Kultury in vitro tytoniu i ich znaczenie w rozwoju biotechnologii roślin ...

PRACE POGL¥DOWE
Anna BUDZIANOWSKA
Kultury in vitro tytoniu i ich znaczenie
w rozwoju biotechnologii roœlin
In vitro cultures of tobacco and their impact
on development of plant biotechnology
Katedra i Zak³ad Botaniki Farmaceutycznej
i Biotechnologii Roœlin, Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ
Kierownik: Prof. dr hab. Jaromir Budzianowski
Dodatkowe s³owa kluczowe:
tytoñ
kultury in vitro
biotechnologia
Additional key words:
tobacco
in vitro cultures
biotechnology
Tytoñ szlachetny (Nicotiana tabacum)
i pokrewne gatunki odegra³y pioniersk¹
rolê w rozwoju biotechnologii
roœlin. Ju¿ w latach 30-tych XX wieku
uzyskano aseptyczne kultury in vitro
tytoniu jako jedne z pierwszych hodowli
in vitro tkanek roœlinnych. W nastêpnym
dziesiêcioleciu kultury tytoniu
s³u¿y³y do badañ nad organogenez¹ –
formowaniem siê przybyszowych pêdów
i korzeni – procesu wa¿nego dla
mikrorozmna¿ania. W latach 60-tych
ubieg³ego wieku, w doœwiadczeniach
z kulturami komórkowymi tytoniu, udowodniono
bezsprzecznie totipotencjê
komórek roœlinnych, czyli zdolnoœæ do
regeneracji kompletnej roœliny z pojedynczej
komórki. Równie¿ dziêki kulturom
in vitro tytoniu zosta³a opracowana
w 1962 roku, najczêœciej stosowana
do dziœ, po¿ywka do prowadzenia
hodowli in vitro roœlin. Pierwsz¹
roœlin¹ zregenerowan¹ z protoplastów
by³ tytoñ, jak równie¿ pierwsza hybryda
somatyczna i chimera in vitro pochodzi³y
z kultur tytoniu (lata 70-te).
Tytoñ by³ te¿ jedn¹ z pierwszych transgenicznych
roœlin, do otrzymania której
niezbêdna by³a transformacja tkanki
i regeneracja z niej pêdów i korzeni
w kulturach in vitro. Równolegle prowadzone
kultury komórkowe, zawiesinowe,
tytoniu wykaza³y z jednej strony
ich wyj¹tkow¹ u¿ytecznoœæ w badaniach
biologii komórki roœlinnej, a z
drugiej strony przydatnoϾ do kontrolowanej
biosyntezy u¿ytecznych metabolitów
i biotransformacji (biokonwersji),
czyli ukierunkowanej chemicznej
modyfikacji zwi¹zków obcych wprowadzonych
do takiej kultury. Tytoñ odegra³
rolê modelowej roœliny w badaniach
biologii i zastosowañ biotechnologicznych
roœlin.
Tobacco (Nicotiana tabacum) and
related species had played a pioneer
role in the development of plant biotechnology.
Already in thirties of the
XX century, aseptic in vitro cultures
were established as one of the first
plant tissue in vitro cultures. In the next
decade the tobacco cultures served for
investigations of organogenesis – formation
of advetitiuos shoots and roots
– the process important for
micropropagation. In 60-ties of the previous
century, the totipotency of plant
cells, i.e. ability for regeneration of the
full plant from single cell, has been
unequivocally proved on the basis of
experiments with tobacco cell cultures.
Moreover, thanks to the tobacco
in vitro cultures, the medium for performance
of plant in vitro cultures was
elaborated in 1962, which is the most
frequently used medium till now. Tobacco
was the first plant regenerated
from a protoplast, as well as the first
somatic hybrid and chimera in vitro
were derived from tobacco cultures
(the 70-ies). Tobacco was also one of
the first transgenic plants and for its
formation in vitro culture has been
necessary to carry out transformation
of tissue and regeneration of shoots
and roots. Simultaneously preformed
cell suspension culture of tobacco
exhibited, on one hand, exceptional
utility for studies of plant cell biology,
and on the other hand, appeared applicable
for performing controlled biosynthesis
of useful metabolites and
biotransformation (bioconversion),
that is directed chemical modification
of foreign compounds introduced to
such culture. Tobacco has played the
role of the model plant in investigations
of biology and biotechnological
applications of plants.
