnictví a pivovarnictví. Ve sladu jsou<br />

zastoupeny dva enzymy, které štěpí α(1-4) glykosidovou vazbu polysacharidů: α-amylasa (1,4-α-Dglukan-glukanonhydrolasa,<br />

EC 3.2.1.1) a β-amylasa (1,4-α-D-glukan-maltohydrolasa, EC 3.2.1.2).<br />

Jak napovídají systematické názvy, první enzym štěpí molekulu škrobu ve vnitřní části řetězce za<br />

vzniku dextrinu (glukanů), kdežto druhý odštěpuje disacharid maltosu z neredukujícího konce<br />

řetězce.<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE<br />

50 g nabobtnalých ječmenných obilek, 0,1 M Tris/acetátový pufr, pH 7,6, pevný síran amonný,<br />

Nesslerovo činidlo na amonné ionty.<br />

Strojek na mletí masa, centrifuga, kyvety, třecí miska s tloučkem, elektromagnetická míchačka,<br />

míchadlo, miska s ledem, dialyzační střevo, spona na dialyzační střevo, odměrné válce,<br />

ultrafiltrační cela Amicon, ocelová láhev s dusíkem, předvážky, zkumavky, pipety, kádinky, lžička.<br />

POJMY<br />

Precipitát - pevná, usazená část po centrifugaci<br />

Supernatant – čirá kapalina nad precipitátem<br />

Difuzát – kapalina procházející membránou při ultrafiltraci<br />

Retentát – roztok vysokomolekulárních látek neprocházející ultrafiltrační<br />

membránou a zůstávající v ultrafiltrační cele.<br />

POSTUP<br />

Nabobtnaná semena rozemelte na strojku na maso a navažte přesně 50 gramů rozemleté<br />

kaše. Proteiny extrahujte dvojnásobným objemem (100 mL) 0,1 M Tris/acetátového pufru, pH<br />

7,6. Extrakt nechejte za občasného míchání stát 10 minut na ledu. Po deseti minutách extrakt<br />

rozdělte do dvou kyvet, které je třeba pečlivě vyvážit na předvážkách. Centrifugujte 20 minut<br />

při maximálním možném g (12.000 x g). Supernatant opatrně přelijte do čisté kádinky a<br />

odměrným válcem změřte objem. 1/2 mililitru extraktu odeberte do mikrozkumavky a změřte<br />

v něm obsah proteinů (navazuje na lab. cvičení č. 5). Podle tabulky 4 zjistěte potřebné množství<br />

síranu amonného pro 50% nasycení, toto množství síranu amonného odvážte a důkladně rozetřete<br />

ve třecí misce. Do kádinky s extraktem dejte elektromagnetické míchadlo a kádinku umístěte do<br />

misky s ledem na elektromagnetickou míchačku. Po dobu 20 minut postupně k extraktu přidávejte<br />

odvážené množství síranu amonného, další přídavek vždy až po rozpuštění předešlého. Dokonale<br />

rozpuštěný extrakt se síranem amonným rozdělte do dvou kyvet a centrifugujte (12.000 x g, 20<br />

min). Supernatant odstraňte a precipitát rozpusťte v 10 mL 0,02 M Tris/acetátového pufru, pH<br />

7,6, který připravíte naředěním 0,1 M pufru. 5 mL rozpuštěného precipitátu nalijte do předem<br />

namočeného dialyzačního střeva a nechejte dialyzovat přes noc proti stejnému pufru v 1 L<br />

kádině.<br />

Ze zbylých 5 mL rozpuštěného precipitátu odeberte do mikrozkumavky 0,5 mL (vzorek č. 1)<br />

a zbytek umístěte do ultrafiltrační cely Amicon, kterou si předem sestavíte dle návodu. Celu<br />

umístěte do misky s ledem na elektromagnetickou míchačku a napojte láhev s dusíkem přes<br />

33

gumovou hadici a redukční ventil. Otevřením láhve s dusíkem se vytvoří v cele tlak, který spustí<br />

vlastní ultrafiltraci. Difuzát jímejte do předem připraveného 5 mL odměrného válce. Po odkapání<br />

3 mL difuzátu (vzorek č. 2), uzavřete přívod dusíku, otevřete celu a k retentátu přidejte 20 mL<br />

0,02 M Tris/acetátového pufru, pH 7,6, celu uzavřete a opět spusťte ultrafiltraci. Difuzát<br />

jímejte do odměrného válce a po odkapání 18 mL (vzorek č. 3), zopakujte předcházející krok<br />

(vzorek č. 4). Po ukončení druhé fáze ultrafiltrace celu otevřete a zbylý retentát opatrně<br />

převeďte pomocí pipety do mikrozkumavky (vzorek č. 5), tak aby jste se špičkou pipety nedotkli<br />

filtru. Určete objem zahuštěného retentátu a změřte v něm obsah proteinů (navazuje na cvičení<br />

č. 5). Celu poté důkladně vypláchněte destilovanou vodou a vraťte vedoucímu cvičení.<br />

Nezapomeňte také zkontrolovat redukční ventil láhve s dusíkem, zda je správně uzavřen a zda<br />

manometr ventilu ukazuje nulový tlak.<br />

Stanovení amonných iontů reakcí s Nesslerovým činidlem<br />

Princip: Amonné ionty reaguji s Nesslerovým činidlem (tetrajodortuťnatan draselný) za<br />

vzniku červenohnědého produktu, který lze stanovit kolorimetricky s maximem při 436 nm.<br />

NH 4 + + 2 HgI 4 2- + 4 OH - → NH 2 I.Hg 2 O + 7 I - + 3 H 2 O<br />

Do 7 zkumavek napipetujte 1,5 mL destilované vody, přidejte 0,5 mL vzorku odebraných<br />

během ultrafiltrace: 1/ vzorek č. 1, 2/ vzorek č. 2, 3/ vzorek č. 3, 4/ vzorek č. 4, 5/ vzorek č. 5<br />

6/ dialyzační pufr z právě probíhající dialýzy, 7/ čerstvý dialyzační pufr jako blank a nakonec 0,1<br />

mL Nesslerova činidla do každé zkumavky, po 5 minutách okem porovnejte zabarvení<br />

v jednotlivých zkumavkách.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

1) Popište a zhodnoťte purifikační proces. Srovnejte dva způsoby odsolení proteinů, které jste<br />

použili. Využijte výsledků reakce s Nesslerovým činidlem. Navrhněte alternativní kroky, které<br />

by jste mohli použít pro homogenizaci, precipitaci a odsolení izolovaných proteinů.<br />

2) Pomocí metody Bradfordové vám vaší kolegové v rámci úlohy Spektrofotometrie stanoví<br />

množství proteinů v 10 µL homogenátu (extrakt z obilek po centrifugaci) a zahuštěného<br />

vzorku po odsolení v ultrafiltrační cele Amicon. Ze získaných údajů vypočtěte množství<br />

proteinů (extrahovatelných) v jednom gramu obilek a procentuálně stanovte obsah proteinů,<br />

které vyizolujete z tohoto extraktu po 50% vysolení síranem amonným.<br />

3) Zamyslete se a s pomocí literatury vypište biologicky aktivní látky, které jsou přítomné<br />

v obilkách. Zkuste se zamyslet nad jejím kvantitativním obsahem.<br />

Doporučená literatura:<br />

Peč, P. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.<br />

Káš, J. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Nakladatelství Olomouc, 2000.<br />

Ferenčík, M. a kol.: Biochemické laboratórne metódy, Alfa Bratislava, 1981.<br />

Procházka, S. a kol.: Fyziologie rostlin, Academia Praha, 1998.<br />

Dey, P.M. a kol.: Plant Biochemistry, Academia Press London, 1997.<br />

34

Laboratorní cvičení č. 4<br />

EXTRAKCE, FILTRACE, SUBLIMACE A PRÁCE S VAKUOVOU ODPARKOU<br />

EXTRAKCE<br />

Jako extrakce je označováno převedení látky z jedné fáze, v níž je rozpuštěna nebo<br />

suspendována, do fáze jiné. Toto převedení je možné, neboť látka se v určitém poměru rozdělí<br />

mezi obě fáze. Distribuce rozpuštěné látky mezi dvě kapalné fáze se řídí Nernstovým<br />

rozdělovacím zákonem:<br />

c a /c b = K<br />

Podle něj je poměr koncentrací látky ve dvou vzájemně nemísitelných kapalinách při určité<br />

teplotě a po dosažení rovnováhy konstantní. K se nazývá rozdělovací koeficient.<br />

Extrakce látky je podle toho snadná tehdy, jestliže je v extrakčním rozpouštědle mnohem<br />

lépe rozpustná než v druhé fázi, čili je-li rozdělovací koeficient značně odlišný od jedničky. Pro<br />

látky s rozdělovacím koeficientem menším než 100 jediná extrakce nestačí. V takovém případě je<br />

nutno extrakci vícekrát opakovat s čerstvým rozpouštědlem.<br />

Pro jednotlivé typy extrakce se historicky vyvinula některá označení, která budou společně<br />

se stručnými definicemi uvedena:<br />

Macerace - látka v pevné fázi je za studena opakovaně<br />

extrahována dávkami rozpouštědla.<br />

Digesce - látka v pevné fázi je za tepla extrahována<br />

opakovanou dávkou rozpouštědla. Nejčastěji tuhou látku<br />

zahříváme s rozpouštědlem pod zpětným chladičem a směs<br />

poté filtrujeme nebo dekantujeme. Nejčastěji se používá<br />

Soxhletův přístroj, v němž je extrakt stále zahušťován.<br />

Přístroj pracuje automaticky. Ve varné baňce je rozpouštědlo,<br />

později již roztok, které se odpařuje a jeho páry odcházejí<br />

širokou trubicí na levé straně středního dílu přístroje (obr. 11)<br />

do zpětného chladiče. Zde dochází k jejich kondenzaci. čisté<br />

rozpouštědlo stéká do papírové patrony v níž je umístěn<br />

extrahovaný materiál. Hladina roztoku ve střední části<br />

přístroje neustále stoupá. V okamžiku, kdy její výška dosáhne<br />

úrovně horní části tenké přepadové trubičky, dojde k jejímu<br />

přetečení zpět do varné baňky. Tak je možno vyextrahovat<br />

značné množství látky s malým množstvím rozpouštědla.<br />

Obrázek 11: Soxhletův přístroj<br />

Perkolace - látkou v pevné fázi prosakuje vlastní tíhou rozpouštědlo. Přívodem čistého<br />

rozpouštědla je hladina kapaliny v perkolátoru udržována stále ve stejné výši. To zabezpečuje,<br />

aby na vyextrahovávaný materiál v horních vrstvách přicházelo stále nové rozpouštědlo (obr. 12).<br />

Vytřepávání – látka je z roztoku extrahována jednou dávkou rozpouštědla nebo opakovaně<br />

dalšími dávkami (frakční vytřepávání). Vytřepavání provádíme tak, že vodný roztok nebo méně<br />

často suspenzi látky smísíme v dělící nálevce asi z 1/3 až 1/4 objemu extrakčního činidla. Dělící<br />

nálevka má být naplněna nejvýše do 2/3 objemu. Uzavřeme ji zábrusovou zátkou a nejdříve<br />

35

protřepeme, přičemž držíme zátku i kohout. Pak otočíme dělící nálevku vypouštěcí stopkou vzhůru<br />

a otevřením kohoutu zrušíme vzniklý přetlak. Třepání a odpouštění tlaku opakujeme obvykle 3-4 x.<br />

Pracujeme-li s kyselinami, zásadami či jinými žíravinami, používáme ochranné pomůcky! Jednotlivé<br />

fáze se většinou oddělí po chvíli stání. Spodní vrstvu vypouštíme kohoutem, horní odléváme<br />

hrdlem dělicí nálevky.<br />

Jedním vytřepáním extrakční výtěžky bývají většinou nízké, v optimálním případě<br />

odpovídají Nerstovu rozdělovacími zákonu. Provádíme proto extrakci vždy nejméně 3-4 x.<br />

Účinnější je vždy opakovaná extrakce menším množstvím rozpouštědla než extrakce celým<br />

množstvím najednou.<br />

Nejčastěji používaná extrakční činidla jsou:<br />

Lehčí než voda: diethylether, benzen, hexan<br />

Těžší než voda: methylendichlorid, chloroform, chlorid<br />

uhličitý<br />

FILTRACE<br />

Filtrace je oddělování fází pomocí propustného<br />

materiálu, který dovoluje průchod pouze jedné z obou fázi.<br />

Obyčejně se pod pojmem filtrace rozumí oddělování pevné<br />

fáze od kapaliny nebo plynu. Filtrace je v laboratoři velice<br />

běžnou operací. Nejčastější je filtrace kapalin, prováděná<br />

buď za účelem zbavení kapaliny mechanických nečistot, nebo<br />

k izolaci pevné složky, např. při krystalizaci.<br />

Obrázek 12: Perkolátor<br />

Filtrační materiál je určován chemickým charakterem filtrovaného roztoku. Může to být<br />

neklížený, tzv. filtrační papír nebo i pórovitá skleněná nebo porcelánová frita, vrstva azbestu<br />

nebo skelné vaty apod. Rychlost filtrace závisí na ploše a vlastnostech filtračního prostředí, na<br />

počtu a velikosti pórů, na tlaku a teplotě při filtraci, na povaze sraženiny i na viskozitě filtrované<br />

kapaliny.<br />

Základní pomůckou při filtraci je filtrační nálevka, do níž se vkládá vhodně složený papírový<br />

filtr. Filtrační papír je vyráběn s různou velikostí pórů. Filtr se zhotovuje ze čtverce filtračního<br />

papíru složeného pravoúhle na čtvrtiny a sestřiženého do tvaru kruhové výseče. Rozevřením<br />

takto upraveného papíru vzniká kuželový filtr, který je z jedné poloviny trojnásobný a z druhé<br />

jednoduchý. Tento tzv. hladký filtr filtruje pouze špičkou a poměrně pomalu. Rychleji pracuje<br />

filtr skládaný, nazývaný též francouzský. Připraví se z kruhové výseče, která je vějířovitě<br />

překládána směrem od středu k obvodu. Při skládání francouzského filtru je nutno dbát, aby při<br />

několikerém překládání nedošlo k poškození filtru ve špičce (obr. 13). Je proto nezbytné, aby<br />

jednotlivé záhyby neprocházely jedním bodem. Před vložením do nálevky se doporučuje složený<br />

filtr rozevřít a obrátit tak, aby původně vnější stěna filtru tvořila vnitřní stěnu. Tím je možné<br />

předejít znečištění filtrátu vlákny papíru uvolněnými během skládání a nečistotami z rukou.<br />

Skládaný filtr se opírá o stěny nálevky jen hranami, a proto filtruje téměř celou svou plochou na<br />

rozdíl od hladkého filtru, který filtruje jen špičkou. Filtrace francouzským filtrem je podstatně<br />

rychlejší než filtrace hladkým filtrem téhož průměru.<br />

36

Obrázek 13: Skládání hladkého a francouzského filtru<br />

Nálevka s filtrem se vkládá do<br />

filtračního kruhu připevněného na železném<br />

stojanu. Pod ní je umístěná kádinka pro<br />

zachycení filtrátu. Stonek nálevky se při<br />

filtraci dotýká špičkou svého šikmo<br />

seříznutého stonku stěny kádinky, přibližně<br />

ve dvou třetinách výšky (obr. 14). Filtrát pak<br />

klidně stéká po stěnách nádoby a<br />

nevystřikuje. Při filtraci naléváme roztok na<br />

filtr po skleněné tyčince, která se ve<br />

vhodném úhlu přiblíží stěně filtru. Proud<br />

kapaliny je vždy třeba směřovat proti místu,<br />

kde je papírová vrstva trojitá. Sníží se tím<br />

nebezpečí protržení filtru. Filtr se plní vždy<br />

několik milimetrů pod okraj. Při filtraci<br />

sraženiny je vhodné ji nechat usadit u dna<br />

kádinky a na filtr nejprve nalévat čirý<br />

matečný roztok, který rychle protéká ještě<br />

nezaneseným filtrem. Teprve nakonec se ve<br />

zbytku kapaliny rozvíří sraženina a vše se<br />

nalije na filtr.<br />

Obrázek 14: Filtrace za normálního tlaku.<br />

Při promývání sraženiny na filtru se sedlina nejprve pomocí střičky spláchne do spodní části<br />

filtru. Proud vody je třeba řídit od okraje filtru k jeho špičce. Promývání se provádí tak dlouho,<br />

až je reakce filtrátu negativní na látku přítomnou v matečném roztoku. Důkaz se provádí citlivým<br />

činidlem v malém podílu filtrátu.<br />

Pro horké roztoky, u nichž hrozí, že se při ochlazení část rozpuštěné látky vyloučí na filtru<br />

a ucpe jeho póry je nutno používat nálevky s vyhřívaným pláštěm, plášť může být vyhřívám horkou<br />

vodou nebo elektricky. Jednoduše je možno improvizovat filtraci za horka nálevkou se<br />

seříznutým stonkem, která je položena na hrdle kádinky. Plášť nálevky je pak přímo vyhříván<br />

parami vroucího roztoku.<br />

37

Podstatně urychlit filtraci je možno použitím sníženého tlaku, odsáváním vzduchu<br />

v prostoru pod filtrem. Pro filtraci za sníženého tlaku užíváme Büchnerovy nálevky (obr. 1-17),<br />

skleněných nebo porcelánových nučí a filtračních kelímků. Nejednodušší zařízení pro filtraci za<br />

sníženého tlaku je Büchnerova nálevka s odsávací baňkou. Dno Büchnerovy nálevky je jemně<br />

dírkované, na ně pokládáme filtrační papír tak, aby všechny otvory byly zakryty a papír<br />

nepřečníval podél stěn nálevky vzhůru, poněvadž by vzniklými kanálky procházel filtrovaný roztok<br />

do odsávací baňky. Nálevka je v odsávací baňce upevněná pryžovou vložkou nebo zátkou. Mezi<br />

odsávací baňku a vývěvu je vhodné umístit pojistnou láhev (prázdnou promývačku), která<br />

zabraňuje vniknutí vody z vývěvy do odsávací baňky nebo roztoku do vývěvy. Vniknutí vody do<br />

odsávací baňky zabráníme, odpojíme-li baňku od vývěvy před zastavením toku vody ve vodní<br />

vývěvě.<br />

Při filtraci látek reagujících s filtračním papírem (koncentrované kyseliny, KMnO 4 a pod.)<br />

používáme skleněné frity, kde funkci filtračního papíru zastává do filtračního kelímku vtavená<br />

skleněná pórovitá destička. Velikost pórů je odstupňována v řadě S1-S2-S3-S4-S5, velmi malé<br />

póry jsou určeny pro filtraci biologických materiálu. Vzhledem k velké hustotě frit (pomalá<br />

filtrace) filtrujeme vždy za použití sníženého tlaku. Nevýhodou skleněných frit je jejich značná<br />

cena a hlavně jejich obtížné čištění.<br />

SUBLIMACE<br />

Sublimace je podobně jako krystalizace jednou ze základních metod čištění a oddělování<br />

jednotlivých složek směsi. Děj je založen na tom, že tenze par tuhých látek se s rostoucí<br />

teplotou zvyšuje, a proto lze mnohé látky převést do plynného skupenství, aniž roztají, a páry<br />

opět přímo zkondenzovat v tuhou látku. Bod sublimace je teplota, při níž se tenze par tuhé látky<br />

vyrovná s vnějším tlakem. V porovnání s krystalizací má sublimace v mnoha případech značné<br />

výhody. Sublimovaný preparát totiž neobsahuje mechanické nečistoty, které i při pečlivé<br />

krystalizaci mohou doprovázet výsledný produkt. Při sublimaci jednoduchých směsí se obyčejně<br />

pracuje s malými ztrátami a jednoduchá sublimace často nahradí i několikrát opakovanou<br />

krystalizaci. Vhodnost použití sublimace jako čistící a separační techniky záleží na vlastnostech<br />

dané látky. Rozmezí teplot a tlaků, za nichž lze sublimaci použít je možno zjistit ze stavového<br />

diagramu příslušné látky (viz fyzikální chemie).<br />

Zařízení a způsob sublimace se řídí podle toho, jaké vlastnosti má mít sublimát. Čím nižší je<br />

teplota chlazeného prostoru, v němž páry kondenzují, tím jemnější krystaly se vytvářejí. Vyšší<br />

kondenzační teploty podporují naopak vznik větších a vyvinutějších krystalů.<br />

Nejjednodušším zařízením pro provedení sublimace s nepříliš nízkou sublimační teplotou<br />

mohou být dvě zabroušená hodinová skla (viz obr. 15-1). Na spodní sklo umístíme sublimovanou<br />

látku, přikryjeme druhým sklem a opatrně zahříváme. Sublimující látka se usazuje na horním<br />

hodinovém skle. V případě, že sublimovaná látka padá do surového produktu, můžeme mezi skla<br />

položit perforovaný filtrační papír, na němž se sublimovaná látka zachytí. Jiným jednoduchým<br />

zařízením je porcelánová miska a na ní postavená nálevka (obr. 15-2). Nálevka má mít o něco menší<br />

průměr než miska. Stonek nálevky opatříme volnou vatovou ucpávkou. Mezi misku a nálevku opět<br />

vkládáme perforovaný filtrační papír. V případě, že sublimační teplota je nízká, použijeme pro<br />

sublimaci aparaturu znázorněnou na obrázku 15-3. Surový produkt nasypeme na dno suché<br />

kádinky, kterou uzavřeme baňkou. Do baňky zavádíme až ke dnu stále čerstvou chladící vodu.<br />

Sublimující látka se pak usazuje na kulatém dně baňky. Po skončení sublimace baňku opatrně<br />

sejmeme a usazené krystaly špachtlí seškrábneme.<br />

38

Obrázek 15: Různé způsoby sublimace<br />

1 2 3<br />

Látky při normálním tlaku nesublimující nebo sublimující<br />

jen pomalu, případně látky, které se při sublimaci za vyšší<br />

teploty rozkládají, lze často sublimovat při sníženém tlaku.<br />

K tomuto účelu používáme aparatury podle obrázku 16.<br />

ODPAŘOVÁNÍ VE VAKUU<br />

Odpařování ve vakuu je v biochemické laboratoři jeden z<br />

nejčastějších způsobu odpařování rozpouštědla z roztoků<br />

látek. Dá se použít na roztoky jak nízko- tak<br />

vysokomolekulárních látek, jejichž objem může být od<br />

několika mililitrů až po litry a využívá se při něm efektu<br />

snížení bodu varu při sníženém tlaku v systému.<br />

Odpařování malých objemů do 2 mL se dělá<br />

v evakuovaném exikátoru nad vhodným sorbentem vody (P 2 O 5 ,<br />

NaOH, CaCl 2 ). Vzorek se umístí do mikrozkumavky, a nebo jiné<br />

vhodné nádoby, které jsou v exikátoru uloženy tak, aby vodní<br />

páry měly k sušidlu co nejkratší cestu.<br />

Obrázek 16: Aparatura pro<br />

sublimaci za sníženého tlaku<br />

Hlavní výhodou této metody je, že je levná a dostupná v každé laboratoři, nevýhodou je<br />

dlouhý čas (řádově hodiny) a nemožnost odpařit jiné rozpouštědlo než vodu. Nevýhody se<br />

odstraňují přístroji pracujícími na podobném principu, kde se páry rozpouštědla neustále odsávají.<br />

Při vakuovém zahuštování roztoků, kde je použito organické rozpouštědlo nastává utajený var, což<br />

může často způsobit napěnění vzorku či jeho vystřiknutí. Tyto problémy se dají odstranit<br />

odpařováním vzorku za současné centrifugace. Zařízení se obvykle skládá z centrifugy, která<br />

může být vyhřívaná, z vymrazovací části a z vakuové pumpy.<br />

Nejběžnější způsob odpařovaní středních objemů je odpařování na vakuové rotační<br />

odparce. Rotační vakuová odparka se skládá z odpařovací baňky, pohonné jednotky a z vhodného<br />

chladiče s kondenzační baňkou a musí být doplněná zdrojem vakua (vodní vývěva, membránová<br />

vývěva). Odpařovací baňka se většinou během odpařování ponoří do vodní lázně, kde je vyhřívána<br />

na zvolenou teplotu. Vakuum vytvořené v prostoru s roztokem snižuje její bod varu a rotační<br />

pohyb baňky způsobuje intenzivní míchání odpařované směsi spojené se stálým obnovováním filmu<br />

na kapaliny na vnitřním povrchu baňky. Tímto se zamezuje přehřívání kapaliny, zvyšuje se<br />

odpařovací povrch a zkracuje dráha bublin páry z vnitřního prostoru baňky na povrch roztoku.<br />

Důsledkem je intenzivní odpařování kapaliny, jejíž páry kondenzují ve vodním chladiči, umístěném<br />

mezi zdrojem vakua a odpařovací baňkou, a stékají do kondenzační baňky. Schéma vakuové<br />

odparky je na znázorněno na obrázku 17.<br />

39

Obrázek 17: Schéma vakuové rotační<br />

odparky: 1 – odpařovací baňka, 2 – pohonná<br />

jednotka, 3 - vodní chladič, 4 – kondenzační<br />

baňka, 5 – napouštěcí uzávěr.<br />

ÚKOL č. 6: Izolace kofeinu z čaje a jeho přečištění sublimací<br />

Alkaloidy jsou nejpočetnější skupinou rostlinných látek sekundárního metabolismu. Dosud<br />

jich bylo izolováno kolem sedmi tisíc. Z chemického hlediska se dají alkaloidy popsat jako<br />

organická báze s jedním nebo několika heterocyklickými dusíkovými atomy v molekule. V přírodě<br />

se vyskytují ve formě solí s organickými kyselinami. Alkaloidy obsahuje 10 až 20 % všech vyšších<br />

rostlin. Byly nalezeny ve všech jejich částech, ale nejvíce jsou přítomné především v semenech,<br />

kořenech a kůře stromů. Kofein patří do skupiny purinových alkaloidů (purin je složen ze dvou<br />

heterocyklů – pětičlenného a šestičlenného a obsahuje celkem 4 atomy dusíku na molekulu).<br />

Molekula kofeinu má navíc dvě oxo-skupiny (xantin) a je třikrát methylovaná. Kofein je nejhojněji<br />

zastoupen v semenech kávovníku a kakaovníku a listech čaje. Má povzbudivý účinek na centrální<br />

nervovou soustavu a srdeční činnost, podporuje činnost ledvin a zvyšuje tvorbu moči. Stimulační<br />

účinek kofeinu, stejně jako theofylinu z čaje, je založen na inhibici enzymu fosfodiesterasy,<br />

která odbourává látky mající podobnou strukturu a přenášející nervový vzruch, jako je např.<br />

cyklický adenosinmonofosfát.<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE<br />

Kádinky, vařič, filtrační papír, nálevka, dělicí nálevka, vakuová odparka, železný stojan s kruhem,<br />

pipety, odpařovací miska, vodní lázeň, baňka, korková zátka, skleněné trubice, hadice,<br />

mikrozkumavka, špachtle, parafilm, čajové listy, octan olovnatý, ethanol, chloroform, 5% roztok<br />

hydroxidu sodného.<br />

POSTUP<br />

Před začátkem práce si zapněte vodní lázeň u vakuové odparky a vodní lázeň v digestoři na<br />

odpařování vzorku, aby jste předešli časovým prodlevám.<br />

Na předvážkách odvažte tři gramy čajového listí a povařte v kádince na vařiči 5 minut v 50<br />

mL destilované vody. Mezitím si připravte 20 mL roztoku octanu olovnatého (w/v = 5%), přidejte<br />

ho k čajovému odvaru a povařte dalších 5 minut. Připravte si francouzský skládaný filtr a po<br />

vychladnutí roztok přefiltrujte. Filtrát odpařte zhruba na 20 mL objemu kapaliny. S použitím<br />

dělící nálevky pak proveďte extrakci odparku s 15 mL chloroformu třikrát po sobě. Spojené<br />

extrakty v organickém rozpouštědle promyjte v dělící nálevce destilovanou vodou (15 mL) a potom<br />

stejným objemem roztoku hydroxidu sodného (w/v = 5%). Přečištěný chloroformový extrakt<br />

zahustěte na vakuové odparce. Postupujte následovně:<br />

40

1) Extrakt přelijte do 250 mL baňky s kulatým dnem a zábrusovým hrdlem. Nezapomeňte vložit<br />

varné kuličky. Baňku připevněte svorkou na levé ústí vakuové odparky.<br />

2) Zapněte vodní lázeň na 60°C a pomoci šroubu umístěte baňku do polohy, kdy je její spodní<br />

stěna omývána vodou ve vodní lázni.<br />

3) Uzavřete tlačkou hadici na pravé straně vakuové odparky.<br />

4) Do chladiče pusťte mírným proudem vodu a zkontrolujte, zda-li je utěsněna kondenzační<br />

baňka.<br />

5) Spusťte vývěvu a evakuujte odparku.<br />

6) Spusťte rotaci baňky.<br />

7) Po skončení odpařování nejprve uvolněte tlačku na pravé trubici odparky a teprve pak vypněte<br />

vývěvu.<br />

Odparek rozpusťte v etanolu a baňku kvantitativně etanolem vypláchněte. Ethanolický<br />

roztok odpařte na vodní lázni v odpařovací misce.<br />

Připravte si aparaturu k sublimaci podle obrázku 15-3. Odparek kvantitativně převeďte na<br />

dno kádinky aparatury. Rozhraní mezi chladicí baňkou a kádinkou utěsněte parafilmem. Aparaturu<br />

zahřívejte na vařiči s azbestovou síťkou až do doby, kdy skončí vývoj sublimujících par.<br />

Nezapomeňte pustit vodu. Po skončení sublimace zastavte vodu a oddělejte zátku s trubicemi.<br />

Krystalky kofeinu vyloučené na dně baňky se pokuste pomocí špachtle kvantitativně převést do<br />

předem zvážené mikrozkumavky.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

1) Popište a zhodnoťte postup izolace. Navrhněte jiné metody, kterými by jste mohli nahradit<br />

jednotlivé kroky.<br />

2) Uveďte výtěžek izolace kofeinu a navrhněte způsob, jak by jste určili jeho čistotu.<br />

3) Za pomocí literatury navrhněte analytickou reakci, kterou by jste dokázali kofein.<br />

Doporučená literatura:<br />

Ferenčík, M. a kol.: Biochemické laboratórne metódy, Alfa Bratislava, 1981.<br />

Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.<br />

Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.<br />

Čtrnáctová, H. a kol.: Didaktika a <strong>technika</strong> chemických pokusů, Vydavatelství Karolinium Praha,<br />

1992.<br />

41

Laboratorní cvičení č. 5<br />

SPEKTROFOTOMETRICKÁ MĚŘENÍ<br />

Viditelné záření tvoří malý úsek z oblasti elektromagnetického vlnění v rozmezí délek 400-<br />

700 nm. Přilehlá oblast rozmezí vlnových délek 200-400 nm se nazývá blízká ultrafialová oblast,<br />

700-2000 nm se pak nazývá blízká infračervená oblast. Celá oblast vlnových délek se také nazývá<br />

oblastí elektronových spekter.<br />

Prakticky v každé biologicky zaměřené laboratoři se dnes setkáváme s přístroji pro měření<br />

spektrálních veličin ve viditelné a ultrafialové oblasti. Tzv. spektrofotometry, pro registraci<br />

spekter v oblasti od 200 (někdy 185 nm) do 700 nebo 1000 nm. Není divu, vždyť téměř všechny<br />

biologicky zajímavé látky (kromě sacharidů) mají v této oblasti, kterou označujeme zkratkou UV-<br />

VIS (ultraviolet - visible), charakteristické absorpční pásy a jejich koncentraci lze proto<br />

většinou poměrně snadno stanovit na základě jejich spektrálních vlastností.<br />

Určování koncentrace roztoků není jedinou možností využití absorpční spektrofotometrie.<br />

Již po několik desetiletí je známo, že absorpční vlastnosti závisejí na interakci příslušného<br />

chromoforu s okolím. Z toho vyplývá, že vlnová délka absorpčního maxima i intensita absorpce<br />

mohou být ovlivněny řadou procesů, které biochemika enormně zajímají. Uveďme zde pro ilustraci<br />

několik příkladů:<br />

- Při denaturaci biopolymeru (bílkoviny nebo nukleové kyseliny) se mění jeho absorpční<br />

spektrum, protože chromofory se dostávají do jiného mikroprostředí (u bílkovin zevnitř<br />

globule do vodného prostředí, v DNA z jádra helixu, kde těsně interagují se sousedy<br />

vodíkovými a patrovými interakcemi).<br />

- Protože fenolátový ion má jiné vlastnosti než nedisociovaný fenol, je možné ze změny<br />

spekter bílkoviny při zvyšování pH roztoku určit titrační křivku tyrosinových zbytků a z ní<br />

pak usoudit na jejich lokalizaci v molekule proteinu.<br />

- Při nekovalentní vazbě různých ligandů na biopolymer se často mění jejich spektrum; to<br />

dovoluje touto metodou určit počet navázaných ligandů a asociační konstantu.<br />

