Kultury in vitro tytoniu i ich znaczenie w rozwoju biotechnologii roślin ...
Kultury in vitro tytoniu i ich znaczenie w rozwoju biotechnologii roślin ...
Kultury in vitro tytoniu i ich znaczenie w rozwoju biotechnologii roślin ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
PRACE POGL¥DOWE<br />
Anna BUDZIANOWSKA<br />
<strong>Kultury</strong> <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong> i <strong>ich</strong> <strong>znaczenie</strong><br />
w <strong>rozwoju</strong> <strong>biotechnologii</strong> roœl<strong>in</strong><br />
In <strong>vitro</strong> cultures of tobacco and their impact<br />
on development of plant biotechnology<br />
Katedra i Zak³ad Botaniki Farmaceutycznej<br />
i Biotechnologii Roœl<strong>in</strong>, Uniwersytet Medyczny<br />
im. Karola Marc<strong>in</strong>kowskiego, Poznañ<br />
Kierownik: Prof. dr hab. Jaromir Budzianowski<br />
Dodatkowe s³owa kluczowe:<br />
tytoñ<br />
kultury <strong>in</strong> <strong>vitro</strong><br />
biotechnologia<br />
Additional key words:<br />
tobacco<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong> cultures<br />
biotechnology<br />
Tytoñ szlachetny (Nicotiana tabacum)<br />
i pokrewne gatunki odegra³y pioniersk¹<br />
rolê w <strong>rozwoju</strong> <strong>biotechnologii</strong><br />
roœl<strong>in</strong>. Ju¿ w latach 30-tych XX wieku<br />
uzyskano aseptyczne kultury <strong>in</strong> <strong>vitro</strong><br />
<strong>tytoniu</strong> jako jedne z pierwszych hodowli<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong> tkanek roœl<strong>in</strong>nych. W nastêpnym<br />
dziesiêcioleciu kultury <strong>tytoniu</strong><br />
s³u¿y³y do badañ nad organogenez¹ –<br />
formowaniem siê przybyszowych pêdów<br />
i korzeni – procesu wa¿nego dla<br />
mikrorozmna¿ania. W latach 60-tych<br />
ubieg³ego wieku, w doœwiadczeniach<br />
z kulturami komórkowymi <strong>tytoniu</strong>, udowodniono<br />
bezsprzecznie totipotencjê<br />
komórek roœl<strong>in</strong>nych, czyli zdolnoœæ do<br />
regeneracji kompletnej roœl<strong>in</strong>y z pojedynczej<br />
komórki. Równie¿ dziêki kulturom<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong> zosta³a opracowana<br />
w 1962 roku, najczêœciej stosowana<br />
do dziœ, po¿ywka do prowadzenia<br />
hodowli <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> roœl<strong>in</strong>. Pierwsz¹<br />
roœl<strong>in</strong>¹ zregenerowan¹ z protoplastów<br />
by³ tytoñ, jak równie¿ pierwsza hybryda<br />
somatyczna i chimera <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> pochodzi³y<br />
z kultur <strong>tytoniu</strong> (lata 70-te).<br />
Tytoñ by³ te¿ jedn¹ z pierwszych transgenicznych<br />
roœl<strong>in</strong>, do otrzymania której<br />
niezbêdna by³a transformacja tkanki<br />
i regeneracja z niej pêdów i korzeni<br />
w kulturach <strong>in</strong> <strong>vitro</strong>. Równolegle prowadzone<br />
kultury komórkowe, zawies<strong>in</strong>owe,<br />
<strong>tytoniu</strong> wykaza³y z jednej strony<br />
<strong>ich</strong> wyj¹tkow¹ u¿ytecznoœæ w badaniach<br />
biologii komórki roœl<strong>in</strong>nej, a z<br />
drugiej strony przydatnoϾ do kontrolowanej<br />
biosyntezy u¿ytecznych metabolitów<br />
i biotransformacji (biokonwersji),<br />
czyli ukierunkowanej chemicznej<br />
modyfikacji zwi¹zków obcych wprowadzonych<br />
do takiej kultury. Tytoñ odegra³<br />
rolê modelowej roœl<strong>in</strong>y w badaniach<br />
biologii i zastosowañ biotechnologicznych<br />
roœl<strong>in</strong>.<br />
Tobacco (Nicotiana tabacum) and<br />
related species had played a pioneer<br />
role <strong>in</strong> the development of plant biotechnology.<br />
Already <strong>in</strong> thirties of the<br />
XX century, aseptic <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> cultures<br />
were established as one of the first<br />
plant tissue <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> cultures. In the next<br />
decade the tobacco cultures served for<br />
<strong>in</strong>vestigations of organogenesis – formation<br />
of advetitiuos shoots and roots<br />
– the process important for<br />
micropropagation. In 60-ties of the previous<br />
century, the totipotency of plant<br />
cells, i.e. ability for regeneration of the<br />
full plant from s<strong>in</strong>gle cell, has been<br />
unequivocally proved on the basis of<br />
experiments with tobacco cell cultures.<br />
Moreover, thanks to the tobacco<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong> cultures, the medium for performance<br />
of plant <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> cultures was<br />