Adres do korespondencji:
Dr Anna Budzianowska
Katedra i Zak³ad Botaniki Farmaceutycznej
i Biotechnologii Roœlin
Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego
61-861 Poznañ, ul. Œw. Marii Magdaleny 14
Tel. (+61) 66 87 848; Fax: (+61) 66 87861
e-mail: abudzian@ump.edu.pl
Wstêp
Tytoñ szlachetny – Nicotiana tabacum,
jeden z 67 gatunków rodzaju Nicotiana, nale¿y
do klasy dwuliœciennych, rodziny Solanaceae,
obejmuj¹cej wiele wa¿nych roœlin
leczniczych, zawieraj¹cych alkaloidy oraz
roœlin uprawnych – takich jak ziemniak, papryka
i pomidor. Wystêpuje w ciep³ych regionach
Ameryki, Australii i Polinezji i obecnie
uprawiany jest w wiêkszoœci krajów podzwrotnikowych
[5].
Ró¿ne gatunki tytoniu (na czele z Nicotiana
tabacum) oprócz znaczenia komercyjnego
w produkcji tytoniu jako u¿ywki odegra³y
pioniersk¹ rolê w rozwoju biotechnologii
roœlin [17]. Podstawowym narzêdziem
tej dziedziny nauki s¹ kultury in vitro, czyli
aseptyczne hodowle „w szkle” tkanek, ko-
890 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 10 A. Budzianowska

mórek, organów czy ca³ych roœlin na sztucznych
pod³o¿ach, w specjalnych, regulowanych
warunkach. Hodowle in vitro roœlin sta-
³y siê niezbêdnym elementem szeregu eksperymentów
dotycz¹cych badania fizjologii
i metabolizmu komórek roœlinnych, mikrorozmna¿ania,
czyli klonalnego mno¿enia,
uzyskiwania roœlin wolnych od wirusów, genetycznej
transformacji, itd. Kultury tkankowe
i komórkowe pozwalaj¹ równie¿ na wybiórcz¹
produkcjê po¿¹danych zwi¹zków o
dzia³aniu leczniczym w warunkach laboratoryjnych,
niezale¿nie od klimatu i pory roku.
Jednym z pierwszych, eksperymentalnych
gatunków wykorzystywanych w tej metodzie
by³ w³aœnie tytoñ, z którego ju¿ w latach 30-
tych XX wieku uzyskano, stale wzrastaj¹ce
hodowle tkankowe. W nastêpnych latach
kolejne doœwiadczenia z tytoniem pozwoli-
³y opracowaæ podstawowe metody prowadzenia
tych kultur oraz bezsprzecznie udowodniæ
totipotencjê komórek roœlinnych.
Równolegle prowadzone kultury komórkowe,
zawiesinowe, tytoniu wykaza³y z jednej
strony ich wyj¹tkow¹ u¿ytecznoœæ w badaniach
biologii komórki roœlinnej, a z drugiej
strony przydatnoœæ do biosyntezy u¿ytecznych
metabolitów i sterowania ni¹, jak równie¿
do biotransformacji (biokonwersji), czyli
ukierunkowanej chemicznej modyfikacji
zwi¹zków obcych wprowadzonych do takiej
kultury dziêki dzia³aniu enzymów komórkowych
[12,21].
Tytoñ odgrywa rolê modelowej roœliny
w badaniach biologicznych i biotechnologicznych.
W bie¿¹cej pracy przedstawiono
udzia³ gatunków tytoniu w historii kultur in
vitro, rodzaje prowadzonych kultur in vitro
tych roœlin i przyk³ady ich zastosowañ do
biosyntezy i biotransformacji.
Tytoñ w historii kultur in vitro
Wa¿niejsze zdarzenia z rozwoju kultur
in vitro tytoniu, maj¹cych wp³yw na ogólny
rozwój tej dziedziny z zakresu biotechnologii
roœlin, przedstawiono w Tabeli I.
Ju¿ w latach 30-tych XX wieku, na przyk³adzie
rakowej tkanki Nicotiana glauca x
N.langsdorfii stwierdzono, ¿e tkanka roœlinna
mo¿e byæ stale utrzymywana w kulturze,
wzrastaæ, a tak¿e wykazuje zdolnoœæ
do ró¿nicowania siê w pêdy i korzenie
[14,17].
Kolejnymi osi¹gniêciami by³y wyniki badañ
tworzenia siê pêdów i korzeni przybyszowych
(organy rozwijaj¹ce siê z merystemów
powstaj¹cych z tkanek sta³ych) pod
wp³ywem regulatorów wzrostu i rozwoju roœlin
oraz indukcji kwitnienia in vitro. W 1957r.
nast¹pi³o odkrycie regulacji tworzenia organów
z kalusa tytoniu przez zmianê stosunku
stê¿enia cytokininy do auksyny [12,14].