ODVOZENÍ LAMBERT - BEEROVA ZÁKONA<br />

Interakcí záření s hmotou, tj. s atomy a molekulami, dochází k jeho absorpci, tj. k přijetí<br />

kvanta energie a zvýšení energie atomu (molekuly) z původního základního stavu do stavu<br />

exitovaného. Při absorpci záření v oblasti 200-2000 nm dochází převážně k exitaci elektronového<br />

systému, resp. valenčních elektronů zúčastněných atomů a molekul. Vlastní interakce záření<br />

s hmotou se sleduje na absorpčním spektru, tj. na záznamu závislostí množství absorbovaného<br />

záření na jeho vlnové délce.<br />

Předpokládejme, že na spekrofotometrickou kyvetu s optickou drahou I, která obsahuje<br />

absorbující látku, dopadá světlo o intensitě I o . Pokles intensity světla dI v důsledku jeho<br />

absorpce vrstvou roztoku o tloušťce dl, pak bude<br />

-dI = k.I.dl<br />

kde k je konstanta úměrnosti. Po separaci proměnných a integraci (interval 0 - 1) získáme vztah<br />

I<br />

log o =<br />

I<br />

j.c<br />

42

T = I I o<br />

zvaný Lambertův zákon, kde I je intensita světla vystupujícího z kyvety.<br />

Analogicky můžeme postupovat při studiu závislosti poklesu intensity světla na koncentraci<br />

absorbující látky při konstantní délce kyvety. Zde vycházíme z předpokladu, že dI bude, přes<br />

jinou konstantu j, úměrné vzrůstu koncentrace dc, tedy:<br />

-dI = j.I.dc<br />

Opět integrujeme, tentokrát v intervalu 0 až c, a získáme Beerův zákon:<br />

I<br />

log o =<br />

I<br />

Zaměřme se nyní na veličiny na levé straně obou rovnic. Veličina I o je intensita světla, které do<br />

kyvety vstupuje, a I je intensita světla vystupujícího. Nabízí se vyjádřit poměr těchto hodnot<br />

jako frakci světla pohlceného v kyvetě; tato veličina se pak nazývá transmitance T:<br />

j.c<br />

a často se vyjadřuje v procentech. Z fyzikálního pohledu není přirozenějšího popisu absorpčních<br />

efektů než pomocí této veličiny. Ta však byla v posledních letech téměř opuštěna, neboť pro<br />

praktické laboratorní používání trpí zásadním nedostatkem: není přímo úměrná koncentraci<br />

absorbující látky. Přímou úměru zajišťuje veličina na levé straně obou výše uvedených vztahů,<br />

která se nazývá absorbance A; tedy<br />

A =log I I<br />

o<br />

1<br />

= log<br />

T<br />

Dříve se místo ”absorbance” užívalo termínu ”extinkce” (označení E); v anglosaské, zejména<br />

americké literatuře, toto označení tvrdošíjně přežívá. Evropský čtenář by si měl být jist, že<br />

pojmy absorbance a extinkce (a podobně i absorpční a extinkční koeficient) jsou naprosto<br />

ekvivalentní.<br />

Poněkud jinak bychom měli hledět na pojem optická hustota, zkracovaný O.D. nebo OD (optical<br />

density). Prochází-li paprsek kyvetou, může být jeho intensita snižována i jinými jevy než<br />

absorpcí (pohlcením fotonu spojeným s excitací molekuly do vyššího energetického stavu). Pro<br />

zeslabení intensity v důsledku absorpce je vhodný termín absorbance, zde také většinou platí, jak<br />

uvidíme dále, Beerův zákon. Pokud však je intensita paprsku zeslabována například rozptylem<br />

záření na velikých částicích (agregátech molekul při turbidimetrických měřeních, buňkách při<br />

proměřování růstových křivek v mikrobiologii apod.), je vhodné toto zeslabení kvantifikovat jako<br />

optickou hustotu. Ta je definována stejně jako absorbance, tedy<br />

OD =log I o<br />

I ,<br />

ale nemá přímou souvislost s jevem absorpce. Jinými slovy, optická hustota je pojmem<br />

nadřazeným, kdy jenom v některých případech je totožná s absorbancí.<br />

Spojíme-li oba výše uvedené zákony, získáme jeden z nejznámějších fyzikálně-chemických<br />

vztahů, zvaný Lambert-Beerův zákon:<br />

43

A = ε.c.l<br />

kde ε je konstanta úměrnosti, odvoditelná z výše definovaných konstant k a j. Jinými slovy, je to<br />

absorbance roztoku o jednotkové koncentraci absorbující látky v kyvetě o jednotkové délce.<br />

Vzhledem k tomu, že, jak vyplývá z definiční rovnice, je absorbance bezrozměrná veličina, musí<br />

mít ε rozměr (délka -1 . koncentrace -1 ). Za jednotkovou délku zde prakticky vždy považujeme 1 cm.<br />

Podle toho, v jakých jednotkách dosazujeme koncentrace, nabývá pak ε různých rozměrů.<br />

Pokud je koncentrace vyjádřena v jednotkách mol.l -1 , má ε rozměr cm -1 .l.mol -1 a hovoříme o<br />

molárním absorpčním (postaru extinkčním) koeficientu. Jeho rozměr lze dále upravit vykrácením<br />

délkových jednotek, čímž získáme tvar cm 2 .mmol -1 ; je dobré si uvědomit, že tento rozměr je<br />

zcela totožný s výše uvedeným základním tvarem a mmol nemá nic do činění s nějakou milimolární<br />

koncentrací. Jiným, zcela ekvivalentním rozměrem, je M -1 .cm -1 , kde M označuje molaritu; tento<br />

dokonale pochopitelný tvar je užíván zejména v anglosaské literatuře.<br />

Až doposud jsme uvažovali o přítomnosti jediné absorbující látky ve zkoumaném roztoku.<br />

Tento stav je však u reálných vzorků spíše výjimečný. Většinou je přítomno několik látek, které<br />

absorbují při dané vlnové délce. Měřená absorbance je pak součtem všech dílčích absorbancí.<br />

URČOVÁNÍ KONCENTRACE ROZTOKŮ POMOCÍ ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE<br />

Jak je patrno z definice absorbance, při jejím měření potřebujeme znát intensity (nebo<br />

lépe světelné toky) dvou paprsků: tzv. referenčního (srovnávacího - I o ), jenž nebyl oslaben<br />

absorpcí, a měrného (I), který prošel kyvetou se vzorkem. Podle způsobu měření dělíme<br />

spektrofotometry na několik základních typů:<br />

1) Jednopaprskové přístroje mají jedinou optickou dráhu. Paprsku se nejdříve postaví do cesty<br />

referenční vzorek (v laboratorní mluvě zvaný blank). Množství světla, jež jím prošlo, je<br />

zaregistrováno jako I o . Poté je do optické dráhy umístěn měřený vzorek, zaregistruje se I a<br />

z obou údajů je vypočtena absorbance. Na starších a jednodušších přístrojích tohoto typu se<br />

nastavují dva parametry: při zacloněném paprsku se kompensuje tzv. temný tok, který<br />

detekční zařízení poskytuje i v situaci, kdy na něj žádné světlo nedopadá (označení "0"<br />

souvisí s nulovou transmitancí při zacloněném paprsku), poté se do paprsku umístí referenční<br />

vzorek, jehož absorbance je z definice nulová (transmitance 100%). Toto nastavení je nutno<br />

provádět pro každou vlnovou délku, a proto se přístroje tohoto typu nepoužívají pro měření<br />

spekter. U moderních přístrojů se závislost I o na vlnové délce pro referenční vzorek uloží do<br />

paměti a po změření této závislosti pro vzorek (I) se vypočtou hodnoty absorbancí pro<br />

všechny vlnové délky. Princip jednopaprskového spektrofotometru je na obrázku 18.<br />

2) Dvoupaprskové přístroje mají oddělené dráhy pro referenční paprsek a pro vzorek. V každém<br />

okamžiku proto mohou registrovat I i I o a vypočítat absorbanci. Tyto přístroje, obvykle<br />

poněkud dražší, dovolují velmi snadno měřit různé typy diferenčních spekter a mívají i lepší<br />

optické parametry (monochromatičnost světla).<br />

3) Pro úplnost se zmiňme o nejnovějším typu spektrofotometrů, tzv. diod-array-detectors<br />

(DAD). Tato koncepce se objevila v polovině 80. let. Ostatní spektrofotometry mají<br />

monochromátor umístěn před kyvetovým prostorem, takže vzorkem prochází pouze vybrané<br />

("monochromatické") světlo, které je pak přímo zpracováno detektorem. V DAD přístrojích<br />

prochází všechno světlo (polychromatické) vzorkem a teprve poté je rozloženo mřížkou; řada<br />

světlocitlivých diod pak analyzuje množství světla jednotlivých vlnových délek, které prošlo<br />

vzorkem, respektive referenčním roztokem. Toto experimentální uspořádání má sice poněkud<br />

nižší kvalitu optických parametrů (rozlišovací schopnost z hlediska spektrální čistoty), jeho<br />

44

předností je však fantastická rychlost měření, neboť intensita světla všech vlnových délek se<br />

snímá v jediném okamžiku. Proto je toto uspořádání vhodné zejména pro kinetická měření<br />

nebo jako detektory chromatografických zařízení (HPLC).<br />

monochromátor<br />

detektor<br />

čočka<br />

lampa<br />

kyveta<br />

se vzorkem<br />

zesilovač<br />

výstup<br />

Obrázek 18: Princip jednopaprskového spektrofotometru.<br />

Při stanovení koncentrace pomocí měření absorbance se setkáváme s řadou úskalí. Dále<br />

probereme nejběžnější příčiny, jež vedou k chybám.<br />

Prvořadým úkolem je proměřit závislost absorbance na koncentraci absorbující látky.<br />

Můžeme volit kteroukoli vlnovou délku, až na výjimky však volíme vlnovou délku absorpčního<br />

maxima stanovované látky, a to ze dvou důvodů: je zde nejvyšší citlivost stanovení a přesnost<br />

stanovení zde nejméně závisí na přesnosti nastavení vlnové délky. Závislost absorbance na<br />

koncentraci by měla být přímková a procházet počátkem. Směrnice této přímky je rovna<br />

absorpčnímu koeficientu. Setkáváme se však často s odchylkami od této nejjednodušší závislosti.<br />

−<br />

−<br />

−<br />

Přímka neprochází počátkem. Taková situace je vždy artefaktem: při nulové koncentraci<br />

látky musí být absorbance nulová. Dosti obvyklou chybou je to, že při počítačovém<br />

vyhodnocení je zvolen nevhodný přímkový model, povolující nenulový úsek na ose y. Pokud<br />

přímku "nelze přinutit", aby procházela počátkem, bývá chyba v nevhodné volbě<br />

referenčního roztoku, nečisté referenční kyvetě apod.<br />

Závislost není přímková. K tomuto jevu dochází v případě, kdy se látka vyskytuje v několika<br />

spektrálně odlišitelných stavech, přičemž koncentrace jednotlivých složek roztoku závisí<br />

na celkové koncentraci. Jako typický příklad se uvádějí oligomerní rovnováhy, kdy oligomer<br />

má jiné absorpční spektrum než monomerní jednotky. V těchto případech, kdy neplatí<br />

Beerův zákon, nelze snadno určit koncentraci z měření při jediné vlnové délce.<br />

Pokud látka fluoreskuje, je část absorbovaného světla opět vyzářena. Světlo při vyšších<br />

hodnotách absorbance zdánlivě snižuje její hodnotu. Závislost absorbance na koncentraci<br />

je pak zakřivená a limituje k nějaké hodnotě.<br />

Při stanovování koncentrace skupiny látek bývá problémem zvolit vhodný "obecný" standard.<br />

Typickým příkladem je zde stanovování koncentrace proteinů. Aromatické postranní řetězce<br />

bílkovin absorbují v UV oblasti v okolí 280 nm. Často se volí jako standard hovězí sérový albumin,<br />

jehož A jednoprocentního roztoku činí 6.8. Zastoupení aromatických aminokyselin v albuminu je<br />

však ve srovnání s většinou bílkovin relativně nízké a hodnota jeho specifického absorpčního<br />

koeficientu je v "rodině" rozpustných bílkovin nepoužitelná. Na obrázku 19 je srovnání spekter<br />

albuminu a imunoglobulinu při stejné koncentraci.<br />

45

a<br />

b<br />

s<br />

o<br />

r<br />

b<br />

a<br />

n<br />

c<br />

e<br />

1,6<br />

3<br />

1,4<br />

2<br />

1,2<br />

1<br />

0,8<br />

0,6<br />

0,4<br />

1<br />

0,2<br />

0<br />

210 230 250 270 290 310 330<br />

vlnová délka [nm]<br />

Obrázek 19: Absorpční spektra. 1 - hovězího sérového albuminu (1 mg.mL -1 ), 2 - lidského<br />

imunoglobulinu G (1 mg.mL -1 ) a 3 - DNA (0.1 mg.mL -1 ), optická délka kyvety 1 cm.<br />

V biologickém materiálu často komplikuje spektrofotometrické měření zákal, jenž<br />

nekontrolovaně zvyšuje turbiditu roztoku, která se pak přičítá ke skutečné absorbanci. Právě zde<br />

by bylo vhodnější mluvit o optické hustotě, jejíž vztah ke koncentraci bývá mnohem<br />

komplikovanější než přímá úměrnost Beerova zákona. Dobrým vodítkem pro posouzení, zda<br />

turbidita významně ovlivňuje změřenou absorbanci při dané vlnové délce, je tvar absorpčního<br />

spektra: křivka by měla poměrně rychle klesat k nule, zatímco v zakalených vzorcích klesá<br />

mnohem pomaleji. Pokud je tímto způsobem zjištěn zákal (pro bílkoviny není u 330 nm OD nulová),<br />

je nutno pokusit se vliv zákalu na měřenou absorbanci nějakým způsobem snížit. Např. pro<br />

bílkoviny se odčítá registrovaná "absorbance" u 330 nm od měřené absorbance v maximu u 280<br />

nm.<br />

Jak jsme již ukázali, absorbance při určité vlnové délce je součtem absorbancí všech<br />

přítomných absorbujících látek. Při studiu roztoků biologicky aktivních látek se málokdy setkáme<br />

se situací, že by v inkriminované oblasti spektra (zejména v UV) absorbovala jediná složka<br />

roztoku. V tom případě musíme velmi opatrně posoudit, zda další absorbující látky neovlivňují naše<br />

stanovení. Proto bývá velmi vhodné nespokojovat se s měřením absorbance při jediné vlnové délce,<br />

ale proměřit vždy relevantní závislost absorbance na vlnové délce (absorpční spektrum) a podle<br />

jeho tvaru usoudit, zda nějaká cizí látka naše stanovení neruší. Typickým problémem tohoto typu<br />

je překryv spektra bílkoviny příměsí nukleových kyselin, které mají, díky vysokému obsahu<br />

aromátů, velmi vysoký specifický absorpční koeficient (viz obrázek 19).<br />

ÚKOL č. 7: V neznámém vzorku spektrofotometricky stanovte koncentraci niklu v síranu<br />

nikelnatém<br />

MATERIÁL a CHEMIKÁLIE<br />

Spektrofotometr Shimadzu UV-1204, kyvety, kádinky, tiskárna, programová karta SPEKTRUM,<br />

25 mL odměrné baňky, pipety, 0,5 M síran nikelnatý.<br />

46

POSTUP<br />

Připravte si sadu 5 roztoků síranu nikelnatého o koncentracích 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 a 0,3 M<br />

přesným ředěním zásobního roztoku o koncentraci 0,5 M. Postupujte tak, že do odměrných baněk<br />

na 25 mL pipetujte 5 mL automatickou pipetou vypočtené množství zásobního roztoku. Roztoky<br />

v baňkách doplňte po značku vodou, uzavřete zátkou a dobře promíchejte.<br />

Naučte se obsluhovat spektrofotometr Shimadzu UV-700. Přístroj zapněte a následující<br />

měření provádějte vždy přesně podle návodu na obsluhu přiloženého u přístroje. Případné<br />

nejasnosti konzultujte s vedoucím cvičení.<br />

Proměření absorpčního spektra 0,3 M roztoku síranu nikelnatého od 600 nm do 800 nm po 10 nm:<br />

1) Na spektrofotometru nastavte nejnižší vlnovou délku tj. 600 nm.<br />

2) Připravte si kyvetu s blankem (destilovaná voda), vložte ji do kyvetového prostoru a přístroj<br />

vynulujte funkcí AUTOZERO.<br />

3) Do kyvetového prostoru vložte novou kyvetu s měřeným roztokem a odečtěte příslušnou<br />

absorbanci. Kyvetu plňte vždy do 3/4 objemu tak, aby světelný paprsek procházel měřeným<br />

roztokem, ne však plnou, aby se při manipulaci roztok nevyléval do přístroje. Před každým<br />

měřením optickou stěnu kyvety otřete vatovým tampónem.<br />

4) Postup zopakujte pro všechny vlnové délky, vždy i s předcházející kalibrací na destilovanou<br />

vodu.<br />

5) Na závěr podle návodu a pomocí programové karty SPECTRUM proměřte kontinuálně celé<br />

spektrum 0,3 M roztoku od 800-300 nm a to tak, že se funkcí RETURN vrátíte do základní<br />

nabídky spektrofotometru a postupujete podle návodu. Získané spektrum vytiskněte. Maxima<br />

absorpční křivky zjistíte použitím funkce PEAK.<br />

Získanou závislost absorbance na vlnové délce vyneste do grafu na milimetrový papír a<br />

porovnejte s vytištěným kontinuálním spektrem. V místě maximální absorbance odečtěte vlnovou<br />

délku, při které budete provádět další měření (porovnejte s automatickým vyhledáním maxima<br />

funkcí PEAK).<br />

Sestrojení kalibrační křivky<br />

Na spektrofotometru nastavte získanou maximální vlnovou délku. Přístroj vynulujte na<br />

destilovanou vodu a bez další kalibrace proměřte sadu připravených roztoků nikelnatých iontů.<br />

Mezi každým měřením kyvetu důkladně propláchněte destilovanou vodou a vysušte, aby<br />

nedocházelo k ředění a míchání vzorku. Po kalibraci na vodu měření celé sady ještě 2x zopakujte.<br />

Na závěr dejte do kyvety neznámý vzorek a změřte jeho absorbaci. Pokud absorbance<br />

překračuje rozmezí hodnot získaných při kalibračním měření, vzorek vhodně nařeďte<br />

destilovanou vodou a měření zopakujte.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

U každé koncentrace vypočtěte průměrnou hodnotu ze tří naměřených absorbancí.<br />

Získanou závislost absorbance na koncentraci vyneste do grafu na milimetrový papír. Z grafu, tzv.<br />

kalibrační křivky, pak jednoduše odečtete koncentraci neznámého vzorku. Pozor, berte v úvahu<br />

případné ředění neznámého vzorku.<br />

47

ÚKOL č. 8: Praktická aplikace spektrofotometrie v biochemické laboratoři - stanovení<br />

obsahu proteinů v biologickém vzorku metodou Bradfordové s vazbou barviva Coomassie<br />

Brilliant blue<br />

Barvivo Coomassie Brilliant blue G250 se váže na proteinové molekuly v kyselém pH dvěma<br />

způsoby. Trifenylmethanová skupina se váže na nepolární části proteinu a anion sulfoskupiny na<br />

bazické skupiny ve vedlejších řetězcích aminokyselin (arginin a lysin). Po vazbě barviva na<br />

proteiny dochází k barevné změně, která je úměrná množství proteinu. Reakce je velmi citlivá u<br />

albuminu a řady globulárních proteinů. Stanovení je však rušeno řadou interferujících látek, které<br />

jsou známy. Metoda je díky své jednoduchosti a citlivosti široce používána. Jako kalibrační<br />

protein se používá hovězí sérový albumin (BSA). Barevný produkt barviva s proteinem vykazuje<br />

absorpční maximum při 595 nm.<br />

MATERIÁL a CHEMIKÁLIE<br />

Spektrofotometr, kyvety, pipety, zkumavky, vortex, činidlo Bradfordové, kalibrační křivka na<br />

BSA.<br />

POSTUP<br />

Do pěti zkumavek napipetujte po 2 mL činidla Bradfordové. Do první a druhé přidejte po<br />

10 µL extraktu z ječmenných obilek, do třetí a čtvrté přidejte po 2 µL zahuštěného retentátu<br />

z vysoleného extraktu (vzorky dodají kolegové dělající cvičení č. 3) a pátou ponechte jako blank.<br />

Zkumavky promíchejte na vortexu (přístroj pro rychlé a účinné promíchání zkumavek) a nechejte<br />

5 minut stát při laboratorní teplotě. Na spektrofotometru nastavte vlnovou délku 595 nm. Do<br />

kyvetového prostoru umístěte v kyvetě vzorek číslo 5 se samotným činidlem Bradfordové a<br />

přístroj vynulujte, poté postupně proměřte všechny čtyři připravené vzorky. Po každém vzorku<br />

kyvetu vypláchněte ethanolem, jelikož se barvivo Coomassie Brilliant blue váže na stěny<br />

skleněných i plastových kyvet.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Hodnoty absorbanci si zaznamenejte a z kalibrační křivky na BSA (dodá vedoucí cvičení)<br />

odečtěte obsah proteinů v daném vzorku. Množství proteinu pak přepočtěte na 1 mL vzorku.<br />

ÚKOL č. 9: Měření absorpčních spekter listových barviv<br />

V listech zelených rostlin se vyskytuje větší množství lipofilních barviv, jejichž<br />

charakteristickou vlastností je rozpustnost v tucích a tukových rozpouštědlech. Pro fotosyntézu<br />

mají hlavní význam chlorofyly a, b a karotenoidy. Jsou značně citlivé vůči vzdušnému kyslíku a<br />

světlu. Každé barvivo má své typické maximum, které můžeme pozorovat na absorpčním spektru.<br />

MATERIÁL a CHEMIKÁLIE<br />

Spektrofotometr Shimadzu UV-1204, kyvety, tiskárna, programová karta SPEKTRUM, třecí<br />

miska s tloučkem, špachtle, nálevka, filtr, kádinky, pipety, mořský písek, uhličitan vápenatý,<br />

hexan, zmražený špenát.<br />

POSTUP<br />

Odvážte 2 g listu špenátu a rozetřete je v třecí misce s malým množstvím mořského písku a<br />

uhličitanu vápenatého (na špičku špachtle), na konec přidejte 5 mL hexanu a znovu rozetřete.<br />

Směs přefiltrujte přes malý filtr do kádinky.<br />

Do spektrofotometru vložte programovou kartu SPEKTRUM a nastavte rozsah vlnových<br />

délek od 800 do 200 nm, pracujte podle návodu přiloženého u spektrofotometru a nezapomeňte<br />

48

zapnout wolframovou lampu pro měření v UV oblasti. Do křemenné kyvety pro UV měření (dodá<br />

vedoucí cvičení) nalijte do 3/4 objemu hexan a spektrofotometr vynulujte funkcí BASECORR. Po<br />

té do kyvety nalijte hexanový extrakt a proměřte absorpční spektrum. Pokud některá maxima<br />

výrazně převyšují absorbanci nad 1,0 vzorek řeďte a to tak dlouho dokud nedostanete čitelné<br />

spektrum. Spektrum vytiskněte a pomocí funkce PEAK odečtěte absorpční maxima spektra.<br />

Poznámka: Pro měření v blízké UV oblasti, tzn. 190-350 nm, se používají kyvety ze<br />

speciálního křemenného skla, které na rozdíl od skla obyčejného a plastu UV záření propouští.<br />

S těmito kyvetami je však nutno pracovat velmi opatrně, jelikož jejich cena mnohonásobně<br />

převyšuje cenu běžných kyvet.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

1) Odečtěte maxima na absorpčním spektru a pomocí literatury se pokuste zjistit, která barviva<br />

se vám podařilo extrahovat ze špenátu. Na základě absorpčního spektra zkuste taky porovnat<br />

vzájemně jejich kvantitativní zastoupení v listech špenátu. Z literatury také nastudujte,<br />

která další barviva jsou v listech obsažena a vysvětlete, proč jste nepozorovali jejich maxima<br />

na absorpčním spektru.<br />

2) Zamyslete se a s pomocí literatury uveďte několik dalších příkladů využití spektrofotometrie<br />

v biochemii.<br />

ÚKOL č. 10: Spektrální stanovení koncentrace DNA<br />

Nukleové kyseliny absorbují záření v ultrafialové oblasti, maximum absorbance je při 260<br />

nm. Při stanovení je nutné dbát na čistotu preparátu, protože ruší přítomnost proteinů (280 nm) a<br />

aromatických látek. Pokud je DNA preparát čistý, poměr A 260 /A 280 dosahuje hodnoty 1.9.<br />

Koncentraci DNA lze získat podle vztahu:<br />

c DNA (µg/ml) = 62.9 * A 260 – 36.0 * A 280<br />

POSTUP<br />

Do 1 cm křemenné kyvety napipetujeme vhodně zředěnou DNA (10-100x). Vzorek DNA dodá<br />

vedoucí cvičení. Měříme absorpční spektra vzorku v UV oblasti v rozsahu 200 - 340 nm proti TE<br />

pufru a odečteme absorbance při 280 a 260 nm.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Pomocí výše uvedeného vzorce určete koncentraci a čistotu neznámého vzorku DNA.<br />

Doporučená literatura:<br />

Káš, J. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Nakladatelství Olomouc, 2000.<br />

Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.<br />

Procházka, S. a kol.: Fyziologie rostlin, Academia Praha, 1998.<br />

Voet, D. A Voet, J. G.: Biochemie, Victoria Publishing Praha, 1995.<br />

49

Laboratorní cvičení č. 6<br />

DESTILACE<br />

Destilace je metoda užívaná k dělení a čištění směsi kapalin, které se navzájem liší bodem<br />

varu. Všeobecně platí, že těkavější složky směsi přecházejí v páry snadněji, takže plynná fáze má<br />

jiné složení než kapalná směs a destilát (kondenzát) vzniklý kondenzaci těchto par, který bude<br />

bohatší na těkavější složku. Chceme-li dosáhnout dokonalého rozdělení směsi dvou kapalin jedinou<br />

destilací v jednoduché aparatuře, musí se jejich body varu lišit alespoň o 50°C a destilované látky<br />

nesmějí vytvářet azeotropní směs (směs s konstantním bodem varu). Dle povahy kapalné směsi<br />

volíme destilační metodu. Je-li kapalina znečištěna pouze malým množstvím těkavých látek, pak ji<br />

čistíme jednoduchou destilací nebo pouhým odpařováním. Máme-li směs látek s velmi blízkými<br />

body varu, pak používáme tzv. frakční destilaci (neboli rektifikaci). Je-li destilovaná látka<br />

termicky málo stabilní a rozkládá se při nižší teplotě, než je její bod varu, pak jsme nucení použít<br />

destilace vakuové. Destilace s vodní párou užíváme k oddělení těch látek, které těkají s vodní<br />

párou při nižší teplotě než je jejich bod varu.<br />

ODPAŘOVÁNÍ<br />

Odpařování používáme tam, kde nemáme zájem o odpařené rozpouštědlo. Metodu provádíme<br />

na porcelánové misce či v kádince. Odpařovací nádobu zahříváme buď na elektrické vodní lázni<br />

(při odpařování látek s bodem varu do 100°C), nebo kahanem přes síťku s azbestem (není-li<br />

odpařovaná složka hořlavá). Při odpařování hořlavých látek volného plamene nikdy nepoužíváme a<br />

z bezpečnostních důvodu těkavou složku raději oddestilujeme. Rychlost odpařování závisí na<br />

teplotě (s rostoucí teplotou se zrychluje) a při bodu varu je nebezpečí, že rychle se vyvíjející<br />

páry budou strhávat i zahušťovanou složku. Dále závisí na ploše povrchu kapaliny a na rychlosti<br />

odtahu par z prostoru nad kapalinou.<br />

D<br />

B<br />

C<br />

A<br />

Obrázek 20: Součásti destilační aparatury. A/ varná baňka, B/ Claisenův nadstavec, C/<br />

chladič, D/ alonž.<br />

DESTILACE ZA NORMÁLNÍHO TLAKU<br />

Je to nejběžnější druh destilace a užíváme ji všude tam, kde kapalina přechází snadno<br />

v páry při teplotě, za které se není třeba obávat rozkladu destilované látky. Destilační aparatura<br />

(obr. 20) se skládá z varné baňky (nejčastěji se používá frakční baňka). Varnou baňku nevolíme<br />

příliš velkou a plníme ji maximálně do 3/4 objemu. Uzavíráme ji přes Claisenův nádstavec vrtanou<br />

zátkou, již prochází teploměr. Jelikož má při destilaci směsi vroucí kapalina obvykle vyšší bod<br />

varu než kondenzát, je vhodnější neponořovat teploměr do kapaliny, nýbrž odečítat teplotu<br />

odváděných par. Páry vysokovroucích látek (s bodem varu nad 150°C) můžeme kondenzovat ve<br />

vzdušném chladiči (obr. 21-1), v ostatních případech používáme vodní chladič Liebigův (obr. 21-2).<br />

Ještě účinnější je chladič kuličkový (obr. 21-3) nebo spirálový (obr. 21-4), který musíme při<br />

sestavování destilační aparatury postavit do šikmé polohy tak, aby se v něm nezdržoval<br />

kondenzát. Na konci chladiče upevníme alonž, pomocí níž stéká kondenzát do jímací nádoby<br />

(předloha). Velice výhodné jsou aparatury zábrusové, obzvláště při práci s agresivními látkami.<br />

50

Obrázek 21: Chladiče - 1/vzdušný, 2/ Liebigův,<br />

3/ kuličkový, 4/ spirálový.<br />

1 2 3 4<br />

Poznámka: V dokonale hladkých nádobách může<br />

při zahřívání kapalin dojít k tzv. utajenému<br />

varu. Je to metastabilní stav, který vznikne<br />

přehřátím kapaliny o několik stupňů nad její bod<br />

varu. Náhodný impuls pak vyvolává prudký var,<br />

vzkypění a přetečení destilované směsi do<br />

předlohy. Abychom zabránili vzniku utajeného<br />

varu, vkládáme do varné baňky tzv. varná<br />

tělíska (skleněné kuličky, úlomky polévaného<br />

porcelánu, drcenou cihlu apod.).<br />

VAKUOVÁ DESTILACE<br />

Destilace za sníženého tlaku užíváme tehdy, chceme-li dělit složky z roztoku, v němž je<br />

jedna složka při vyšších teplotách labilní. Abychom zabránili rozkladu, musíme při destilaci snížit<br />

bod varu roztoku za použití vakua. Aparaturu pro destilaci za sníženého tlaku sestavujeme<br />

obvykle z částí s normalizovanými zábrusy (obr. 22). Zvláště výhodné se jeví použití Claisenova<br />

nástavce, který spojuje frakční baňku se zábrusovým chladičem a má nahoře dva otvory. Do<br />

jednoho otvoru vkládáme zábrusový teploměr, do druhého skleněnou trubičku protaženou do<br />

kapiláry, která zasahuje do destilované kapaliny. Význam kapiláry, která spojuje atmosféru<br />

s destilovanou kapalinou je v tom, že se při destilaci udržuje konstantní vakuum a zároveň se<br />

zajistí promíchávání vroucí kapaliny zaváděním mírného proudu vzduchu. Proud vzduchu<br />

regulujeme kohoutem na horní části skleněné trubice, který může být nahrazen nasazením<br />

gumové hadice s tlačkou. Kapilárou se také zabraňuje riziku utajeného varu, který je u vakuové<br />

destilace daleko pravděpodobnější. Destilační baňku zahříváme vždy jen na vodní lázni nebo<br />

topném hnízdě a nikdy nepoužíváme baňky s plochým dnem, které by nevydržely podtlak. Na<br />

varnou baňku s Claisenovým nádstavcem je napojen chladič, který je ukončen vakuovou alonží<br />

vedoucí destilát do předlohy. Alonž je napojena na zdroj vakua. Mezi předlohou a zdrojem vakua<br />

se často zapojuje pojistná nádoba (promývačka) a manometr. Destilaci za sníženého tlaku<br />

provádíme při tlaku 100 - 1000 Pa. Snížení tlaku vede ke snížení bodu varu kapalin. Var kapaliny<br />

nastává, jak známo tehdy, když se tenze jejich par rovná atmosférickému tlaku, v tomto případě<br />

tlaku v aparatuře. Použitím dobré vodní vývěvy je možno snížit bod varu kapaliny o 80-90°C.<br />

DESTILACE S VODNÍ PAROU<br />

Podle Daltonova zákona je tlak nad směsí dvou nebo několika kapalin roven součtu<br />

parciálních tlaků jednotlivých složek. Jelikož var kapaliny nastane v okamžiku, kdy tenze její páry<br />

se rovná okolnímu – atmosférickému tlaku, je zřejmé, že bod varu takové směsi bude nižší než<br />

body varu jednotlivých oddělených složek. Jako příklad uvedeme pro jednoduchost směs anilinu a<br />

vody, která vře při 98°C, když tenze vodní páry činí 9,42.10 4 Pa a tlak par anilinu je 7,07.10 3 Pa.<br />

Bod varu samotného anilinu pak 184.4°C. Destilace s vodní parou je tedy založena na využití<br />

Daltonova zákona. Používá se hlavně v organické chemii. Tímto způsobem je totiž možno<br />

předestilovat látky, které mají bod varu i vyšší než 200°C při teplotách nižších než 100°C a<br />

uchránit je tak před nežádoucím rozkladem.