elaborated <strong>in</strong> 1962, wh<strong>ich</strong> is the most<br />
frequently used medium till now. Tobacco<br />
was the first plant regenerated<br />
from a protoplast, as well as the first<br />
somatic hybrid and chimera <strong>in</strong> <strong>vitro</strong><br />
were derived from tobacco cultures<br />
(the 70-ies). Tobacco was also one of<br />
the first transgenic plants and for its<br />
formation <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> culture has been<br />
necessary to carry out transformation<br />
of tissue and regeneration of shoots<br />
and roots. Simultaneously preformed<br />
cell suspension culture of tobacco<br />
exhibited, on one hand, exceptional<br />
utility for studies of plant cell biology,<br />
and on the other hand, appeared applicable<br />
for perform<strong>in</strong>g controlled biosynthesis<br />
of useful metabolites and<br />
biotransformation (bioconversion),<br />
that is directed chemical modification<br />
of foreign compounds <strong>in</strong>troduced to<br />
such culture. Tobacco has played the<br />
role of the model plant <strong>in</strong> <strong>in</strong>vestigations<br />
of biology and biotechnological<br />
applications of plants.<br />
Adres do korespondencji:<br />
Dr Anna Budzianowska<br />
Katedra i Zak³ad Botaniki Farmaceutycznej<br />
i Biotechnologii Roœl<strong>in</strong><br />
Uniwersytet Medyczny<br />
im. Karola Marc<strong>in</strong>kowskiego<br />
61-861 Poznañ, ul. Œw. Marii Magdaleny 14<br />
Tel. (+61) 66 87 848; Fax: (+61) 66 87861<br />
e-mail: abudzian@ump.edu.pl<br />
Wstêp<br />
Tytoñ szlachetny – Nicotiana tabacum,<br />
jeden z 67 gatunków rodzaju Nicotiana, nale¿y<br />
do klasy dwuliœciennych, rodz<strong>in</strong>y Solanaceae,<br />
obejmuj¹cej wiele wa¿nych roœl<strong>in</strong><br />
leczniczych, zawieraj¹cych alkaloidy oraz<br />
roœl<strong>in</strong> uprawnych – tak<strong>ich</strong> jak ziemniak, papryka<br />
i pomidor. Wystêpuje w ciep³ych regionach<br />
Ameryki, Australii i Pol<strong>in</strong>ezji i obecnie<br />
uprawiany jest w wiêkszoœci krajów podzwrotnikowych<br />
[5].<br />
Ró¿ne gatunki <strong>tytoniu</strong> (na czele z Nicotiana<br />
tabacum) oprócz znaczenia komercyjnego<br />
w produkcji <strong>tytoniu</strong> jako u¿ywki odegra³y<br />
pioniersk¹ rolê w <strong>rozwoju</strong> <strong>biotechnologii</strong><br />
roœl<strong>in</strong> [17]. Podstawowym narzêdziem<br />
tej dziedz<strong>in</strong>y nauki s¹ kultury <strong>in</strong> <strong>vitro</strong>, czyli<br />
aseptyczne hodowle „w szkle” tkanek, ko-<br />
890 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 10 A. Budzianowska
mórek, organów czy ca³ych roœl<strong>in</strong> na sztucznych<br />
pod³o¿ach, w specjalnych, regulowanych<br />
warunkach. Hodowle <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> roœl<strong>in</strong> sta-<br />
³y siê niezbêdnym elementem szeregu eksperymentów<br />
dotycz¹cych badania fizjologii<br />
i metabolizmu komórek roœl<strong>in</strong>nych, mikrorozmna¿ania,<br />
czyli klonalnego mno¿enia,<br />
uzyskiwania roœl<strong>in</strong> wolnych od wirusów, genetycznej<br />
transformacji, itd. <strong>Kultury</strong> tkankowe<br />
i komórkowe pozwalaj¹ równie¿ na wybiórcz¹<br />
produkcjê po¿¹danych zwi¹zków o<br />
dzia³aniu leczniczym w warunkach laboratoryjnych,<br />
niezale¿nie od klimatu i pory roku.<br />
Jednym z pierwszych, eksperymentalnych<br />
gatunków wykorzystywanych w tej metodzie<br />
by³ w³aœnie tytoñ, z którego ju¿ w latach 30-<br />
tych XX wieku uzyskano, stale wzrastaj¹ce<br />
hodowle tkankowe. W nastêpnych latach<br />
kolejne doœwiadczenia z tytoniem pozwoli-<br />
³y opracowaæ podstawowe metody prowadzenia<br />
tych kultur oraz bezsprzecznie udowodniæ<br />
totipotencjê komórek roœl<strong>in</strong>nych.<br />
Równolegle prowadzone kultury komórkowe,<br />
zawies<strong>in</strong>owe, <strong>tytoniu</strong> wykaza³y z jednej<br />
strony <strong>ich</strong> wyj¹tkow¹ u¿ytecznoœæ w badaniach<br />
biologii komórki roœl<strong>in</strong>nej, a z drugiej<br />
strony przydatnoœæ do biosyntezy u¿ytecznych<br />
metabolitów i sterowania ni¹, jak równie¿<br />
do biotransformacji (biokonwersji), czyli<br />
ukierunkowanej chemicznej modyfikacji<br />
zwi¹zków obcych wprowadzonych do takiej<br />
kultury dziêki dzia³aniu enzymów komórkowych<br />
[12,21].<br />
Tytoñ odgrywa rolê modelowej roœl<strong>in</strong>y<br />
w badaniach biologicznych i biotechnologicznych.<br />
W bie¿¹cej pracy przedstawiono<br />
udzia³ gatunków <strong>tytoniu</strong> w historii kultur <strong>in</strong><br />