Procesy te s¹ niezwykle wa¿ne w mikrorozmna¿aniu,
czyli mno¿eniu roœlin drog¹ kultur
in vitro.
Na podstawie obserwacji White'a
(1934r.), ¿e wirus mozaiki tytoniowej (TMV)
jest nierównomiernie rozmieszczony w ró¿-
nych strefach korzenia tytoniu, (stê¿enie
zmniejsza³o siê w kierunku szczytu i koniuszki
korzenia by³y wolne od wirusów,)
opracowano póŸniej (lata 50-te) metodê
uzyskiwania roœlin wolnych od wirusów
przez ich regeneracjê z kultur merystemów
wierzcho³kowych [12].
Tabela I
Tytoñ w historii kultur in vitro roœlin*
Tobacco in history of plant in vitro culture
Rok
Wyniki doœwiadczeñ
1939 rakowa tkanka hybrydy N.glauca x N.langsdorfii jako tkanka roœlinna pierwszy raz utrzymywana stale w
kulturze i mo¿liwoœæ ró¿nicowania jej w korzenie i pêdy (White)
1944 pierwsze kultury in vitro tytoniu u¿yte do badañ tworzenia siê pêdów przybyszowych (Skoog)
1948 formowanie siê przybyszowych korzeni i pêdów tytoniu pod wp³ywem proporcji stê¿enia auksyny do
adeniny (Skoog i Tsui)
1957 odkrycie regulacji tworzenia organów z kalusa tytoniu przez zmianê stosunku stê¿enia cytokininy do
auksyny (Skoog i Miller)
1962 opracowanie po¿ywki do kultur in vitro roœlin (Murashige i Skoog)
1965 indukcja kwitnienia w tkance tytoniu in vitro (Aghion-Prat)
1965 regeneracja roœlin tytoniu z pojedynczych wyizolowanych komórek w mikrokulturze (Vasil i Hildebrandt)
1969 analizy kariologiczne roœlin zregenerowanych z kultur kalusa (Sacristan en Melchers)
1971 regeneracja ca³ych roœlin z protoplastów wyizolowanych z mezofilu liœci tytoniu (Takebe i in.)
1972 miêdzygatunkowa hybrydyzacja poprzez fuzjê protoplastów dwóch gatunków tytoniu (otrzymanie
pierwszej somatycznej hybrydy roœlinnej) (Carlson i in.)
1974 Pierwsze formowanie chimer w kulturze in vitro z pêdów przybyszowych otrzymanych z kalusa N.tabacum
i N.glauca x N.langsdorffii (Carlson i Chaleff)
1981 izolowanie auksotrofów w badaniach przesiewowych du¿ej skali kolonii komórkowych otrzymanych z
haploidalnych protoplastów N.plumbaginifolia traktowanych mutagenami (Siderov i in.)
1985 infekcja i transformacja dysków liœciowych tytoniu Agrobacterium tumefaciens i regeneracja
transformowanych roœlin (Horsch i in.)
* [12, 14, 7, 16]
W latach 60-tych ubieg³ego wieku w
doœwiadczeniach z kulturami komórkowymi
tytoniu udowodniono bezsprzecznie totipotencjê
komórek roœlinnych, czyli zdolnoœæ do
regeneracji kompletnej roœliny z pojedynczej
komórki somatycznej [18,19]. Jest to jedno
z najwa¿niejszych odkryæ dotycz¹cych komórek
roœlinnych, o prze³omowym znaczeniu
i daj¹cym nieograniczone wrêcz mo¿liwoœci
zastosowañ.
Równie¿ dziêki kulturom in vitro tytoniu
zosta³a opracowana w 1962 roku przez
Murashige i Skooga [9], najczêœciej stosowana
do dziœ po¿ywka do prowadzenia
aseptycznej hodowli roœlin.
Wkrótce tytoñ sta³ siê specjalnie interesuj¹cy
dla badaczy mutagenezy in vitro ze
wzglêdu na ³atwoœæ uzyskiwania linii komórek
i protoplastów haploidalnych z mikrospor
(ziarn py³ku) oraz doœæ prost¹ regeneracjê
roœlin z kalusów. W 1969r. po raz pierwszy
uzyskano mutanty tytoniu stosuj¹c napromieniowanie.
