Κινητική Î•Î½Î¶Ï Î¼Î¹ÎºÏŽÎ½ Αντιδράσεων

Χαρακτηριστική ιδιότητα και λειτουργία των ενζύµων, είναι ηκατάλυση των χηµικών αντιδράσεων. Μελέτη της καταλυτικής δράσης, πρέπει να βασίζεται στονποσοτικό προσδιορισµό της ταχύτητας της χηµικήςαντίδρασης που καταλύεται. Από τη µελέτη της µεταβολής της ταχύτητας, καταλήγουµεσε συµπεράσµατα χρήσιµα για τη δοµή και για το µηχανισµόδράσης των ενζύµων ( κυρίως όταν το ένζυµο είναι υψηλήςκαθαρότητας).Η µελέτη της ενζυµικής κινητικής είναι σηµαντική και γιαπρακτικούς λόγους: Ο ορισµός ικανοποιητικών µονάδων (Units) απαιτεί ναγνωρίζουµε τις βέλτιστες συνθήκες (pΗ, θερµοκρασία κ.λπ.) για τηδράση του ενζύµου, καθώς και την επίδραση των διαφόρων παραγόντων(αναστολείς, ενεργοποιητές κ.λπ.) σ’ αυτήν.

Η γνώση της ενζυµικής κινητικής βοηθάει: στην κατανόηση των βιολογικών φαινοµένων τα οποία,είναι πολύ ευαίσθητα σε αλλαγές θερµοκρασίας, pΗ κ.λπ. στην επίλυση του ερωτήµατος “µε ποιο τρόπο δρουν ταένζυµα µέσα στο κύτταρο”. Για όλους τους παραπάνω λόγους, η ενζυµική κινητική ήκινητική ενζυµικών αντιδράσεων, έχει εξελιχθεί σε έναιδιαίτερο επιστηµονικό κλάδο. Στην ενζυµική κινητική πρωταρχικό ρόλο παίζει η µελέτητης ταχύτητας (v) της ενζυµικής αντίδρασης σε συνάρτηση µετους διάφορους παράγοντες που επιδρούν σ’ αυτήν, µε επίκεντρο τη µελέτη της σχέσης µεταξύ της ταχύτηταςτης ενζυµικής αντίδρασης και της συγκέντρωσης του ενζύµου (Ε) και του υποστρώµατος (S).

ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ∆ΡΑΣΗΣ ΤΩΝΕΝΖΥΜΩΝ Μερικά µόνο ένζυµα µπορούν να προσδιοριστούν µεάµεσες φασµατοµετρικές µεθόδους. Η παρουσία των περισσοτέρων ενζύµων πιστοποιείταιαπό τη θετική έκβαση των συγκεκριµένων αντιδράσεων πουκαταλύουν Το ποσό των ενζύµων υπολογίζεται από την ταχύτητα τηςαντίδρασης. Η µέτρηση λοιπόν της ταχύτητας της αντίδρασης, είναι τοπιο σηµαντικό κοµµάτι των τεχνικών που χρησιµοποιούνταιστη µελέτη των ενζύµων.

Για να αποφευχθούν οι παραπάνω λόγοι, υιοθετήθηκε ηµέτρηση της αρχικής ταχύτητας, κατά την οποία οιπαραπάνω λόγοι δεν έχουν τη χρονική δυνατότητα ναπαρέµβουν. Κατά τη µελέτη των ενζύµων, είναι απόλυτα αναγκαίο ναπροσδιορίζεται η επίδραση στην αρχική ταχύτητα ενόςπαράγοντα (pΗ, θερµοκρασία, συγκέντρωση ενζύµου κ.λπ.)κάθε φορά. Για τη µέτρηση της αρχικής ταχύτητας, επιλέγεται συνήθωςένας τέτοιος χρόνος, ώστε η αλλοίωση του υποστρώµατος,να είναι κάτω από το 20% της συνολικής. Μέχρι αυτού του ορίου, οι καµπύλες της ταχύτητας, σεσυνάρτηση µε το µεταβαλλόµενο παράγοντα είναι συνήθωςευθείες γραµµές.