<strong>vitro</strong>, rodzaje prowadzonych kultur <strong>in</strong> <strong>vitro</strong><br />
tych roœl<strong>in</strong> i przyk³ady <strong>ich</strong> zastosowañ do<br />
biosyntezy i biotransformacji.<br />
Tytoñ w historii kultur <strong>in</strong> <strong>vitro</strong><br />
Wa¿niejsze zdarzenia z <strong>rozwoju</strong> kultur<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong>, maj¹cych wp³yw na ogólny<br />
rozwój tej dziedz<strong>in</strong>y z zakresu <strong>biotechnologii</strong><br />
roœl<strong>in</strong>, przedstawiono w Tabeli I.<br />
Ju¿ w latach 30-tych XX wieku, na przyk³adzie<br />
rakowej tkanki Nicotiana glauca x<br />
N.langsdorfii stwierdzono, ¿e tkanka roœl<strong>in</strong>na<br />
mo¿e byæ stale utrzymywana w kulturze,<br />
wzrastaæ, a tak¿e wykazuje zdolnoœæ<br />
do ró¿nicowania siê w pêdy i korzenie<br />
[14,17].<br />
Kolejnymi osi¹gniêciami by³y wyniki badañ<br />
tworzenia siê pêdów i korzeni przybyszowych<br />
(organy rozwijaj¹ce siê z merystemów<br />
powstaj¹cych z tkanek sta³ych) pod<br />
wp³ywem regulatorów wzrostu i <strong>rozwoju</strong> roœl<strong>in</strong><br />
oraz <strong>in</strong>dukcji kwitnienia <strong>in</strong> <strong>vitro</strong>. W 1957r.<br />
nast¹pi³o odkrycie regulacji tworzenia organów<br />
z kalusa <strong>tytoniu</strong> przez zmianê stosunku<br />
stê¿enia cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>y do auksyny [12,14].<br />
Procesy te s¹ niezwykle wa¿ne w mikrorozmna¿aniu,<br />
czyli mno¿eniu roœl<strong>in</strong> drog¹ kultur<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong>.<br />
Na podstawie obserwacji White'a<br />
(1934r.), ¿e wirus mozaiki tytoniowej (TMV)<br />
jest nierównomiernie rozmieszczony w ró¿-<br />
nych strefach korzenia <strong>tytoniu</strong>, (stê¿enie<br />
zmniejsza³o siê w kierunku szczytu i koniuszki<br />
korzenia by³y wolne od wirusów,)<br />
opracowano póŸniej (lata 50-te) metodê<br />
uzyskiwania roœl<strong>in</strong> wolnych od wirusów<br />
przez <strong>ich</strong> regeneracjê z kultur merystemów<br />
wierzcho³kowych [12].<br />
Tabela I<br />
Tytoñ w historii kultur <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> roœl<strong>in</strong>*<br />
Tobacco <strong>in</strong> history of plant <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> culture<br />
Rok<br />
Wyniki doœwiadczeñ<br />
1939 rakowa tkanka hybrydy N.glauca x N.langsdorfii jako tkanka roœl<strong>in</strong>na pierwszy raz utrzymywana stale w<br />
kulturze i mo¿liwoœæ ró¿nicowania jej w korzenie i pêdy (White)<br />
1944 pierwsze kultury <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong> u¿yte do badañ tworzenia siê pêdów przybyszowych (Skoog)<br />
1948 formowanie siê przybyszowych korzeni i pêdów <strong>tytoniu</strong> pod wp³ywem proporcji stê¿enia auksyny do<br />
aden<strong>in</strong>y (Skoog i Tsui)<br />
1957 odkrycie regulacji tworzenia organów z kalusa <strong>tytoniu</strong> przez zmianê stosunku stê¿enia cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>y do<br />
auksyny (Skoog i Miller)<br />
1962 opracowanie po¿ywki do kultur <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> roœl<strong>in</strong> (Murashige i Skoog)<br />
1965 <strong>in</strong>dukcja kwitnienia w tkance <strong>tytoniu</strong> <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> (Aghion-Prat)<br />
1965 regeneracja roœl<strong>in</strong> <strong>tytoniu</strong> z pojedynczych wyizolowanych komórek w mikrokulturze (Vasil i Hildebrandt)<br />
1969 analizy kariologiczne roœl<strong>in</strong> zregenerowanych z kultur kalusa (Sacristan en Melchers)<br />
1971 regeneracja ca³ych roœl<strong>in</strong> z protoplastów wyizolowanych z mezofilu liœci <strong>tytoniu</strong> (Takebe i <strong>in</strong>.)<br />
1972 miêdzygatunkowa hybrydyzacja poprzez fuzjê protoplastów dwóch gatunków <strong>tytoniu</strong> (otrzymanie<br />
pierwszej somatycznej hybrydy roœl<strong>in</strong>nej) (Carlson i <strong>in</strong>.)<br />
1974 Pierwsze formowanie chimer w kulturze <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> z pêdów przybyszowych otrzymanych z kalusa N.tabacum<br />
i N.glauca x N.langsdorffii (Carlson i Chaleff)<br />
1981 izolowanie auksotrofów w badaniach przesiewowych du¿ej skali kolonii komórkowych otrzymanych z<br />
haploidalnych protoplastów N.plumbag<strong>in</strong>ifolia traktowanych mutagenami (Siderov i <strong>in</strong>.)<br />
1985 <strong>in</strong>fekcja i transformacja dysków liœciowych <strong>tytoniu</strong> Agrobacterium tumefaciens i regeneracja<br />
transformowanych roœl<strong>in</strong> (Horsch i <strong>in</strong>.)<br />