W póŸniejszym czasie stosowano
mutageny chemiczne i otrzymywano
ró¿ne wyniki m.in. roœliny N.tabacum niewra¿liwe
na chorobotwórcze bakterie, antybiotyki,
tolerancyjne na wysokie stê¿enie
NaCl i wiele innych [12,21].
W 1968r. uzyskano kulturê komórkow¹
odmiany hodowlanej tytoniu N.tabacum cv.
Bright Yellow No. 2, która sta³a siê modelowym
systemem badania biologii komórki
roœlinnej [15].
W latach 70-tych przeprowadzono szereg
doœwiadczeñ dotycz¹cych androgenezy
– opracowano kultury pylników tytoniu,
formowanie embrioidów z py³ków i otrzymywanie
roœlin haploidalnych t¹ metod¹ [2,13].
Pierwsz¹ somatyczn¹ hybrydê (mieszañca)
roœlinn¹ (1972r.) otrzymano poprzez
fuzjê protoplastów dwóch gatunków
tytoniu, a w 1974r. po raz pierwszy opisano
powstawanie chimer (roœliny zawieraj¹ce
komórki o ró¿nym genotypie) in vitro. W
wyniku formowania siê pêdów przybyszowych
z kalusa N.tabacum i mieszañca
N.glauca x N.langsdorffii zregenerowano 28
chimer z ogólnej liczby otrzymanych 7000
roœlin [12].
Tytoñ by³ te¿ jedn¹ z pierwszych transgenicznych
roœlin (1985r.), do otrzymania
której niezbêdna by³a transformacja tkanki i
regeneracja z niej pêdów i korzeni w kulturach
in vitro [7,12].
Sposóby prowadzenia kultur in vitro tytoniu,
takie jak kultura kalusa, regeneracja
z niej pêdów i korzeni, androgeneza, kultura
protoplastów i ich fuzja, transformacja
genetyczna, ze wzglêdu na wysok¹ odtwarzalnoœæ,
s¹ sta³ymi pozycjami w opracowaniach
dotycz¹cych metod doœwiadczalnych
w prowadzeniu kultur in vitro roœlin [2,12,
13,14,21].
Kultury in vitro tytoniu
Kultury in vitro roœlin przypominaj¹ nieco
kultury drobnoustrojów, gdy¿ materia³
roœlinny umieszcza siê na sztucznej po¿ywce
zestalonej agarem w naczyniu laboratoryjnym
(probówka, kolba sto¿kowa, p³ytka
Petriego), w warunkach sterylnych (lo¿a z
nawiewem laminarnym powietrza) i kulturê
przechowuje siê w specjalnym pokoju hodowlanym
z regulacj¹ temperatury, fotoperiodu
(dzieñ/noc) i natê¿enia œwiat³a. Podstawowym
warunkiem jest sterylnoœæ – materia³
roœlinny wyjœciowy do za³o¿enia kultur
in vitro, czyli tzw. eksplantat wyja³awia siê
najczêœciej roztworem podchlorynu sodu,
naczynia laboratoryjne – wysok¹ tempera-
Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 10
891

tur¹, po¿ywki – w autoklawie, narzêdzia metalowe
(bezpoœrednio przed u¿yciem) – p³omieniem.
Podstawowa po¿ywka Murashige-
Skoog'a (MS) [9] jest roztworem wodnym
zawieraj¹cym ró¿ne sole mineralne, sacharozê
i witaminy, aminokwas – glicynê. Dalszy
rozwój wy³o¿onego na po¿ywkê fragmentu
roœliny czêsto zale¿y od suplementacji
po¿ywki roœlinnymi regulatorami wzrostu
i rozwoju, jak cytokininy, auksyny i (rzadko)
gibereliny. Z eksplantatu mog¹ rozwin¹æ
siê organy (organogeneza bezpoœrednia)
– pêdy, korzenie, somatyczne zarodki
(bezpoœrednia embriogeneza somatyczna)
lub kalus, z którego mo¿na otrzymaæ organy
przybyszowe (organogeneza poœrednia),
kulturê komórkow¹ zawiesinow¹ lub zarodki
somatyczne (poœrednia embriogeneza somatyczna)
[2,12,14,21].
Kultury kalusa i regeneracja
z nich roœlin
Kalus w naturze jest tkank¹ przyrann¹,
powstaj¹c¹ wskutek uszkodzenia roœliny. W
kulturach in vitro mo¿na go zainicjowaæ z
ró¿nych eksplantatów, charakteryzuje siê
zdolnoœci¹ do ci¹g³ych podzia³ów i wiêkszym
lub mniejszym zró¿nicowaniem tkankowym
[12].