Obrázek 22: Vakuová destilace.<br />

Při destilaci s vodní parou používáme aparatury sestavené dle obrázku 23. Aparatura se<br />

skládá z vyvíječe vodní páry, jimž je varná baňka uzavřená 2x vrtanou zátkou. Jedním otvorem<br />

prochází dlouhá skleněná trubice sahající až ke dnu nádoby. Je to tzv. pojistná trubice a jejím<br />

úkolem je zabránit při náhlém poklesu tlaku ve vyvíječi nasátí kapaliny z destilační baňky. Podtlak<br />

se vyrovná nasátím vzduchu pojistnou trubicí. Vodní pára pak probublává destilační baňkou,<br />

kterou zahříváme souběžně s vyvíječem vodní páry. Destilační baňku většinou upevňujeme<br />

vzhledem k ostatní aparatuře do šikmé polohy a to proto, aby kapalina, rozstřikována proudem<br />

vodní páry, nevnikla do chladiče a neznečišťovala tak kondenzát.<br />

H<br />

B<br />

E<br />

D<br />

F<br />

A<br />

C<br />

G<br />

Obrázek 23: Aparatura pro destilaci s vodní parou. A/ vyvíječ vodní páry, B/ pojistná trubice,<br />

C/ destilační baňka, D/ Claisenův nádstavec E/ chladič, F/ alonž, G/ předloha, H/ místo pro<br />

teploměr.<br />

52

ÚKOL č. 11: Izolace hřebíčkové silice z hřebíčku destilací s vodní parou<br />

Hřebíčková silice obsahuje vedle malých množství jiných látek 85 – 90% eugenolu a 9 –10%<br />

acetyleugenolu. Tyto látky mají teploty varu 249 a 253°C a jsou ve vodě jen velmi málo rozpustné.<br />

Při teplotě varu vody však mají značnou tenzi páry a lze je proto z hřebíčku snadno vydestilovat<br />

s vodní parou při teplotě nižší než 100°C. Ze získané vodní emulze se silice vyextrahuje do<br />

vhodného rozpouštědla. Oddestilováním rozpouštědla z extraktu lze získát čistou hřebíčkovou<br />

silici.<br />

Eugenol je fenolická látka obsažená hlavně v nezralých plodech rostlin čeledi Myrtaceae<br />

jako je Pimento officinalis či Caryophyllum aromaticum u nás známých jako nové koření (jamajský<br />

pepř) a hřebíček. Eugenol se používá v zubním lékařství jako lokální anestetikum. Působí také jako<br />

aktivátor žaludečních trávicích enzymů a s tím také souvisí obliba těchto druhů koření téměř ve<br />

všech světových kuchyních.<br />

MATERIÁL<br />

Třecí miska s tloučkem, topné hnízdo na 250 mL a 500 mL, vodní lázeň, stojany, svorky, baňky,<br />

korkové zátky, skleněné trubice, chladiče, alonže, Erlenmaeyerovy baňky, kadiny, teploměr, dělicí<br />

nálevka, odměrný válec, skleněné kuličky, hřebíček, hexan.<br />

POSTUP<br />

Sestavte destilační aparaturu pro destilaci s vodní párou dle obrázku 23. Obě baňky<br />

umístěte do topných hnízd. Zábrusy dobře promažte silikonem. Vyvíječ vodní páry naplňte do 2/3<br />

vodou a na jeho dno nezapomeňte dát skleněné kuličky (varné kamínky). Do trojhrdlé baňky<br />

nasypte 10 gramů jemně rozdrceného a ve třecí misce rozetřeného hřebíčku a přilijte 100 mL<br />

destilované vody. Zaváděcí trubičku z vyvíječe vodní páry zaveďte do trojhrdlé baňky. Mírným<br />

proudem pusťte do chladiče vodu. Zapněte nejdříve vyhřívání vyvíječe vodních pár a až začnou<br />

do destilační baňky unikat vodní páry spusťte i vyhřívání druhé baňky zhruba na polovinu<br />

stupnice. Během destilace neustále kontrolujte aparaturu, případně regulujte teplotu vyhřívání.<br />

Suspenzi silice s vodou jímejte do připravené předlohy. Z časových důvodu ukončete destilaci asi<br />

po 1/2 hodině i v případě, že veškerá silice nebude z hřebíčku vydestilovaná.<br />

Ze získané směsi vody a silice vyextrahujte silici hexanem. Předestilovanou směs nalijte do<br />

dělící nálevky, přidejte k ní 15 mL hexanu a po uzavření nálevky zátkou obsah důkladně protřepte<br />

(viz úloha č. 4 – Extrakce). Pozor na vnitřní přetlak, odstraníte ho otočením nálevky a otevřením<br />

ventilu. Po důkladném protřepání vyčkejte až se v nálevce vytvoří rozhraní dvou vrstev. Spodní<br />

vrstvu tj. vodu se zbytkem silice odlijte do kádinky. Roztok silice v hexanu (horní vrstva) pak<br />

přelijte do SUCHÉ Erlenmayerovy baňky. I minimální množství vody způsobí zakalení silice po<br />

oddestilování hexanu. Extrakci zopakujte ještě dvakrát vždy s novým podílem hexanu, který<br />

přidáváte k vodné fázi. Jednotlivé podíly silice v hexanu spojte a oddestilujte rozpouštědlo.<br />

Sestavte aparaturu pro destilaci za normálního tlaku. Roztok silice přelijte do malé<br />

zábrusové baňky (100 mL), na kterou nasadíte Claisenův nadstavec s vodním chladičem. Baňku<br />

zahřívejte opatrně na vodní lázni (vařič s hrncem). Během destilace je nutno regulovat teplotu<br />

vodní lázně. Udržujte ji mezi 80 - 90°C. Zároveň sledujte teplotu v destilační aparatuře. Jakmile<br />

přestane hexan destilovat, destilaci zastavte a nechte aparaturu zchladnout. Mikropipetou<br />

převeďte silici do předem odvážené mikrozkumavky a určete její objem a hmotnost.<br />

Oddestilovaný hexan přelijte do láhve k tomu určené.<br />

Pozor: Hexan je hořlavina I. třídy, nepoužívejte v blízkosti práce s ním otevřeného ohně.<br />

Zabraňte, aby se dostala voda dovnitř topného hnízda. Pokud se tak stane okamžitě<br />

odpojte hnízdo z elektrické sítě.<br />

53

VYHODNOCENÍ<br />

1) Určete výtěžek hřebíčkové silice a vypočtěte její hustotu.<br />

2) Stanovte teplotu varu hexanu a srovnejte ji s tabulkovou hodnotou.<br />

3) Zamyslete se nad tím, proč je výhodnější destilaci s vodní parou provádět výše popsaným a<br />

provedeným způsobem, než destilovat danou látku společně s vodou v jedné baňce.<br />

4) Do protokolu zakreslete vzorce eugenolu a acetyleugenolu a pokuste se odvodit jejich<br />

systematické názvy.<br />

Doporučená literatura:<br />

Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.<br />

Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.<br />

Mareček, A. a Růžička, A.: Laboratorní <strong>technika</strong> pro nechemické obory, Vydavatelství MU Brno,<br />

1997<br />

Chemické analytické tabulky<br />

54

Laboratorní cvičení č. 7<br />

PRÁCE S PLYNY A SKLEM<br />

V současné době jsou téměř všechny plyny dostupné komerčně v tlakových lahvích. Občas<br />

si však potřebujeme v laboratoři připravit malé množství plynu sami. Nejjednodušším zařízením<br />

k tomuto účelu je Oswaldova baňka (obr. 24). Její princip je patrný z obrázku: k tenkostěnné<br />

skleněné baňce je přes korkovou zátku připojena dělící, popř. klasická nálevka. Na dno baňky<br />

dáváme tuhou látku, případně suspenzi s vodou, ke které z dělící nálevky přikapáváme vhodnou<br />

kapalinu, se kterou tuhá látka reaguje za vzniku žádaného plynného produktu. Uvolněný plyn se<br />

odvádí trubičkou. Dokonalejším zařízením je Kippův přístroj (obr. 25), v němž se při přerušení<br />

odběru plynu vývoj plynu samovolně zastaví. Do střední části C se na dírkovanou kaučukovou<br />

destičku vloží tuhá kusovitá látka. Do horní části D nalijeme tolik kyseliny, aby zaplnila celou<br />

spodní část a dostala se do styku s tuhou látkou. V tomto okamžiku se začne uvolňovat plyn. Je-li<br />

kohoutek B uzavřený, vzniklý plyn vytlačí kapalinu z části A, čímž přeruší další vývoj plynu.<br />

Kohoutkem je tedy možno vývoj plynu regulovat. Horní rezervoár D uzavíráme zátkou,<br />

zamezujeme tak unikání nežádoucích plynů do ovzduší.<br />

D<br />

C<br />

Obrázek 24: Oswaldova baňka.<br />

Obrázek 25: Kippův přístroj A/ spodní prostor pro<br />

kapalinu, B/ odvaděč plynu, C/ střední prostor pro pevnou<br />

látku, D/ zásobník na kapalnou složku reakce.<br />

Laboratorně lze běžné plyny připravit následovně:<br />

1) Reakcí tuhé látky s kapalinou<br />

CO 2 :<br />

kusový mramor + 4 M kyselina chlorovodíková<br />

CaCO 3 + 2 HCl → CaCl 2 + H 2 O + CO 2<br />

H 2 S:<br />

kusový sulfid železnatý + 3 M kyselina chlorovodíková<br />

FeS + 2 HCl → FeCl 2 + H 2 S<br />

H 2 :<br />

granulový zinek + 4 M kyselina chlorovodíková<br />

Zn + 2 HCl → ZnCl 2 + H 2<br />

55

Cl 2 :<br />

manganistan draselný + konc. kyselina chlorovodíková<br />

2 KMnO 4 + 16 HCl → 2 KCl + 2 MnCl 2 + 8 H 2 O + 5 Cl 2<br />

oxid manganičitý + konc. kyselina chlorovodíková<br />

MnO 2 + 4 HCl → MnCl 2 + 2 H 2 O + Cl 2<br />

chlorové vápno + konc. kyselina chlorovodíková<br />

ClOCl 2 + 2 HCl → CaCl 2 + H 2 O + Cl 2<br />

SO 2 :<br />

měď + konc. kyselina sírová<br />

Cu + 2 H 2 SO 4 → CuSO 4 + H 2 O + SO 2<br />

disiřičitan draselný + 2 M kyselina sírová<br />

K 2 S 2 O 5 + H 2 SO 4 → K 2 SO 4 + H 2 O + 2 SO 2<br />

C 2 H 2 : karbid vapenatý + voda<br />

CaC 2 + 2 H 2 O → Ca(OH) 2 + C 2 H 2<br />

O 2 :<br />

HCl:<br />

katalytický rozklad 30% peroxidu vodíku účinkem burelu<br />

MnO<br />

2 H 2 O 2 ⎯⎯ 2 →2 H2O + O 2<br />

chlorid sodný + konc. kyselina sírová<br />

2 NaCl + H 2 SO 4 → Na 2 SO 4 + 2 HCl<br />

HN 3 : chlorid amonný + 50% hydroxid amonný<br />

NH 4 Cl + KOH → KCl + H 2 O + NH 3<br />

HBr:<br />

bromid sodný + 85% kyselina fosforečná<br />

3 NaBr + H 3 PO 4 → Na 3 PO 4 + 3 HBr<br />

2) Reakcí dvou kapalin<br />

O 2 :<br />

15% peroxid vodíku + nasycený roztok manganistanu draselného v 1 M kys. sírové<br />

2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 4 H 2 SO 4 → 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O + 5 O 2<br />

SO 2 :<br />

nasycený roztok hydrogensiřičitanu sodného + 3 M kyselina sírová<br />

NaHSO 3 + H 2 SO 4 → NaHSO 4 + H 2 O + SO 2<br />

CO:<br />

CO 2 :<br />

dehydratací kyseliny mravenčí účinkem konc. kyseliny sírové<br />

HCOOH<br />

⎯ 4<br />

⎯<br />

H 2SO ⎯→H<br />

2O + CO<br />

nasycený roztok hydrogenuhličitanu draselného + 3 M kyselina sírová<br />

KHCO 3 + H 2 SO 4 → KHSO 4 + H 2 O + CO 2<br />

HCl:<br />

N 2 :<br />

dehydratací kyseliny chlorovodíkové účinkem konc. kyseliny sírové<br />

10% roztok chloridu amonného + 10% roztok dusitanu sodného<br />

NH 4 Cl + NaNO 2 → NaCl + 2 H 2 O + N 2<br />

56

3) Zahříváním tuhých látek<br />

CO 2 : 2 NaHCO 3 ⎯→<br />

t Na2CO 3 + H 2 O + CO 2<br />

O 2 : 2 KClO 3 ⎯ t,MnO ⎯⎯<br />

2 → 2 KCl + 3 O<br />

N 2 O: NH 4 NO 3<br />

NO 2 : 2 Pb(NO 3 ) 2<br />

NH 3 : CaO + 2 NH 4 Cl<br />

⎯→<br />

t 2 H2O + N 2 O<br />

⎯→<br />

t 2 PbO + 4 NO2 + O 2<br />

⎯→<br />

t CaCl2 + H 2 O + 2 NH 3<br />

H 2 S: zahříváním směsi parafínu, síry a kaolínu (Al 2 O 3 )<br />

2<br />

4) Zahřívaním kapalin<br />

NH 3 : konc. roztok amoniaku<br />

HCl:<br />

konc. kyselina chlorovodíková<br />

Většina laboratorně připravených plynů, stejně jako plynů odebíraných z lahví, není zcela<br />

čistá a suchá. Sušení a čištění plynů provádíme zpravidla v promývačce, U-trubicích a sušících<br />

válcích. Absorpční prostředky pro jednotlivé plyny uvádí tabulka 5:<br />

PLYN PŘÍMĚSI LÁTKY ZACHYCUJÍCÍ<br />

PŘIMĚSI<br />

Vodík<br />

AsH 3 , PH 3<br />

KMnO 4 , KOH<br />

H 2 O konc. H 2 SO 4<br />

Amoniak H 2 O CaO, KOH<br />

Dusík O 2 alkalický roztok pyrogalolu<br />

Různé<br />

CO 2 , H 2 S, SO 2<br />

25% roztok KOH<br />

H 2 O P 2 O 5 , silikagel, bezvodý CaCl 2<br />

Cl 2 roztok Na 2 S 2 O 3<br />

Tabulka 5: Absorpční prostředky používané pro čištění laboratorně připravených plynů.<br />

PLYNY V TLAKOVÝCH LAHVÍCH<br />

Pro použití ve větších množstvích se plyny do laboratoří dodávají v ocelových lahvích. Plyny<br />

obtížně zkapalnitelné (kyslík, vodík, dusík, vzduch) jsou v nich stlačeny na vysoký tlak až 1500<br />

MPa, plyny snáze zkapalnitelné (chlor, amoniak, SO 2 , CO 2 ) jsou v ocelových láhvích pod tlakem<br />

daleko nižším. Některé plyny se z bezpečnostních důvodu nedají komprimovat na vysoký tlak.<br />

Příkladem může být acetylen, který se proto dodává v ocelových láhvích vyplněných porézní<br />

hmotou nasáklou acetonem, ve kterém se acetylen dobře rozpouští. Obsah láhve je označen<br />

barevným pruhem pod hrdlem láhve a kromě toho musí být technické údaje o láhvi blízko pod<br />

hrdlem vyraženy.<br />

57

Přehled barevných označení tlakových láhví:<br />

modrá……………..…kyslík<br />

zelená……………….dusík<br />

červená………….…vodík<br />

stříbrošedá……..vzduch<br />

bílá………………….…acetylen<br />

žlutá………………………..chlor<br />

fialová..……………….….amoniak<br />

černá…..………………....oxid uhličitý<br />

perlově šedá…………..oxid siřičitý<br />

pastelově zelená…..oxid dusný<br />

Kromě barevného označení jsou ventily k láhvím s hořlavými plyny opatřeny levotočivým<br />

závitem, ventily k láhvím s nehořlavými plyny mají závit pravotočivý. Ocelové láhve je nutno<br />

chránit před zbytečným zahříváním a před nárazem, kdy by skryté vady materiálu a koroze oceli<br />

mohly způsobit explozi. V laboratoři je proto nutné uložit láhve do speciálního stojanu nebo<br />

připoutat řetězem k pevné opoře.<br />

Odběr plynů z láhví můžeme provádět pouze přes redukční ventily různých typů. Pro plyny<br />

dodávané pod vysokým tlakem, používáme nejčastěji redukční ventil zobrazený na obrázku 26.<br />

Redukční ventil našroubujeme na vývod láhve pomocí matice. Těsnící kroužek nesmí být<br />

poškozený, aby mohl dokonale těsnit. Dříve než otevřeme ventil na láhvi, uzavřeme na doraz<br />

uzavírací ventil a odšroubujeme otáčením doleva regulační šroub tak, abychom necítili tlak<br />

pružiny. Po otevření ventilu na láhvi ukáže manometr vyžadovaný tlak plynu v láhvi. Zašroubováním<br />

šroubu naregulujeme vyžadovaný tlak na manometru. Láhev je takto připravená k odběru plynu.<br />

Pomalým otáčením uzavíracího ventilu nastavíme vyžadovaný tlak proudu plynu, přičemž tlak<br />

odebíraného plynu se samovolně reguluje prohýbáním membrány a dosednutím čepu do ložiska. Do<br />

redukční komory zasahuje pojistný ventil, kterým unikne plyn, když se redukční zařízení pokazí.<br />

Redukční ventily, zejména na kyslík, se nesmí nikdy z bezpečnostních důvodů mazat organickými<br />

mazadly a ani těsnící složky nesmějí být z organických látek. Užívají se proto kroužky azbestové<br />

a olověné.<br />

Obrázek 26: Redukční ventil.<br />

K zachycování a krátkodobému skladování plynů používáme tzv. plynojemy s uzavíracími<br />

kapalinami. Nejjednodušším zařízením je zkumavka nebo válec naplněný vodou a ponořený dnem<br />

nahoru do větší nádoby s vodou. Plyn zavádíme do zkumavky ohnutou trubičkou. Je-li zkumavka<br />

kalibrována, pak mluvíme o tzv. eudiometru (obr. 27), jehož se užívá ke stanovení objemu<br />

vzniklého plynu. Větší množství plynu uchováváme ve skleněných nebo kovových plynojemech.<br />

Jednoduchý plynojem představují dvě láhve, opatřené dole tubusem a navzájem spojené pryžovou<br />

58

hadicí. V jedné láhvi je v hrdle pryžová zátka s trojcestným kohoutem. Toto zařízení umožňuje<br />

nasávání plynu při plnění a zároveň nastavení libovolného přetlaku při odběru plynu. Plyny<br />

nasáváme tak, že láhev s trojcestným kohoutem naplníme zcela uzavírací kapalinou. Pak ji pomocí<br />

trojcestného kohoutu spojíme s prostorem, v němž se vyvíjí plyn. Jakmile prázdnou láhev snížíme,<br />

začne se plnit uzavírací kapalinou, která do ní protéká z láhve opatřené trojcestným kohoutem.<br />

Tím nad kapalinou jímáme plyn, který se nasává do prostoru, v němž původně byla kapalina. Po<br />

uzavření kohoutu můžeme plyn nad kapalinou uchovávat. Chceme-li plyn odebírat, spojíme<br />

nastavením trojcestného kohoutu láhev s prostorem, kam má být plyn transportován a druhou<br />

láhev zvedneme nad hladinu láhve s plynem.<br />

ÚKOL č. 12: Práce se sklem a korkem<br />

Naučte se řezat a otavovat skleněné trubičky, ohýbat je, vytahovat z nich kapiláry a<br />

zatavovat jejich konce.<br />

Skleněné trubice nebo tyčinky se při řezání položí na stůl a nožem na sklo nebo jemným<br />

pilníkem se udělá asi na polovinu obvodu vryp. Trubice se uchopí oběma rukama co nejblíže vrypu<br />

tak, aby byly palce opřeny do trubice na opačné straně vrypu. Mírným tahem a současným tlakem<br />

se trubice rozlomí. Nedá-li se trubice snadno rozlomit, je nutné vryp prohloubit, neboť by<br />

trubice mohla prasknout nepravidelně. Tlustostěnné trubice a trubice o velkém průměru se řežou<br />

tak, že se udělá vryp po celém obvodu trubice a na rysku se přiloží za stalého pomalého otáčení<br />

silný rozžhavený drát ohnutý do půlkruhu. Ostré hrany trubic je třeba hladce otavit. Zamezí se<br />

tak zbytečným úrazům pořezáním, zároveň je tím usnadněno vsazování trubic do pryžových hadic<br />

nebo zátek. Konec trubice se otáčí a zahřívá v plameni tak dlouho, až sklo začne měknout, což se<br />

projeví jasně žlutou barvou plamene. Pozor, při delším zahřívání by se konec trubice mohl zúžit a<br />

nakonec by se úplně uzavřel.<br />

Při ohýbání trubice je důležité rovnoměrné prohřátí trubice po celé délce ohybu. Trubici je<br />

třeba držet v plameni podélně a stále ji otáčet a posouvat, aby se dosáhlo rovnoměrného ohřevu.<br />

Zahřívá se tak dlouho, až se sklo začne vlastní váhou ohýbat. Po vytažení trubice z plamene je<br />

nutno ji ihned ohnout do požadovaného tvaru a sečkat, až sklo dostatečně ztuhne. Plného tvaru<br />

ohnutí lze dosáhnout, když se během ohýbání do trubice mírně fouká při utěsnění druhého konce.<br />

Při vytahování kapilár je opět nutné důkladné prohřátí trubice v délce zhruba 6 cm. Když<br />

sklo dostatečně změkne, stlačí se oba konce trubice mírně k sobě, aby se na nažhaveném úseku<br />

nahromadilo více skloviny. Po vyjmutí trubice z plamene se ihned rychlým tahem vytáhne kapilára<br />

do požadované délky a šířky. Po ochlazení skla se kapilára vylomí ze zbytku trubice, popř. odřízne<br />

nožem na sklo. Konec kapiláry lze zatavit krátkým podržením v plameni.<br />

Skleněné trubice se mohou spojovat stavováním jen v případě, jsou-li ze stejného skla nebo<br />

ze skla podobných vlastností. Při spojování trubic stejného průměru je postup takový, že se jedna<br />

z trubic na jednom konci zazátkuje a volné přilehlé konce trubic se protaví v plameni. Mimo<br />

plamen se trubice přiloží rozžhavenými konci k sobě a za stálého otáčení se lehce stlačí. Trubice<br />

se musí dokonale stavit, a spojení musí být bez nejmenších otvorů. Nahromaděné sklo ve sváru se<br />

vyrovná foukáním po předchozím protavení, do otevřeného konce trubice. Při stavování trubic<br />

nestejného průměru je potřeba širší trubici vytažením zúžit na průměr menší trubice.<br />

Na vrtání otvorů do korkových a gumových zátek se užívá korkovrtů, což jsou tenkostěnné<br />

mosazné trubice na jednom konci naostřené. Korková zátka se nejprve změkčí ponořením na<br />

několik minut do vařící vody. Pro vrtání se vybírá vždy korkovrt s o něco menším průměrem než má<br />

trubička, která se bude do otvoru vsazovat. Zátku je třeba položit na tvrdou podložku a vrtat<br />

kolmo k ploše zátky šroubovitým pohybem. Po provrtání zátky se vyvrtaná hmota odstraní<br />

59

z korkovrtu tyčinkou a korkovrt se vytáhne. Trubičky se do otvorů vsouvají šroubovitým<br />

pohybem. Trubičku je lépe držet co nejblíže zátce a z bezpečnostních důvodů nejlépe v hadříku.<br />

MATERIÁL<br />

Skleněná trubice o průměru 6 mm s tenkou stěnou, skleněná trubice o průměru 6 mm s tlustou<br />

stěnou, nůž na sklo, podložka, hořák, korková zátka, korkovrt, gumová hadice.<br />

POSTUP<br />

Podle přiložených materiálů se seznamte se základní charakteristikou práce s chemickým<br />

sklem a práci s korkovrtem. Naučte se řezat a otavovat skleněné trubičky, ohýbat je, vytahovat<br />

z nich kapiláry a zatavovat jejich konce. Pokuste se o vyfouknutí baničky.<br />

Na závěr využijte dovedností, které jste se naučili. Sestavte aparaturu dle obrázku 27,<br />

kterou budete potřebovat pro následující úkol. Využijte skleněné trubice se širší stěnou,<br />

korkovou zátku, do které pomocí korkovrtu vyvrtáte dva otvory (jeden pro dělící nálevku a druhý<br />

pro připravenou odvodovou trubici). Pro lehčí manipulaci s aparaturou tuto trubici připravte<br />

dvoudílnou a díly propojte gumovou hadicí.<br />

Obrázek 27: Aparatura pro měření objemů plynu uvolněného chemickou reakcí (eudiometr).<br />

ÚKOL č. 13: Určete procentuální obsah uhličitanu vápenatého ve vaječné skořápce jeho<br />

rozložením na oxid uhličitý.<br />

Někteří živočichové a rostliny jsou schopní akumulovat ve svých tělech potravou a živinami<br />

přijímaný vápník ve formě uhličitanu. Tato ryze anorganická látka pak díky své pevnosti a tvrdosti<br />

plní především roli ochrannou a je vylučována na povrch, např. někteří zástupci měkkýšů nebo u<br />

vejcorodých obratlovců chrání vajíčka, kde je hlavní složkou jejich obalů. O přítomnosti<br />

uhličitanu vápenatého ve vaječné skořápce se dá přesvědčit jejím rozkladem koncentrovanou<br />

kyselinou chlorovodíkovou a jímáním uvolněného oxidu uhličitého dle následující rovnice:<br />

CaCO 3 + 2 HCl → CO 2 + H 2 O + CaCl 2<br />

Plyn uvolněný během reakce se může jímat pomocí jednoduše zhotoveného eudiometru a<br />

z objemu lze vypočítat na základě Avogadrova zákona množství původního CaCO 3 .<br />

60

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE<br />

Dělící nálevka, Erlenmayerova baňka, korková zátka s odvodovou trubicí, skleněná vana, odměrný<br />

válec bez podstavce, stojan, svorka, sifónová láhev s bombičkami plněnými CO 2 , váženka, třecí<br />

miska s tloučkem, teploměr, předvážky, analytické váhy, vaječné skořápky, parafilm, konc. HCl a<br />

CaCO 3 .<br />

POSTUP<br />

Ve třecí misce rozetřete o něco více než 1 gram vaječné skořápky zbavené organických<br />

složek (bílek). Na analytických vahách odvažte přesně 1 g rozmělněné skořápky a nasypte na dno<br />

suché Erlenmayerovy baňky. Poté sestavte a pomocí parafilmu neprodyšně uzavřete aparaturu<br />

sestavenou v předchozí úloze. Vanu naplňte pomocí sifónové láhve vodou sycenou CO 2 , tím<br />

zabráníte možnému rozpouštění uvolňovaného CO 2 během vlastního pokusu ve vodě skleněné vany.<br />

Skleněný válec eudiometru naplňte sycenou vodou. Nejlépe se to dělá tak, že se celý válec<br />

položí do vany s vodou a pak se opatrně vyzvedne, aniž se jeho hrdlo dostane nad hladinu. Pomocí<br />

volné skleněné trubice opatrně vžeňte pod hrdlo válce bubliny tak, aby se hladina vody ve válci<br />

posunula přesně na dobře zapamatovatelnou rysku stupnice (100 mL). Poté vsuňte do válce<br />

odvodovou trubici z aparatury.<br />

Do uzavřené dělící nálevky eudiometru opatrně nalijte koncentrovanou HCl. Celý pokus<br />

zahájíte opatrným vypouštěním HCl na vzorek. Dbáte přitom na to, aby vám uvolňovaný CO 2<br />

neprobublával přes kyselinu v dělící nálevce (kohout otvírejte vždy jen krátce a po přídavku ihned<br />

zavírejte). Po skončení vývoje plynu odečtěte jeho objem na stupnici eudiometru a ten použijte<br />

pro výpočet.<br />

Pro kontrolu proveďte celý pokus znovu s přesně odváženým 1 gramem čistého CaCO 3 .<br />

Poznámka: Rozklad a vývoj CO 2 u skořápky je na rozdíl od čistého CaCO 3 zpomalen napěněním<br />

vzorku, proto vyčkejte až do rozložení veškerého vzorku (15-20 min).<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Avogadrův zákon praví, že za normálních podmínek (273,15 K a 101,3 kPa) objem jednoho<br />

molu plynu zaujímá 22,414 litrů. Objem CO 2 uvolněný při pokusu se proto musí přepočíst na tyto<br />

podmínky, tj. zjistit objem V o jaký by plyn zaujímal při 273,15 K (O°C) a tlaku 101,3 kPa. Při<br />

výpočtu vycházejte ze stavové rovnice:<br />

p.V/T = p 0 .V 0 /T 0<br />

kde veličiny se symbolem 0 udávají hodnotu za standardních podmínek. Tlak v laboratoři je nutno<br />

korigovat na tensi par uzavírající kapaliny p aq , která se liší s teplotou a musí se od atmosférického<br />

tlaku odečíst. Zjistíte ji z následující tabulky:<br />

Teplota (°C) Tenze par (kPa) Teplota (°C) Tenze par (kPa)<br />

15 1,705 23 2,809<br />

16 1,817 24 2,982<br />

17 1,937 25 3,167<br />

18 2,062 26 3,360<br />

19 2,197 27 3,565<br />

20 2,337 28 3,778<br />

21 2,486 29 4,005<br />

22 2,642 30 4,241<br />

Tabulka 6: Korekce atmosférického tlaku v laboratoři.<br />

61

Po úpravě stavové rovnice dostáváte:<br />

V 0 = (p – p aq ).V.T 0 / p 0 .T<br />

Nezapomeňte, že teplotu T i T 0 je nutno uvádět v Kelvinech, T získáte připočtením 273,15<br />

k teplotě ve stupních Celsia. Současný atmosférický tlak v laboratoři vám sdělí vedoucí cvičení.<br />

K výpočtu množství původního CaCO 3 je pak nutné si uvědomit, že reakce probíhá<br />

stechiometricky podle koeficientů (z jednoho molu CaCO 3 se uvolní jeden mol CO 2 ), a dále že<br />

jeden mol je látkové množství soustavy, která obsahuje právě tolik částic (atomů, molekul, iontů<br />

či jiných částic), kolik je atomů v 0,012 kg uhlíku C 12 . Jeho hmotnost je číselně rovna poměrné<br />

molekulové (atomové, iontové) hmotnosti uvažované látky.<br />

Určete procentuální obsah CaCO 3 ve vaječné skořápce a správnost výpočtu i měření si<br />

ověřte výpočtem hmotnosti CaCO 3 , přes CO 2 uvolněný jeho rozkladem z přesně naváženého 1<br />

gramu CaCO 3 . Získané hodnoty komentujte a vyhodnoťte přesnost vašeho pokusu.<br />