* [12, 14, 7, 16]<br />
W latach 60-tych ubieg³ego wieku w<br />
doœwiadczeniach z kulturami komórkowymi<br />
<strong>tytoniu</strong> udowodniono bezsprzecznie totipotencjê<br />
komórek roœl<strong>in</strong>nych, czyli zdolnoœæ do<br />
regeneracji kompletnej roœl<strong>in</strong>y z pojedynczej<br />
komórki somatycznej [18,19]. Jest to jedno<br />
z najwa¿niejszych odkryæ dotycz¹cych komórek<br />
roœl<strong>in</strong>nych, o prze³omowym znaczeniu<br />
i daj¹cym nieograniczone wrêcz mo¿liwoœci<br />
zastosowañ.<br />
Równie¿ dziêki kulturom <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong><br />
zosta³a opracowana w 1962 roku przez<br />
Murashige i Skooga [9], najczêœciej stosowana<br />
do dziœ po¿ywka do prowadzenia<br />
aseptycznej hodowli roœl<strong>in</strong>.<br />
Wkrótce tytoñ sta³ siê specjalnie <strong>in</strong>teresuj¹cy<br />
dla badaczy mutagenezy <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> ze<br />
wzglêdu na ³atwoœæ uzyskiwania l<strong>in</strong>ii komórek<br />
i protoplastów haploidalnych z mikrospor<br />
(ziarn py³ku) oraz doœæ prost¹ regeneracjê<br />
roœl<strong>in</strong> z kalusów. W 1969r. po raz pierwszy<br />
uzyskano mutanty <strong>tytoniu</strong> stosuj¹c napromieniowanie.<br />
W póŸniejszym czasie stosowano<br />
mutageny chemiczne i otrzymywano<br />
ró¿ne wyniki m.<strong>in</strong>. roœl<strong>in</strong>y N.tabacum niewra¿liwe<br />
na chorobotwórcze bakterie, antybiotyki,<br />
tolerancyjne na wysokie stê¿enie<br />
NaCl i wiele <strong>in</strong>nych [12,21].<br />
W 1968r. uzyskano kulturê komórkow¹<br />
odmiany hodowlanej <strong>tytoniu</strong> N.tabacum cv.<br />
Bright Yellow No. 2, która sta³a siê modelowym<br />
systemem badania biologii komórki<br />
roœl<strong>in</strong>nej [15].<br />
W latach 70-tych przeprowadzono szereg<br />
doœwiadczeñ dotycz¹cych androgenezy<br />
– opracowano kultury pylników <strong>tytoniu</strong>,<br />
formowanie embrioidów z py³ków i otrzymywanie<br />
roœl<strong>in</strong> haploidalnych t¹ metod¹ [2,13].<br />
Pierwsz¹ somatyczn¹ hybrydê (mieszañca)<br />
roœl<strong>in</strong>n¹ (1972r.) otrzymano poprzez<br />
fuzjê protoplastów dwóch gatunków<br />
<strong>tytoniu</strong>, a w 1974r. po raz pierwszy opisano<br />
powstawanie chimer (roœl<strong>in</strong>y zawieraj¹ce<br />
komórki o ró¿nym genotypie) <strong>in</strong> <strong>vitro</strong>. W<br />
wyniku formowania siê pêdów przybyszowych<br />
z kalusa N.tabacum i mieszañca<br />
N.glauca x N.langsdorffii zregenerowano 28<br />
chimer z ogólnej liczby otrzymanych 7000<br />
roœl<strong>in</strong> [12].<br />
Tytoñ by³ te¿ jedn¹ z pierwszych transgenicznych<br />
roœl<strong>in</strong> (1985r.), do otrzymania<br />
której niezbêdna by³a transformacja tkanki i<br />
regeneracja z niej pêdów i korzeni w kulturach<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong> [7,12].<br />
Sposóby prowadzenia kultur <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong>,<br />
takie jak kultura kalusa, regeneracja<br />
z niej pêdów i korzeni, androgeneza, kultura<br />
protoplastów i <strong>ich</strong> fuzja, transformacja<br />
genetyczna, ze wzglêdu na wysok¹ odtwarzalnoœæ,<br />
s¹ sta³ymi pozycjami w opracowaniach<br />
dotycz¹cych metod doœwiadczalnych<br />
w prowadzeniu kultur <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> roœl<strong>in</strong> [2,12,<br />
13,14,21].<br />
<strong>Kultury</strong> <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong><br />
<strong>Kultury</strong> <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> roœl<strong>in</strong> przypom<strong>in</strong>aj¹ nieco<br />
kultury drobnoustrojów, gdy¿ materia³<br />
roœl<strong>in</strong>ny umieszcza siê na sztucznej po¿ywce<br />
zestalonej agarem w naczyniu laboratoryjnym<br />
(probówka, kolba sto¿kowa, p³ytka<br />
Petriego), w warunkach sterylnych (lo¿a z<br />
nawiewem lam<strong>in</strong>arnym powietrza) i kulturê<br />
przechowuje siê w specjalnym pokoju hodowlanym<br />
z regulacj¹ temperatury, fotoperiodu<br />
(dzieñ/noc) i natê¿enia œwiat³a. Podstawowym<br />
warunkiem jest sterylnoœæ – materia³<br />
roœl<strong>in</strong>ny wyjœciowy do za³o¿enia kultur<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong>, czyli tzw. eksplantat wyja³awia siê<br />
najczêœciej roztworem podchlorynu sodu,<br />
naczynia laboratoryjne – wysok¹ tempera-<br />
Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 10<br />
891
tur¹, po¿ywki – w autoklawie, narzêdzia metalowe<br />
(bezpoœrednio przed u¿yciem) – p³omieniem.<br />
Podstawowa po¿ywka Murashige-<br />
Skoog'a (MS) [9] jest roztworem wodnym<br />