Kalus tytoniu mo¿na otrzymaæ (zainicjowaæ)
z rdzenia ³odygi, który stanowi tkanka
miêkiszowa [13] lub z fragmentów siewek
[14]. Z wyizolowanego rdzenia ³odygi tytoniu
wy³o¿onego na po¿ywkê MS zawieraj¹c¹
auksynê (IAA, w przewadze) i cytokininê
(kinetynê) rozwija siê po dwóch tygodniach
kultura kalusowa, któr¹ po nastêpnych
dwóch tygodniach mo¿na przenosiæ na
now¹ po¿ywkê. Wraz ze zwiêkszaniem stê-
¿enia cytokininy obserwuje siê proporcjonalny
wzrost masy kalusa. St¹d kultura kalusa
z rdzenia tytoniu nadaje siê do oznaczania
si³y dzia³ania cytokinin. Z kalusa wy³o¿onego
na po¿ywkê o odpowiedniej proporcji
auksyny do cytokininy rozwijaj¹ siê pêdy lub
korzenie, a nawet roœlinki. Kulturê kalusow¹
tytoniu mo¿na te¿ ³atwo otrzymaæ z siewek
(jako eksplantatów) otrzymanych przez
skie³kowanie wyja³owionych nasion na po-
¿ywce MS. Po trzech tygodniach siewki tnie
siê i ich fragmenty wyk³ada na po¿ywkê MS
z kinetyn¹ i IAA (w przewadze), utrzymuje
w ciemnoœci i temperaturze 27-30°C. Po
szeœciu tygodniach kalus odcina siê od eksplantatów
(fragmentów siewek) i pasa¿uje
na tak¹ sam¹ po¿ywkê, na nastêpne 6 tygodni
w celu przyrostu kalusa. Niedawno
wydatnie poprawiono wzrost i stabilnoœæ genetyczn¹
kalusa tytoniu przez zamianê w
po¿ywce MS nieorganicznego azotu i fosforu
na organiczny w postaci peptonu sojowego
i kwasu fitowego (heksafosforan inozytolu)
[11].
Roœliny haploidalne
Szczególnymi eksplantatami s¹ ziarna
py³ku, czyli mikrospory, z których, w wyniku
procesu zwanego androgenez¹, mo¿na zregenerowaæ
roœliny haploidalne [13]. Materia³em
wyjœciowym kultur s¹ pylniki zawieraj¹ce
jednoj¹drowe mikrospory wyizolowane
z wyja³owionych nie otwartych p¹czków
kwiatowych tytoniu (gdy korona i kielich
maj¹ jednakow¹ d³ugoœæ). Pylniki wyk³ada
siê na po¿ywkê MS bez regulatorów wzrostu.
Z mikrospor rozwijaj¹ siê haploidalne
roœlinki, które po potraktowaniu kolchicyn¹
staj¹ siê roœlinami diploidalnymi – homozygotycznymi.
Zalet¹ ich jest utrzymanie po-
¿¹danych cech recesywnych.
Protoplasty i ich fuzja
Protoplast to komórka roœlinna, z której
usuniêto œcianê komórkow¹. Szczególnie
³atwo jest otrzymaæ protoplasty z mezofilu
(miêkisz zieleniowy) liœcia tytoniu [13]. Po
zdjêciu dolnej skórki liœcia i zanurzeniu w
roztworze hipertonicznym mannitolu i nastêpnie
w roztworze enzymów celulolitycznych
i pektynolitycznych nastêpuje uwolnienie
protoplastów, które wydziela siê przez
wirowanie w roztworze sacharozy. Po przeniesieniu
protoplastów na po¿ywkê regeneruj¹
œciany komórkowe.
Kultury protoplastów mog¹ s³u¿yæ do
badañ fizjologii. Protoplasty ró¿nych odmian,
gatunków, a nawet rodzajów, mo¿na ³¹czyæ
(fuzja) dzia³aj¹c ró¿nymi czynnikami, np.
polietylenoglikolem (PEG). Z uzyskanych
hybryd po regeneracji œcian komórkowych
mo¿na wyprowadziæ pe³ne roœliny stanowi¹ce
mieszañce somatyczne. Fuzja protoplastów
pozwala na uzyskanie mieszañców
roœlin, których nie udaje siê otrzymaæ w sposób
tradycyjny – przez krzy¿owe zapylanie.