Doporučená literatura:<br />

Eysseltová, J. a kol.: Základy laboratorní techniky, Nakladatelství Karolinium Praha, 2000.<br />

Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.<br />

Pazdera, P. a Potáček, M.: Laboratorní cvičení z organické chemie, Vydavatelství UJEP Brno,<br />

1984.<br />

62

Laboratorní cvičení č. 8<br />

SUŠENÍ, CHLAZENÍ A LYOFILIZACE<br />

Sušením se rozumí proces, kdy zbavujeme látku pevnou, kapalnou či plynnou vody nebo jiné<br />

nežádoucí kapaliny a jejích par. V praxi se nejčastěji setkáváme s odstraňováním vody, ve které<br />

většina chemických reakcí probíhá. A nebo naopak je třeba vodu odstranit z reakční směsi u<br />

reakcí, kde i v malém množství může průběh reakce nepříznivě ovlivnit. Vlhkost a vodu lze<br />

odstraňovat jednak fyzikálně – sušením v proudu horkého vzduchu, zahříváním nebo chemicky -<br />

vhodným dehydratačním činidlem. Podle způsobu jak vážou vodu lze tato činidla rozdělit do<br />

následujících skupin:<br />

- látky hygroskopické, které snadno vytvářejí hydráty, patří sem bezvodé soli a jejich nižší<br />

hydráty (např. K 2 CO 3 , Na 2 SO 4 , KOH)<br />

- látky odstraňující vodu ze směsi tím, že s ní chemicky reagují (P 4 O 10 , BaO, CaO, Na, B 2 O 5 )<br />

- látky poutající vodu fyzikální adsorpcí (silikagel, Al 2 O 3 , některé polymery)<br />

SUŠENÍ PLYNŮ<br />

Plyny sušíme v promývačkách (obr. 27), sušících věžích (obr. 28) a U-trubicích (obr. 29), do<br />

kterých umísťujeme sušící činidlo - pevnou látku (do sušících věží a U-trubic) a hygroskopické<br />

kapaliny (do promývaček). Stupeň vysušení je závislý na tloušťce vrstvy sušícího činidla a dobrém<br />

styku plynu s ním. Toho můžeme dosáhnout vložením frity do promývačky a propojením několika<br />

promývaček za sebou. Sušící věže a U-trubice plníme tak, aby hmota kladla plynu všude stejný<br />

odpor a plyn případně neprocházel kanálky v ní. Promývačky plníme do 1/3 jejich objemu.<br />

Obrázek 27: Promývačky.<br />

Obrázek 28: Sušící věž.<br />

Při výběru sušidla je nutno brát v úvahu, zda je plyn inertní nebo zda má bazický či kyselý<br />

charakter. Bazické plyny, jako např. amoniak, nejčastěji sušíme pevnými hydroxidy. Kyselé (H 2 S,<br />

HBr) a inertní (N 2 ) pak oxidem fosforečným, silikagelem či nejúčinněji kyselinou sírovou (tab. 7)<br />

Velmi účinným způsobem sušení plynu je jeho vymrazení. Provádí se tak, že plyn vedeme U-trubicí<br />

ponořenou do chladící směsi (viz níže).<br />

63

Někdy je důležité zabránit vzdušné vlhkosti přístupu do aparatury (destilace). To<br />

provádíme napojením trubice plněné bezvodým chloridem vápenatým na konec aparatury.<br />

Obrázek 29: U-trubice<br />

Plyn čištění Sušení Identifikace<br />

Vodík roztok KMnO 4<br />

pevný KOH<br />

konc. H 2 SO 4 , P 4 O 10<br />

CaCl 2<br />

hoří, tvoří výbušnou směs<br />

se vzduchem<br />

Kyslík konc. H 2 SO 4 , P 4 O 10<br />

CaCl 2<br />

podporuje hoření,<br />

žhnoucí špejle vzplane<br />

Dusík<br />

alkal.roztok<br />

pyrogallolu<br />

konc. H 2 SO 4 , P 4 O 10<br />

CaCl 2<br />

nepodporuje hoření,<br />

žhnoucí špejle zhasne<br />

Amoniak CaO. KOH, NaOH pH papírkem, konc.HCl<br />

oxid uhličitý roztok NaHCO 3 konc. H 2 SO 4 , P 4 O 10 , CaCl 2 Ba(OH) 2 , Ca(OH) 2<br />

oxid siřičitý konc. H 2 SO 4 , P 4 O 10 roztok K 2 Cr 2 O 7 ,<br />

CaCl 2 pH papírek<br />

sulfan voda CaCl 2 roztok olovnaté soli<br />

pH papírek<br />

chlor roztok KMnO 4<br />

voda<br />

konc. H 2 SO 4 ,<br />

CaCl 2<br />

jodoškrobový papírek,<br />

barva žlutozelená<br />

chlorovodík konc. H 2 SO 4 , CaCl 2 pH papírek<br />

Tabulka 7: Sušení a čištění plynů.<br />

SUŠENÍ KAPALIN<br />

Kapalné látky se suší v uzavřených lahvích či dělících nálevkách přímým stykem se sušícím<br />

činidlem za občasného protřepávání. Aby bylo sušení účinné je třeba ho provádět i několik hodin.<br />

Používá se jen přiměřené množství sušidla, aby nedocházelo ke zbytečným ztrátám sušené<br />

kapaliny zachycením časti kapaliny v sušidle. Podmínkou samozřejmě je, aby sušidlo s kapalinou<br />

chemicky nereagovalo a nerozpouštělo se v ní. Často se používají vápenaté soli CaCl 2 , CaCO 3 a<br />

bezvodá skalice modrá či uhličitan sodný. Bazické kapaliny, jako třeba pyridin, se suší hydroxidem<br />

sodným, draselným a barnatým. Organická rozpouštědla se dobře zbavují vody reakcí<br />

s alkalickými kovy (pozor na nebezpečí výbuchu při velkém obsahu vody), P 4 O 10 , nebo<br />

Grinardovými sloučeninami. Netěkavé kapaliny se nejlépe vysuší azeotropní destilací. V posledních<br />

64

letech se s oblibou začaly na vysoušení organických rozpouštědel používat syntetické<br />

křemičitany.<br />

SUŠENÍ PEVNÝCH LÁTEK<br />

Ve velké většině případů je sušení pevných látek založeno na volném odpařování vlhkosti. To<br />

může probíhat za normální nebo zvýšené teploty, ve vakuu nebo za normálního tlaku. Před<br />

počátkem sušení je třeba vždy odstranit co největší množství vody mechanicky – dokonalým<br />

odsátím, vylisováním apod. Nejjednodušším způsobem sušení, je rozprostření sušené látky v tenké<br />

vrstvě na filtračním papíru či porcelánové misce na volném vzduchu. Je možné provést sušení za<br />

zvýšené teploty v sušárně nebo pod infralampou. Filtrační papír však snáší teploty jen do 100ºC,<br />

při vyšších teplotách je třeba použít vhodnější podložku. V sušárně nikdy nesmějí být sušené látky<br />

těkavé nebo látky se zbytky těkavých hořlavých rozpouštědel, jejichž páry by mohly se vzduchem<br />

vytvořit třaskavou směs. Pro sušení při teplotách vyšších než 200ºC se používají muflové pece<br />

nebo sušící pícky.<br />

Obrázek 30: Exsikátory: klasický vakuový<br />

Chemickou cestou je možno vysoušet<br />

různými dehydratačními činidly. Vysoušení<br />

obvykle provádíme v uzavřených nádobách –<br />

exsikátorech, které mohou být i pod vakuem<br />

(obr. 30). Rychlejšího vysoušení malých<br />

množství látek lze dosáhnout v tzv.<br />

vysoušecích pistolích (Abderhaldenův<br />

přístroj) rovněž napojených na vakuum (obr.<br />

31). Látka (A) je zde vyhřívána párami vroucí<br />

kapaliny o vhodném bodu varu (C), kdežto<br />

sušidlo je ve zvláštní baňce mimo vyhřívaný<br />

prostor (B). Nejběžnější vysoušecí<br />

prostředky používané v exsikátorech jsou<br />

shrnuty v tabulce 8. Kyselinu sírovou a oxid<br />

fosforečný nenaléváme přímo na dno<br />

exsikátoru, ale zvlhčíme kapalinou skleněné<br />

kuličky a tím zvětšíme absorpční povrch.<br />

A<br />

C<br />

B<br />

Obrázek 31: Abderhaldenův přístroj.<br />

65

Sušidlo zbylé mg H 2 O na litr sušeného vzduchu při 25ºC<br />

bezv. CuSO 4 1,4<br />

98% H 2 SO 4 0,3<br />

bezv. CaCl 2 0,25 – 0,14<br />

CaO 0,2<br />

Mg(ClO 4 ) 2 .3H 2 O 0,031<br />

silikagel 0,02<br />

100% H 2 SO 4 0,003<br />

KOH 0,002<br />

bezv. Mg(ClO 4 ) 2 0,0005<br />

P 4 O 10 0,000025<br />

Tabulka 8: Sušidla vhodná pro použití v exsikátorech a jejich účinnost.<br />

CHLAZENÍ<br />

V chemické laboratoři se velmi často setkáváme s chlazením. Chlazení hraje důležitou roli<br />

při krystalizačních pochodech, při destilaci látek s nízkou teplotou bodu varu. Chladit musíme<br />

silně exotermické reakce.<br />

Při izolacích biomolekul, u nichž je nutné zachovat jejich biologickou funkci (enzymová<br />

aktivita) je třeba celý proces izolace provádět při teplotě okolo 0ºC. Tím zabraňujeme denaturaci<br />

proteinů, která in vitro nastává již při teplotách nad 4ºC. Ve velkých biochemických ústavech<br />

k tomuto účelu slouží celé speciální chladící místnosti, tzv. „cold roomy“. V našich podmínkách<br />

můžeme chlazení při izolaci dosáhnout použitím misek s drceným ledem, popř. provádět nenáročné<br />

úkony (dialýza) v ledničkách (viz. lab. cvičení č. 3).<br />

K dlouhodobému uchovávání mnohých chemikálií a<br />

biologického materiálu je třeba snížené teploty.<br />

V biochemické laboratoři proto velice často narazíme na<br />

lednice a mrazící boxy vyhrazené k tomu účelu. Pro uchovávání<br />

vzorku RNA a kompetentních bakteriálních řetězců je pak<br />

nezbytný hlubokomrazící box s teplotou -80ºC. Případně se<br />

mohou tyto vzorky uchovávat v Dewarových nádobách<br />

s tekutým dusíkem (-196ºC, obr. 32). Tekutý dusík se také<br />

používá na rozrušování a snadnější homogenizaci biologického<br />

materiálu. Dewarovy nádoby mají dvojité stěny mezi nimiž je<br />

vakuum. Stěny bývají většinou postříbřeny, aby docházelo<br />

k menším ztrátám sáláním. Chlazení kapalným vzduchem se<br />

moc často nepoužívá (-180ºC), jelikož při manipulaci s ním<br />

hrozí nebezpečí exploze.<br />

Obrázek 32: Dewarova nádoba.<br />

Průřez a celkový pohled.<br />

Nejčastěji se však setkáváme s chlazením vodou. Běžná vodovodní voda mívá teplotu kolem<br />

12ºC a pomocí různých průtokových systémů (chladič) můžeme dosáhnout jejího rovnoměrného<br />

proudění kolem chlazených nádob. Účinnějšího chlazení než je chlazení drceným ledem, lze<br />

zajistit chladícími směsmi, což jsou směsi drceného ledu s elektrolytem. Při přípravě směsi je<br />

třeba dbát na dobré promísení obou složek a na to, aby byl zabezpečen dokonalý styk chlazeného<br />

povrchu s chladícím prostředím. Směsi NaCl s ledem (1:3) lze dosáhnout teploty -21ºC.<br />

Nejúčinnější je pak směs CaCl 2 .6H 2 O (3:2) s teplotou -49ºC. Dalším poměrně snadno dostupným<br />

66

chladícím prostředkem je pevný oxid uhličitý – suchý led. Používá se ho nejčastěji ve směsi<br />

s různými nízkotuhnoucími organickými rozpouštědly, ve kterých se rozpouští a která ochlazuje<br />

často na teploty nižší, než je jeho bod sublimace. Unáší-li plynný oxid uhličitý s sebou páry<br />

těkavého rozpouštědla směs se dále ochlazuje v důsledku odpařování kapaliny. Použitím<br />

následujících rozpouštědel s pevným CO 2 docílíme těchto teplot:<br />

ethylenglykol<br />

chloroform<br />

aceton<br />

ether<br />

absolutní ethanol<br />

-15ºC<br />

-77ºC<br />

-86ºC<br />

-90ºC<br />

-100ºC<br />

LYOFILIZACE – MRAZOVÁ SUBLIMACE<br />

Lyofilizace je jedním z nejšetrnějších způsobu odstraňování vody z vodných roztoků.<br />

Používá se především k zakoncentrovávání roztoků biologicky aktivních látek, které jsou náchylné<br />

na vyšší teploty a nemohou být zakoncentrovány klasickými způsoby (destilace, odpařování na<br />

vakuové rotační odparce). Podstatou lyofilizace je odsublimování vody ze zamraženého vzorku<br />

pod vakuem. Vakuum by mělo být silné okolo 1-3 kPa. Lyofilizovat se dají pouze vodné roztoky<br />

látek. Přítomnost organických rozpouštědel je nežádoucí, protože snižuji teplotu tuhnutí vody a<br />

zvyšují riziko roztopení vzorku během lyofilizace. Nedostatečné zmrazení vzorku a jeho<br />

roztopení během lyofilizace se projevuje napěněním a může způsobit denaturaci nativního<br />

proteinu (ztráta enzymové aktivity). Vzorek před lyofilizací je nutno odsolit, jelikož se po jeho<br />

zakoncentrování (odstranění většího podílu vody) zvedne koncentrace soli nad mez rozpustnosti.<br />

Zvýšená pozornost by se měla také věnovat lyofilizaci tlumivých roztoků. Rozdílná krystalizace<br />

solí ve vícesložkových pufrech může zapříčinit značné posuny hodnoty pH a způsobit tak opět<br />

denaturaci proteinu.<br />

Na lyofilizaci větších objemů se používají skleněné nádoby, které vydrží zamrazení na<br />

­70°C. Menší objemy lze zamrazovat a lyofilizovat přímo v plastových mikrozkumavkách. Ústí<br />

nádoby, ve které se nachází vzorek, je třeba při lyofilizaci zakrýt porézním materiálem, jelikož<br />

lyofilizovaný produkt je velmi lehký a prachovitý a mohl by ho proud vodní páry strhnout do<br />

kondenzátoru. Vzorky se předem vychlazují buď několikahodinovým zamrazením<br />

v hlubokomrazících boxech (-80°C), nebo umístěním do chladící lázně zhotovené z pevného CO 2 a<br />

acetonu. Mikrozkumavky se vzorkem mohou být zamraženy přímo krátkým ponořením do<br />

kapalného dusíku. Před začátkem vlastní lyofilizace je třeba prostor pro kondenzaci vodních par<br />

dokonale vychladit. Před koncem lyofilizace se do systému pomalu vpouští vzduch a po zrušení<br />

vakua se odeberou vzorky a vypne vývěva. Kdyby se vývěva vypnula před zrušením vakua, mohl by<br />

se olej z vývěvy nasát do kondenzačního systému.<br />

Vlastní zařízení na lyofilizaci (obr. 33) se liší typ od typu podle výrobce. Obecně se však<br />

vždy skládá ze zdroje vakua - výkonné olejové vývěvy, mrazící jednotky spojené s prostorem pro<br />

uložení vzorku a kondenzací par. Přístroj je pak vždy opatřen kontrolním a regulačním zařízením<br />

pro registraci parametrů (teplota, tlak) během lyofilizace. Některé moderní lyofilizátory bývají<br />

vybaveny navíc chlazenou centrifugou, do které se umísťují lyofilizované vzorky. Odstředivou<br />

silou je pak zabráněno vybublání či vypěnění vzorku, který se před vlastní lyofilizací již nemusí<br />

zamrazovat a tím se celý proces značně urychluje.<br />

67

Obrázek 33: Základní princip jednoduchého lyofilizátoru.<br />

V laboratořích, které nedisponují finančně nákladným zařízením na lyofilizaci, lze tepelně<br />

nestabilní vodné roztoky biopolymerů zakoncentrovávat ultrafiltrací (viz. lab. cvičení č. 3) nebo<br />

ještě jednodušším způsobem založeném na principu gelové filtrace. Do roztoku se přidá asi<br />

třetina jeho objemu suchého hydrofilního gelu, např. Sephadex G-25, používaného pro<br />

molekulovou vylučovací chromatografii (gelovou filtraci, viz. lab. cvičení č. 11). Voda a<br />

nízkomolekulární látky se pohlcují částečkami Sephadexu, který bobtná a vysokomolekulární látky<br />

zůstávají v roztoku. Po několika minutách se Sephadex oddělí od roztoku centrifugací. Proces se<br />

dá samozřejmě i několikrát opakovat. Nevýhodou jsou však značné ztráty biopolymeru. Během<br />

zakoncentrovávání nedochází ke změnám pH ani iontové síly.<br />

ÚKOL č. 14: Stanovení obsahu krystalové vody ve skalici modré<br />

U mnohých krystalických látek se účastní stavby jejich struktury i molekuly vody. Takové<br />

krystaly se nazývají hydráty a vázaná voda vodou krystalovou. Jako příklad lze uvést dihydrát<br />

chloridu barnatého BaCl 2 .2H 2 O, skalici zelenou FeSO 4 .7H 2 O aj. Kromě látek tvořících pouze<br />

jediný hydrát, jsou známy i takové, které tvoří hydrátů několik. Obsah krystalové vody potom<br />

závisí na teplotě, při které látka krystalizuje. Uhličitan sodný vyloučený z roztoku za varu je<br />

monohydrát, krystalický za laboratorní teploty je dekahydrát (obsahuje deset molekul vody) a<br />

jeho preparát vykrystalovaný při -20ºC obsahuje patnáct molekul vody, tzv. pentadekahydrát.<br />

Hydráty krystalizující při nižší teplotě mívají zpravidla vyšší obsah hydrátové vody. Obsah<br />

hydrátové vody bývá často ovlivněn jinou složkou v roztoku. Např. přítomnost kyseliny snižuje<br />

stupeň hydratace. Tak síran měďnatý může z roztoku obsahující nadbytek kyseliny sírové<br />

krystalizovat i při laboratorní teplotě jako tri- nebo monohydrát.<br />

Stálost hydrátů závisí na parciálním tlaku vodní páry nad příslušným hydrátem. Je-li tento<br />

parciální tlak stejný jako tense vodních par v okolí, je hydrát na vzduchu stálý. Je-li tento<br />

parciální tlak větší, než je tense vodní páry v okolí, ztrácí krystal samovolně část hydrátové vody,<br />

aby se rozdíl tenzí vyrovnal. V opačném případě, je-li tense vodních par v okolí vyšší, hydrát<br />

68

samovolně přijímá vodu z okolí a dochází k jeho vlhnutí případně až rozpouštění. Látky, které<br />

ochotně přijímají vodu z prostředí, se označují jako hygroskopické.<br />

Hydrát lze částečně nebo úplně zbavit krystalové vody tím, že se tense jeho vodních par<br />

zvýší zahřáním nebo že se značně sníží tense vodních par v okolí (tj. umístěním krystalohydrátu<br />

do exsikátoru nad silně hygroskopickou látku. Pro dehydrataci zahřáním stačí obvykle teplota<br />

mezi 100-300ºC. Při použití teploty vyšší může kromě dehydratace docházet i k hlubšímu rozkladu<br />

látky. Před dehydratací je třeba látku vždy důkladně rozetřít. Neučiní-li se tak, může unikající<br />

vodní pára větší krystaly roztrhat a dochází ke ztrátám vyletováním drobných částic a prskání<br />

z kelímku.<br />

MATERIÁL<br />

Elektrická sušárna, třecí miska s tloučkem, porcelánový kelímek, analytické váhy, kleště,<br />

exsikátor, lžička, pentahydrát síranu měďnatého.<br />

POSTUP<br />

V sušárně s teplotou vyregulovanou na 150ºC vysušte porcelánový kelímek do konstantní<br />

hmotnosti. Tzn. že se hmotnost kelímku po dalším sušení již nesnižuje. Hmotnost kelímku stanovte<br />

asi po 1/2 hodině sušení a následně ověřte vždy po 10 minutách. Hmotnost vysušeného kelímku si<br />

zapište. Manipulaci s kelímkem provádějte v exsikátoru, kde ho taky necháte po sušení<br />

vychladnout. Kelímku se nedotýkejte rukou, ale vždy kleštěmi. Rukou přenášíte na kelímek zpět<br />

vlhkost. Mezitím rozetřete asi 1,5 gramu skalice modré ve třecí misce. A do vysušeného a<br />

zváženého kelímku přesně odvažte asi 1 g rozetřené CuSO 4 .5H 2 O (tzn. na analytických vahách<br />

stanovíte hmotnost přibližně 1 gramu s přesností na 4 desetinná místa, např. budete mít 1,0584 g<br />

skalice modré). Sušárnu vyregulujte na 110ºC a kelímek s pentahydrátem v ní sušte opět do<br />

konstantní hmotnosti (asi 1/2 hodiny). Po vychladnutí v exsikátoru přesně zvažte.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Podle úbytku hmotnosti určete, kolik molekul vody ztratil pentahydrát síranu měďnatého<br />

při teplotě 110ºC.<br />

ÚKOL č. 15: Příprava bezvodého silikagelu<br />

Silikagel je amorfní forma oxidu křemičitého. Je netoxický a chemicky odolný vůči většině<br />

kyselin, je však citlivý vůči zásaditým látkám. Silikagel je používán především ve formě granulátu<br />

a kuliček, což značně zvětšuje jeho povrch a umožňuje tak, aby lépe vázal vzdušnou vlhkost.<br />

Správně připravený silikagel může vázat vlhkost až do 40% své váhy. K indikaci nasycenosti<br />

silikagelu se používá chlorid kobaltnatý, do jehož roztoku se silikagel vměšuje, a tím získává<br />

typickou narůžovělou barvu. Po vysušení CoCl 2 ztrácí krystalickou vodu a mění zabarvení na<br />

intenzivní modř. Modrý silikagel je tedy připraven k použití. Adsorpcí vody pak postupně znovu<br />

přechází do růžového zabarvení a je opět nutno ho regenerovat vysušením.<br />

MATERIÁL<br />

Elektrická sušárna, kleště, exsikátor, lžička, kádinka, porcelánová miska, hexahydrát chloridu<br />

kobaltnatého, technický silikagel.<br />

POSTUP<br />

Do 100 mL kádinky navažte 20 g technického silikagelu. Do další kádinky si připravte 10 mL<br />

přibližně 4% roztoku CoCl 2 .6H 2 O. A tento roztok vlijte do silikagelu a pořádně promíchejte.<br />

Narůžovělý preparát vysušte mezi filtračními papíry a rozestřete na porcelánovou misku v co<br />

nejtenčí vrstvě. Misku vložte do sušárny a vyregulujte teplotu na 150ºC. Přibližně každých 15<br />

69

minut silikagel v misce promíchejte skleněnou tyčinkou a sušte až do doby, kdy má intenzivně<br />

modrou barvu (asi 1 hod). Modrým silikagelem naplňte dno exsikátoru nebo ho uložte do suché<br />

zábrusové láhve (rozhodne vedoucí cvičení).<br />

ÚKOL č. 16: Příprava, sušení, čištění a důkaz vodíku<br />

Vodík je nejlehčí plyn, bez chuti, bez zápachu. Jeho teplota varu se pohybuje okolo -<br />

252,7ºC stupňů Celsia a teplota tání je -259ºC. Ve vodě se rozpouští velmi málo a téměř vždy<br />

(kromě stavu zrodu) se vyskytuje ve formě dvouatomových molekul. Vodík jako plyn je směsí<br />

svých tří izotopů. Prócium - má v jádře pouze jeden proton, deuterium neboli těžký vodík má ve<br />

svém jádře kromě protonu také jeden neutron, a proto má i vlastní značku - D, tricium - jeho<br />

jádro obsahuje již dva neutrony. Zjistilo se však, že existují i izotopy s nukleonovým číslem 4 a 5.<br />

Ve sloučeninách s vodíkem bývá vazba polární. Vodík má ve sloučeninách většinou kladný náboj, ale<br />

s některými kovy se váže ve formě aniontu a vznikají tzv. hydridy. S přechodnými kovy tvoří<br />

sloučeniny, které mají charakter tuhých roztoků a tvoří v nich také někdy kovovou vazbu. Celkově<br />

se slučuje více s nekovovými než kovovými prvky. Za normální teploty je málo reaktivní, ale pokud<br />

se teplota zvýší, slučuje se dobře s kyslíkem a halovými prvky za uvolnění velké tepelné energie.<br />

Tento prvek má silně redukční vlastnosti - za zvýšené teploty redukuje např. oxidy, sulfidy nebo<br />

chloridy až na elementární kov. Vodík se dá získat uvolněním z vody alkalickými kovy nebo kovy<br />

alkalických zemin již za studena (většina ostatních kovů ho uvolňuje z vody až za zvýšené teploty).<br />

Uvolňuje ho i rozžhavený uhlík. Nejčastěji se však připravuje buď elektrolýzou vody nebo reakcí<br />

zinku s kyselinou chlorovodíkovou případně sírovou.<br />

Pozor: Při práci s vodíkem je třeba dbát zvýšené opatrnosti a dodržovat bezpečnostní<br />

předpisy, hrozí nebezpečí vzniku třaskavé směsi se vzduchem.<br />

MATERIÁL<br />

Dělící nálevka, frakční baňka, korková zátka, skleněné trubice, hadičky, U-trubice, promývačka,<br />

vana, špejle, kyselina chlorovodíková, práškový zinek, hydroxid draselný, konc. kyselina sírová,<br />

dětský bublifuk.<br />

POSTUP<br />

Sestavte aparaturu pro přípravu vodíku sestávající z dělící nálevky a frakční baňky.<br />

Korkovou zátkou ve frakční baňce vyveďte skleněnou trubici, na kterou postupně napojíte U-<br />

trubici naplněnou pevným KOH a promývačku s konc. kyselinou sírovou. U-trubici a dělící nálevku<br />

řádně upevněte do stojanu. Na vývod z promývačky napojte skleněnou trubici asi o délce 20 cm.<br />

Připravte si skleněnou vanu naplněnou do 1/4 vodou. Na dno frakční baňky nasypte přáškový zinek<br />

a do dělicí nálevky nalijte přibližně 20 mL kyseliny chlorovodíkové (ředění vodou 1:1).<br />

Zkontrolujte, zda jsou všechny spoje řádně napojeny, a zaveďte skleněnou trubici z promývačky<br />

pod hladinu vody ve vaně.<br />

Opatrně začněte přikapávat HCl na zinek a sledujte vývoj vodíku (unikající bubliny do vany).<br />

Skleněnou trubicí ve vaně vyjměte a snažte se vyfukovat bubliny bublifukem. Pokud vývoj vodíku<br />

ustane přilijte na zinek další podíl kyseliny chlorovodíkové. Když máte vodík vznikající v aparatuře<br />

dostatečně vyčištěný, budou vám vznikající bubliny létat vzhůru ke stropu. Hořící špejlí opatrně<br />

bubliny zapalujte.<br />

Nikdy nedávejte zapálenou špejli k ústí přívodové trubičky z aparatury na přípravu<br />

vodíku. Nebezpečí výbuchu!!!<br />

70

VYHODNOCENÍ<br />

1) Popište co se stalo, když jste přiblížili špejli k bublinám.<br />

2) Proč jste na čištění a sušení vodíku použili H 2 SO 4 a KOH? K jakým chemickým dějům dochází?<br />

ÚKOL č. 17: Zakoncentrování roztoku proteinů pomocí gelové filtrace<br />

V biochemické laboratoři se budete velice často setkávat s požadavkem na<br />

zakoncentrovávání naředěných roztoků biopolymerů. Existuje řada způsobů, jak snížit v roztoku<br />

množství vody a nízkomolekulárních látek tak, aby vysokomolekulární látka zůstala ve stejném<br />

množství. Lze k tomu využít dialýzy, ultrafiltrace či lyofilizace. Tyto procesy jsou však většinou<br />

dosti zdlouhavé a musí se řešit problém denaturace biologicky aktivních biopolymerů. Jeden<br />

z nejrychlejších a nejšetrnějších způsobu zahuštění vysokomolekulární látky je založen na<br />

principu gelové filtrace a prakticky ho provedete se vzorkem standartního hovězího sérového<br />

albuminu (BSA – bovine serum albumin).<br />

MATERIÁL<br />

Automatické pipety, Hamiltonova pipeta, mikrozkumavky, zkumavky, špachtle, vortex, stolní<br />

pikofuga, spektrofotometr, kyveta, kalibrační křivka pro metodu Bradfordové, roztok BSA, suchý<br />

Sephadex G-50 Coarse, Bradfordové činidlo.<br />

POSTUP<br />

Do mikrozkumavky odpipetujte přesně 1 mL ze zásobní láhve roztoku BSA a přisypte<br />

špachtlí suchý Sephadex G-50 tak, aby po nabobtnání zabral asi 1/3 objemu (na špičku špachtle).<br />

Směs nechte asi 10 minut stát za laboratorní teploty a za občasného promíchání na vortexu. Poté<br />

mikrozkumavku asi 2 minuty centrifugujte na pikofuze. Do čisté mikrozkumavky opatrně přeneste<br />

čirý supernatant nad usazeným Sephadexem a pomocí automatické pipety nejpřesněji odhadněte<br />

jeho objem. Objem si zaznamenejte a do čisté mikrozkumavky odeberte 12 µL a označte jako<br />

vzorek 2. Ke zbylému supernatantu opět přisypte suchý Sephadex asi do 1/3 objemu, za<br />

občasného vortexování opět nechejte stát 10 minut a po 2 minutové centrifugaci odeberte a<br />

přesně změřte pipetou objem supernatantu. 12 µL odeberte do čisté mikrozkumavky jako vzorek<br />

3. Se zbytkem celý proces ještě jednou zopakujte a dostanete tak vzorek 4.<br />

Metodou Bradfordové změřte obsah proteinů vždy v 5 µL vzorku. Každé měření provádějte<br />

2x. Nachystejte si 9 zkumavek do každé pipetujte 2 mL Bradfordové činidla a pomocí<br />

Hamiltonové pipety přidejte 5 µL vzorku, 9 zkumavka je blank (slepý vzorek, pro vynulování<br />

spektrofotometru). Vzorek číslo 1 je zásobní roztok BSA. Zkumavky s činidlem a vzorkem krátce<br />

zvortexujte a nechejte 5 minut stát při laboratorní teplotě. Poté změřte absorbanci při 595 nm.<br />

Hodnoty si zaznamenejte a pomocí kalibrační křivky stanovte obsah proteinu.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Sestavte si tabulku z naměřených hodnot – objem, obsah proteinu v 1 µL, celkový obsah<br />

proteinu ve vzorku. Vypočtěte kolikrát se vám podařilo zahustit původní roztok BSA a jak velkých<br />

ztrát jste se přitom dopustili (tzn. kolik BSA vám zbylo z původního množství obsaženého v 1 mL<br />

zásobního roztoku).<br />

71

Doporučená literatura:<br />

Ferenčík, M. a kol.: Biochemické laboratórne metódy, Alfa Bratislava, 1981.<br />

Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.<br />

Mareček, A. a Růžička, A.: Laboratorní <strong>technika</strong> pro nechemické obory, Vydavatelství MU Brno,<br />

1997.<br />

Klečková, M. a Šindelář, Z.: Školní pokusy z anorganické a organické chemie, Vydavatelství UP<br />