zawieraj¹cym ró¿ne sole m<strong>in</strong>eralne, sacharozê<br />
i witam<strong>in</strong>y, am<strong>in</strong>okwas – glicynê. Dalszy<br />
rozwój wy³o¿onego na po¿ywkê fragmentu<br />
roœl<strong>in</strong>y czêsto zale¿y od suplementacji<br />
po¿ywki roœl<strong>in</strong>nymi regulatorami wzrostu<br />
i <strong>rozwoju</strong>, jak cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>y, auksyny i (rzadko)<br />
giberel<strong>in</strong>y. Z eksplantatu mog¹ rozw<strong>in</strong>¹æ<br />
siê organy (organogeneza bezpoœrednia)<br />
– pêdy, korzenie, somatyczne zarodki<br />
(bezpoœrednia embriogeneza somatyczna)<br />
lub kalus, z którego mo¿na otrzymaæ organy<br />
przybyszowe (organogeneza poœrednia),<br />
kulturê komórkow¹ zawies<strong>in</strong>ow¹ lub zarodki<br />
somatyczne (poœrednia embriogeneza somatyczna)<br />
[2,12,14,21].<br />
<strong>Kultury</strong> kalusa i regeneracja<br />
z n<strong>ich</strong> roœl<strong>in</strong><br />
Kalus w naturze jest tkank¹ przyrann¹,<br />
powstaj¹c¹ wskutek uszkodzenia roœl<strong>in</strong>y. W<br />
kulturach <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> mo¿na go za<strong>in</strong>icjowaæ z<br />
ró¿nych eksplantatów, charakteryzuje siê<br />
zdolnoœci¹ do ci¹g³ych podzia³ów i wiêkszym<br />
lub mniejszym zró¿nicowaniem tkankowym<br />
[12].<br />
Kalus <strong>tytoniu</strong> mo¿na otrzymaæ (za<strong>in</strong>icjowaæ)<br />
z rdzenia ³odygi, który stanowi tkanka<br />
miêkiszowa [13] lub z fragmentów siewek<br />
[14]. Z wyizolowanego rdzenia ³odygi <strong>tytoniu</strong><br />
wy³o¿onego na po¿ywkê MS zawieraj¹c¹<br />
auksynê (IAA, w przewadze) i cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>ê<br />
(k<strong>in</strong>etynê) rozwija siê po dwóch tygodniach<br />
kultura kalusowa, któr¹ po nastêpnych<br />
dwóch tygodniach mo¿na przenosiæ na<br />
now¹ po¿ywkê. Wraz ze zwiêkszaniem stê-<br />
¿enia cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>y obserwuje siê proporcjonalny<br />
wzrost masy kalusa. St¹d kultura kalusa<br />
z rdzenia <strong>tytoniu</strong> nadaje siê do oznaczania<br />
si³y dzia³ania cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>. Z kalusa wy³o¿onego<br />
na po¿ywkê o odpowiedniej proporcji<br />
auksyny do cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>y rozwijaj¹ siê pêdy lub<br />
korzenie, a nawet roœl<strong>in</strong>ki. Kulturê kalusow¹<br />
<strong>tytoniu</strong> mo¿na te¿ ³atwo otrzymaæ z siewek<br />
(jako eksplantatów) otrzymanych przez<br />
skie³kowanie wyja³owionych nasion na po-<br />
¿ywce MS. Po trzech tygodniach siewki tnie<br />
siê i <strong>ich</strong> fragmenty wyk³ada na po¿ywkê MS<br />
z k<strong>in</strong>etyn¹ i IAA (w przewadze), utrzymuje<br />
w ciemnoœci i temperaturze 27-30°C. Po<br />
szeœciu tygodniach kalus odc<strong>in</strong>a siê od eksplantatów<br />
(fragmentów siewek) i pasa¿uje<br />
na tak¹ sam¹ po¿ywkê, na nastêpne 6 tygodni<br />
w celu przyrostu kalusa. Niedawno<br />
wydatnie poprawiono wzrost i stabilnoœæ genetyczn¹<br />
kalusa <strong>tytoniu</strong> przez zamianê w<br />
po¿ywce MS nieorganicznego azotu i fosforu<br />
na organiczny w postaci peptonu sojowego<br />
i kwasu fitowego (heksafosforan <strong>in</strong>ozytolu)<br />
[11].<br />
Roœl<strong>in</strong>y haploidalne<br />
Szczególnymi eksplantatami s¹ ziarna<br />
py³ku, czyli mikrospory, z których, w wyniku<br />
procesu zwanego androgenez¹, mo¿na zregenerowaæ<br />
roœl<strong>in</strong>y haploidalne [13]. Materia³em<br />
wyjœciowym kultur s¹ pylniki zawieraj¹ce<br />
jednoj¹drowe mikrospory wyizolowane<br />
z wyja³owionych nie otwartych p¹czków<br />
kwiatowych <strong>tytoniu</strong> (gdy korona i kiel<strong>ich</strong><br />
maj¹ jednakow¹ d³ugoœæ). Pylniki wyk³ada<br />
siê na po¿ywkê MS bez regulatorów wzrostu.<br />
Z mikrospor rozwijaj¹ siê haploidalne<br />
roœl<strong>in</strong>ki, które po potraktowaniu kolchicyn¹<br />
staj¹ siê roœl<strong>in</strong>ami diploidalnymi – homozygotycznymi.<br />
Zalet¹ <strong>ich</strong> jest utrzymanie po-<br />
¿¹danych cech recesywnych.<br />
Protoplasty i <strong>ich</strong> fuzja<br />
Protoplast to komórka roœl<strong>in</strong>na, z której<br />
usuniêto œcianê komórkow¹. Szczególnie<br />
³atwo jest otrzymaæ protoplasty z mezofilu<br />
(miêkisz zieleniowy) liœcia <strong>tytoniu</strong> [13]. Po<br />
zdjêciu dolnej skórki liœcia i zanurzeniu w<br />
roztworze hipertonicznym mannitolu i nastêpnie<br />
w roztworze enzymów celulolitycznych<br />
i pektynolitycznych nastêpuje uwolnienie<br />
protoplastów, które wydziela siê przez<br />
wirowanie w roztworze sacharozy. Po przeniesieniu<br />