Dodatkowo, protoplasty mog¹ byæ bezpoœrednio
transformowane genetycznie z u¿yciem
elektroporacji lub glikolu polietylenowego
i mo¿na z nich uzyskaæ wtedy roœliny
transgeniczne.
Szansa zregenerowania roœlin z wyizolowanych
protoplastów jest jednak wzglêdnie
niska. Gatunki nale¿¹ce do rodziny Solanaceae,
w tym Nicotiana regeneruj¹ naj-
³atwiej [12].
Regeneracja roœlin transgenicznych
Eksplantatami s¹ liœcie roœlin gruntowych
(wymagaj¹ wyja³owienia podchlorynem)
lub liœcie siewek skie³kowanych ze sterylnych
nasion. Z liœci wycina siê kr¹¿ki, które
wyk³ada siê na po¿ywkê, a po dwóch dniach
umieszcza w zawiesinie transgenicznej bakterii
Agrobacterium tumefaciens (15s do 1
min) na p³ytkach Petriego. Nastêpnie po
wysuszeniu kr¹¿ków liœciowych na bibule
filtracyjnej (celem usuniêcia zawiesiny bakterii)
wyk³ada siê je na po¿ywkê MS z cytokinin¹
(BA w przewadze) i auksyn¹ (NAA)
na 2 dni i nastêpnie przenosi na tak¹ sam¹
po¿ywkê dodatkowo z antybiotykami (kanamycyn¹
i karbenicylin¹) w celu eliminacji
bakterii i selekcji transformantów. Po 2-4
tygodniach kultury wyrastaj¹ pêdy, które
przenosi siê na po¿ywkê ukorzeniaj¹c¹ bez
regulatorów wzrostu, zawieraj¹c¹ obydwa
antybiotyki [14].
Kultury komórkowe tytoniu
Szczególnego znaczenia nabra³a kultura
zawiesinowa linii komórkowej tytoniu o
nazwie BY-2 uzyskana z kalusa z rdzenia
³odygi odmiany hodowlanej tytoniu N.tabacum
cv. Bright Yellow No. 2 w Japonii, w
1968 roku [15]. Pod wzglêdem w³aœciwoœci
jest ona porównywalna z lini¹ ludzkich komórek
HeLa. Komórki BY-2 s¹ komórkami
bezzieleniowymi, dziel¹cymi siê niezwykle
szybko na odpowiedniej po¿ywce i w odpowiednich
warunkach – czas podwojenia kultury
wynosi 13 godzin, a w ci¹gu tygodnia
liczba komórek mo¿e wzrosn¹æ 100-krotnie.
Co wiêcej bardzo ³atwo mo¿na uzyskaæ kulturê
synchroniczn¹ czyli z³o¿on¹ z komórek
w tej samej fazie cyklu komórkowego. Z
tego wzglêdu linia komórkowa BY-2 sta³a
siê modelowym systemem badania biologii
komórki roœlinnej i jej kompartmentów - podzia³ów
komórkowych w tym cytokinezy, rozwoju
cytoszkieletu i organelli, sygnalizacji
hormonów roœlinnych. Komórki BY-2 s¹
równie¿ podatne na transformacjê genetyczn¹,
co znacznie rozszerzy³o mo¿liwoœci ich
zastosowañ [1,3,8,20].
Biosynteza w kulturze
in vitro tytoniu
Ze wzglêdu na mo¿liwoœæ pe³nej kontroli
nad rozwojem materia³u roœlinnego w
kulturze in vitro mo¿na w niej sterowaæ równie¿
biosyntez¹ okreœlonych metabolitów.
Nale¿y rozró¿niæ biosyntezê de novo, czyli
ze sk³adników pokarmowych po¿ywki oraz
biosyntezê z prekursorów, czyli zwi¹zków
poœrednich danego szlaku biosyntezy dodawanych
do po¿ywki. Przyk³adem badañ
dotycz¹cych obydwu rodzajów biosyntezy
s¹ badania nad biosyntez¹ kwasu chlorogenowego
w kulturze komórkowej zawiesinowej
Nicotiana plumbaginifolia [4]. Kwas
chlorogenowy to estrowe po³¹czenie kwasu
kawowego i chinowego o w³aœciwoœciach
przeciwutleniaj¹cych, hamuj¹cych glikogenolizê,
obni¿aj¹cych poziom cukru we krwi.