Olomouc, 1993.<br />

72

Laboratorní cvičení č. 9<br />

KRYSTALIZACE, PROMÝVÁNÍ NA FILTRU, DEKANTACE A STANOVENÍ BODU TÁNÍ<br />

KRYSTALIZACE<br />

Krystalizace je proces vylučování pevné fáze z taveniny nebo rozpuštěné pevné látky<br />

z roztoku. Z našeho hlediska má význam pouze krystalizace z roztoku, což je jedna ze základních<br />

metod čištění pevných látek.<br />

Čištění látek krystalizací spočívá v jejím rozpuštění ve vhodném rozpouštědle, vyčištění<br />

roztoku filtrací a opětné vyloučení látky z roztoku v krystalické formě. Látku lze ke krystalizaci<br />

přivést několikerým způsobem:<br />

−<br />

−<br />

Krystalizace volným odpařováním. Volným odpařováním roztoku za normální teploty dojdeme<br />

ke stavu, kdy je roztok při dané teplotě nasycen a látka se pak vylučuje z roztoku ve velkých,<br />

dobře vyvinutých krystalech.<br />

Krystalizace volným chladnutím. Při tomto způsobu krystalizace si nejprve připravíme za<br />

varu nasycený roztok, přefiltrujeme a kádinku s vroucím roztokem vložíme do termostatu,<br />

který udrží roztok několik hodin teplý. Krystalky, které po vychladnutí roztoku získáme, jsou<br />

velké a pěkně vyvinuté.<br />

Výše popsané dva způsoby krystalizace jsou časově náročné a hodí se především pro čištění<br />

látek, jejichž rozpustnost není výrazně závislá na teplotě.<br />

−<br />

−<br />

Rušená krystalizace. Opět nejdříve připravíme za horka (nebo varu) nasycený roztok a ten<br />

pak za trvalého míchání krouživým pohybem krystalizační nádoby prudce ochladíme na teplotu<br />

tekoucí vody. Získáme tak velké množství drobných krystalů, které odfiltrujeme od tzv.<br />

matečného louhu, jenž obsahuje zbytek krystalizované látky a většinu nečistot. Novým<br />

odpařením matečného louhu můžeme získat další, ovšem již méně čisté podíly. Rušené<br />

krystalizace užíváme u látek, u nichž je rozdíl v rozpustnosti za studena a za horka<br />

dostatečně velký.<br />

Krystalizace vyvolaná změnou složení rozpouštědla. Změnou složení rozpouštědla lze<br />

z roztoku vyloučit tu látku, která je v dané směsi nerozpustná. V praxi to provádíme tak, že<br />

k vodnému roztoku přidáváme alkohol, aceton nebo jiné méně polární rozpouštědlo, které je<br />

mísitelné s vodou. V takto získané směsi se brzy překročí součin rozpustnosti rozpouštěné<br />

látky, která se pak začne vylučovat v krystalech.<br />

O nasycenosti roztoku se přesvědčíme u rychle krystalizujících látek např. tak, že kapku<br />

roztoku přeneseme tyčinkou na hodinové sklíčko. Když se roztok zakalí vyloučenými krystaly, je<br />

již dostatečně zahuštěn. U řady látek se na hladině lehkých nasycených roztoků vytváří vlivem<br />

chladného okolního vzduchu tzv. krystalizační blána (plovoucí krystaly).<br />

Aby látka krystalizovala z roztoku, musí být porušená fázová rovnováha dané soustavy, tj.<br />

roztok musí být přesycen. Dále je pro krystalizaci nutné, aby vznikala nepatrná krystalizační<br />

centra, jež pak narůstají v krystaly. Vlastní pochod krystalizace se skládá z tvorby jader, k niž<br />

dojde porušením fázové rovnováhy roztoku ochlazením na teplotu nižší než je mez nasycenosti, a<br />

z růstu krystalů na vytvořených jádrech. Tvorba jader závisí na intenzitě chlazení, na rychlosti a<br />

způsobů míchání, na teplotě, na vlastnostech látky a také na nečistotách obsažených v roztoku.<br />

Je známo, že vznik velkého počtu jader je podporován rychlým ochlazením, intenzivním mícháním<br />

a malou molární hmotností rozpuštěné látky. Počet vznikajících jader se projevuje na tvaru a<br />

velikosti krystalů. Při malém počtu jader se pomalu tvoří velké krystaly s plně vyvinutými<br />

plochami. Velký počet malých krystalizačních center podmiňuje naopak vznik drobných krystalů

se špatně vyvinutými plochami. Všechny uvedené faktory pak mají vliv na krystalizační výtěžek,<br />

což je poměr množství vykrystalizované látky k výchozímu množství látky.<br />

Jemné krystaly zadržují na svém povrchu mnoho matečného louhu, špatně se filtrují a<br />

promývají. U velkých krystalů hrozí naopak nebezpečí zadržení matečného louhu v eventuálních<br />

dutinách. Pro získání čisté látky je proto důležité i udržení přiměřené zrnitostí krystalů.<br />

Některé látky mají sklon k tvorbě přesycených roztoků, to znamená, že ani po přestoupení<br />

meze rozpustnosti, např. ochlazením, látka nekrystalizuje. V takovém případě stačí někdy<br />

k vyvolání krystalizace tření stěny kádinky ostrohrannou skleněnou tyčinkou. Když i to selhává je<br />

možno vyvolat krystalizaci naočkováním, tj. vhozením několika krystalků látky do roztoku.<br />

Doba trvání krystalizace je velmi různá a nelze ji všeobecně předepsat. V některých<br />

případech stačí pouze vyčkat na ochladnutí roztoku, jindy je nutné ponechat při nízké teplotě<br />

řadu dní. Výsledek krystalizace rovněž závisí na správné volbě rozpouštědla. Při jeho výběru je<br />

třeba brát v úvahu, že každá látka se nejlépe rozpouští v rozpouštědlech, která jsou ji chemicky<br />

nejpříbuznější. Důležitým požadavkem při volbě rozpouštědla je to, aby rozdíl rozpustnosti za<br />

horka a za studena byl co největší. V případě, že se takové rozpouštědlo nepodaří nalézt, je nutno<br />

část rozpouštědla odstranit odpařením. Přílišné odpaření rozpouštědla není však žádoucí, protože<br />

se tím čistící efekt krystalizace snižuje. Odpaření rozpouštědla lze provést několika způsoby:<br />

−<br />

−<br />

−<br />

volným odpařením na vzduchu nebo v exsikátoru. Tento způsob se obyčejně používá jen pro<br />

rozpouštědla s nízkým bodem varu.<br />

odpařením na vodní lázní. Při postupném odpařování rozpouštědla postupně dochází<br />

k vylučování krystalů, které je nutno tyčinkou občas promíchat, aby došlo k porušení<br />

krystalické blány tvořící se na povrchu kapaliny.<br />

oddestilováním rozpouštědla za normálního nebo sníženého tlaku. Tento způsob je<br />

nejekonomičtější (regenerace rozpouštědla).<br />

Na závěr je nutno připomenout fakt, že i když u většiny látek rozpustnost s teplotou roste,<br />

existuji též látky, jejichž rozpustnost je v určitém rozpouštědle prakticky nezávislá na teplotě<br />

(chlorid sodný ve vodě), případně i látky, jejichž rozpustnost s rostoucí teplotou klesá (např.<br />

monohydrát uhličitanu sodného ve vodě).<br />

PROMÝVÁNÍ NA FILTRU A DEKANTACE<br />

Promývání na filtru slouží k oddělování vyloučené sraženiny z roztoku od matečného louhu,<br />

nehledě na to, zda je sraženina amorfní či krystalické povahy. Tuto operaci lze provést několika<br />

způsoby: centrifugací, filtrací, odsátím nebo přímo dekantací v reagenční nádobě.<br />

Při dekantaci necháme sraženinu usadit na dně nádoby, ve které ke srážení došlo a čirý<br />

matečný louh jednoduše odlijeme. Na dně nám kromě sraženiny samozřejmě zůstane ještě<br />

spousta matečného louhu i s nečistotami. Abychom tyto nečistoty odstranili, přilijeme čiré<br />

rozpouštědlo, dobře promícháme, sraženinu necháme opět usadit a čirý roztok dekantujeme. Tuto<br />

operaci můžeme opakovat několikrát, až do té doby než se zbavíme veškerých stop nečistot, o<br />

čemž se obvykle přesvědčíme příslušnou kvalitativní zkouškou. Dekantace se většinou používá na<br />

promývání sraženin amorfních, které se nedají promýt na filtru, jelikož ucpávají póry filtru.<br />

Dekantace se nehodí na promývání krystalů po krystalizaci. Při přídavku čirého rozpouštědla by<br />

samozřejmě docházelo ke zpětnému rozpouštění krystalů a tím k velkým ztrátám produktu.<br />

Při promývání krystalů po krystalizaci je třeba řádně odkapat matečný louh a jeho zbytky<br />

odstranit promytím. Je nutné zvážit jakou kapalinu a jaké množství na promytí použít. Většinou se<br />

promytí provádí malým množstvím rozpouštědla, použitým pro krystalizaci. Při promývání je třeba<br />

dbát značné opatrnosti, zvláště tehdy, je-li produkt v rozpouštědle dobře rozpustný. V tomto<br />

případě může totiž dojít ke ztrátám produktu. Nejdokonalejší promytí lze dosáhnout, je-li<br />

74

produkt na filtru při odpojené vývěvě promíchán s čistým rozpouštědlem, které je pak znova<br />

odsáto. Promývání je vhodné několikrát opakovat.<br />

Matečný louh odsáváme na Büchnerově nálevce, do které vložíme papírový filtr o vhodném<br />

průměru. Papír by měl zakrýt všechny póry v nálevce, ale neměl by vystupovat nad její dno. Pokud<br />

je krystalizace prováděná v agresivním rozpouštědle, které by mohlo reagovat s celulosovým<br />

filtrem, je vhodnější použít na odsátí a následné promytí skleněnou fritu, do které se již filtrační<br />

papír nevkládá. Nevýhodou těchto frit je jejich časté ucpávání a špatné čištění. Po důkladném<br />

odsátí matečného louhu odpojíme vývěvu a malým množstvím čistého rozpouštědla, nejlépe ze<br />

střičky, omýváme krystaly. Rozpouštědlo smývá z povrchu krystalů zbylé stopy matečného louhu a<br />

případně rozpouští i zbytky nezreagovaných reakčních komponent. Po krátkém působení<br />

promývací kapalinu vždy odsajeme, toto opakujeme několikrát. Abychom zamezili větším ztrátám,<br />

je vhodné používat promývací kapalinu co nejstudenější. Při promývání je nutno mít na zřeteli, že<br />

je mnohem efektivnější promývat sraženinu vícekrát malými podíly promývacího roztoku než<br />

celým množstvím najednou. Je pravidlem neplnit Büchnerovu nálevku výše než pět milimetrů nad<br />

filtr.<br />

Zmínku zasluhuje i správné oddělení pevné fáze od filtru. Jestliže ze skleněné frity<br />

můžeme produkt seškrabat tyčinkou nebo špachtlí, z Büchnerovy nálevky produkt v žádném<br />

případě nevyškrabujeme nebo nedáváme sušit i z nálevkou, protože tak bychom produkt znečistili<br />

částečkami filtračního papíru. Správný postup spočívá v přiklopení nálevky hodinovým sklem<br />

vhodného průměru, otočení stonkem vzhůru a silným fouknutím do stonku. Filtr s produktem<br />

vypadne na sklo, kde ho osušíme lehkým přitlačením čtverečku filtračního papíru. Produkt potom<br />

sloupneme z filtračního papíru.<br />

ÚKOL č. 18: Izolace kyseliny citrónové z citrónové šťávy<br />

Kyselina citronová - C 3 H 4 OH(COOH) 3 je bílá krystalická látka rozpustná ve vodě a slabě<br />

rozpustná v organických rozpouštědlech. Její vodné roztoky jsou o něco kyselejší než kyselina<br />

octová. Stopy kyseliny citrónové lze nalézt v mnoha rostlinných i živočišných organismech,<br />

protože patří mezi intermediáty bazálního metabolismu (Krebsův cyklus). Velké množství této<br />

kyseliny je obsaženo ve šťávě citrusových plodů, ze které ji lze vysrážet vápenatými ionty. Ze<br />

vzniklého citrátu vápenatého je možné vlastní kyselinu citrónovou vytěsnit silnější kyselinou<br />

sírovou za vzniku síranu vápenatého. Komerčně se získává fermentací cukrů plísní Aspergillus<br />

niger. Používá se jako aditivum do jídel a nápojů pro vytvoření příjemné kyselé chuti. Dále se<br />

využívá v medicíně, textilnictví (modrotisk) a jako leštící prostředek na kovy.<br />

MATERIÁL<br />

Vařič, vodní lázeň, exsikátor, lis na citróny, kádinky, Pasteurovy pipety, skleněná tyčinka, pH<br />

papírky, Bűchnerova nálevka, odsávací baňka, vývěva, filtrační papír, skleněná frita se zábrusovou<br />

baňkou, porcelánová krystalizační miska, citrón popř. citrónová šťáva, 20% amoniak, 25% roztok<br />

CaCl 2 , 30% kyselina sírová.<br />

POSTUP<br />

Pomocí kuchyňského lisovače citrónů vymačkejte šťávu z jednoho citrónu a přelijte ji do<br />

100 mL kádinky. 20% amoniakem šťávu zneutralizujte. Pasteurovou pipetou opatrně přidávejte za<br />

stálého míchání amoniak a pomocí pH papírku kontrolujte hodnotu pH. Ve slabě zásaditém<br />

prostředí šťáva tmavne. Silně zásadité prostředí je nežádoucí, jelikož by při srážení chloridem<br />

vápenatým vznikal hydroxid vápenatý a rušil by následnou izolaci. Neutrální šťávu zfiltrujte za<br />

sníženého tlaku na Bűchnerově nálevce a přiveďte k varu. Za varu pak šťávu vysrážejte 25%<br />

roztokem CaCl 2 . Vzniklou sraženinu citrátu vápenatého odfiltrujte na skleněné fritě a promyjte<br />

horkou vodou (připravte si ji současně při srážení zahřátím v kádince na vařiči). Sraženinu<br />

kvantitativně převeďte do čisté kádinky a rozpusťte v 10 mL 30% kyseliny sírové. Citrát<br />

75

vápenatý má daleko větší rozpustnost ve vodě za studena než za horka. Kádinku postavte na vařič<br />

a opět zahřejte. Vařte asi 5-10 minut. Kyselina sírová uvolňuje z citrátu vlastní kyselinu<br />

citrónovou za vzniku nerozpustného síranu vápenatého. Roztok odstavte, opatrně přidejte asi 20<br />

mL studené destilované vody a nechejte vychladnout. Síran vápenatý odsajte na skleněné fritě.<br />

Filtrát přelijte do porcelánové misky a na vodní lázni zahustěte ke krystalizaci. Misku<br />

s krystalizačním roztokem nakonec dejte do exsikátoru, odsajte vzduch a nechejte krystalizovat<br />

do příštího cvičení.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

1) Zapište chemické rovnice všech reakcí, které jste provedli.<br />

2) Vypočtěte výtěžek krystalizace a stanovte tak přibližné množství kyseliny citrónové<br />

v jednom citrónu.<br />

ÚKOL č. 19: Rušená krystalizace technické skalice modré<br />

V tomto úkolu použijeme krystalizaci jako čistící metodu. Skalice modrá se v normálním<br />

stavu vyskytuje jako pentahydrát, tzn. jedna molekula síranu měďnatého krystalizuje s pěti<br />

molekulami vody. Tvoří trojklonné jehlicovité krystaly. Technická skalice bývá často znečištěná<br />

síranem železnatým. Přídavkem malého množství kyseliny dusičné do krystalizačního roztoku<br />

zoxidujeme dvojmocné železo na trojmocné, to pak během krystalizace zůstává v matečném<br />

louhu. Síran železitý má totiž na rozdíl od síranu měďnatého daleko větší rozpustnost. Podobným<br />

způsobem můžeme od sebe oddělovat různé soli lišící se svou rozpustností v daném rozpouštědle.<br />

MATERIÁL<br />

Třecí miska s tloučkem, kádinky, vařič, nálevka, kleště, Pasteurova pipeta, stojan s kruhem,<br />

filtrační papír, skleněná tyčinka, podložní sklíčko, Bűchnerova nálevka, odsávací baňka, vývěva,<br />

miska s drceným ledem, technická skalice modrá, konc. kyselina dusičná.<br />

POSTUP<br />

Na předvážkách odvažte 5 gramů technické skalice modré a jemně utřete ve třecí misce.<br />

Pomocí tabulek vypočtěte množství vody potřebné na rozpuštění tohoto množství za laboratorní<br />

teploty. Skalici v tomto množství rozpusťte a přidejte několik kapek koncentrované kyseliny<br />

dusičné. Roztok na vařiči přiveďte k varu a zfiltrujte. Filtrát zahustěte ke krystalizaci<br />

vyvařením. Průběžně provádějte zkoušku: skleněnou tyčinkou kápněte kapku roztoku na podložní<br />

sklíčko a sledujte, zda roztok krystalizuje. V momentě, kdy je roztok připraven, vložte kádinku<br />

do misky s rozdrceným ledem a vyčkejte, až se vyloučí krystalky CuSO 4 .5H 2 O. Produkt odsajte<br />

na Bűchnerově nálevce a vysušte mezi kousky filtračního papíru. Matečný louh znovu zahustěte a<br />

již popsaným způsobem tak získáte druhý produkt krystalizace.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

1) První i druhý produkt po vysušení zvažte a vypočítejte procentové výtěžky krystalizace.<br />

Který produkt bude mít větší čistotu?<br />

2) Do kádinky se 100 mL vody jste nasypali po 10 gramech oxidu chromitého, kamence draselnohlinitého<br />

a skalice modré. Pomocí chemických tabulek navrhněte postup, jak by jste tyto tři<br />

látky od sebe oddělili pomocí metod popsaných v této úloze.<br />

76

STANOVENÍ BODU TEPLOTY TÁNÍ<br />

Bod tání je teplota, při níž je tuhá látka v rovnováze se svou taveninou. Je to jedna ze<br />

základních fyzikálních veličin vedle bodu varu, hustoty, indexu lomu světla, optické aktivity apod.<br />

charakterizujících každou látku. Stanovení této veličiny a srovnání s tabelovanou hodnotou je<br />

zvláště pro organického chemika nejrychlejší metodou určení čistoty dané látky. Anorganické<br />

sloučeniny mají obvykle příliš vysoký bod tání. Čisté látky mají ostrý bod tání. Již nepatrné<br />

znečištění látky se projeví značným snížením bodu tání a to i tehdy, jestliže nečistoty mají bod<br />

tání vyšší. Kromě snížení bodu tání pozorujeme i zvětšení intervalu bodu tání. Tohoto jevu<br />

využíváme ke zkoušení identity dvou látek s týmž bodem tání. Stejná množství obou látek<br />

dokonale promísíme a stanovíme pak bod tání (tzv. směsný bod tání). Je-li nezměněn, jsou obě<br />

látky identické, je-li ve srovnání s bodem tání složek nižší, jde o různé látky. Mnohé látky se<br />

v okamžiku kdy roztají, zároveň rozloží. Rozklad se obvykle projeví ztmavnutím nebo vývojem<br />

plynu. Bod rozkladu je zpravidla neostrý a závisí na rychlosti zahřívání.<br />

Prakticky bod taní stanovujeme tak, že malý vzorek látky napěchovaný ve skleněné<br />

tenkostěnné kapiláře umístíme do lázně dobře vodící teplo, tj. do kapaliny nebo do kovového<br />

bloku, a pomalu zahříváme tak, aby se podmínky co nejvíce blížily rovnovážným. Přitom sledujeme<br />

teplotu lázně a pozorujeme látku. Jako teplotu tání označíme teplotu, při níž se objeví kapalná<br />

fáze.<br />

Přístroje pro stanovení teploty tání nazýváme bodotávky. Pro látky s teplotou tání nižší než<br />

120°C používáme skleněné bodotávky. Jsou to skleněné nádobky, které bývají plněny kapalinou o<br />

vhodné tepelné kapacitě, např. silikonovým olejem, glycerolem apod. Vhodným tvarem nádobky se<br />

dosahuje toho, že při pozvolném zahřívání dochází k proudění kapaliny a současnému prohřívání<br />

vzorku a teploměru, na kterém je kapilára se vzorkem připevněna. Na obrázku 34 je skleněný P-<br />

bodotávek. U látek s vyšší teplotou tání používáme kovové bodotávky, tzv. Thieleho bloky. Jsou to<br />

bloky z kovu dobře vedoucího teplo, do kterých jsou vyvrtány svisle tři otvory (obr. 35). Do<br />

prostředního otvoru vkládáme teploměr, do zbývajících kapiláry se vzorkem. U kovového bloku je<br />

pomalého zahřívání dosaženo tím, že nezahříváme přímo blok, ale tyčku, kterou je blok zároveň<br />

upevněn do stojanu. Vzorek pozorujeme v procházejícím světle lampičky upevněné na stojanu za<br />

vzorkem.<br />

Obrázek 34: Skleněný P-bodotávek<br />

Obrázek 35: Thieleho kovový blok<br />

V laboratorní praxi se často používá speciálních zařízení určených pro práci<br />

v mikroměřítku. Jsou to v podstatě upravené mikroskopy s elektricky vyhřívaným stolkem, který<br />

je opatřen teploměrem. Na tento tzv. mikrovýhřevný stolek pokládáme vzorek v uspořádání<br />

běžném pro mikroskopování a během zahřívání jej pozorujeme v mikroskopu a čekáme na stav,<br />

kdy se krystaly změní v rovnovážnou směs pevné a kapalné fáze.<br />

77

ÚKOL č. 20: Stanovte teplotu bodu tání kofeinu<br />

V této úloze ověříte čistotu vámi izolovaného kofeinu z čajového listí pomocí jedné<br />

z nejrychlejších a nejspolehlivějších metod. Teplotu bodu tání budete stanovovat pomocí<br />

moderního bodotávku firmy STUART SCIENTIFIC. Jeho princip je založen na Thieleho kovovém<br />

bloku. Bodotávek je ovládán elektronicky s digitálním výstupem. Lze na něm měřit současně tři<br />

vzorky, umístěné v kapilárách. Odečet se dělá okem pomocí zvětšovacího okuláru.<br />

MATERIÁL<br />

Bodotávek STUART SCIENTIFIC, kapiláry, skleněná trubice, kofein čistý, kofein izolovaný ve<br />

cvičení č. 4.<br />

POSTUP<br />

Do předem připravených kapilár (úloha č. 7) vložte vzorek vámi izolovaného kofeinu a<br />

vzorek čistého kofeinu. Kapiláry plňte následujícím způsobem. Otevřeným koncem kapiláry<br />

nahrňte malé množství suchého vzorku, zbytek kolem kapiláry otřete a kapiláru nechejte asi 5x<br />

volně padat svisle postavenou trubicí dlouhou asi 1,5 metru na tvrdou podložku. Vzorek látky se<br />

tak dobře napěchuje do malého objemu na dně kapiláry. Sloupeček by měl být vysoký asi 2 mm.<br />

Zapněte bodotávek hlavním vypínačem. Kapiláry se vzorkem vložte do bodotávku a zkontrolujte,<br />

zda je vzorek dobře viditelný. Funkcí MODE nastavte teplotu, na kterou chcete zahřívat (270ºC),<br />

a poté tlačítkem START spusťte výhřev. Kolem předpokládaného bodu tání pozorně sledujte oba<br />

vzorky a odečtěte hodnoty bodu tání pro čistý i pro izolovaný kofein.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

1) Porovnejte obě získané hodnoty bodu tání. V literatuře či na internetu vyhledejte uváděnou<br />

hodnotu bodu tání pro kofein a případné rozdíly vysvětlete.<br />

2) Nakreslete vzorec kofeinu a vysvětlete od které základní sloučeniny je odvozen.<br />

Doporučená literatura:<br />

Kašpárek, F. a kol.: Cvičení z laboratorní techniky, Vydavatelství UP Olomouc, 2000.<br />

Mareček, A. a Růžička, A.: Laboratorní <strong>technika</strong> pro nechemické obory, Vydavatelství MU Brno,<br />

1997.<br />

Klečková, M. a Šindelář, Z.: Školní pokusy z anorganické a organické chemie, Vydavatelství UP<br />

Olomouc, 1993.<br />

78

Laboratorní cvičení č. 10<br />

CHROMATOGRAFIE NA IONTOMĚNIČÍCH<br />

Současnou práci v biochemickém výzkumu a ve studiu přírodních látek si nelze bez<br />

chromatografických metod představit. Jejich principem je rozdělování látek mezi stacionární a<br />

mobilní fázi na základě rozdílných afinit složek k uvedeným fázím. Mobilní fáze je buď kapalina<br />

nebo plyn, stacionární fáze může mít velmi různorodou formu např. částečky tuhé fáze, tenká<br />

vrstva kapaliny na pevných částicích, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry atd. Objevení<br />

principu chromatografie je připisováno ruskému botanikovi M. S. Cvětovi (1872-1919), který<br />

rozdělil chloroplastové pigmenty z rostlinných extraktů na sloupci uhličitanu vápenatého.<br />

Chromatografické metody se mohou dělit podle různých kriterií, nejčastější dělení je podle<br />

podstaty procesu zodpovědného za separaci, podle skupenství mobilní fáze, způsobu provedení<br />

(sloupcová, tenkovrstevná, papírová atd.) nebo podmínek (nízkotlaká, střednětlaká nebo<br />

vysokotlaká kapalinová chromatografie). Podle podstaty procesu je můžeme rozdělit do<br />

následujících kategorii. Je však třeba mít na paměti, že zejména při dělení biopolymerů (bílkovin,<br />

nukleových kyselin) se jedná často o kombinaci dvou nebo více separačních principů. Tak<br />

například při rozdělovací chromatografii může docházet také k adsorpci proteinu na povrch<br />

sorbentu nebo se uplatňuje síťový efekt porézních sorbentů (gelová permeační chromatografie).<br />

ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE<br />

Patří k nejstarším a nejrozšířenějším metodám. Pevný adsorbent je obtékán vhodným<br />

rozpouštědlem, které unáší analyzovanou směs látek. Na povrchu adsorbentu dochází k různě<br />

silné adsorbci těchto látek a tím k jejich rozdělení. Nejčastěji užívanými adsorbenty jsou látky<br />

pórovité struktury jako jsou silikagel, Al 2 O 3, CaCO 3 , hydroxylapatit či aktivní uhlí. Při adsorpci na<br />

polárních sorbentech hrají největší úlohu interakce typu ion - dipól a dipól – dipól, zatímco u<br />

nepolárních sorbentů to jsou převážně van der Waalsovy síly. Adsorpční chromatografie může<br />

být v provedení sloupcovém (CC – column chromatography) nebo tenkovrstevném (TLC - thin layer<br />

chromatography).<br />

Zvláštním případem adsorpční chromatografie je hydrofobní chromatografie biopolymerů<br />

(zejména proteinů), která využívá jejich schopnosti adsorbovat se na hydrofobní skupiny a<br />

povrchy. Vytěsnění adsorbovaných biopolymerů se provádí nejčastěji snížením iontové síly, popř.<br />

přídavkem organického rozpouštědla. Jako adsorpční hydrofobní materiály se nejčastěji<br />

používají polysacharidové či polyglykolmethakrylátové matrice s navázanými alkylovými řetězci<br />

(Sepharosa, Spheron).<br />

ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE<br />

Principem je dělení látek mezi dvě navzájem nemísitelná nebo omezeně mísitelná<br />

rozpouštědla a je charakterizováno rozdělovací konstantou K, která je rozdílná pro jednotlivé<br />

složky směsi a liší se pochopitelně i pro různé systémy rozpouštědel. Volbou složení těchto<br />

systémů lze ovlivnit účinnost rozdělení složek směsi. Rozdělovací chromatografie je uspořádána<br />

tak, že jedna z kapalných fází je zakotvena na inertní pevný nosič (silikagel, filtrační papír,<br />

křemelina, škrob) a stává se tak fází stacionární, zatímco druhá fáze - mobilní - přes tuto<br />

přetéká. Látky ze separované směsi se rozpouštějí mezi obě fáze. Na pevný nosič se zakotvuje<br />

především vodná stacionární fáze, která má k nosiči vyšší afinitu a jako mobilní je pak používaná<br />

směs organických rozpouštědel. Častou formou rozdělovací chromatografie je papírová<br />

chromatografie (PC – paper chromatography). Vývoj nových sorbentů a automatizace pak daly<br />

vzniknout novému a v současnosti jednomu z nejpoužívanějších typů chromatografie –<br />

vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC – high performence liquid chromatography). Při<br />

HPLC se pracuje za vysokého tlaku, nazývá se také často jako vysokotlaká kapalinová<br />

79

chromatografie. Umožňuje několikanásobně rychlejší a citlivější analýzy všech typů látek oproti<br />

klasickým sloupcovým metodám.<br />

AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE<br />

Je založena na biochemických interakcích, jako jsou interakce enzym – substrát nebo<br />

protilátka – antigen, které probíhají s vysokou selektivitou. Princip spočívá v navázání příslušného<br />

substrátu či antigenu chemickou reakcí na určitý sorbent, kterým se pak naplní kolona. Enzym<br />

nebo protilátka jsou selektivně vychytávány z analyzované směsi a následně mohou být z kolony<br />

vymyty. Afinitní chromatografie se ku příkladu využívá k čištění protilátek z krevního séra.<br />

GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE (GPC – GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY)<br />

Dělí látky na základě velikosti jejích molekul a blíže se s ní seznámíme ve cvičení č. 11.<br />

CHROMATOGRAFIE NA IONTOMĚNIČÍCH<br />

Chromatografie na měničích iontů neboli ionexová chromatografie je určena pro separaci<br />

látek nesoucích náboj. Při výměně iontů se ionty, které jsou elektrostaticky vázány k pevnému a<br />

chemicky inertnímu podkladu, reversibilně vyměňují za ionty z roztoku:<br />

R + A − + B −<br />

↔ R + B − + A −<br />

R + A − je měnič iontů s navázaným aniontem A − - anex a B − odpovídá aniontům v roztoku.<br />

Měnič kationtů - katex obsahuje záporně nabité skupiny, které reversibilně vážou kationty.<br />

Afinita iontů k ionexu není stejná, ale závisí na velikosti náboje a na poloměru hydratovaného<br />

iontu. Rozdíly v nábojových vlastnostech, jichž ionexová chromatografie využívá, jsou u<br />

biologických látek značné, proto tímto způsobem lze oddělit i látky jinak velmi podobných<br />

vlastností. Při vazbě iontu na ionex je však třeba počítat i s dalšími vlivy a to zejména s van der<br />

Waalsovými a polárními interakcemi. Síla vazby je také ovlivněna iontovou silou a hodnotou pH<br />

prostředí. Dále je třeba si uvědomit, že látky nesoucí stejný náboj jako ionex nebudou zachyceny<br />

vůbec.<br />

Jako chromatografický materiál slouží pro ionexovou chromatografii různé inertní matrice,<br />

které mají na svém povrchu kovalentně navázané kladně nebo záporně nabité funkční skupiny (viz<br />

tab. 9). Charakter funkčních skupin udává sílu ionexu, jejich celkové množství a využitelnost<br />

určuje kapacitu ionexu. Označení slabé, střední a silné ionexy vyjadřuje stupeň disociace skupin v<br />

závislosti na pH. Zatímco silné ionexy jsou úplně disociovány v širokém rozmezí pH, disociace<br />

slabých ionexů je naopak na pH silně závislá. Slabé katexy ztrácejí náboj při pH pod 6 slabé<br />

anexy při pH nad 9.<br />

ANEXY<br />

Aminoethyl (AE-)<br />

Diethylaminoethyl (DEAE-)<br />

Kvarterní aminoethyl (QAE-)<br />

FUNKČNÍ SKUPINA<br />

+<br />

OCH 2 CH 2 NH 3 Cl -<br />

OCH 2 CH 2 N + H(CH 2 CH 3 ) 2 Cl -<br />

OCH 2 CH 2 N + (C 2 H 5 ) 2 CH(OH)CH 3 Cl -<br />

KATEXY<br />

Karboxymethyl (CM-)<br />

Fosfo (P-)<br />

Sulfopropyl (SP-)<br />

OCH 2 COO − H +<br />

PO 4 H 2<br />

−<br />

H +<br />

CH 2 CH 2 CH 2 SO 3<br />

−<br />

H +<br />

Tabulka 9: Funkční skupiny ionexů.<br />

80

Jako matrice se v ionexové chromatografii používají tři druhy materiálů: syntetické<br />

pryskyřice, jako je např. nejčastěji používaný polystyren zesíťovaný divinylbenzenem, celulosa a<br />

konečně gely na bázi polyakrylamidu, dextranů nebo agarosy.<br />

Hlavní fáze ionexové chromatografie jsou ekvilibrace ionexu, navázání látek ze vzorku<br />

a vymytí nenavázaných složek, změna podmínek, která vede k selektivní desorpci, a konečně<br />

regenerace ionexu (obr. 36).<br />

Ekvilibrace ionexu se provádí startovním pufrem před tím, než je na kolonu aplikován<br />

vzorek. Výběru druhu pufru i pH je třeba věnovat značnou pozornost. Zdaleka ne všechny pufry<br />

jsou pro ionexovou chromatografii vhodné a to i v případě, že je splněna podmínka vhodného pH.<br />