protoplastów na po¿ywkê regeneruj¹<br />
œciany komórkowe.<br />
<strong>Kultury</strong> protoplastów mog¹ s³u¿yæ do<br />
badañ fizjologii. Protoplasty ró¿nych odmian,<br />
gatunków, a nawet rodzajów, mo¿na ³¹czyæ<br />
(fuzja) dzia³aj¹c ró¿nymi czynnikami, np.<br />
polietylenoglikolem (PEG). Z uzyskanych<br />
hybryd po regeneracji œcian komórkowych<br />
mo¿na wyprowadziæ pe³ne roœl<strong>in</strong>y stanowi¹ce<br />
mieszañce somatyczne. Fuzja protoplastów<br />
pozwala na uzyskanie mieszañców<br />
roœl<strong>in</strong>, których nie udaje siê otrzymaæ w sposób<br />
tradycyjny – przez krzy¿owe zapylanie.<br />
Dodatkowo, protoplasty mog¹ byæ bezpoœrednio<br />
transformowane genetycznie z u¿yciem<br />
elektroporacji lub glikolu polietylenowego<br />
i mo¿na z n<strong>ich</strong> uzyskaæ wtedy roœl<strong>in</strong>y<br />
transgeniczne.<br />
Szansa zregenerowania roœl<strong>in</strong> z wyizolowanych<br />
protoplastów jest jednak wzglêdnie<br />
niska. Gatunki nale¿¹ce do rodz<strong>in</strong>y Solanaceae,<br />
w tym Nicotiana regeneruj¹ naj-<br />
³atwiej [12].<br />
Regeneracja roœl<strong>in</strong> transgenicznych<br />
Eksplantatami s¹ liœcie roœl<strong>in</strong> gruntowych<br />
(wymagaj¹ wyja³owienia podchlorynem)<br />
lub liœcie siewek skie³kowanych ze sterylnych<br />
nasion. Z liœci wyc<strong>in</strong>a siê kr¹¿ki, które<br />
wyk³ada siê na po¿ywkê, a po dwóch dniach<br />
umieszcza w zawies<strong>in</strong>ie transgenicznej bakterii<br />
Agrobacterium tumefaciens (15s do 1<br />
m<strong>in</strong>) na p³ytkach Petriego. Nastêpnie po<br />
wysuszeniu kr¹¿ków liœciowych na bibule<br />
filtracyjnej (celem usuniêcia zawies<strong>in</strong>y bakterii)<br />
wyk³ada siê je na po¿ywkê MS z cytok<strong>in</strong><strong>in</strong>¹<br />
(BA w przewadze) i auksyn¹ (NAA)<br />
na 2 dni i nastêpnie przenosi na tak¹ sam¹<br />
po¿ywkê dodatkowo z antybiotykami (kanamycyn¹<br />
i karbenicyl<strong>in</strong>¹) w celu elim<strong>in</strong>acji<br />
bakterii i selekcji transformantów. Po 2-4<br />
tygodniach kultury wyrastaj¹ pêdy, które<br />
przenosi siê na po¿ywkê ukorzeniaj¹c¹ bez<br />
regulatorów wzrostu, zawieraj¹c¹ obydwa<br />
antybiotyki [14].<br />
<strong>Kultury</strong> komórkowe <strong>tytoniu</strong><br />
Szczególnego znaczenia nabra³a kultura<br />
zawies<strong>in</strong>owa l<strong>in</strong>ii komórkowej <strong>tytoniu</strong> o<br />
nazwie BY-2 uzyskana z kalusa z rdzenia<br />
³odygi odmiany hodowlanej <strong>tytoniu</strong> N.tabacum<br />
cv. Bright Yellow No. 2 w Japonii, w<br />
1968 roku [15]. Pod wzglêdem w³aœciwoœci<br />
jest ona porównywalna z l<strong>in</strong>i¹ ludzk<strong>ich</strong> komórek<br />
HeLa. Komórki BY-2 s¹ komórkami<br />
bezzieleniowymi, dziel¹cymi siê niezwykle<br />
szybko na odpowiedniej po¿ywce i w odpowiedn<strong>ich</strong><br />
warunkach – czas podwojenia kultury<br />
wynosi 13 godz<strong>in</strong>, a w ci¹gu tygodnia<br />
liczba komórek mo¿e wzrosn¹æ 100-krotnie.<br />
Co wiêcej bardzo ³atwo mo¿na uzyskaæ kulturê<br />
synchroniczn¹ czyli z³o¿on¹ z komórek<br />
w tej samej fazie cyklu komórkowego. Z<br />
tego wzglêdu l<strong>in</strong>ia komórkowa BY-2 sta³a<br />
siê modelowym systemem badania biologii<br />
komórki roœl<strong>in</strong>nej i jej kompartmentów - podzia³ów<br />
komórkowych w tym cytok<strong>in</strong>ezy, <strong>rozwoju</strong><br />
cytoszkieletu i organelli, sygnalizacji<br />
hormonów roœl<strong>in</strong>nych. Komórki BY-2 s¹<br />
równie¿ podatne na transformacjê genetyczn¹,<br />
co znacznie rozszerzy³o mo¿liwoœci <strong>ich</strong><br />
zastosowañ [1,3,8,20].<br />
Biosynteza w kulturze<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong><br />
Ze wzglêdu na mo¿liwoœæ pe³nej kontroli<br />
nad rozwojem materia³u roœl<strong>in</strong>nego w<br />
kulturze <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> mo¿na w niej sterowaæ równie¿<br />
biosyntez¹ okreœlonych metabolitów.<br />
Nale¿y rozró¿niæ biosyntezê de novo, czyli<br />
ze sk³adników pokarmowych po¿ywki oraz<br />
biosyntezê z prekursorów, czyli zwi¹zków<br />
poœredn<strong>ich</strong> danego szlaku biosyntezy dodawanych<br />
do po¿ywki. Przyk³adem badañ<br />
dotycz¹cych obydwu rodzajów biosyntezy<br />
s¹ badania nad biosyntez¹ kwasu chlorogenowego<br />
w kulturze komórkowej zawies<strong>in</strong>owej<br />
Nicotiana plumbag<strong>in</strong>ifolia [4]. Kwas<br />
chlorogenowy to estrowe po³¹czenie kwasu<br />
kawowego i ch<strong>in</strong>owego o w³aœciwoœciach<br />
przeciwutleniaj¹cych, hamuj¹cych glikogenolizê,<br />