Badania wp³ywu warunków kultury na akumulacjê
tego zwi¹zku wykaza³y, ¿e hamowana
jest ona w ciemnoœci. Wzbogacanie
po¿ywki o kwas kawowy nieoczekiwanie
zmniejsza³o zawartoœæ kwasu chlorogenowego,
w miejsce którego powstawa³y trzy
nowe niezidentyfikowane zwi¹zki. Natomiast
wzbogacanie po¿ywki o kwas chinowy pozosta³o
bez wp³ywu.
W tytoniu mo¿na produkowaæ zwi¹zki
obce dla tego gatunku dziêki in¿ynierii metabolicznej,
polegaj¹cej na wprowadzeniu do
komórek genu enzymu – katalizatora tej syntezy.
Z kolei poziom zachodz¹cej ju¿ syntezy
mo¿na zwiêkszyæ (elicytowaæ) za pomoc¹
jasmonianu metylu, który jest zwi¹zkiem
stresowym (elicytorem) nasilaj¹cym biosyntezê
metabolitów wtórnych w roœlinach.
Przyk³adem w kulturach Nicotiana tabacum
jest in¿ynieria biosyntezy limonenu, lotnego
zwi¹zku monoterpenowego, zapachowego
(aromat cytryny) maj¹cego zastosowanie
w przemyœle spo¿ywczym i kosmetycznym
[10]. Do komórek tytoniu wprowadzono
nie wystêpuj¹cy w nim gen (cDNA) enzymu
syntazy limonenu pochodz¹cego z
innej roœliny (Perilla frutescens) przez transformacjê
za poœrednictwem bakterii Agrobacterium.
Zastosowano trzy ró¿ne konstrukty
genowe, tak aby gen zosta³ wprowadzony
albo do plastydów albo cytozolu
albo do retikulum endoplazmatycznego
(RE). Substratem tego enzymu jest difosforan
geranylu, konstytutywny dla tytoniu jako
prekursor biosyntezy karotenoidów i fitosteroli,
ale nie monoterpenów. Stwierdzono
najwiêksz¹ aktywnoœæ enzymu zlokalizowanego
w plastydach, ni¿sz¹ w cytozolu i brak
jego aktywnoœci w RE. Stwierdzono, ¿e liœcie
zregenerowanych transgenicznych roœlin
produkuj¹ limonen in vivo, którego za-
892 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 10 A. Budzianowska

wartoœæ wzrasta³a oko³o trzykrotnie po potraktowaniu
jasmonianem metylu. Oznaczono
równie¿ miesiêczn¹ emisjê limonenu
przez hodowane w kolbach transgeniczne
roœliny tytoniu wysokoœci 12 cm. Ostatecznie
autorzy tych eksperymentów stwierdzili,
¿e produktywnoœæ limonenu przez tytoñ jest
niska (reprezentacyjna linia produkowa³a
143 nanog/g œwie¿ej masy liœcia). Wykazano
jednak mo¿liwoœæ in¿ynierii metabolicznej
monoterpenów w tytoniu i nakreœlono
kierunki dalszych badañ w celu poprawienia
wydajnoœci.
Biotransformacje w kulturze in vitro
tytoniu
Biotransformacja w biotechnologii polega
na chemicznej modyfikacji zwi¹zku obcego
(egzogennnego) dla fizjologii danej
komórki przez enzymy tej komórki, co jest
mo¿liwe dziêki niezbyt œcis³ej specyficznoœci
substratowej tych enzymów. Przyk³adem
tego zjawiska z wykorzystaniem kultur komórkowych
in vitro tytoniu jest biotransformacja
hydroksykumaryn do ich glukozydów
[6]. Stwierdzono, ¿e hydrokumaryny wywo-
³ywa³y fragmentacjê genomowego DNA i
wydzielanie do pod³o¿a kultury wewn¹trzkomórkowej
fitoaleksyny (zwi¹zek o funkcji
obronnej wydzielany na skutek czynników
stresowych odzia³ywuj¹cych na roœlinê) -
skopoletyny (zwi¹zek kumarynowy). Równoczeœnie
egzogenne hydroksykumaryny
ulega³y transformacji do ich beta-D-glukozydów,
które nie powoduj¹ fragmentacji
DNA. Badania te wykaza³y, z jednej strony
zdolnoœæ komórek do glukozydacji egzogennych
zwi¹zków fenolowych, stwierdzonej
tak¿e u innych roœlin, jak i mechanizm reakcji
obronnej tytoniu na te zwi¹zki.
Podsumowanie
Tytoñ w kulturach in vitro wystêpuje w
postaci kalusa, organów – pêdów, korzeni,
ca³ych roœlin, komórek w zawiesinie i protoplastów.