ΕΠΙ∆ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣΣΤΗΝ ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΗΣ Η πλειοψηφία των ενζυµικών αντιδράσεων περιλαµβάνειπερισσότερα από ένα υποστρώµατα.Ακόµα και στις υδρολάσες, οι οποίες συχνά θεωρούνταιαντιδράσεις ενός υποστρώµατος, το δεύτερο υπόστρωµα(το Η 2 Ο) υπάρχει σε υψηλές συγκεντρώσεις, και το ένζυµονα είναι κορεσµένο στο Η 2 Ο σε όλες τις χρονικές στιγµές. Αν και η περίπτωση των ενζυµικών αντιδράσεων ενόςυποστρώµατος είναι σπάνια στα βιοχηµικά συστήµατα, παρ’όλ’ αυτά αντιπροσωπεύει ένα χρήσιµο µοντέλο για τηνανάπτυξη της θεωρίας της ενζυµικής κινητικής και ταπερισσότερα συµπεράσµατα που εξάγονται βρίσκουνεφαρµογή και στα πιο πολύπλοκα ενζυµικά συστήµατα. Για τους λόγους αυτούς, θα αναπτυχθεί κυρίως η κινητικήτων ενζυµικών αντιδράσεων µε ένα υπόστρωµα πριναναφερθούν οι περιπτώσεις των ενζύµων µε πολλάυποστρώµατα.

Η συγκέντρωση του υποστρώµατος [S], είναι ένας από τουςσηµαντικότερους παράγοντες που επιδρούν στην ταχύτητα[v], των ενζυµικών αντιδράσεων. Σε µια πρώτης τάξης µη εvζυµική αvτίδραση, η µεταβoλήτης ταχύτητας, καθώς αυξάvει η συγκέντρωση τουυποστρώµατος, είvαι σταθερή και η καµπύλη v = f(S) είvαιευθεία. Στις περισσότερεςπεριπτώσεις σε µιαενζυµική αντίδραση,το διάγραµµα της αρχικήςταχύτητας (ν) συναρτήσειτης συγκέντρωσηςτου υποστρώµατοςέχει τη µορφήκαµπύλης υπερβολής.

Στις ενζυµικές αντιδράσεις ακολουθείται κινητική κορεσµού.Σε χαµηλές [S], η v εξαρτάται τόσο από τη [S] όσο και απότη [E]. Από µία τιµή [S] και µετά (όταν το Ε έχει κορεσθεί από το S)η v είναι ανεξάρτητηαπό τη [S] καιεξαρτάται µόνοαπό τη [E]. ∆ηλαδή, σε υψηλέςτιµές [S], το E έχεικορεσθεί απότο S και η v έχειαποκτήσει τηµέγιστη τιµή τηςτο Vmax.

Tο 1902, οι Βrown και Ηenri πρότειναν ότι το ένζυµοδηµιουργεί αρχικά ένα σύµπλοκο µε το υπόστρωµα, τοοποίο διασπάται στη συνέχεια σε ένζυµο και σταπροϊόντα της αντίδρασης (Ρ)Ε + S ES (1) και ES → E + P (2)όπου οι κ 1 , κ -1 και κ 2 σταθερές ταχύτητας,µε διαστάσεις Μ -1 sec -1 για την κ 1 καιsec -1 για τις κ -1 και κ 2 . Tο 1913, οι Μichaelis - Μenten απέδωσαν µε µαθηµατικότρόπο το µηχανισµό δράσης των ενζύµων, στηριζόµενοιστην ιδέα της δηµιουργίας του ενδιάµεσου συµπλόκουενζύµου-υποστρώµατος.

Θεωρία των Μichaelis - Μenten(παραδοχή αποκατάστασης ισορροπίας) Βασίζεται στη γενική παραδοχή ότι έχει αποκατασταθεί µιαισορροπία στο σύστηµα.Oι σηµαντικές παραδοχές είναι οι εξής:κ 1 Η αντίδραση µεταξύ του Ε και του S, Ε + S ES (1)παραµένει σε ισορροπία και οποιαδήποτε επίδραση της αντίδρασης ES → E + P (2)κστην (1), θεωρείται αµελητέα.2 Οι συνθήκες αυτές επιτυγχάνονται όταν ο ρυθµόςδιάσπασης του συµπλόκου ΕS προς Ε και S είναι πολύµεγαλύτερος από το ρυθµό διάσπασής του σε Ε και Ρ(δηλαδή κ -1 >>κ 2 ). Η συγκέντρωση του ελεύθερου S παραµένει σχεδόναµετάβλητη κατά την αρχική περίοδο της αντίδρασης,και ισούται µε τη συγκέντρωση του ολικού S,δηλαδή [S] = [St].κ -1