obni¿aj¹cych poziom cukru we krwi.<br />
Badania wp³ywu warunków kultury na akumulacjê<br />
tego zwi¹zku wykaza³y, ¿e hamowana<br />
jest ona w ciemnoœci. Wzbogacanie<br />
po¿ywki o kwas kawowy nieoczekiwanie<br />
zmniejsza³o zawartoœæ kwasu chlorogenowego,<br />
w miejsce którego powstawa³y trzy<br />
nowe niezidentyfikowane zwi¹zki. Natomiast<br />
wzbogacanie po¿ywki o kwas ch<strong>in</strong>owy pozosta³o<br />
bez wp³ywu.<br />
W <strong>tytoniu</strong> mo¿na produkowaæ zwi¹zki<br />
obce dla tego gatunku dziêki <strong>in</strong>¿ynierii metabolicznej,<br />
polegaj¹cej na wprowadzeniu do<br />
komórek genu enzymu – katalizatora tej syntezy.<br />
Z kolei poziom zachodz¹cej ju¿ syntezy<br />
mo¿na zwiêkszyæ (elicytowaæ) za pomoc¹<br />
jasmonianu metylu, który jest zwi¹zkiem<br />
stresowym (elicytorem) nasilaj¹cym biosyntezê<br />
metabolitów wtórnych w roœl<strong>in</strong>ach.<br />
Przyk³adem w kulturach Nicotiana tabacum<br />
jest <strong>in</strong>¿ynieria biosyntezy limonenu, lotnego<br />
zwi¹zku monoterpenowego, zapachowego<br />
(aromat cytryny) maj¹cego zastosowanie<br />
w przemyœle spo¿ywczym i kosmetycznym<br />
[10]. Do komórek <strong>tytoniu</strong> wprowadzono<br />
nie wystêpuj¹cy w nim gen (cDNA) enzymu<br />
syntazy limonenu pochodz¹cego z<br />
<strong>in</strong>nej roœl<strong>in</strong>y (Perilla frutescens) przez transformacjê<br />
za poœrednictwem bakterii Agrobacterium.<br />
Zastosowano trzy ró¿ne konstrukty<br />
genowe, tak aby gen zosta³ wprowadzony<br />
albo do plastydów albo cytozolu<br />
albo do retikulum endoplazmatycznego<br />
(RE). Substratem tego enzymu jest difosforan<br />
geranylu, konstytutywny dla <strong>tytoniu</strong> jako<br />
prekursor biosyntezy karotenoidów i fitosteroli,<br />
ale nie monoterpenów. Stwierdzono<br />
najwiêksz¹ aktywnoœæ enzymu zlokalizowanego<br />
w plastydach, ni¿sz¹ w cytozolu i brak<br />
jego aktywnoœci w RE. Stwierdzono, ¿e liœcie<br />
zregenerowanych transgenicznych roœl<strong>in</strong><br />
produkuj¹ limonen <strong>in</strong> vivo, którego za-<br />
892 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 10 A. Budzianowska
wartoœæ wzrasta³a oko³o trzykrotnie po potraktowaniu<br />
jasmonianem metylu. Oznaczono<br />
równie¿ miesiêczn¹ emisjê limonenu<br />
przez hodowane w kolbach transgeniczne<br />
roœl<strong>in</strong>y <strong>tytoniu</strong> wysokoœci 12 cm. Ostatecznie<br />
autorzy tych eksperymentów stwierdzili,<br />
¿e produktywnoœæ limonenu przez tytoñ jest<br />
niska (reprezentacyjna l<strong>in</strong>ia produkowa³a<br />
143 nanog/g œwie¿ej masy liœcia). Wykazano<br />
jednak mo¿liwoœæ <strong>in</strong>¿ynierii metabolicznej<br />
monoterpenów w <strong>tytoniu</strong> i nakreœlono<br />
kierunki dalszych badañ w celu poprawienia<br />
wydajnoœci.<br />
Biotransformacje w kulturze <strong>in</strong> <strong>vitro</strong><br />
<strong>tytoniu</strong><br />
Biotransformacja w <strong>biotechnologii</strong> polega<br />
na chemicznej modyfikacji zwi¹zku obcego<br />
(egzogennnego) dla fizjologii danej<br />
komórki przez enzymy tej komórki, co jest<br />
mo¿liwe dziêki niezbyt œcis³ej specyficznoœci<br />
substratowej tych enzymów. Przyk³adem<br />
tego zjawiska z wykorzystaniem kultur komórkowych<br />
<strong>in</strong> <strong>vitro</strong> <strong>tytoniu</strong> jest biotransformacja<br />
hydroksykumaryn do <strong>ich</strong> glukozydów<br />
[6]. Stwierdzono, ¿e hydrokumaryny wywo-<br />
³ywa³y fragmentacjê genomowego DNA i<br />
wydzielanie do pod³o¿a kultury wewn¹trzkomórkowej<br />
fitoaleksyny (zwi¹zek o funkcji<br />
obronnej wydzielany na skutek czynników<br />
stresowych odzia³ywuj¹cych na roœl<strong>in</strong>ê) -<br />
skopoletyny (zwi¹zek kumarynowy). Równoczeœnie<br />
egzogenne hydroksykumaryny<br />
ulega³y transformacji do <strong>ich</strong> beta-D-glukozydów,<br />
które nie powoduj¹ fragmentacji<br />
DNA. Badania te wykaza³y, z jednej strony<br />
zdolnoœæ komórek do glukozydacji egzogennych<br />
zwi¹zków fenolowych, stwierdzonej<br />
tak¿e u <strong>in</strong>nych roœl<strong>in</strong>, jak i mechanizm reakcji<br />
obronnej <strong>tytoniu</strong> na te zwi¹zki.<br />
Podsumowanie<br />
Tytoñ w kulturach <strong>in</strong> <strong>vitro</strong> wystêpuje w<br />
postaci kalusa, organów – pêdów, korzeni,<br />
ca³ych roœl<strong>in</strong>, komórek w zawies<strong>in</strong>ie i protoplastów.<br />
Otrzymuje siê z niego l<strong>in</strong>ie haploidalne<br />
i transformowane genetycznie, mutanty<br />
i hybrydy. Przebadano na nim mo¿liwoœci<br />
biosyntezy i biotransformacji <strong>in</strong> <strong>vitro</strong>.<br />