Otrzymuje siê z niego linie haploidalne
i transformowane genetycznie, mutanty
i hybrydy. Przebadano na nim mo¿liwoœci
biosyntezy i biotransformacji in vitro.
By³ i jest jedn¹ z najwa¿niejszych roœlin eksperymentalnych
w biotechnologii roœlin. Tym
samym przyczyni³ siê do odkrycia zjawisk o
potencjalnym zastosowaniu dla dobra ludzkoœci.
Tytoñ wiêc to nie tylko u¿ywka, niew¹tpliwie
dla pal¹cych przyjemna, lecz nios¹ca
zagro¿enie zdrowia i ¿ycia, ale bardzo
u¿yteczna, cenna roœlina badawcza.
Piœmiennictwo
1. Benchabane M., Saint-Jore-Dupas C. et al.: Targeting
and post-translational processing of human
a1-antichymotrypsin in BY-2 tobacco cultured cells.
Plant Biotechnol. J. 2009, 7, 146.
2. Dodds J.H., Roberts L.W.: Experiments in Plant Tissue
Culture (Third Edition). Cambridge University
Press, New York 1995.
3. Gális I., Simek P., Narisawa T. et al.: A novel R2R3
MYB transcription factor NtMYBJS1 is a methyl
jasmonate-dependent regulator of phenylpropanoid
conjugate biosynthesis in tobacco. Plant J. 2006, 46,
573.
4. Gilleta F., Mesnard F., Fliniauxa O. et al.:
Chlorogenic acid in a Nicotiana plumbaginifolia cell
suspension. Plant Physiol. Biochem., 1999, 37, 869.
5. Hickey M., King C.: Common Families of Flowering
Plants. Cambridge University Press 2005.
6. Hirata T., Shimoda K., Fujino T.: Biotransformation
of hydroxycoumarins by the cultured cells of Nicotiana
tabacum. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 2000, 10,
477.
7. Horsch R.B., Fry J.E., Hoffman N.L. et al.: A simple
and general method of transferring genes into
plants. Science 1985, 227, 1229.
8. Lienard D., Tran Dinh O., van Oort E. et al.: Suspension-cultured
BY-2 tobacco cells produce and
mature immunologically active house dust mite allergens.
Plant Biotechnol. J. 2007, 5, 93.
9. Murashige T., Skoog F.: A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue cultures.
Physiol. Plant. 1962, 15, 473.
10. Ohara K., Ujihara T., Endo T. et al.: Limonene production
in tobacco with Perilla limonene synthase
cDNA. J. Exp. Botany, 2003, 54, 2635.
11. Parc G., Rembur J., Rech P., Chriqui D.: In vitro
culture of tobacco callus on medium containing peptone
and phytate leads to growth improvement and
higher genetic stability. Plant Cell Reports 2007, 26,
145.
12. Pierik R.L.M.: In vitro Culture of Higher Plants.
Martinus Nijhoff Publishers Dordrecht 1987.
13. Reinert J., Yeoman M.M.: Plant Cell and Tissue
Culture. A Laboratory Manual. Springer- Verlag Berlin
Heidelberg New York1982.
14. Smith R.H.: Plant tissue culture. Techniques and
experiments. Second edition. Academic Press San
Diego 2000.
15. Strona internetowa organizacji RIKEN (Japonia):
http://mrg.psc.riken.go.jp/strc/BY-2.htm (dostêp dnia
27 sierpnia 2009).
16. Takebe I., Labib G., Melchers G.: Regeneration of
whole plants from isolated mesophyll protoplasts of
tobacco. Naturwiss. 1971, 58, 318.
17. Vasil I.K.: A short history of plant biotechnology.
Phytochem. Rev. 2008, 7, 387-394.
18. Vasil V., Hildebrandt A.C.: Differentiation of tobacco
plants from single, isolated cells in microcultures.
Science 1965, 150, 889.
19. Vasil V., Hildebrandt A.C.: Further studies on the
growth and differentiation of single, isolated cells of
tobacco in vitro. Planta 1967, 75, 139.
20. Yang S.W., Jin E.S., Chung I.K., Kim W.T.: Cell
cycle-dependent regulation of telomerase activity by
auxin, abscisic acid and protein phosphorylation in
tobacco BY-2 suspension culture cells. Plant J. 2002,
29, 617.
21. Zenkteler M. (red.): Hodowla komórek i tkanek
roœlinnych. Praca zbiorowa. Pañstwowe Wydawnictwo
Naukowe, Warszawa 1984.
Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 10
893