Η σταθερά διάστασης (Κs) του συµπλόκου ΕS ορίζεται ως[E][S]K = =κ -1S( 3)[ES] κΟι διαστάσεις της Κs είναι sec-1/M-1 sec-1=M,δηλαδή η Κs έχει διαστάσεις συγκέντρωσης. Στην (3) ισχύει η σχέση [Ε] = [Εt] - [ΕS] (4)Η ταχύτητα της συνολικής αντίδρασης, µε βάση τηναντίδραση ES → E + P (2) δίνεται από τον τύπο Με αντικατάσταση της [Ε] από την εξίσωση (4) στηνεξίσωση (3) λαµβάνεται η κάτωθι εξίσωση (6)+1dPv = = κ 2 [ ΕS] ( 5dt([ E ] - [ES]) [S]K =t( 6 )S[ES])

Η εξίσωση (6) αν λυθεί ως προς [ΕS] και αντικατασταθείστην εξίσωση (5) λαµβάνεται η εξίσωση (7)v=κ 2 [ Et][S][S] + KS Όταν η [S] είναι πολύ µεγάλη σε σύγκριση µε την Κ S(δηλαδή Κ S /S τείνει στο 0), τότε η v ισούται µε το γινόµενοκ 2 [Εt] και έχει ήδη ορισθεί σαν Vmax.(7)v=κ2[ Et[S]][S]= κ2[Εt] (8) Άρα η εξίσωση (8) µπορεί να γραφείv=Vmax[S][S] + KS(9)

Η σταθερά διάστασης του συµπλόκου (Κ S ) ονοµάζεταισταθερά Μichaelis - Μenten (Κ Μ ) και η εξίσωση (9)v=Vmax[S][S] + KS(9)παίρνει την τελική µορφή της εξίσωσης Μichaelis- Μenten(10)v=Vmax[S][S] + KM( 10)

Θεωρία των Βriggs – Ηaldane(παραδοχή της αποκατάστασης σταθεροποιηµένηςκατάστασης) Μία διαφορετική µαθηµατική προσέγγιση για τον τρόποδράσης των ενζύµων, αποδόθηκε το 1925 από τους Βriggsκαι Ηaldane.Η θεωρία τους βασίστηκεστην παραδοχήότι σε κάθε χρονικήστιγµή, ο ρυθµός σχη-µατισµού και διάσπασηςτου συµπλόκουΕS είναι σχεδόν ίσος,έτσι ώστε να αποκαθίσταταιµια δυναµικήισορροπία(steady state).

Με βάση τη θεωρία αποκατάστασης σταθεροποιηµένηςκατάστασηςκ 1 κ 2Ε + S ES → E + Pισχύει ότικ -1d [ES]= κ 1[E][S] - κ -1[ES] -κ2 [ES] = 0 ( 11)dt[Ε] = [Εt] - [ΕS] (4)dPv = = 2 [ S] ( 5 )dtκΕΛύνοντας την (4) ως προς [Ε] και αντικαθιστώντας την τιµήαυτή στην (11), η οποία λύνεται στη συνέχεια ως προς [ES]και αντικαθιστώντας την τιµή αυτή στην (5) προκύπτει ησχέση

v=κ 2 [ Et] κ 1[S]κ 1[S] + κ -1+κ 2v=V max [S]-1+2[S] +κ κκ 1( 12 ) Ονοµάζοντας το κλάσµα (κ -1+ κ 2)/κ 1= Κ Μ, η τελευταίαεξίσωση είναι ίδια µε την εξίσωση των Μichaelis-Μenten, µεεξαίρεση ότι η Κ Sέχει αντικατασταθεί από την Κ Μόπουκ1+ κ22KM= − = KκS+ (13)κκ +1 Η Κ Μ έχει διαστάσεις συγκέντρωσης διότι τόσο η Κ S όσο και ο λόγος κ 2 /κ 1 =sec -1 /M -1 sec -1 =M,έχουν διαστάσεις συγκέντρωσης.1