By³ i jest jedn¹ z najwa¿niejszych roœl<strong>in</strong> eksperymentalnych<br />
w <strong>biotechnologii</strong> roœl<strong>in</strong>. Tym<br />
samym przyczyni³ siê do odkrycia zjawisk o<br />
potencjalnym zastosowaniu dla dobra ludzkoœci.<br />
Tytoñ wiêc to nie tylko u¿ywka, niew¹tpliwie<br />
dla pal¹cych przyjemna, lecz nios¹ca<br />
zagro¿enie zdrowia i ¿ycia, ale bardzo<br />
u¿yteczna, cenna roœl<strong>in</strong>a badawcza.<br />
Piœmiennictwo<br />
1. Benchabane M., Sa<strong>in</strong>t-Jore-Dupas C. et al.: Target<strong>in</strong>g<br />
and post-translational process<strong>in</strong>g of human<br />
a1-ant<strong>ich</strong>ymotryps<strong>in</strong> <strong>in</strong> BY-2 tobacco cultured cells.<br />
Plant Biotechnol. J. 2009, 7, 146.<br />
2. Dodds J.H., Roberts L.W.: Experiments <strong>in</strong> Plant Tissue<br />
Culture (Third Edition). Cambridge University<br />
Press, New York 1995.<br />
3. Gális I., Simek P., Narisawa T. et al.: A novel R2R3<br />
MYB transcription factor NtMYBJS1 is a methyl<br />
jasmonate-dependent regulator of phenylpropanoid<br />
conjugate biosynthesis <strong>in</strong> tobacco. Plant J. 2006, 46,<br />
573.<br />
4. Gilleta F., Mesnard F., Fl<strong>in</strong>iauxa O. et al.:<br />
Chlorogenic acid <strong>in</strong> a Nicotiana plumbag<strong>in</strong>ifolia cell<br />
suspension. Plant Physiol. Biochem., 1999, 37, 869.<br />
5. Hickey M., K<strong>in</strong>g C.: Common Families of Flower<strong>in</strong>g<br />
Plants. Cambridge University Press 2005.<br />
6. Hirata T., Shimoda K., Fuj<strong>in</strong>o T.: Biotransformation<br />
of hydroxycoumar<strong>in</strong>s by the cultured cells of Nicotiana<br />
tabacum. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 2000, 10,<br />
477.<br />
7. Horsch R.B., Fry J.E., Hoffman N.L. et al.: A simple<br />
and general method of transferr<strong>in</strong>g genes <strong>in</strong>to<br />
plants. Science 1985, 227, 1229.<br />
8. Lienard D., Tran D<strong>in</strong>h O., van Oort E. et al.: Suspension-cultured<br />
BY-2 tobacco cells produce and<br />
mature immunologically active house dust mite allergens.<br />
Plant Biotechnol. J. 2007, 5, 93.<br />
9. Murashige T., Skoog F.: A revised medium for rapid<br />
growth and bioassays with tobacco tissue cultures.<br />
Physiol. Plant. 1962, 15, 473.<br />
10. Ohara K., Ujihara T., Endo T. et al.: Limonene production<br />
<strong>in</strong> tobacco with Perilla limonene synthase<br />
cDNA. J. Exp. Botany, 2003, 54, 2635.<br />
11. Parc G., Rembur J., Rech P., Chriqui D.: In <strong>vitro</strong><br />
culture of tobacco callus on medium conta<strong>in</strong><strong>in</strong>g peptone<br />
and phytate leads to growth improvement and<br />
higher genetic stability. Plant Cell Reports 2007, 26,<br />
145.<br />
12. Pierik R.L.M.: In <strong>vitro</strong> Culture of Higher Plants.<br />
Mart<strong>in</strong>us Nijhoff Publishers Dordrecht 1987.<br />
13. Re<strong>in</strong>ert J., Yeoman M.M.: Plant Cell and Tissue<br />
Culture. A Laboratory Manual. Spr<strong>in</strong>ger- Verlag Berl<strong>in</strong><br />
Heidelberg New York1982.<br />
14. Smith R.H.: Plant tissue culture. Techniques and<br />
experiments. Second edition. Academic Press San<br />
Diego 2000.<br />
15. Strona <strong>in</strong>ternetowa organizacji RIKEN (Japonia):<br />
http://mrg.psc.riken.go.jp/strc/BY-2.htm (dostêp dnia<br />
27 sierpnia 2009).<br />
16. Takebe I., Labib G., Melchers G.: Regeneration of<br />
whole plants from isolated mesophyll protoplasts of<br />
tobacco. Naturwiss. 1971, 58, 318.<br />
17. Vasil I.K.: A short history of plant biotechnology.<br />
Phytochem. Rev. 2008, 7, 387-394.<br />
18. Vasil V., Hildebrandt A.C.: Differentiation of tobacco<br />
plants from s<strong>in</strong>gle, isolated cells <strong>in</strong> microcultures.<br />
Science 1965, 150, 889.<br />
19. Vasil V., Hildebrandt A.C.: Further studies on the<br />
growth and differentiation of s<strong>in</strong>gle, isolated cells of<br />
tobacco <strong>in</strong> <strong>vitro</strong>. Planta 1967, 75, 139.<br />
20. Yang S.W., J<strong>in</strong> E.S., Chung I.K., Kim W.T.: Cell<br />
cycle-dependent regulation of telomerase activity by<br />
aux<strong>in</strong>, abscisic acid and prote<strong>in</strong> phosphorylation <strong>in</strong><br />
tobacco BY-2 suspension culture cells. Plant J. 2002,<br />
29, 617.<br />
21. Zenkteler M. (red.): Hodowla komórek i tkanek<br />
roœl<strong>in</strong>nych. Praca zbiorowa. Pañstwowe Wydawnictwo<br />
Naukowe, Warszawa 1984.<br />
Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 10<br />
893