Iontová síla startovního roztoku, který používáme při prvním stupni chromatografie, by neměla<br />

být příliš nízká, protože ekvilibrace ionexu je obtížnější a zdlouhavá, zpomaluje se výměnná<br />

kinetika, čímž se zhoršuje chromatografické rozlišení. Dochází rovněž ke smršťování ionexu a tím<br />

se mění průtok kolonou. Obvykle se doporučuje iontová síla 0,05 – 0,1 M.<br />

1. 2. 3. 4. 5.<br />

+ + + + +<br />

+ + + + + + + + + +<br />

+ + + + +<br />

+ + + + +<br />

+ + + + +<br />

protiionty<br />

startovacího pufru<br />

separované látky<br />

gradientové ionty<br />

Obrázek 36: Průběh ionexové chromatografie. 1 - ionex v rovnováze s protiionty (ekvilibrace<br />

ionexu), 2 - náhrada protiontů nabitými skupinami ze separované směsi, 3 - ionty s malou afinitou<br />

k ionexu jsou desorbovány a nahrazeny protionty z pufru, 4 - desorpce zbývajících iontů změnou<br />

podmínek (náhrada gradientovými ionty), 5 - náhrada gradientových iontů protionty startovního<br />

pufru (regenerace ionexu).<br />

Vlastní separační proces probíhá ve dvou oddělených fázích. V prvním kroku dochází k<br />

sorpci (navázání) látky, určené k separaci na ionex. Ve druhé fázi musí být navázané látky z<br />

kolony desorbovány. Ionexová chromatografie se obvykle provádí buď vsádkově nebo v kolonách.<br />

Je třeba vzít v úvahu, že rozměry kolony, resp. rozměry chromatografického materiálu v koloně,<br />

mají zásadní význam pro úspěšnost separačního procesu. Výšku kolony je třeba zvolit takovou, aby<br />

látky ze směsi byly adsorbovány v horní části kolony, nejméně však 1-2 cm od dolního okraje.<br />

Velice složité směsi je nutno dělit na delších sloupcích, pro laboratorní měřítko se však většinou<br />

vystačí se sloupci do 20 cm. Průměr sloupce závisí na tom, kolik ionexu je nutno do sloupce<br />

umístit (při předem zvolené výšce). Průměr sloupce tedy závisí na požadované kapacitě ionexové<br />

náplně. Kolony pro ionexovou chromatografii mají obvykle větší průměr a jsou krátké.<br />

Na kolonu aplikujeme vzorek, který by měl být rozpuštěn v ekvilibračním pufru nebo<br />

alespoň by měl mít pH odpovídající zvolené hodnotě a nízkou iontovou sílu. Při ionexové<br />

chromatografii nezáleží na objemu aplikovaného vzorku, pouze na množství separovaných látek ve<br />

vzorku. Jestliže totiž aplikujeme takové množství, že je přesažena kapacita kolony, část<br />

separovaných látek se nenaváže a vymyje se z kolony v mrtvém objemu. Ideální je, obsahuje-li<br />

vzorek takové množství dělených látek, které odpovídá asi 80-90% kapacity ionexu.<br />

81

Desorpce látek vázaných na ionexu se zpravidla provádí změnou složení elučního pufru.<br />

Mění se buď pH nebo iontová síla roztoku, výjimečně oba tyto faktory současně. V praxi to<br />

znamená, že do pufru, kterým promýváme kolonu, přidáme sůl ve vysoké koncentraci. Převážně se<br />

používá KCl v koncentracích od 0,1 do 2,0 M. V případě eluce změnou pH použijeme nový pufr o<br />

odlišném pH.<br />

Jestliže se složení elučního roztoku rychle mění (příkré gradienty), látky se vymývají s<br />

mnohem menším objemem eluentu, rozlišení může být však nižší. Jsou-li vlastnosti separovaných<br />

látek známy, lze gradienty utvářet tak, aby bylo dosaženo maximálního rozlišení a přitom<br />

rovnoměrného rozložení chromatografických vrcholů. V oblasti, kde se eluuje najednou několik<br />

látek, by měl být gradient mírný. Strmých gradientů by se mělo užít tam, kde se od sebe<br />

chromatografické vrcholy příliš vzdalují. Gradienty vytváříme většinou ve dvou spojených<br />

nádobách, do kterých nalijeme dva odlišné pufry. Pomocí míchadla je rovnoměrně mísíme a<br />

nanášíme na kolonu. Nejpříkřejší gradient může být vytvořen pouhou výměnou elučního pufru.<br />

Při sloupcové chromatografii (chromatografie na koloně) je chromatografický materiál<br />

umístěn do chromatografické kolony (skleněná nebo kovová trubice) a vytvoří tak sloupec, na<br />

němž probíhá dělení. Po aplikaci vzorku na kolonu dochází vlivem toku mobilní fáze k pohybu<br />

jednotlivých složek kolonou a k jejich separaci. Náplň kolony je různá, podle toho o jaký typ<br />

chromatografie se jedná. Kolony si můžeme naplnit v laboratoři sami nebo lze zakoupit kolony již<br />

naplněné, které jsou dodávány řadou firem. To platí zejména o kolonách pro chromatografické<br />

techniky, kdy dělení probíhá za zvýšeného tlaku (HPLC) na sorbentech s velmi malým průměrem<br />

částic (několik mikronů) a správné naplnění kolony je jedním z rozhodujících faktorů pro kvalitní<br />

separaci látek. Hlavní podmínkou je, aby kolona byla naplněna kontinuálně a náplň byla v celé své<br />

délce kompaktní bez jakýchkoliv heterogenit. Moderní zařízení pro kapalinovou sloupcovou<br />

chromatografii se skládá z rezervoárů mobilních fází, dávkovače vzorku, kolony s<br />

chromatografickým materiálem, čerpadel (popř. gradientového mixéru), detektoru měřícího eluát<br />

– vytékající mobilní fázi (spektrofotometr, refraktometr, hmotnostní spektrometr apod.), jímače<br />

frakcí a výstupu analyzovaných dat (zapisovač, počítač).<br />

Charakteristickou veličinou pro každou separovanou látku je eluční objem nebo eluční čas,<br />

označovaný V R , resp. t R . Eluční objem představuje celkový proteklý objem mobilní fáze od<br />

nanesení rozdělované látky na kolonu po dosažení maximální koncentrace této látky v eluátu.<br />

Eluční čas je pak analogicky doba od nástřiku po dosažení maxima eluční křivky dané látky. Eluční<br />

objem V R může být ještě dále charakterizován jako součet V R´, tj. skutečný eluční objem, a V M<br />

mrtvý objem kolony.<br />

V R = V R´ + V M<br />

Mrtvý objem kolony se dá charakterizovat jako celkový objem, který v koloně zaujímá<br />

mobilní fáze. Experimentálně se dá určit tak, že se na kolonu aplikuje inertní látka, která není na<br />

koloně zadržována žádnými silami a její eluční objem se pak rovná mrtvému elučnímu objemu (obr.<br />

37).<br />

Obrázek 37: Eluční profil při sloupcové kapalinové chromatografii. V M – mrtvý eluční objem, V R1<br />

a V R2 eluční objemy látek 1 a 2.<br />

82

ÚKOL č. 21: Rozdělení směsi aminokyselin na silném katexu<br />

Zvláštní, leč v biochemii velmi významnou skupinu látek tvoří ty, jejichž nábojové vlastnosti<br />

závisí na pH (aminokyseliny, peptidy a bílkoviny) a tudíž mohou být separovány jak na anexech tak<br />

na katexech. Volba ionexu v tomto případě závisí zejména na hodnotě izoelektrického bodu (pI).<br />

Izoelektrický bod amfipolární látky je hodnota pH, při které má její molekula nulový náboj. Při pH<br />

nižším, než je izoelektrický bod, nese látka kladný náboj a váže se na katex. Při pH nad<br />

izoelektrickým bodem má záporný náboj a váže se tedy na anex. U aminokyselin to znamená, že<br />

při pH nižším, než je pI, dává molekule náboj skupina NH 3 + a při pH vyšším pak skupina COO - . Při<br />

dělení proteinů je třeba brát také v úvahu jejich stabilitu v závislosti na pH. Izoelektrický bod<br />

proteinu je součtem izoelektrických bodů všech aminokyselin v něm obsažených.<br />

V této úloze budete dělit směs tří aminokyselin, které se značně liší hodnotou svého pI na<br />

sloupci silného katexu. Aminokyseliny se navážou na katex v silně kyselém prostředí, kdy má<br />

většina z nich záporný náboj a postupně se budou vymývat vzrůstající hodnotou pH elučního<br />

pufru. V eluátu budete aminokyseliny detekovat pomocí ninhydrinového činidla. Barevnou reakci<br />

s ninhydrinem poskytují všechny volné aminokyseliny. Aminoskupina aminokyselin poskytuje<br />

s ninhydrinem červeno-fialové zabarvení po zahřátí na 100ºC, kromě prolinu a asparaginu, které<br />

dávají žluté zabarvení. Arginin budete dokazovat specifickou Sakaguchiho reakcí, kdy jeho<br />

guanidinová skupina reaguje s bromnanem a α-naftolem v alkalickém prostředí za vzniku malinově<br />

červeného produktu.<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE<br />

Skleněná kolona (25 cm) s gumovou zátkou a hadičkou, stojan se svorkou, kádinky, pH metr,<br />

rozprašovač aerosolu, filtrační papír, odměrná baňka, Pasteurovy pipety, kulatý stojan na<br />

zkumavky, stříkačka, zkumavky, odměrný válec, kapkovací destička, elektrický fén, sušárna,<br />

automatická pipeta, skelná vata Akuver, 50 mM citrátové pufry podle McIlvaine pH 3 a 6, 50 mM<br />

Tris/HCl pufr pH 9, katex Amberlite IR 120 v citrátovém pufru pH 3, 2,5% vodný roztok serinu,<br />

valinu a argininu (směs), 2,5% vodný roztok argininu, 0,4% etanolický roztok ninhydrinu, alkalický<br />

roztok bromnanu sodného, etanolický roztok α-naftolu, 10% roztok hydroxidu sodného.<br />

POSTUP<br />

Příprava kolony: Skleněnou kolonu s kohoutem upevněte vertikálně do stojanu. Na dno<br />

kolony umístěte chomáč skelné vaty Akuver tak, aby pokryla celé dno. Regenerovaný katex<br />

Amberlite IR 120 rozmíchejte asi ve dvojnásobku objemu citrátového pufru, pH 3 a nalijte do<br />

kolony, jejíž kohout je otevřený. Sledujte rychlost, s níž se katex usazuje, a neustále dolévejte<br />

nové podíly ionexu tak, aby nedošlo k vytvoření vrstev katexu. Katex musí tvořit jeden kompaktní<br />

sloupec. Až sahá sloupec asi 3 cm pod ústí kolony, nechejte katex pořádně usadit a pufr odpusťte<br />

asi 1/2 cm nad hladinu katexu a kohoutem kolonu uzavřete. Při chromatografii nikdy nenechejte<br />

sloupec náplně vyschnout! Poté umístěte na kolonu provrtanou gumovou zátku s hadičkou, která<br />

vede do litrové odměrné baňky umístěné nad kolonou obsahující zásobní eluční pufr – citrátový<br />

pufr pH 3. Stříkačkou nasajte pufr tak, aby kontinuálně protékal. Zátkou uzavřete kolonu a dole<br />

ji kohoutem otevřete. Pod výtok z kolony umístěte 50 mL kádinku a promývejte kolonu citrátovým<br />

pufrem, pH 3 tak dlouho, až hodnota pH eluátu dosáhne hodnoty pH 3. Eluát z kolony průběžně<br />

proměřujte na pH metru.<br />

Nanesení vzorku: Před nanesením vzorku na kolonu vypusťte veškerý pufr nad sloupcem<br />

kolony a kolonu uzavřete. Poté opatrně automatickou pipetou naneste na kolonu 1 mL směsi<br />

aminokyselin a kolonu otevřete. Po vsáknutí vzorku do kolony automatickou pipetou naneste na<br />

kolonu 3 mL elučního pufru – citrátový pufr, pH 3 a nechejte vsáknout. Poté opět napojte zátku<br />

s hadičkou ze zásobního rezervoáru.<br />

Sběr frakcí eluátu: Od okamžiku nanesení vzorku na kolonu měřte pomocí odměrného válce<br />

pod kolonou objem eluátu. Do kruhového stojanu si připravte sadu 10 kalibrovaných zkumavek<br />

83

označených 1 až 10 a po odkapání 10 mL eluátu z kolony jímejte frakce po 5 mL do jednotlivých<br />

zkumavek.<br />

Detekce eluátu: Aby jste zjistili, ve kterých zkumavkách jsou aminokyseliny, odeberete<br />

z každé zkumavky automatickou pipetou 20 µL vzorku a necháte je po kapkách vsáknout do<br />

filtračního papíru (3 × 10 cm), kde budete mít čísly označené body jako frakce. Kapku vždy<br />

vysušíte elektrickým fénem. Její průměr by neměl přesáhnout 1 cm. Po vysušení papír v digestoři<br />

postříkáte aerosolem ninhydrinového činidla z rozprašovače a dáte do sušárny zahřát na 10 minut<br />

při 110 o C. Frakce obsahující aminokyseliny se zbarví červeno-fialově. Pokud je i desátá skvrna<br />

intenzivně zabarvená ve vymývání a detekci budete pokračovat. V této fázi jsou ze směsi<br />

odděleny kyselé aminokyseliny.<br />

Pokud už nejsou v posledních či dalších zkumavkách aminokyseliny, uzavřete kohout a<br />

v zásobní odměrné baňce vyměníte pufr za citrátový pufr, pH 6 a necháte ho protéct hadičkou až<br />

k zátce. Poté zátkou uzavřete znovu kolonu a do čistých zkumavek budete jimát frakce 11-20<br />

opět po 5 mL. Po najímání všech frakcí proměříte a zapíšete pH ve zkumavkách a provedete<br />

detekční test na aminokyseliny s ninhydrinem. Pokud již 20 zkumavka neobsahuje aminokyseliny<br />

vyměníte eluční pufr za 50 mM Tris/HCl pufr, pH 9 a jímáte další frakce 21-30, které obsahují<br />

bazické aminokyseliny. Opět proměříte pH jednotlivých zkumavek a uděláte test na<br />

aminokyseliny.<br />

Během celé chromatografie provádějte na kapkovací destičce test na arginin. Vždy<br />

v rozmezí zhruba 20 vytečených mililitrů z kolony odeberete do jamky na kapkovací destičce asi<br />

4 kapky eluátu, přidáte k nim jednu kapku 10% NaOH, 2 kapky etanolického roztoku α-naftolu a<br />

kapku alkalického bromnanu. Reakci si nejprve vyzkoušejte s jednou kapkou zásobního roztoku<br />

argininu. U pozitivní reakce si poznačte zhruba objem vytečeného eluátu od začátku<br />

chromatografie.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

1) Sestrojte eluční profil chromatografie (chromatogram) – závislost objemu vytečeného eluátu<br />

na pH a vyznačte místa, ve kterých z kolony vytékaly aminokyseliny.<br />

2) Rozhodněte, která z aminokyselin (valin, arginin, serin) vytékala jako první, druhá a třetí a<br />

proč? Pomoci vám může specifický test na arginin, popř. literatura.<br />

3) Napište iontové formy všech tří aminokyselin, které existují ve vodných roztocích o pH 2, 6 a<br />

10.<br />

ÚKOL č. 22: Regenerace ionexu<br />

Po skončené eluci se obvykle provádí regenerace ionexu. V malých analytických pokusech je<br />

regenerace někdy neekonomická, protože množství ionexu v koloně je velmi malé a práce spojená<br />

s regenerací je nákladnější. Pracuje-li se však ve větším měřítku, je třeba regeneraci provést.<br />

Jestliže již byly eluovány všechny látky nanesené na kolonu, uskuteční se regenerace promytím<br />

startovním pufrem. Kontrolu ekvilibrace provedete tak, že změříme pH a vodivost ve vytékající<br />

kapalině. Jestliže však některé látky zůstanou zadrženy v koloně, je třeba je vymýt. Chcete-li tak<br />

učinit u látek navázaných silami iontové povahy, zvýšíte iontovou sílu. K odstranění látek, které na<br />

koloně vyprecipitovaly nebo jsou velmi pevně vázány, se dá použít 0,1 M NaOH, detergentů, které<br />

se na ionex neváží, nebo organických rozpouštědel, jako je např. ethanol.<br />

Většina ionexů, kromě gelových, se však musí po každém použití znovu nastavit do<br />

požadovaného cyklu (zregenerovat). Jinak jejich kapacita rapidně klesá. Živcové ionexy se<br />

střídavě promývají v 1-4 M roztocích HCl a NaOH, přičemž mezi jednotlivými cykly se vždy<br />

nadbytečné ionty vymyjí destilovanou vodou do neutrální reakce. U celulosových ionexů se<br />

používají mírnější podmínky - maximálně 0,5 M roztoky kyseliny či zásady. Pořadí kyseliny a<br />

84

zásady je vždy takové, že anex se nejprve promyje v roztoku kyseliny a katex hydroxidu. Po<br />

vymytí vodou se pak anex regeneruje v hydroxidu a katex v kyselině, po vymytí nadbytečných<br />

iontů se ionexy stabilizují v pufru, ve kterém začíná dělení.<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE<br />

Vývěva, skleněná nálevka s fritou, odsávací baňka, kádinky, skleněná tyčinka, pH papírky, pH<br />

metr, konc. kyselina chlorovodíková, hydroxid sodný, citrátový pufr pH 3, použitý katex z kolony<br />

Amberlite IR 120 (z předchozího cvičení).<br />

POSTUP<br />

Připravte si 100 mL 1 M roztoku NaOH. Použitý katex odsajte na fritě a přeneste do<br />

roztoku hydroxidu. Za občasného míchání skleněnou tyčinkou nechejte stát katex v roztoku<br />

hydroxidu asi 1/2 hodiny. Roztok hydroxidu poté dekantujte a promývejte několikrát<br />

destilovanou vodou. Nakonec odsajte a na fritě ještě několikrát promyjte vodou až do neutrální<br />

reakce. Pomocí pH papírku analyzujte výtok ze stopky frity. Připravte si 100 mL 1 M roztoku HCl<br />

a katex do něj převeďte a nechejte za občasného míchání stát při laboratorní teplotě. Po 1/2<br />

hodině opět dekantujte a na fritě promývejte až do neutrální reakce. Poté katex ekvilibrujte<br />

v citrátovém pufru, pH 3, a to tak dlouho, až je jeho pH totožné s pH pufru.<br />

Poznámka:<br />

Roztoky hydroxidů připravujte vždy tak, že budete přidávat pevný hydroxid do vody.<br />

Reakce je silně exotermická, a kdyby jste lili vodu přímo na hydroxid, mohlo by dojít<br />

k přehřátí skla a jeho prasknutí.<br />

Stejně tak postupujte při ředění kyseliny, přidávejte ji vždy do vody.<br />

Ionexy a ostatní strukturované náplně chromatografických kolon nikdy nemíchejte na<br />

elektromagnetických míchadlech, mohlo by dojít k jejich narušení.<br />

Doporučená literatura:<br />

Káš, J. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Nakladatelství Olomouc, 2000.<br />

Ferenčík, M. a kol.: Biochemické laboratórne metódy, Alfa Bratislava, 1981.<br />

Anzenbacher, P. a Kovář, J.: Metody chemického výzkumu pro biochemiky, VN MON Praha, 1986.<br />

Voet, D.A. a Voet, J.G.: Biochemie, Academia Publishing Praha, 1995.<br />

85

Laboratorní cvičení č. 11<br />

CHROMATOGRAFIE NA TENKÉ VRSTVĚ A GELOVÁ CHROMATOGRAFIE<br />

GELOVÁ CHROMATOGRAFIE<br />

Tento typ chromatografie je jednou z nejpoužívanějších metod v preparativní chemii<br />

biopolymerů. Na rozdělování látek při gelové chromatografii mají rozhodující vliv rozměry jejich<br />

molekul. Na pórovitém gelu (také nazývaném molekulové síto) dochází k zadržování malých<br />

molekul tím, že pronikají do nitra částic gelu (obr. 38). Molekuly, které jsou tak veliké, že<br />

neprojdou póry, se nezadržují a vymývají se z kolony rychleji. Malé molekuly jsou tedy<br />

zpomalovány více než velké a jednotlivé složky směsi se uvolňují ze sloupce v pořadí klesající<br />

velikosti molekuly (relativní molekulové hmotnosti, viz obr. 39). Kriteriem rozdělení látek je<br />

velikost pórů v částicích gelu. Gel by neměl obsahovat žádné specificky ani nespecificky<br />

adsorbující skupiny, aby nedocházelo k dělení látek jiným mechanismem. Jde v podstatě o typ<br />

rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina, kde stacionární fáze je kapalina<br />

zakotvená v gelu. Stejná kapalina tvoří mobilní fázi, která protéká mezi částicemi gelu.<br />

V literatuře se můžeme setkat s různými názvy pro<br />

gelovou chromatografii. Pro oddělování látek s velmi<br />

rozdílnými molekulovými hmotnostmi, např. při odsolování<br />

bílkovin, používáme hlavně termín gelová filtrace. Proces<br />

separace látek s blízkými molekulovými hmotnostmi je pak<br />

nazýván jako gelová permeační chromatografie (GPC – gel<br />

permeation chromatography). Často se také můžeme setkat<br />

s termínem kapalinová vylučovací chromatografie, který je<br />

z teoretického hlediska asi nejvhodnější.<br />

Obrázek 38: Zadržování<br />

částic v pórech gelu.<br />

Jednotlivé typy gelů lze charakterizovat tzv. frakcionačním rozsahem gelu, což je rozmezí<br />

molekulových hmotností nebo velikostí molekul, v němž jejich změna způsobuje změnu v elučním<br />

objemu (objem mobilní fáze, který proteče kolonou od nanesení vzorku až po dobu, kdy je daná<br />

látka z kolony vymývána, viz cvičení č. 10). Nejčastěji používaným typem gelu jsou Sephadexy.<br />

Obrázek 39: Princip gelové chromatografie<br />

86

Sephadexy jsou vyráběny z fragmentů dextranu, což je polysacharid s relativní<br />

molekulovou hmotností okolo 10 7 – 10 8 , který vzniká ze sacharosy působením bakterie<br />

Leuconostoc mesenteroides. Dextranová vlákna se pak zesíťují příčnými vazbami působením<br />

epichlorhydrinu (obr. 40). Stupeň zesíťování a s tím související velikost póru lze ovlivnit<br />

vzájemným poměrem epichlorhydrinu a dextranu. Jednotlivé typy Sephadexů se označují číslicí a<br />

písmenem. Na odsolování se nejčastěji používají Sephadexy s nižším číslem. Pro dělení látek o<br />

vyšších molekulových hmotnostech Sephadexy G-75, G-150 nebo jiné typy gelů, jako je<br />

Sepharosa, Sephacryl, Bio-gel atd.<br />

Obrázek 40: Část zesíťované struktury Sephadexu<br />

Gelové permeační chromatografie se velmi často užívá pro stanovování relativní molekulové<br />

hmotnosti makromolekul. Před vlastní chromatografii daného vzorku je nutno provést separaci<br />

standardů o známé relativní molekulové hmotnosti a z jejich elučních objemů sestrojit závislost.<br />

Většinou vynášíme závislost retenčního času na logaritmu molekulové hmotnosti. Z retenčního<br />

času vzorku o neznámé hmotnosti, který je chromatografován za stejných podmínek jako směs<br />

standardů, pak jednoduše odečteme jeho relativní molekulovou hmotnost. Podmínkou je, aby<br />

vzorek nebyl znečištěn látkami o přibližně stejné molekulové hmotnosti, které zkreslují retenční<br />

čas vzorku. Důležité je také vhodné zvolení typu gelu tak, aby se do jeho frakcionačního rozsahu<br />

vešly všechny standardy a samozřejmě i vzorek. Na obrázku 41 je znázorněn eluční profil směsi<br />

standardů na koloně Superosy 12 HR používané v systému FPLC (fast protein liquid<br />

chromatography).<br />

Odsolování roztoků biopolymerů pomocí gelové chromatografie (gelová filtrace) bývá často<br />

vhodnější než dialýza. Odsolováním nestabilních biopolymerů dialýzou dochází někdy k jejich<br />

denaturaci z důvodu časové náročnosti procesu. Používá se nejčastěji Sephadex G-25, pro<br />

odsolování biopolymerů s relativní molekulovou hmotností nad 30. 000 je pak vhodnější Sephadex<br />

G-50. Důležitá je také délka kolony, při větších objemech nanášeného vzorku je nutno úměrně<br />

zvyšovat délku náplně v koloně tak, aby se během průtoku směs nízko a vysokomolekulárních látek<br />

stačila od sebe oddělit. Obecně se udává, že při gelové chromatografii by měl činit objem<br />

nanášeného vzorku maximálně 1-2% z celkového objemu kolony. Pro gelovou chromatografii se<br />

proto používají kolony 75 cm dlouhé a často i delší.<br />

87

Obrázek 41: Typický chromatogram směsí proteinů na koloně Superosy 12 HR. 1 – protilátka<br />

IgG (M r 160.000), 2 – hovězí sérový albumin (M r 67.000), 3 – β-laktoglobulin (M r 37.000), 4 –<br />

cytochrom c (M r 12.400), 5 - vitamin B 12 (M r 1.355), 6 - cytidin (M r 246).<br />

CHROMATOGRAFIE NA TENKÉ VRSTVĚ<br />

Tato varianta provedení chromatografického pokusu se nejčastěji provádí u adsorpční,<br />

případně u rozdělovací a ionexové chromatografie. TLC používáme především pro analýzu<br />

zkoumané směsi, v menší míře pro preparativní účely. Hlavní využití má TLC při separaci<br />

nepolárních látek.<br />

Pro tenkovrstvou chromatografii se používají sypané vrstvy (např. oxid hlinitý, celulosa),<br />

které jsou však kvůli mechanické stabilitě méně vhodné než vrstvy lité. Adsorbent je nanášen na<br />

podložku ve stejnoměrné vrstvičce pomocí skleněné tyčinky s gumovými zarážkami (viz obr. 42).<br />

Obrázek 42: Příprava sypané tenké vrstvy.<br />

Obrázek 43: Vyvíjení sypané vrstvy<br />

v horizontální poloze. A – deska s vrstvou,<br />

B – rozpouštědlo.<br />

Lité vrstvy se připravují ze suspenze stacionární fáze (např. silikagel) a pojidla (např.<br />

sádra). Nejpoužívanější jsou komerčně dostupné lité vrstvy Al 2 O 3 na hliníkové fólii známe pod<br />

názvy Silufol či Alufol. Cenově dražší jsou vrstvy, kdy je jako nosič použito sklo a na něj upevněn<br />

silikagel nebo celulosa. S oblibou se používají i polymerní nosiče s nanesenou vrstvou polyamidu.<br />

88

Vlastní provedení tenkovrstvé<br />

chromatografie může probíhat v několika<br />

uspořádáních. Klasické je šikmé uspořádání,<br />

kdy desku s tenkou vrstvou umístíme do<br />

vyvíjecí nádoby (chromatografická komůrka)<br />

asi pod úhlem 20 stupňů a na dno nádoby<br />

nalijeme rozpouštědlo (obr. 43). Důležité je,<br />

aby chromatografická komůrka byla<br />

uzavřena a atmosféra uvnitř se mohla<br />

nasytit párami rozpouštědla. Pokud je deska<br />

umístěná v komůrce vertikálně, mluvíme o<br />

chromatografii vzestupné nebo sestupné,<br />

v závislosti na tom, zda je rozpouštědlo<br />

umístěno dole nebo nahoře. Vzestupná<br />

chromatografie se provádí ve speciálních<br />

komůrkách, ve kterých lze vyvíjet i více<br />

chromatogramu najednou (obr. 44). Při<br />

sestupné chromatografii se jako nosič<br />

většinou používá speciální chromatografický<br />

papír (komerčně dodávaný pod značkou<br />

Whatman), který se zavěsí do nádobky<br />

s rozpouštědlem (obr. 45).<br />

Obrázek 44: Vyvíjecí komora pro větší<br />

počet desek.<br />

Připomeňme jen, že papírová chromatografie je založená na principu rozdělovací<br />

chromatografie, na rozdíl od výše uváděných chromatografii na tenkých vrstvách, které<br />

především fungují na principu adsorpční chromatografie. Papírová chromatografie ve vertikálním<br />

uspořádání se provádí většinou jako kruhová. Doprostřed papíru umístíme knot, kterým vzlíná<br />

rozpouštědlo a kolem něj nanášíme vzorky, které pak migrují k okraji papíru (obr. 46).<br />

Obrázek 45: Zařízení pro sestupnou<br />

papírovou chromatografii<br />

Obrázek 46: Kruhové vyvíjení papírové<br />

chromatografie<br />

Velkou předností chromatografie na tenkých vrstvách je velká časová úspora, malá<br />

spotřeba látek i rozpouštědel, minimální experimentální zařízení a snadné provedení. Jelikož při<br />

TLC a papírové chromatografii nemůžeme přímo zjistit charakteristickou veličinu udávající<br />

mobilitu dané látky – eluční objem či retenční čas jako u sloupcové chromatografie, používá se<br />

pro charakterizaci a identifikaci látek jiná veličina, tzv. retenční faktor R f . Retenční faktor<br />

udává poměr vzdálenosti středu skvrny látky od startu (V M ) ku vzdálenosti čela mobilní fáze (V R ),<br />

tj. vzdálenost kam až doputuje mobilní fáze.<br />

R f = V M / V R

Při separaci směsi látek je vždy žádoucí provádět i chromatografii standardů v tomtéž<br />

pokusu. Identifikace je pak snadnější. Kvantitativní vyhodnocení se provádí denzitometricky nebo<br />

vyškrabáním a následnou elucí jednotlivých skvrn (změřením koncentrace látek v eluátech).<br />

Detekce látek při tenkovrstevné a papírové chromatografii se provádí různými způsoby:<br />

−<br />

−<br />

−<br />

−<br />

−<br />

přímá – skvrny barevných látek jsou dobře vidět pouhým okem (např. rostlinná barviva),<br />

absorpce světla v UV oblasti – používá se adsorbentu obsahující fluoreskující složku, po<br />

osvětlení UV světlem deska fluoreskuje pouze v místech rozdělených látek jsou vidět tmavá<br />

místa,<br />

fluorescence – některé látky po ozáření UV světlem samy svítí (např. některé alkaloidy),<br />

specifické barvení – chromatogram se obvykle vyvíjí postříkáním nějakým specifickým<br />

činidlem, které se separovanou látkou tvoří barevné produkty, např. ninhydrin je specifické<br />

činidlo na aminokyseliny, se kterými dává fialově-červené produkty,<br />

izotopové techniky – látky jsou označeny radioaktivními izotopy a při vyhodnocování se měří<br />

vznikající radioaktivita.<br />

ÚKOL č. 23: Chromatografie karotenoidů z papriky na tenké vrstvě<br />

Karotenoidy jsou rostlinná barviva rozpustná v tucích, v přírodě hojně zastoupená ve všech<br />

rostlinných druzích, obvykle zbarvena žlutě, oranžově a červeně. Některé typy karotenoidů se<br />

nacházejí i v říši živočišné, dávají například charakteristické zabarvení plameňáků, kanárků, raků<br />

nebo třeba slunéčka sedmitečného. Z chemického hlediska je lze řadit do skupiny terpenoidů,<br />

tzn. látek odvozených od izoprenové podjednotky. Používají se především jako nezávadná,<br />

přirozená barviva v potravinářském a kosmetickém průmyslu. V rostlinném organismu jsou<br />

nezbytné pro růst a fotosyntézu, pro člověka jsou nezastupitelným zdrojem vitaminu A, jehož<br />

jsou prekurzorem. V současné době se také hovoří o jejich schopnosti snižovat některá rizika<br />

rakoviny. Hojně se využívají jako antioxidanty zachycující pro organismus nebezpečné volné<br />

radikály.<br />

Lycopen (rajče)<br />

Beta-karoten (mrkev)<br />

Kapsantin (paprika)<br />

90

(kukuřice)<br />

Obrázek 47: Nejznámější typy karotenoidů, jejich vzorce a typicky výskyt.<br />

Extrakt z papriky (Capsicum annum) obsahuje 37 – 54 pigmentů, počet závisí na způsobu<br />

izolace. Většina z nich je na bázi karotenoidů. Hlavním pigmentem papriky je červený kapsantin a<br />

kapsorubin, žluto-oranžový beta-karoten a žluté luteiny a xantofyly. Karotenoidy z papriky<br />

budete chromatografovat v nepolárním benzenu. Mobilita jednotlivých molekul závisí na jejich<br />

polaritě, tzn. především na počtu hydroxy skupin.<br />

POZOR: Pracujete s karcinogenním benzenem. Chraňte se rukavicemi a pracujte v digestoři!<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE<br />