Φυσική σηµασία των σταθερών Κ Μ και Vmax Για τον πλήρη ορισµό της φυσικής σηµασίας της σταθεράςΚ Μ πρέπει να είναι γνωστές οι τιµές των σταθερών ταχύτηταςαφού µε βάση την εξίσωσηκ1+ κ22KM= − = KκS+ (13)κκ +1µπορεί να ισχύουν οι σχέσεις: κ -1 >> κ 2 κ -1 = κ 2 κ -1 < < κ 21

Κ Μ = κ -1 + κ 2κ 1 κ 2Ε + S ES → E + Pκ -1κ +1κ +1Κ S = κ -1 Αν κ -1 > > κ 2 , τότε η εξίσωση απλοποιείται καιη Κ Μ ισούται µε την Κ S καιισχύει η παραδοχή της αποκατάστασης ισορροπίας πουέγινε στη θεωρία Μichaelis-Μenten,δηλαδή είναι η σταθερά διάστασης του συµπλόκουενζύµου- υποστρώµατος. Αν κ -1 = κ 2 , τότε η εξίσωση παραµένει ως έχει καιη Κ Μ έχει την τιµή που βγαίνει από την παραδοχή τηςαποκατάστασης σταθεροποιηµένης κατάστασης.

κ 1Ε + S ES → E + Pκ -1Κ Μ = κ -1 + κ 2Κ S = κ -1κκ +1+1 Αν κ -1 < < κ 2 , τότε η Κ Μ ισούται µε κ 2 /κ 1 δηλαδή δεν είναιπαρά ο λόγος δύο σταθερών ταχύτητας των δύο διαδοχικώνκαι πρακτικά µη αµφίδροµων αντιδράσεωνκ 1 κ 2E + S ES E + Pόπου το αποτέλεσµα εξαρτάται πλέον από τη σχέση µεταξύκ 2 και κ 1 δηλαδή αν κ 2 κ 1κ 2

Με άλλα λόγια, η εξίσωση Michaelis-Menten µπορεί ναθεωρηθεί µερική περίπτωση της γενικής εξίσωσης τηςΘεωρία των Βriggs – Ηaldane που ισχύει όταν η ταχύτηταδιάσπασης του [ES] προς E+P είναι αµελητέα (δηλαδή η κ 2είναι πολύ µικρότερη της κ -1 ). Από τα παραπάνω φαίνεται ότι αν η ταχύτητα µιαςενζυµικής αντίδρασης ανταποκρίνεται στην εξίσωσηΜichaelis-Μenten, δε σηµαίνει ότι ανταποκρίνεται και στοπρότυπό της, δηλαδή ότι η Κ Μ είναι σταθερά διάστασης τουσυµπλόκου και ισούται µε την Κ S .Vmax Αν στις εξισώσεις των δύο θεωριώνv=δώσουµε v=Vmax/2, προκύπτει ότι[S]+KΚ Μ =[S], αλλά και το αντίστροφο. ∆ηλαδή η Κ Μ ισούται µε εκείνη τησυγκέντρωση υποστρώµατος, στηνοποία η ταχύτητα της αντίδρασης έχειτη µισή τιµή της µέγιστης ταχύτητας.[S]M

Η σταθερά Κ Μ όπως φαίνεται έχει µονάδες συγκέντρωσης και αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά του ενζύµου γιασυγκεκριµένο υπόστρωµα. Επιπλέον, όσο µεγαλύτερη είναι η τιµή της Κ Μ , δηλαδή(όσο περισσότερο ποσό υποστρώµατος απαιτείται για νααποκτήσει ηαντίδρασηv = Vmax/2) τόσο µικρότερηείναιη τάση σύνδεσης(χηµική συγγένεια)µεταξύ Ε και S καιαντίστροφα.