Skleněná vana, velká a malá skleněná deska, skleněná tyčinka s gumičkami, odměrné válce, třecí<br />

miska s tloučkem, pipety, kádinky, nálevka, filtrační kruh, filtrační papír, vodní lázeň, odpařovací<br />

miska, umělohmotné zátky, Silufol, Al 2 O 3 pro chromatografii, benzin, benzen, červená paprika.<br />

POSTUP<br />

Odvážte 1 gram suché papriky a ve třecí misce jej rozetřete s 10 mL směsi benzin -benzen<br />

(4:1). Karotenoidy společně s dalšími látkami přejdou do rozpouštědla. Extrakt odfiltrujte přes<br />

hladký suchý filtr do kádinky. Pozor, veškeré sklo musí být dokonale suché! Na vodní lázni<br />

zfiltrovaný extrakt odpařte do sucha a odparek rozpusťte v 1 mL čistého benzinu.<br />

Příprava sypané tenké vrstvy: Menší skleněnou destičku si položte na stůl a na jeden<br />

z jejich konců nasypte hromádku oxidu hlinitého určeného pro chromatografii. Pak opatrně<br />

skleněnou tyčinkou na konci s gumičkami projeďte po celé délce skla tak, aby se na jeho povrchu<br />

vytvořila jednolitá vrstva oxidu hlinitého. Destičku opatrně chytněte za hrany a přeneste do<br />

ploché skleněné vany, na jejíž jeden konec si předem položíte dvě umělohmotné zátky (obr. 43).<br />

Destička je umístěná šikmo pod úhlem asi 20º. Asi centimetr od spodního okraje naneste<br />

jako souvislou čáru v délce okolo 3 centimetrů extrakt z papriky. Vzorek nanášejte automatickou<br />

pipetou s rozsahem 20-200 mikrolitrů. Na dno nádoby nalijte čistý benzen tak, aby začal vzlínat<br />

po destičce nahoru a nádobku překryjte velkým sklem. Chromatogram nechejte vyvíjet a sledujte<br />

rozdělování jednotlivých barviv.<br />

Stejný vzorek extraktu z papriky rozdělte vzestupnou chromatografii na vrstvě silufolu.<br />

Z folie silufolu si odstřihněte pruh asi o šířce 2 cm. Silufol stříhejte v rukavicích, aby jste ho<br />

zbytečně neznečistili. Asi 1 cm od jednoho konce folie nanesete vzorek. Pruh silufolu umístěte do<br />

odměrného válce, na jehož dno nalijete mobilní fázi – benzen. Dbejte na to, aby hladina<br />

rozpouštědla nezasahovala do naneseného vzorku. Válec uzavřete převrácenou kádinkou a<br />

nechejte chromatogram vyvíjet. Jakmile rozpouštědlo vyvzlíná na 1 cm pod horní konec folie,<br />

chromatogram vyjměte a nechejte na vzduchu oschnout.<br />

91

VYHODNOCENÍ<br />

1) Porovnejte účinnost obou provedení tenkovrstevné chromatografie a rozhodněte, které<br />

dělení je lepší.<br />

2) Vyvinutý chromatogram na silufolu překreslete do protokolu a podle barvy jednotlivých pruhů<br />

se pokuste určit, o které karotenoidy jde. V potaz berte i polaritu jejich molekul.<br />

3) Z chromatografie na silufolu vypočtěte retenční faktory pro jednotlivá barviva.<br />

92

ÚKOL č. 24: Gelová chromatografie proteinu s nízkomolekulární látkou<br />

V této úloze budete od sebe oddělovat pomocí gelové filtrace hemoglobin a síran nikelnatý.<br />

Průběh gelové filtrace je možno dobře sledovat díky barevnosti obou látek. Nikelnaté ionty jsou<br />

zelené. Krevní barvivo hemoglobin má červeno-hnědou barvu. Jde o sloučeninu proteinu – globinu a<br />

prostetické skupiny – hemu, na který je vázáno dvojmocné železo. Molekula hemoglobinu je<br />

tetramer, to znamená, že se k sobě vážou čtyři základní jednotky globinu s hemem. Celková<br />

molekulová hmotnost tohoto tetrameru je 67.000 kDa.<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE<br />

75 cm dlouhá kolona na chromatografii, nabobtnalý Sephadex G-25, odměrná baňka 1 L, hadička<br />

se zátkou, kádinky, zkumavky, pipety, spektrofotometr Shimadzu UV 1204, konduktometr,<br />

kyvety, injekční stříkačka, směs hemoglobinu a síranu nikelnatého.<br />

POSTUP<br />

75 cm kolonu naplněnou Sephadexem G-25 postavte na židli do těsné blízkosti pracovního<br />

stolu na jehož horní polici umístíte jednolitrovou odměrnou baňku naplněnou destilovanou vodou.<br />

Baňku spojte pomocí gumové hadičky se zátkou s horním ústím kolony a nasajte do ní stříkačkou<br />

vodu tak, aby po otevření kolony voda kontinuálně protékala z odměrné baňky přes kolonu. Pod<br />

kolonu umístěte kádinku, do které bude voda odkapávat. Kolonu nechejte asi 20 minut promývat<br />

vodou.<br />

POZOR:<br />

Nikdy nenechejte kolonu vyschnout!!! Dbejte na to, aby nad sloupcem gelu v koloně bylo vždy<br />

alespoň minimální množství vody.<br />

Během chromatografie hlídejte zásobník s vodou, aby v něm bylo vždy dostatek vody,<br />

vyhnete se tím nechtěnému vyschnutí kolony.<br />

Při každém vyschnutí sloupce gelu je nutno kolonu vždy znova přeplnit.<br />

Když je kolona dostatečně promytá vodou, zavřete kohoutek kolony, tlačkou zastavte<br />

průtok vody v hadičce a oddělejte zátku z kolony. Pak opatrně kohoutkem odpusťte vodu ze<br />

sloupce gelu právě tak, aby se klesající hladina vody zastavila na začátku sloupce gelu.<br />

Napipetujte opatrně 1 mL vzorku na sloupec gelu a nechejte vsáknout. Pod kolonu umístěte 100<br />

mL odměrný válec. Po vsáknutí vzorku na sloupec naneste 1 mL vody a nechejte vsáknout, totéž<br />

ještě jednou s vodou zopakujte a až poté na kolonu opět zapojte hadičku ze zásobníku a nechejte<br />

vodu volně protékat. Sledujte dělící se látky na koloně jako dva barevné pruhy. Po odkapání 50 mL<br />

vody z kolony začněte jímat do předem připravených zkumavek (25) frakce po 3 mL. Pokud<br />

nemáte kalibrované zkumavky, vyznačte si na ně ryskou objem 3 mL. Pokud i po odebrání 25<br />

frakcí stále vytéká z kolony barevný roztok, jímejte do dalších zkumavek až do okamžiku, kdy už<br />

eluát není na první pohled zabarven.<br />

Po ukončení chromatografie nechejte kolonu ještě asi 20 minut promývat vodou. Najímané<br />

frakce analyzujte. Nejprve proměřte pomocí spektrofotometru Shimadzu absorbance<br />

jednotlivých frakcí při 410 nm, což je vlnová délka maximální absorbance hemové skupiny<br />

hemoglobinu.<br />

Koncentraci nízkomolekulární látky – nikelnaté soli budete detekovat na základě zvýšené<br />

vodivosti roztoku. Pomocí konduktometru proměříte vodivost všech frakcí. Do konduktometrické<br />

cely napipetujete vždy přesně 1 mL vzorku a po rysku doplníte destilovanou vodou. Pak do cely<br />

ponoříte čidlo konduktometru a na displeji odečtete hodnotu vodivosti v µS.cm -1 . Mezi<br />

jednotlivými měřeními vždy opláchnete čidlo konduktometru destilovanou vodou.<br />

93

VYHODNOCENÍ<br />

1) Sestrojte chromatogram závislosti elučního objemu na absorbanci při 410 nm a vodivosti.<br />

Vyznačte maxima příslušející nejvyššímu výtoku jednotlivých složek. Podařilo se vám od sebe<br />

dokonale oddělit nízko- a vysokomolekulární látky?<br />

2) Na koloně Sephadexu G-200 dělíte směs cytochromu c, riboflavinu a pepsinu. Která látka<br />

bude z kolony vytékat jako první, která jako druhá a třetí?<br />

Doporučená literatura:<br />

Anzenbacher, P. a Kovář, J.: Metody chemického výzkumu pro biochemiky, VN MON Praha, 1986.<br />

Lábler, L. a Schwarz, V.: Chromatografie na tenké vrstvě, Nakladatelství ČAV, 1965.<br />

Voet, D. a Voet, J. G.: Biochemie, Academia Publishing Praha, 1995.<br />

Káš, J. a kol.: Laboratorní cvičení z biochemie, Nakladatelství Olomouc, 2000.<br />

Mikeš, V.: Základní biochemické praktikum, Vydavatelství MU Brno, 1992.<br />

Karlson, P.: Základy biochemie, Academia Praha, 1965.<br />

Laboratorní cvičení č. 12<br />

PRÁCE S MIKROSKOPEM<br />

Světelná mikroskopie je základní metodou pozorování ve všech biologických oborech,<br />

jejichž předmětem je buňka (tkáň, pletivo, mikroorganismus), protože rozlišovací schopnost této<br />

metody odpovídá velikosti buněk a mnohých organel. Světelná mikroskopie využívá k zobrazení<br />

světelných paprsků (elektronová mikroskopie proudu elektronů).<br />

Podle osvětlení objektu rozlišujeme:<br />

−<br />

mikroskopie v procházejícím světle (světlo prochází pozorovaným objektem).<br />

94

−<br />

mikroskopie v dopadajícím světle (světlo dopadá shora na povrch objektu).<br />

Řadíme sem mikroskopii - ve světelném poli<br />

- v temném poli<br />

- fázově kontrastní<br />

- interferenční<br />

- polarizační<br />

- fluorescenční<br />

- v neviditelných paprscích (UV, RTG, IČ)<br />

Podle osvětlení okolí objektu rozlišujeme:<br />

−<br />

−<br />

mikroskopie ve světelném poli (zobrazený objekt má tmavý obrys a nalézá se ve světelném<br />

zorném poli). Tato metoda je základní a užívá se nejběžněji.<br />

mikroskopie v temném poli (světlý objekt je v černém - temném poli). Užívá se pro zvláštní<br />

případy.<br />

SLOŽENÍ SVĚTELNÉHO MIKROSKOPU (obr.48)<br />

Mechanické díly: stativ, noha stativu, šroub pro hrubé a jemné zaostření, stolek<br />

mikroskopu, vodič preparátu, revolverový měnič objektivů, objímka pro kondenzor, objímka pro<br />

filtr. U starých mikroskopů úchytka pro zrcátko, pružinky pro přidržení preparátu.<br />

Optické díly: objektivy, okuláry, kondenzor s aperturní irisovou clonou. U starých<br />

mikroskopů zrcátko.<br />

Osvětlovací zařízení: lampa v noze stativu s kolektorovou čočkou. Staré mikroskopy<br />

samostatnou mikroskopickou lampu.<br />

Clony: pod kondenzorem aperturní irisová clona, dále polní clona.<br />

Objektiv je základní optický prvek mikroskopu (obr. 49). Vytváří zvětšený převrácený<br />

obraz předmětu v horní ohniskové rovině objektu. Tento obraz zvětšuje okulár. Zvětšený obraz je<br />

registrován oční sítnicí nebo fotografickým filmem.<br />

ČÍSELNÁ APERTURA<br />

Rozlišovací schopnost objektivu je vyjádřena jeho číselnou (numerickou) aperturou A<br />

(apertura = lat. otvor):<br />

A = n . sin ω<br />

kde n = index lomu prostředí mezi objektivem a preparátem (pro vzduch je n = 1, pro imerzní olej<br />

a sklo n = 1,5), ω je poloviční otvorový úhel. Je to polovina úhlu ω, který svírají protilehlé krajní<br />

paprsky vycházející z předmětového bodu (P) na optické ose mikroskopu a vstupující ještě do<br />

objektivu (O). Předmětovým bodem rozumíme kterýkoliv bod či strukturu mikroskopického<br />

objektu (obr. 50).<br />

Číselná apertura objektivu má velký praktický význam:<br />

−<br />

−<br />

Určuje rozlišovací schopnosti a hranice užitečného zvětšení.<br />

Ovlivňuje světelnost mikroskopického obrazu: světelnost obrazu je přímo úměrná čtverci A a<br />

nepřímo zvětšení objektivu<br />

95

−<br />

Ovlivňuje hloubku ostrosti. Snížením A objektivu se zvětšuje tloušťka zobrazené vrstvy<br />

preparátu. Objektivy s velkou hodnotou A mají malou penetrační (pronikací) schopnost,<br />

zobrazují velmi tenkou vrstvičku. Pro svůj zásadní význam je údaj A uveden na každém<br />

objektivu vedle údaje zvětšení.<br />

Obrázek 48: Binokulární mikroskop.<br />

Složení mikroskopu<br />

port pro kameru<br />

rtuťová výbojka<br />

okuláry<br />

trinokulární<br />

hlavice<br />

nosič „flourescenčních<br />

kostek“<br />

nosič objektivů - revolver<br />

objektivy<br />

stolek<br />

kondensor<br />

aperturní clona<br />

Halogenová žárovka pro<br />

pozorování v<br />

procházejícím světle<br />

polní clona<br />

kolektor osvětlovače<br />

LBD filtr<br />

ND filtr<br />

Obrázek 49: Objektivy.<br />

96

okulár<br />

mechanická<br />

tubusová<br />

délka<br />

objektiv<br />

objekt<br />

kondenzor<br />

aperturní clona<br />

polní clona<br />

Parfokalita objektivů<br />

Barevný proužek<br />

- zvětšení<br />

Optická<br />

korekce<br />

Mechanická tubusová<br />

délka<br />

stolek<br />

preparát<br />

Zvětšení<br />

N.A.<br />

Tloušťka<br />

krycího<br />

skla<br />

Pracovní<br />

vzdálenost<br />

Obrázek 50: Číselná apertura (A) objektivu závisí na velikosti otvorového úhlu (2 ω) a na indexu<br />

lomu (n) media mezi objektem (P) v preparátu (pr) a čelní čočkou objektivu (O). Paprsky<br />

vystupující z bodu P pod úhlem větším než 2 ω by se do objektivu nedostaly.<br />

Poznatky pro subjektivní mikroskopii lze souhrnně vyjádřit pojmem rozlišivost mikroskopu<br />

(d m ). Veličina d m informuje o tom, jaké nejmenší rozměry musí mít předmět, abychom jej při<br />

určitém celkovém zvětšení mikroskopu dobře rozlišili svýma očima. Vypočítá se podle vzorce:<br />

327 µm<br />

d m = -------------<br />

M<br />

kde d m je minimální velikost předmětu v µm, 327 µm je vzdálenost dvou bodů, které průměrně<br />

unavené oko rozliší jako dva body ze vzdálenost 250 mm, M je celkové zvětšení mikroskopu. M =<br />

97

M objektivu x M okuláru x zvětšovací koeficient tubusu, který se rovná jedné při dodržení<br />

předepsané tubusové délky mikroskopu. Při subjektivním mikroskopování volíme celkové zvětšení<br />

tak, aby hodnota rozlišivosti (d m ) odpovídala velikosti objektu.<br />

NEJZÁKLADNĚJŠÍ PRAVIDLA MIKROSKOPOVÁNÍ<br />

−<br />

−<br />

−<br />

−<br />

−<br />

−<br />

−<br />

−<br />

−<br />

−<br />

Do optické osy mikroskopu nastavíme objektiv o menším zvětšení (4x nebo 10x).<br />

Osvětlíme zorné pole a upravíme rozestup okulárů.<br />

Zkontrolujeme čistotu optiky.<br />

Položíme na stolek preparát a upevníme ho, vyhledáme a zaostříme obraz objektu.<br />

Začátečníkům doporučujeme postupovat tak, aby se dívali ze strany na vrchol objektivu a<br />

takto, pod kontrolou zraku, jej spouštěli makrometrem až do těsné blízkosti povrchu<br />

preparátu. Teprve potom je možno sledovat zorné pole okulárem a současně zvedat tubus až<br />

do okamžiku, kdy se objeví nejostřejší obraz.<br />

Ověříme, zdali vidíme oběma očima (okuláry) stejně dobře.<br />

Makrometrickým šroubem zachycený obraz doostřujeme mikrometrem.<br />

Pohybujeme preparátem a pátráme po nejvhodnějším místě pro pozorování. Toto místo<br />

posuneme doprostřed zorného pole.<br />

Pro vlastní mikroskopování vyměníme objektiv podle potřeby za jiný a zkontrolujeme<br />

nastavení vhodné apertury. K zaostření pak již stačí mikrometrický šroub.<br />

Po nastavení potřebného zvětšení upravíme vhodně intenzitu světla a kontrast ovládáním<br />

clony, případně kondenzoru.<br />

Při vlastním studiu preparátů jemně pohybujeme mikrometrickým šroubem a tak zaostřujeme<br />

různé roviny v preparátu. Pravou rukou můžeme kreslit.<br />

Formy zobrazení mikroskopických objektů jsou v podstatě čtyři: kresba, mikrofotografie,<br />

mikrokinemetografický záznam a videozáznam. Kterákoliv z uvedených forem může být<br />

v černobílém nebo barevném provedení.<br />

ÚDRŽBA MIKROSKOPU<br />

Čistění optických částí se provádí vatovými tampónky nebo papírky na optiku stíráním ze<br />

středu směrem na periferii nebo ze středu po spirále. Lze použít komerčně prodávané prostředky<br />

na čistění optiky nebo směs isopropylalkohol + destilovaná voda (1:1) + kapka 1% roztoku SDS.<br />

Čistící směs se nesmí nikdy aplikovat přímo na optiku, ale pouze zvlhčit čistící materiál. Nikdy<br />

nepoužívejte korosivní látky a rozpouštědla. Prach se odstraňuje ofukováním balónkem.<br />

Z mechanických částí se prach odstraňuje jemným štětečkem.<br />

MIKROSKOPICKÝ PREPARÁT A OBJEKT<br />

Mikroskopický preparát se skládá z podložního skla a krycího skla, mezi skly je medium a<br />

v něm je uložen objekt. Preparát bereme zásadně za hrany. Preparáty typu krevního nátěru se<br />

mohou pozorovat bez krycího skla. Dobře připravený preparát je předpokladem dobrého<br />

zobrazení objektu.<br />

Mikroskopické preparáty dělíme na:<br />

−<br />

−<br />

čerstvé – dočasné (nativní)<br />

trvalé (pracuje se s materiálem usmrceným, fixovaným, konzervovaným)<br />

98

Čerstvé preparáty umožňují pozorovat pohyb a činnost celých buněk nebo organel.<br />

Nevýhodou je omezený výběr materiálu a časové omezení. K přípravě čerstvých preparátů jsou<br />

vhodné izolované buňky, části tkání a drobnohlední živočichové. Preparáty prohlížíme ve vodě<br />

nebo ve fyziologickém roztoku. Fyziologická media jsou:<br />

−<br />

−<br />

přirozená – krevní sérum, amiová tekutina<br />

umělá – fyziologický roztok, Ringerův roztok aj.<br />

U čerstvých preparátů používáme často vitální barvení. Rozlišujeme:<br />

−<br />

−<br />

−<br />

intravitální barvení – barvení živých, zcela neporušených buněk (př. prvoci)<br />

supravitální barvení – barvení přežívajících buněk vyňatých z těla<br />

postvitální barvení – barvení odumírajících buněk<br />

Příprava čerstvého preparátu. Do středu podložního sklíčka přeneseme kapátkem kapku<br />

vody nebo jiného media, do ní štětečkem, preparační jehlou nebo pinzetou vložíme připravený<br />

vzorek. Byla-li kapka malá proniká vzduch pod krycí sklíčko, odstraníme ho přikápnutím vody<br />

(media) těsně k okraji krycího sklíčka. Naopak, je-li vody pod krycím sklíčkem více a objekt se<br />

pohybuje, musíme přebytečnou vodu odsát filtračním papírem. Dostane-li se voda na svrchní<br />

stranu krycího sklíčka je nutné zhotovit nový preparát.<br />

Krycí sklíčko pokládáme vždy nejdříve šikmo na hranu a pak zvolna spouštíme na objekt.<br />

Trvalý preparát je uzavřen do tzv. uzavíracího média, kterým je nejčastěji kanadský<br />

balzám. Před uzavřením se musí preparát odvodnit a to řadou alkoholů o vzestupné koncentraci.<br />

Trvalé preparáty umožňují nejen lépe rozlišit jednotlivé struktury, ale především slouží jako<br />

dokladový nebo demonstrační materiál.<br />

K přípravě tenkých řezů používáme speciálních mikrotomů (obr. 51). Nejjednodušší ruční<br />

mikrotom je tvořen dutým válcem na horním konci opatřeným černým hladkým stolkem, na<br />

spodním otáčivou hlavicí mikrometrického šroubu, který ve svislém směru pohybuje svorkou<br />

umístěnou uvnitř válce. Do ní se pomocí bočního šroubu upevní v bezové duši objekt, který se<br />

řeže. Objekty se řežou břitvou. Mokrým štětečkem přenášíme řezy do vody (media).<br />

Obrázek 51: Typy mikrotomů.<br />

Ř ezání objektů :<br />

–volnou rukou<br />

–s pomocí ruč ního mikrotomu<br />

–strojním mikrotomem<br />

– rotač ní<br />

– sáň kové<br />

– konzolové<br />

99

ÚKOL č. 25: Mikrosublimace kofeinu<br />

Hmota má schopnost přecházet ze skupenství pevného do kapalného či plynného a naopak.<br />

Přechod ze stavu pevného do stavu plynného se nazývá sublimací. Této vlastnosti, kterou má<br />

mnoho organických látek nacházejících se v léčivých rostlinách, se využívá ve farmakologických<br />

laboratořích. Se sublimátem lze provádět řadu mikroreakcí.<br />

Farmakologicky je zajímavý metylovaný xantin kofein - 1,3,7-trimethyl xantin, který je<br />

obsažen v kávě i čaji. Kofein je jedním z důležitých léčiv, ovlivňujících krevní oběh.<br />

Kofein lze prokázat tzv. murexidovou reakcí. Jedná se o barevný test na kyselinu močovou<br />

a jiné puriny. Pevný vzorek je oxidován v kyselém prostředí, odpařen a následně po přídavku<br />

amonných iontů vzniká purpurové zbarvení náležející vznikajícímu murexidu (amonná sůl 5, 5´nitrildibarbiturová<br />

kyselina).<br />

kofein<br />

murexid<br />

C H 3<br />

O<br />

O CH 3<br />

N<br />

N<br />

N N<br />

CH 3<br />

O<br />

HN<br />

ONH 4<br />

O<br />

N<br />

H<br />

N<br />

O<br />

O<br />

N<br />

H<br />

NH<br />

O<br />

MATERIÁL<br />

3x hodinové sklíčko o průměru asi 8-10 cm, filtrační papír, stojan, azbestová síťka, lihový vařič,<br />

podložní sklíčka, kapátka, mikroskop, 3 % roztok H 2 O 2, koncentrovanou HCl, čpavek.<br />

POSTUP<br />

Práškový čaj (asi na špičku nože) položte do středu hodinového sklíčka (můžete použít i<br />

kofein izolovaný v lab. cvičení č. 4), přikryjte druhým, na jehož vrcholu je asi 3 x 3 cm velký<br />

navlhčený kus filtračního papíru určeného ke chlazení. Přes azbestovou síťku zahřívejte sklíčko<br />

asi 2 minuty. Horní sklo je možné vyměnit za chladné. Na spodní straně hodinového skla se vytvoří<br />

jehličky kofeinu, které budete pozorovat pomocí mikroskopu. Poté proveďte tzv. murexidovou<br />

reakci k prokázání přítomnosti kofeinu. Kontrolní reakci proveďte rovněž s firemním preparátem<br />

kofeinu. Na hodinové sklo se sublimátem a na sklo s firemním kofeinem kápněte 3 % roztok H 2 O 2<br />

a koncentrovanou HCl. Roztok odpařte a přikápněte roztok čpavku. Purpurové zbarvení vám<br />

prokáže přítomnost kofeinu.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Popište tvar a barvu vysublimovaných krystalů kofeinu. Krystaly zakreslete do protokolu.<br />

Uveďte zda reakce na přítomnost kofeinu byly pozitivní.<br />

ÚKOL č. 26: Stavba rostlinné buňky z pokožky cibule, plasmolýza, deplasmolýza,<br />

plazmoptýza<br />

MATERIÁL<br />

Cibule se zbarvenými suknicemi (v buněčné šťávě obsahují antokyan), žiletka, pinzeta, podložní a<br />

krycí sklo, mikroskop, kapátka, 1 M roztok sacharózy, mikroskop.<br />

POSTUP<br />

100

Nařežte si několik čtverečků pokožky (asi 5 x 5 mm) přímo na suknici tak, že ostrou<br />

žiletkou provedete nehluboké zářezy. Pinzetou snadno sloupnete vyříznuté čtverečky pokožky,<br />

které rychle přenesete na podložní sklo do kapky vody nebo do kapky roztoku sacharózy.<br />

Pozorovaný objekt překryjte opatrně krycím sklíčkem. Po ukončení pozorování tkáně v roztoku<br />

sacharózy přikápněte na jednu stranu krycího sklíčka kapku vody a k druhé straně přiložte<br />

proužek filtračního papíru, který vysaje z prostoru pod krycím sklem roztok sacharózy. Tento<br />

úkon zopakujte několikrát do úplného odstranění sacharózy z prostředí okolo pozorované tkáně a<br />

jejím nahrazení vodou.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Popište a zakreslete tvar buněk pokožky cibule ve vodném prostředí. Buňky jsou v jednom<br />

směru protáhlé, mají velkou centrální vakuolu. Buněčná stěna je stejnoměrná silná a mezibuněčné<br />

prostory nejsou vyvinuty, což souvisí s krycí funkcí pokožkových buněk. Jádro se nachází při<br />

buněčné stěně a je bochníkovitého tvaru.<br />

Zakreslete a popište vliv roztoku sacharózy na pokožkové buňky. V prostředí sacharózy<br />

dochází k plasmolýze, která je způsobena tím, že buňky se nacházejí v hypertonickém prostředí a<br />

voda z vakuol je odsávána. Vakuola se zmenšuje a cytoplasma se odchlipuje od buněčné stěny. Po<br />

přidání destilované vody dochází k deplasmolýze, buňka se nachází v hypotonickém prostředí.<br />

Voda vniká do vakuoly, která se zvětšuje a cytoplasma se dostává do původní polohy. Po déle<br />

trvajícím pozorování mohou buňky praskat a červenofialový obsah vytéká do okolní vody. Vlivem<br />

velkého osmotického tlaku dochází k prasknutí cytoplazmatické membrány i buněčné stěny.<br />

ÚKOL č. 27: Histochemická reakce na vápník<br />

MATERIÁL<br />

Suchá suknice cibule, kádinka, 96% etanol, mikroskop, podložní a krycí sklo, žiletka, pinzeta,<br />

kapátko, 5% roztok šťavelanu amonného v 10% kyselině octové, 3% kyselina sírová.<br />

POSTUP<br />

Na malé kousky nařezanou suknici cibule vložte do 96 % etanolu (připraví vedoucí cvičení).<br />

Asi po 12 hodinách vložte preparát do vody a pozorujte pod mikroskopem, zda-li jsou přítomny<br />

nějaké krystaly. Poté vodu vysajte filtračním papírkem a Pasterovou pipetou opatrně z druhé<br />

strany krycího sklíčka přidávejte roztok kyseliny sírové. Za malou chvíli se vyloučí krystalky<br />

síranu vápenatého. Na podložní sklíčko kápněte roztok šťavelanu amonného v kyselině octové a do<br />

něj umístěte několik kousků suknice, přikryjte krycím sklem a pozorujte vyloučené krystaly.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Popište a zakreslete krystaly šťavelanu vápenatého a síranu vápenatého. Krystaly šťavelanu<br />

vápenatého se rychle v prostředí kyseliny sírové rozpouští a na různých místech preparátu se<br />

tvoří krystaly síranu vápenatého. Napište rovnici charakterizující tuto reakci. Jaký typ krystalů<br />

jste našli v preparátu ve vodném prostředí?<br />

ÚKOL č. 28: Histochemická reakce na lignin<br />

Lignifikace je proces, při kterém se do celulózní kostry buněčné stěny ukládá lignin.<br />

K nejznámnějším histochemickým reakcím, které umožňují identifikovat lignin, patří reakce<br />

s floroglucinolem a reakce se síranem anilínu. Tyto reakce nejsou pro lignin specifické, nýbrž jsou<br />

reakcemi uvedených činidel s koniferylaldehydem a jinými příbuznými látkami, které jsou<br />

stavebními kameny ligninu.<br />

101

MATERIÁL<br />

Stonek semenáčků hrachu, kukuřice či fazolu, mikroskop, podložní a krycí sklo, pinzeta, kapátko,<br />

štěteček, ruční mikrotom, žiletky, bezová duše, floroglucinolové činidlo (1g rozpustíme v 50 mL<br />

ethanolu), 75% roztok glycerolu v 10% kyselině sírové, 25% HCl.<br />

POSTUP<br />

Uřízněte asi 3 cm špalíček bezové duše a rozřízněte ho napůl. Rukojetí špachtle do jeho<br />

středu udělejte oboustranně žlábek. Do žlábku vložte 3 cm část stonku (segment) a bezovou duši<br />

se segmentem upněte do ručního mikrotomu. Žiletkou mikrotomu připravte co nejtenčí příčné<br />

řezy, které vložíte do vody. Po ukončení přípravy preparátu přeneste štětečkem jednotlivé řezy<br />

do několika kapek floroglucinolu v Petriho misce. K řezům v misce přikápněte 1 kapku 25% HCl.<br />

Asi po 2-5 minutách přeneste vybarvené řezy do roztoku glycerolu v kyselině sírové na podložním<br />

skle, překryjte krycím sklíčkem a pozorujte mikroskopem. Pro kontrolu si nechejte několik řezu<br />

jen ve vodě a porovnejte s nabarvenými řezy.<br />

VYHODNOCENÍ<br />

Zdřevnatělé buněčné stěny obsahující lignin se na řezu zbarví červeně až červenofialově.<br />

Popište a zakreslete svá pozorování. Pomocí anatomického atlasu nebo jiné literatury pojmenujte<br />

buňky, u kterých byla prokázána přítomnost ligninu.<br />

Doporučená literatura:<br />

Nováček, F.: Praktikum z rostlinné cytologie a histologie se základy mikroskopické techniky,<br />

Vydavatelství UP Olomouc, 1982.<br />

Knoz, J. a Opravilová, V.: Základy mikroskopické techniky, Vydavatelství MU Brno 1992.<br />

Ruzin, S. E.: Plant microtechnique and microscopy, Oxford University Press, 1999.<br />

102

Laboratorní cvičení č. 13<br />

PRÁCE S MIKROORGANISMY VE STERILNÍM PROSTŘEDÍ, IZOLACE BAKTERIÁLNÍ DNA<br />

A AGAROSOVÁ ELEKTROFORESA DNA<br />

V současné době se moderní biochemický výzkum neobejde bez základních znalostí<br />

molekulární biologie a metod používaných pro práci s mikroorganismy a rekombinantní DNA.<br />

Pojmem rekombinantní DNA rozumíme takovou molekulu DNA, která se nevyskytuje v přírodě<br />

přirozeně, ale vznikla zásahem člověka, který její primární strukturu (pořadí<br />

deoxyribonukleotidů) upravil tak, aby měla vlastnosti, kterých se dá využít ve výzkumu či při<br />

průmyslových výrobách. Rekombinantní DNA se nejčastěji využívá v genovém inženýrství, kde<br />

např. vhodným zásahem do promotorových sekvencí genů můžeme mnohonásobně zvýšit expresi<br />

genu v umělém expresním systému (baktérie, kvasinka) a získat tak velké množství<br />

rekombinantního proteinu, které nelze získat standardními postupy izolace z rostlinného pletiva<br />

či živočišné tkáně. V současné době je takto vyráběna řada proteinů (umělé hormony, doplňky<br />

výživy atd.). V biochemickém výzkumu si lze molekulárně-biologickými postupy usnadnit práci<br />

např. rekombinantní expresí málo abundantního proteinu (enzymu), který je možné následně<br />

použít k imunizaci a přípravě protilátek proti tomuto proteinu. Nebo pomocí cílených mutací<br />

primární aminokyselinové struktury proteinů můžeme následně sledovat a určovat aminokyselinová<br />

residua, která mají esenciální vliv na funkci proteinu.<br />

Elektroforesa, neboli migrace iontů v elektrickém poli, se velmi často používá pro analytické<br />

dělení biologických látek, hlavně pak proteinů a nukleových kyselin. Elektroforesa většinou<br />

probíhá na vhodném nosiči jako je papír, celulosa nebo polymerní gel.<br />

Papírová elektroforesa<br />

Při papírové elektroforese se vzorek ve formě tečky nanese na pruh filtračního papíru,<br />

jehož konce se namočí do vhodných pufrů (elektrolyt). Po zapojení stejnosměrného proudu putují<br />

ionty vzorku určitou rychlostí (která je závislá na charakteru iontu např. na jeho velikosti)<br />

k opačně nabitým elektrodám. Po určité době působení proudu vznikají zóny odpovídající<br />

jednotlivým složkám vzorku (bandy – proužky), které se vhodnou analytickou reakcí detekují.<br />

Gelová elektroforesa<br />

Gelová elektroforesa patří mezi<br />

nejpraktičtější a nejvýkonnější metody<br />

používané pro dělení makrokolekul. U běžně<br />

používaných gelů, jako je agarosa nebo<br />

polyakrylamid, je možné ovlivnit velikost<br />

jejích pórů a tím dosáhnout nejen dělení na<br />

základě pohyblivosti v elektrickém poli, ale i<br />

na základě velikosti molekuly. Při gelové<br />

elektroforese se velké molekuly oproti<br />

malým zpožďují, protože na rozdíl od gelové<br />

filtrace (chromatografie) neexistuje při<br />

elektroforese kolem gelu prostor pro volné<br />

rozpouštědlo. Gel je umístěn přímo<br />

v elektrickém přístroji a pohyb velkých<br />

molekul je proti pohybu malých molekul<br />

zpomalen tím, že obtížněji pronikají gelem. Obrázek 52: Komůrka pro vertikální<br />

elektroforesu v polyakrylamidovém gelu.<br />

103

Při polyakrylamidové gelové elektroforese (PAGE) je gel vytvořen polymerací akrylamidu a<br />

N,N´-methylenbisakrylamidu. Gel bývá často připraven ve formě tenké obdélníkové vrstvy, ve<br />

které je možno současně analyzovat několik různých vzorků (viz obr. 52). V případě dělení<br />

proteinů bývá pH gelu kolem 9, aby molekuly měly záporný náboj a pohybovaly se k anodě<br />

umístěné ve spodní nádržce. Každý vzorek se rozpustí v minimálním množství relativně hustého<br />

roztoku (nanášecí pufr obsahující glycerol), aby se zabránilo smíchání vzorku s pufrem v horní<br />

nádržce a nanese se na povrch gelu do předem vytvořené jamky. Při napětí asi 300 V prochází<br />

gelem stejnosměrný proud po dobu nutnou k rozdělení makromolekul do řady jednotlivých<br />

proužků. Gel se poté z přístroje vyjme a jednotlivé zóny se vhodně detekují. Nejčastějším typem<br />

PAGE je elektroforesa v prostředí detergentu dodecylsulfátu sodného tzv. SDS-PAGE. SDS<br />

denaturuje proteiny tím, že se na ně pevně váže a mění jejich terciální strukturu do válcovité<br />

podoby. Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru a získává silný záporný náboj, tzn., že<br />

proteiny pokryté SDS mají shodné poměry počtu nábojů na jednotku hmoty a podobný tvar.<br />

Následkem toho se proteiny při elektroforese v prostředí SDS dělí pouze na základě své<br />

molekulové hmotnosti. Vhodně zvolenou koncentrací akrylamidu v gelu lze pak dosáhnout optimální<br />

dělení proteinů o určité velikosti s odchylkou do 5%. Nejčastěji používané koncentrace<br />

akrylamidu jsou mezi 8-12%.<br />

Druhým nejčastějším typem gelové elektroforesy je agarosová elektroforesa, která se<br />

používá hlavně na dělení látek s velkou molekulovou hmotností (DNA, RNA). Aby byla zajištěná<br />

dostatečná pohyblivost takto velkých molekul, musela by se použít velmi nízká koncentrace<br />

akrylamidu (pod 3%) a gel by byl velice měkký a manipulace s ním komplikovaná. Agarosové gely<br />

jsou i v nízkých koncentracích velmi pevné a koncentrace agarosy v nich je závislá na velikosti<br />

dělených nukleových kyselin, od 3% pro fragmenty DNA a RNA mající desítky až stovky párů bází<br />

po 0.8% pro fragmenty velikostí tisíců až desetitisíců párů nukleotidových bází. Chemicky je<br />

agarosa polysacharid skládající se ze D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy, který se izoluje<br />

z červených řas – ruduch. Nejčastější uspořádaní agarosové elektroforesy je horizontální (obr.<br />

53 a 55), přičemž princip dělení je na rozdíl od proteinů vždy závislý pouze na velikosti nukleové<br />

kyseliny, která je sama o sobě negativně nabitá a pohybuje se proto směrem od katody k anodě.<br />

DNA však není v agarosovém ani polyakrylamidovém gelu možno vidět. Je proto nutné ji nějakým<br />

způsobem obarvit nebo označit. Nejpoužívanějším barvivem pro DNA jsou planární aromatické<br />

kationty, jako je např. ethidium nebo akridinová oranž, které se interkalují (vmezeří) do<br />

struktury dvoušroubovice a po ozáření UV světlem následně fluoreskují. Proteiny se nejčastěji po<br />

elektroforetickém dělení detekují na gelu pomocí barviva Coomassie brilliant blue nebo citlivější<br />

metodou založené na redukci stříbra.<br />

Obrázek 53: Schéma nanášení<br />

vzorků a princip agarosové<br />

elektroforesy: 1. ztuhlý agarosový<br />

gel, 2. nanesení standardu<br />

molekulových hmotností, 3. nanesení<br />

vzorků, 4. zapojení stejnosměrného<br />

proudu, 5. průběh elektroforesy, 6.<br />

ukončení elektroforesy.<br />

104

Kapilární elektroforesa<br />

Třebaže jsou různé formy elektroforesy v gelech snadné a lehce dostupné, obvykle<br />

probíhají několik hodin a je nesnadné je automatizovat a také kvantitativně vyhodnocovat<br />

výsledky. Tyto nedostatky lze obejít použitím kapilární elektroforesy, při níž se vzorky<br />

makromolekul dělí ve velmi tenkých kapilárách (průměr 1 až 10 µm) zhotovených z křemene, skla<br />

nebo plastu. Tyto tenké kapiláry rychle odvádějí teplo, takže mohou být použita elektrická pole<br />

s vysokým napětím (obvykle 100 – 300 V na cm), což je asi stokrát více než v případě<br />

standardních horizontálních nebo vertikálních elektrofores čas analýzyse tak sníží na několik<br />

minut. Rychlé rozdělení také zamezuje difusnímu rozostření proužků. Kapiláry bývají plněny pouze<br />

pufrem nebo velice málo koncentrovaným SDS-polyakrylamidovým gelem. Metody kapilární<br />

elektroforesy mají velmi vysoký stupeň rozlišení a často bývají zcela automatizovány pro rychlé<br />

analýzy velkého počtu vzorků. V současnosti má kapilární elektroforesa největší využití při<br />

sekvencování nukleových kyselin (čtení pořadí jednotlivých bází v řetězci DNA), kdy je třeba<br />

mezi sebou rozlišovat fragmenty DNA lišící se ve velikosti pouze jedním nukleotidem.<br />

Práce ve sterilním prostředí<br />

Při práci s DNA a mikroorganismy se velice často setkáváme s požadavkem celkově<br />

sterilního prostředí. Znamená to, že veškerý materiál a chemikálie musí být zbaveny jakýchkoli<br />

kontaminujících mikroorganismů a ostatních nečistot. Mikroorganismy (baktérie a kvasinky) jsou<br />

nejčastěji používány k produkci rekombinantních nukleových kyselin či proteinů, kdy je množíme<br />

za specifických podmínek v tzv. živných médiích. Živná média jsou roztoky základních živin –<br />

aminokyselin, sacharidů, vitamínů atd., které umožňují rychlé množení a růst daného<br />

mikroorganismu. Pokud by se dostaly do takto připravovaných médií náhodné mikroorganismy<br />

z ovzduší, vody, či naších rukou, docházelo by také k jejich namnožení a znehodnocení<br />

experimentálního vzorku. Všechny roztoky s kterými pracujeme, je proto třeba autoklávovat, tzn.<br />

sterilizovat vodní parou za zvýšeného tlaku (120°C, 100 kPa). Autoklávovat lze i veškerý materiál<br />

zhotovený z chemického skla či porcelánu a plastové pomůcky zhotovené ze speciálního odolného<br />

plastu. Autoklávování je nejúčinnější, pokud na roztok či materiál působí pouze horká vodní pára<br />

bez vzduchu. Autoklávy jsou proto složité tlakové nádoby, ze kterých je před vlastním zahřátím<br />

vody odsán vzduch a následné natlakování je způsobeno pouze vodní parou. Odolný materiál lze<br />

také sterilizovat v horkovzdušných pecích či sušárnách (1-6 hodin při 180-200°C).<br />

Roztoky chemikálií (oligosacharidy, antibiotika atd.), u kterých hrozí za zvýšené teploty<br />

rozklad, se sterilizují speciálními membránovými filtry. V současné době se nejvíce používají<br />

nitrocelulosové filtry s různou velikostí pórů (20 – 100 µm) a průměru. Nitrocelulosové filtry jsou<br />

většinou jednorázové a roztoky se jimi filtrují buď použitím negativního (vodní či mechanická<br />

vývěva) nebo pozitivního (injekční stříkačka) tlaku. Viry procházejí většinou bakteriálních filtrů.<br />

Rychlé sterilizace lze dosáhnout také UV zářením. Optimální baktericidní účinek má záření<br />

o vlnové délce 254 nm. Malé předměty se takto sterilizují po dobu několika minut ve speciálních<br />

sterilizátorech které jsou osazeny několika UV zářiči. Celé laboratoře, větší prostory a vzduch v<br />

nich se sterilizuje germicidními lampami, které jsou vhodně rozmístěny v prostoru. Vzhledem<br />

k tomu, že účinnost UV záření lineárně klesá se čtvercem vzdálenosti od zdroje záření, pro<br />

sterilizaci větších prostorů se používá delší doby (vzhledem k tomu, že UV záření je pro živé<br />

organismy mutagenní, zapínají se germicidní lampy v laboratořích většinou přes noc, nebo po<br />

skončení práce). Nástroje, které se používají během experimentální práce opakovaně (pinzety,<br />

očkovací kličky), se sterilizují otevřeným plamenem za předchozího opláchnutí v 70% ethanolu.<br />

105

Při běžném provozu v laboratoři se však postupnému kontaminování prostředí nikdy<br />

nevyhneme. Tato kontaminace pak může negativně ovlivňovat některé experimenty citlivé na<br />

znečistění běžně se vyskytujícími bakteriemi či plísněmi. Často k takovéto kontaminaci dochází<br />

při očkování kultur pokusnými bakteriemi či kvasinkami, otevírání zásobních láhví s živnými médií,<br />

roztírání kultur na pokusné plotny či pěstování rostlin a živočišných buněk v in vitro podmínkách.<br />

Tyto operace proto většinou provádíme ve speciálních laminárních boxech (též flow boxy). Jsou<br />

to ze všech stran ohraničené pracovní plochy, ve kterých je řízené proudění vzduchu, který<br />

prochází přes speciální mechanické filtry. Tím se vzduch přítomný v okolí experimentu neustále<br />

zbavuje mikroorganismů a pevných nečistot. Laminární boxy mohou být s vertikálním či<br />

horizontálním prouděním vzduchu a k jejích běžnému vybavení patří vlastní germicidní lampa,<br />

která se zapíná vždy po skončení práce.<br />

Dá se říci, že efektivita práce v molekulárně-biologické laboratoři velmi závisí na<br />

dodržování základních návyků pro práci ve sterilních podmínkách. Je tedy nutné využívat všech<br />

dostupných prostředků jak zabránit nechtěné kontaminaci. Udržovat čistotu a pořádek, pro úklid<br />

využívat jednorázové papírové ubrousky, používat desinfekci na ruce nebo jednorázové<br />

vyšetřovací rukavice, při sebemenším podezření na kontaminaci, roztok či materiál zlikvidovat či<br />

znova sterilizovat, většinu manipulace s mikroorganismy směřovat do laminárních boxů, v rámci<br />

možností používat jednorázový materiál, používat germicidních zářičů po skončení práce.<br />

Izolace nukleových kyselin<br />

Pro izolaci nukleových kyselin z živých organismů byla vyvinuta řada metod, které se od<br />

sebe mohou dosti odlišovat. Pro stručnost tohoto textu budou popsány dvě základní. Prvním<br />

krokem u všech metod je vždy lýze buněk, nebo pevné tkáně. U buněk většinou stačí rozrušit<br />

buněčnou stěnu a membrány, nejčastěji se používají detergenty jako je dodecylsulfát sodný<br />

(SDS) nebo Triton X-100. Pro izolaci DNA nebo RNA z rostlinných pletiv nebo živočišných tkání<br />

je třeba nejdříve mechanického narušení, to provádíme buď mrazem – tekutým dusíkem nebo<br />

různými typy homogenizátorů. Buněčný obsah včetně DNA se z lyzovaných buněk uvolní do<br />

extrakčního pufru, který vždy musí obsahovat chelatační činidlo etylendiaminotetraoctovou<br />

kyselinu (EDTA), která vychytá veškeré vápenaté ionty z extraktu. Vápenaté ionty fungují jako<br />

kofaktory nukleas, enzymů které štěpí nukleové kyseliny, a pokud by tyto enzymy byly během<br />

extrakce aktivní, naštěpily by nám veškeré izolované nukleové kyseliny. Do extrakčního pufru se<br />

někdy přidávají navíc ještě proteinázy, enzymy štěpící proteiny. Většina DNA je totiž obalená<br />

histony a jejich odstranění proteinasou zvýší čistotu izolované DNA.<br />

Jeden typ metod je založen na extrakci směsi fenolu a chloroformu. Fenol se rozpouští ve<br />

vodě i v chloroformu, preferuje ale chloroform. Chloroform se jako organické rozpouštědlo<br />

s vodou nemísí. Přidáme-li tedy směs fenolu a chloroformu k extraktu ze živé tkáně, veškeré tuky<br />

přecházejí do chloroformu, bílkoviny a část polysacharidů se působením organických rozpouštědel<br />

vysráží a nukleové kyseliny zůstanou ve vodné fázi. Po intenzivní extrakci se směs zcentrifuguje a<br />

vzniklé fáze od sebe oddělí. Vysrážené proteiny a sacharidy vytvoří na rozhraní bílou<br />

prstencovitou sraženinu. Pro dokonalé odstranění polysacharidů se někdy používá činidlo<br />

cetyltrimethylamonium bromid (CTAB). Pro vysrážení nukleových kyselin z vodné fáze nakonec<br />

použijeme dvou a půl násobek objemu absolutního etanolu nebo isopropanol s přídavkem soli. Po<br />

intenzivní centrifugaci nám pak nukleová kyselina vytvoří ve zkumavce opaleskující pelet, který<br />

ještě několikrát promyjeme etanolem a nakonec rozpustíme ve vodě nebo vhodném pufru.<br />

Novější metody využívají adsorpce nukleových kyselin na sklo v přítomnosti chaotropních<br />

solí, jako je třeba guanidin thiokyanát. Extrakt nukleových kyselin se smíchá se silikátovými<br />

kuličkami v přítomnosti chaotropní soli. Nukleové kyseliny se naváží na kuličky a ty se pak<br />

106

promývají, tím se zbavujeme nečistot. Nakonec se nukleové kyseliny z kuliček uvolní snížením<br />

iontové síly roztoku. Tato metoda je velice rychlá a efektivní a využívá se ve většině komerčních<br />

sestavách např. v diagnostických laboratořích v nemocnicích.<br />

V bakteriálních buňkách bývá část genetické informace kromě vlastní chromosomální DNA<br />

uložená také v plasmidech. Plasmidy jsou krátké kruhovité úseky DNA nesoucí genetickou<br />

informaci, která není esenciální pro život baktérie, např. geny pro rezistenci k různým typům<br />

antibiotik. Uměle vytvořené plasmidy slouží v molekulární biologii pro různé klonovací a expresní<br />

techniky. Plasmidy z bakteriální kultury nejčastěji izolujeme tzv. alkalickou metodou. Tato<br />

metoda je založena na faktu, že většina chromosomální DNA, bakteriálních proteinů a SDS<br />

precipituje při neutralizaci silně alkalického roztoku pomocí octanu draselného, kdežto<br />

plasmidová DNA zůstává v roztoku. Precipitát odstraníme centrifugací a plasmidovou DNA ze<br />

supernatantu vysrážíme etanolem. Pokud je požadována plasmidová DNA velmi vysoké čistoty, lze<br />

pokračovat po odstranění chromozomální DNA a proteinů preparační centrifugací v gradientu<br />

chloridu cesného. Další možností je precipitace polyetylenglykolem. Izolovanou DNA lze pak<br />

skladovat po dobu několika týdnů v lehce zásaditém pufru o malé iontové síle v lednici, nebo<br />

dlouhodobě zamraženou na -70°C.<br />

Koncentraci izolované DNA nejčastěji měříme pomocí spektrofotometru. Nukleové<br />

kyseliny absorbují nejintenzivněji světlo o vlnové délce 260 nm, takže hodnota absorbance je<br />

přímo úměrná koncentraci DNA. Míru kontaminace proteiny pak můžeme určit z poměru<br />

absorbancí při 260 nm a 280 nm, kde mají absorpční maximum proteiny. Pokud se tento poměr<br />

pohybuje kolem hodnoty 1.8, je izolovaná DNA relativně čistá. Koncentraci DNA pak lze<br />

zjednodušeně vypočítat dle vztahu c DNA = A 260 /0.02 za podmínky, že jsme předem ze vzorku<br />

odstranili specificky RNA, která má stejné absorpční maximum. Daleko citlivější stanovení<br />

koncentrace DNA je pomocí fluorimetrie, kdy měříme fluorescenci DNA po smísení se<br />

specifickým interkalačním barvivem.<br />

ÚKOL č.29: Příprava agarových ploten<br />

Mikroorganismy můžeme v laboratoři pěstovat buď na pevném kultivačním médiu nebo<br />

v kapalném médiu. Oba typy médií musí být sterilní a jejich složení musí vyhovovat požadavkům<br />

mikroorganismu na výživu svým pH a osmotickými poměry, musí obsahovat vhodný zdroj dusíku a<br />

uhlíku a případně další látky esenciální pro růst mikroorganismu. Hlavní složky kultivačních médií<br />

jsou získávány po kyselé nebo enzymatické hydrolýze kaseinu, fermentativní hydrolýze masa<br />

(masový výtažek), autolýzou nebo hydrolýzou pekařského droždí (extrakt z kvasinek), působením<br />

žaludečních šťáv na rostlinné a živočišné bílkoviny (pepton). Do pevných kultivačních médií<br />

přidáváme 1-3% agar, který po autoklavování a ochlazení ztuhne.<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE:<br />

Erlenmayerova baňka z připraveným ztuhlým sterilním LB agarem (složení na 100 mL: 1g<br />

bakteriálního tryptonu, 0.5 g kvasničného autolysátu, 0.5 g NaCl, 1.5 g agaru, pH 7.0), sterilní<br />

Petriho misky, flow box, kahan, mikrovlnná trouba, ampicilin 100 mg/mL sterilizováno přes filtr.<br />

POSTUP:<br />

V mikrovlnné troubě rozpustíme ztuhlý agar v Erlenmayerově baňce a necháme ochladit<br />

zhruba na 50-60 ºC. V zapnutém flow boxu si nachystáme čtyři sterilní Petriho misky. Do dvou<br />

misek sterilně nalijeme zhruba po 25 mL LB agaru. Do zbylých 50 mL agaru napipetujeme<br />

107

ampicilin ze zásobního roztoku tak, aby jeho finální koncentrace byla 100 mg na litr. Zamícháme<br />

krouživým pohybem ruky a rozlijeme do zbylých dvou misek. Při manipulaci s Erlenmayerovou<br />

baňkou vždy opálíme její ústí nad kahanem. Po rozlití agaru do všech misek je necháme stát<br />

v zadní části flow boxu s mírně pootevřeným víkem, aby odvětrala kondenzovaná voda. Víka každé<br />

Petriho misky řádně popíšeme.<br />

ÚKOL č. 30: Kultivace mikroorganismů na agarových plotnách<br />

Prvním krokem každé kultivace (pomnožování) mikroorganismů je jejich přenesení z<br />

uchovávacího média nebo přímo z odebraného vzorku do čerstvého živného prostředí, tomuto<br />

přenesení říkáme očkování. Provádí se různými metodami, vždy je nezbytné zachovat všechna<br />

pravidla sterilní práce tak, aby se do čerstvého média dostal pouze sledovaný mikroorganismus,<br />

nikoliv kontaminace ze vzduchu, rukou, dýchacích cest nebo pracovní plochy. Mikroorganismus<br />

vždy přenášíme pomocí bakteriologické kličky. Sterilizace kličky se provádí žíháním v plameni<br />

kahanu. Celý drátek se vloží do plamene a nechá rozžhavit. Potom se ve svislé poloze nechá<br />

vychladnout. Po naočkování je nutno vždy před odložením kličku sterilizovat žíháním. Kličku<br />

vsuneme do zkumavky a do očka nabereme kulturu. Kličku vytáhneme, ožíháme hrdlo zkumavky a<br />

zátku (kterou stále držíme malíkem pravé ruky) a zkumavku uzavřeme. Mikroorganismus na plotnu<br />

přenášíme tak, že víčko se jen mírně nadzvedne a očkem sterilní kličky se lehce přejede po<br />

povrchu agaru. Při neznámém množství mikroorganismu v tekuté kultuře vytváříme na plotně tzv.<br />

hádka. Plotnu si pomyslně rozdělíme na čtvrtiny a kličkou začneme v jedné čtvrtině od horního<br />

okraje do středu kreslit zúžujícího se hádka (viz obr. 54).<br />

Obrázek 54: Roztírání mikroorganismů<br />

na agarovou plotnu,<br />

tzv. hádek.<br />

Druhého hádka vytvoříme ve vedlejší čtvrtině, tak že<br />

při jeho kreslení zajedeme kličkou do struktury hádka<br />

předchozího a tím přeneseme část mikroorganismů znovu na<br />

kličku. Stejně tak pokračujeme se zbylými dvěmi čtvrtinami.<br />

Principem je vyředit mikroorganismy tak, aby se v posledních<br />

hádcích od sebe oddělily na jednotlivé buňky, které dají vznik<br />

jednotlivým koloniím. Pokud máme mikroorganismy v kultuře<br />

značně naředěné, nebo selektujeme málo abundantní<br />

mikroorganismy s rezistencí, naneseme celou tekutou kulturu<br />

nebo její alikvot do středu plotny umístěné na kolotoči a<br />

předem vyžíhanou hokejkou po roztočení kolotoče ji opatrně<br />

rozetřeme po celém povrchu plotny.<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE:<br />

LB agarové plotny s ampicilinem a bez ampicilinu (složení na 100 mL: 1 g bakteriálního tryptonu,<br />

0.5 g kvasničného autolysátu, 0.5 g NaCl, 1.5 g agaru, pH 7.0), flow box, kahan, sterilní očkovací<br />

kličky, hokejka, kolotoč, kultura baktérií Escherichia coli nesoucí plasmid s rezistencí proti<br />

ampicilinu a bez rezistence.<br />

POSTUP:<br />

Na jednu agarovou plotnu s ampicilinem rozetřeme metodou hádka kulturu E. coli nesoucí<br />

plasmid s rezistencí k antibiotiku, na druhou plotnu s antibiotikem rozetřeme pomocí hokejky 50<br />

µL kultury E. coli bez rezistence k antibiotiku. Na jednu misku bez antibiotika rozetřete metodou<br />

hádka kulturu nesoucí plasmid. A na poslední misku bez antibiotika plivněte a sliny rozetřete<br />

108

hokejkou, nebo plotnu pouze otevřete a intenzivně na ní dýchejte a poté zase zavřete. Po<br />

nanesení všech kultur na plotny je dejte kultivovat přes noc do inkubátoru na 37ºC. Plotny<br />

dávejte do inkubátoru obráceně (víkem dolů), to proto, aby voda která se z agaru neustále<br />

vypařuje a kondenzuje na víku, neskapávala zpátky na kulturu mikroorganismu na plotně rostoucí.<br />

ÚKOL č. 31: Izolace plasmidové DNA z E.coli<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE:<br />

Kultura E. coli obsahující plasmid s Amp r genem pěstovaná přes noc, Roztok P1 (50 mM Tris/HCl<br />

pH 8.0, 10 mM EDTA, autoklávováno a přidáno 0.1 mg/ml Rnasy A), Roztok P2 (0.2 M NaOH, 1%<br />

SDS, autoklávováno), Roztok P3 (3 M octan draselný pH 5.5, autoklávováno), Isopropanol a 70 %<br />

ethanol vychlazený v mrazničce (-20 o C), TE pufr (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA),<br />

mikrozkumavky 1,5 ml (eppendorfky), miska s ledem, stolní centrifuga s rotorem na<br />

mikrozkumavky, automatické pipety a špičky.<br />

POSTUP:<br />

1) 1,5 ml podíl kultury E. coli nesoucí plasmid inkubované přes noc přeneseme do<br />

mikrozkumavek, centrifugujeme při 5.000 g 1 min (separace buněk od média) a médium<br />

odlijeme.<br />

2) Přidáme 0,3 ml roztoku P1, bakteriální pelet suspendujeme pomocí vortexu.<br />

3) Přidáme 0,3 ml roztoku P2, promícháme několikerým převrácením zkumavky, ponecháme stát<br />

5 min při laboratorní teplotě.<br />

4) Přidáme 0,3 ml roztoku P3, promícháme několikerým převrácením zkumavky, ponecháme stát<br />

5 min na ledě.<br />

5) Centrifugujeme při 14.000 g, 10 min, supernatant přelijeme do nových ependorfek.<br />

6) Přidáme 0,5 ml isopropanolu (laboratorní teplota), centrifugujeme při 14.000 g, 10 min,<br />

supernatant odlijeme.<br />

7) Sraženinu DNA promyjeme 0,5 ml 70% ethanolu (-20 o C), centrifugujeme při 14.000 g, 5 min,<br />

supernatant odlijeme, jeho zbytky odstředíme na dno mikrozkumavky a odpipetujeme. DNA<br />

ponecháme sušit 10 min ve flowboxu.<br />

8) Sraženinu DNA resuspedujeme pipetováním v 0,04 ml TE.<br />

ÚKOL č. 32: Elektroforesa DNA<br />

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE:<br />

1 % agarosa v 1x TAE pufru (0,04 M Tris-kyselina octová, 0,001 M EDTA), zásobní elektrodový<br />

pufr 10x TAE (0,4 M Tris-kyselina octová, 0,01 M EDTA, pH 8,0), 50 % glycerol, 50 mM EDTA<br />

pH 8, 0,125 % bromfenolová modř, 0,125 % xylenová violeť, 10% Ethidium bromid, λ DNA marker,<br />

mikrozkumavky 1,5 ml (eppendorfky), horizontální elektroforetická komůrka, zdroj napětí,<br />

AlphaDigiDoc, systém pro digitální fotodokumentaci gelů, mikropipety, špičky, pikofuga<br />

109

POSTUP:<br />

Pod dohledem vedoucího cvičení nebo laborantky si sestavíme v digestoři elektroforetickou<br />

komůrku pro agarosový gel v horizontálním uspořádání. Z termostatu na 60 o C vyjmeme<br />

rozpuštěnou 1% agarosu v 1x TAE a nalijeme asi 1 cm silnou vrstvu do elektroforetické komůrky.<br />

Agarosa se nalévá do prostoru ohraničeného postranními plastovými deskami na nosnou skleněnou<br />

desku (viz obr. 55). Ihned přidáme 40 µl 10% ethidium bromidu (POZOR KARCINOGEN, DBÁT<br />

BEZPEČNOSTNÍCH PŘEDPISŮ) a promícháme špičkou. Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý<br />

kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu. Gel ponecháme<br />

ztuhnout asi 30 min.<br />

Po 30 minutách odstraníme postranní plastové desky<br />

a do komůrky nalijeme asi 200 ml elektrodového<br />

pufru 1x TAE tak, aby hladina splývala s agarosovým<br />

gelem a nakonec pod hladinou odstraníme hřeben.<br />

Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky: Do tří<br />

mikrozkumavek napipetujeme 20, 10 a 5 µl izolované<br />

DNA a přidáme pětinu objemu denaturačního<br />

barviva, promícháme a v pikofuze necháme sednout<br />

na dno mikrozkumavky.<br />

Obrázek 55: Nalévání agarosového gelu<br />

V digestoři opatrně pipetou naneseme<br />

jednotlivé vzorky do jamek na startu elektroforesy.<br />

Mezi nanášením jednotlivých vzorků, špičku pipety<br />

vyplachujeme v elektrodovém pufru přímo<br />

v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu<br />

jednotlivých vzorků. Do jedné jamky jako standard<br />

molekulových hmotností DNA naneseme 5 µl λ DNA<br />

naštěpenou restrikčním enzymem StyI nebo<br />

současně restrikčními enzymy HindIII a EcoRI<br />

nanesených vzorků (viz obr. 56).<br />

Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem, připojíme ke zdroji napětí 120<br />

V po dobu asi 20-30 minut. Průběh elektroforézy je možné sledovat podle pohybu pásů barviv ze<br />

vzorků. Vypneme přívod proudu, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel na nosném skle a<br />

pořídíme snímek digitální kamerou podle pokynů vedoucího cvičení.<br />

Po celou dobu práce používáme ochranné nitrilové rukavice (fialové) a dbáme předpisů<br />

pro práci s ethidium bromidem, který je obsažen v gelu.<br />

VYHODNOCENÍ:<br />

1) Následující cvičení si vezměte své agarové plotny, které byly přes noc inkubovány na 37 o C<br />

a popište a zhodnoťte, co na které vyrostlo či nevyrostlo a proč?<br />

2) Podařilo se vám izolovat plasmidovou DNA? Jak by jste zjistili její množství a čistotu?<br />

3) Zhodnoťte výsledek elektroforesy, co jste viděli na gelu po obarvení ethidium bromidem?<br />

Pokuste se vysvětlit proč jste viděli při elektroforese plasmidové DNA více než jeden<br />

proužek.<br />

110

Obrázek 56: λ DNA (48.5 kbp) naštípaná restrikčním enzymem StyI (vlevo) nebo HindIII a<br />

EcoRI (vpravo).<br />

1% agarosa v TAE<br />

standard vlevo: 11 fragmentů - 19.329, 7.743, 6.223, 4.254, 3.472, 2.690, 1.882, 1.489, 925,<br />

421, 74 bp<br />

standard vpravo: 13 fragmentů - 21.226, 5.148, 4.973, 4.268, 3.530, 2.027, 1.904, 1.584, 1.375,<br />

947, 831, 564, 125 bp<br />

Doporučená literatura:<br />

Ráclavský, V.: Úvod do základních metod molekulární genetiky, Vydavatelství UP Olomouc, 1998.<br />

Ruml, T.: Laboratoře z genového inženýrství, Vydavatelství VŠCHT, 1997<br />

Voet, D.A. a Voet, J.G.: Biochemie, Academia Publishing Praha, 1995<br />

Jandová, B. a Kotoučková, L. : Praktikum z Mikrobiologie, Vydavatelství MU, 1996.

logo

products

Resources

Company

Terms of service
Privacy policy
Cookie policy
Cookie settings
Imprint
Change language
Made with love in Switzerland
© 2024 Yumpu.com all rights reserved

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!