Τo Κ Μ είvαι σπoυδαία σταθερά χαρακτηριστική τoυεvζύµoυ, έστω και αv δεv είvαι γvωστή η ακριβής σηµασία της, αφoύ καθoρίζει τηv πoσoτική εξάρτηση τoυ S από τoE. Η Κ Μ αποτελεί λοιπόν ποσοτική έκφραση της αντίδρασηςσχηµατισµού του συµπλόκου ΕSΕ + S → ΕSδείχνει την χηµική συγγένεια του Ε και S και είναι ανεξάρτητηαπό τη συγκέντρωση του ενζύµου. Η Vmax αποτελεί ποσοτική έκφραση της αντίδρασηςδιάσπασης του ΕSΕS → Ε + Ρκαι εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ενζύµου.

Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αρχική ταχύτητα τωνενζυµικών αντιδράσεων, επιδρώντας είτε στο σχηµατισµό του συµπλόκου, είτε στη διάσπασή του, είτε και στα δύο,µεταβάλλουν τις τιµές των Κ Μ και Vmax. Όταν είναι γνωστή η µοριακή συγκέντρωση του ενζύµου,τότε το Vmax εκφράζεται σε µονάδες ποσότητας (mol/L=M)αντιδρώντος υποστρώµατος (ή σχηµατιζόµενου προϊόντος)ανά µονάδα χρόνου, για συγκεκριµένη συγκέντρωσηενζύµου, δηλαδή έχει µονάδες Μ.min -1 . Αν στην εξίσωση Vmax = κ 2 [Εt] θεωρηθεί ότι η [Εt]=1mol/L,προκύπτει ότι Vmax =κ 2 (min -1 ). Για το λόγο αυτό, το κ 2 ονοµάζεται αριθµός ανακύκλωσηςκαι δηλώνει πόσα µόρια υποστρώµατος αλλοιώνονται απόένα µόριο ενζύµου στη µονάδα του χρόνου. Ο αριθµός ανακύκλωσης αποτελεί επίσης χαρακτηριστικήσταθερά του ενζύµου για συγκεκριµένο υπόστρωµα

Γραφικές παραστάσεις της εξίσωσης Michaelis-Menten. Υπολογισµός των Κ Μ και Vmax Η εξίσωση Μichaelis-Μenten µπορεί να αποδοθεί σε πολλάδιαγράµµατα διαφορετικών τύπων, όπου το µόνο πουαπαιτείται είναι ο προσδιορισµός της αρχικής ταχύτητας σεδιαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώµατος. Με κατάλληλoυς µετασχηµατισµoύς της εξίσωσηςMichaelis-Menten πρoκύπτoυv και εξισώσεις µε τιςακόλoυθες γραφικές παραστάσεις. Από τις γραφικές αυτές παραστάσεις µπoρoύv vαυπoλoγιστoύv τα Κ Μ και Vmax εvός εvζύµoυ.

Στις δύo πρώτες περιπτώσεις, για vα βρεθεί τo Vmax καιστη συvέχεια από αυτό τo Κ Μ απαιτoύvται µεγάλες τιµές της[S], πράγµα δύσκoλo πειραµατικά.

Αυτό δε συµβαίvει για τις τρεις άλλες περιπτώσεις, πoυχρησιµoπoιoύvται αραιέςσυγκεvτρώσεις υπoστρώµατoςγια τη χάραξη της καµπύληςκαι τηv εύρεση, στη συvέχεια,τωv Vmax και Κ Μ .Οι περιπτώσεις αυτές έχουν τοµειονέκτηµα ότι συνήθως οι τιµές[S] που απαιτούνται για ναµετρηθούν µεγαλύτερες τιµές τηςv (δηλαδή κοντά στη Vmax) είναιυπερβολικά µεγάλες, µε αποτέλεσµανα χρησιµοποιούνταιαραιότερες συγκεντρώσεις [S]και να προκύπτουν µεγάλασφάλµατα.

Επίδραση της συγκέvτρωσης τoυ υπoστρώµατoςστηv ταχύτητα της αvτίδρασηςµε αδιάλυτα υπoστρώµατα Tα ένζυµα δρουν συνήθως σε υποστρώµατα τα οποία είναισε διάλυµα. Στην περίπτωση πουτο S που προστίθεταιπαραµένει αδιάλυτο,η περίσσεια αυτού δενείναι διαθέσιµη για ναδράσει το ένζυµο. Tότε, ακολουθείταιη καµπύλη Μichaelis-Μenten µόνο µέχρι τοόριο διαλυτοποίησης.

Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις υποστρώµατος δενπαρουσιάζεται αύξηση της ταχύτητας, η οποία άλλωστε δεφθάνει ποτέ στη µέγιστη τιµή της (Vmax).

Υπάρχουν ένζυµα τα οποία απαιτούν για τη δράση τουςτο υπόστρωµα να έχει τη µορφή γαλακτώµατος (γιατίµόνο τότε µπορεί να σχηµατισθεί το σύµπλοκο ενζύµουυποστρώµατος). Έvα χαρακτηριστικό παράδειγµα είvαι η περίπτωση τηςπαγκρεατικής λιπάσης.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣΑΠΟ ΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ Η ταχύτητα της εvζυµικής αvτίδρασης είvαι αvάλoγηπρoς τη συγκέvτρωση τoυ εvζύµoυ (όταν όλα τα άλλασυστατικά του ενζυµικού συστήµατος διατηρούνταισταθερά) µόvo στηv περίπτωση πoυ δύo µόρια εvζύµoυδρoυv αvεξάρτητα στo διάλυµα πράγµα τo oπoίo σηµαίvει ότι µεταφέρoυv(αλλoιώvoυv) διπλάσια µόρια υπoστρώµατoς απόόσα µεταφέρει τo έvα µόριo εvζύµoυ δηλαδή v = κ[Ε].Όµως, κατά τηv πειραµατική µελέτη της ταχύτητας σεσυvάρτηση µε τη συγκέvτρωση τoυ εvζύµoυ,διαπιστώvovται απoµακρύvσεις από τηv ευθεία.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟ pH Ένας από τους κυριότερους παράγοντες που επιδρά στηνταχύτητα της ενζυµικής αντίδρασης είναι το pΗ του όλουενζυµικού συστήµατος. Οποιαδήποτε αλλαγή στην τιµή του pΗ, προκαλεί αλλαγήστην ιοντική κατάσταση των συστατικών του ενζυµικούσυστήµατος, δηλαδή Του ενζύµου Του συµπλόκου ενζύµου – υποστρώµατοςΤου υποστρώµατοςΤων άλλων άµεσων και έµµεσων συστατικών.

Αλλαγή στην ιοντική κατάσταση των υπόλοιπων άµεσων συστατικών (όπως είναι τα συνένζυµα, οιενεργοποιητές, οι αναστολείς κ.λπ.) και έµµεσων συστατικών (π.χ. προσµίξεων κ.λπ.). Επoµέvως τo pH µεταβάλλει, για κάπoιo από τoυς πιoπάvω λόγoυς, τηv κιvητική τoυ εvζυµικoύ συστήµατoς καικατά συvέπεια τηv ταχύτητα της όλης εvζυµικής αvτίδρασης. Tο διάγραµµα της δραστικότηταςτου ενζύµου σε συνάρτηση µε τοpΗ έχει τη µορφή του σχήµατος.Από το διάγραµµα αυτό, φαίνεταιότι τα ένζυµα είναι συνήθωςενεργά σε στενή περιοχή pΗ υπάρχει περιoχή τoυ pH µε"βέλτιστες" συvθήκες(optimum pΗ).

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣΑΠΟ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣIΑ Η θερµοκρασία έχει µεγάλη επίδραση στην ταχύτητα τηςενζυµικής αντίδρασης, η οποία οφείλεται σε πολλούςδιαφορετικούς λόγους: Επιδρά στη σταθερότητα του ενζύµου (µετουσίωση). Επιδρά στην ταχύτητα διάσπασης του συµπλόκου ΕSπρος Ε και Ρ (δηλαδή επιδρά στην κ 2 ). Επιδρά στη χηµική συγγένεια του ενζύµου µε τουπόστρωµα (δηλαδή επιδρά στην κ 1 και κ -1 ). ∆ιαφοροποιεί τις τιµές pΚs ενός ή όλων των συστατικώντης ενζυµικής αντίδρασης. Επιδρά στη χηµική συγγένεια του ενζύµου µε τυχόνυπάρχοντες ενεργοποιητές ή αναστολείς. ∆ιαφοροποιεί κάποιες άλλες ιδιότητες των συστατικώντης ενζυµικής αντίδρασης, όπως για παράδειγµα τηδιαλυτότητα ενός ή περισσότερων συστατικών.

Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η επίδραση τηςθερµοκρασίας είναι ένα πολύπλοκο φαινόµενο. Η επίδραση της θερµοκρασίας στη σταθερότητα τουενζύµου µπορεί να µελετηθεί, αν η ενζυµική αντίδραση γίνεισε διάφορες θερµοκρασίες και µετρηθεί η ταχύτητα τηςενζυµικής αντίδρασης, σε διάφορες χρονικές στιγµές για κάθεθερµοκρασία. Σε µικρούς χρόνους (t 1 ), µε την αύξηση της θερµοκρασίαςαυξάνεται και η δραστικότητα του ενζύµου. Σε µεγάλους χρόνους (t 2 ) δεν ακολουθείται η αντιστοιχίααυτή, γιατίσυγχρόνωςµειώνεται ησταθερότητατου ενζύµου,(µετουσίωση).

Ο ρυθµός απενεργοποίησης των ενζύµων σε διαλύµατααυξάνει ραγδαία µε την αύξηση της θερµοκρασίας. Tα περισσότερα ένζυµα απενεργοποιούνται στους 70 0 Cενώ σχεδόν όλα στους 100 0 C είναι απενεργοποιηµένα. Tο φαινόµενο της απενεργοποίησης (το οποίο οφείλεταιστη µετουσίωση της πρωτεΐνης), είναι αντιστρεπτό σεπολλές περιπτώσεις κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες,όπου ανακτάται η δραστικότητα του ενζύµου όταν το ένζυµοψυχθεί. Πρέπει να τονισθεί ότι η απενεργοποίηση των ενζύµων απότη θερµοκρασία εξαρτάται άµεσα από την τιµή του pΗ τουδιαλύµατός του. Πολλά ένζυµα είναι ανενεργά ακόµα και σε θερµοκρασίαδωµατίου όταν το pΗ είναι 4-5 και 8-10. Επιπλέον, σηµαντικό ρόλο παίζουν και άλλοι παράγοντες,όπως η συγκέντρωση του νερού π.χ. τα λυοφιλοποιηµέναένζυµα είναι συγκριτικά σταθερότερα στη θερµοκρασία.

Αν και η σταθερότητα των ενζύµων είναι συνήθωςµεγαλύτερη σε χαµηλές θερµοκρασίες, υπάρχουνπεριπτώσεις ενζύµων που είναι πιο σταθερά σε θερµοκρασία δωµατίου απ’ ότιστους 0 0 C (π.χ. γλουταµινική αποκαρβοξυλάσηβακτηρίων) είναι ευαίσθητα σε χαµηλές θερµοκρασίες π.χ. ηµιτοχονδριακή αδενοσινο-τριφωσφατάση πουαπενεργοποιείται στους 0 0 C, ενώ σε θερµοκρασίαδωµατίου είναι σταθερή ή ακόµα εµφανίζει µικρή αύξησηδραστικότητας.

Tέλος, το διάγραµµα της ταχύτητας της ενζυµικήςαντίδρασης σε συνάρτηση µε τη θερµοκρασία έχει τη µορφήτου σχήµατος: για κάθε αντίδραση, υπάρχουν βέλτιστες συνθήκεςθερµοκρασίας και σε αρκετές περιπτώσεις και βέλτιστητιµή (optimum θερµοκρασία).Πειραµατικά, χρησιµοποιούνταιθερµοκρασίεςµικρότερες από τη βέλτιστη,για να αποφευχθείη παρουσία ανενεργώνποσών του ενζύµου,στο διάλυµα. Οι βέλτιστες θερµοκρασίεςγια τα ένζυµατων ζώων είναι µεταξύ40 και 50 0 C, ενώτων φυτών 50 και 60 0 C.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣΑΠΟ ΤΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ∆IΑΛΥΤΗ Η σύσταση του διαλύτη σε ένα ενζυµικό σύστηµα µπορεί ναµεταβληθείµε προσθήκη αλάτων, τα οποία µεταβάλλουν την ιοντικήισχύ του διαλύµατος ή προκαλούν επίδραση κοινούιόντος µε προσθήκη οργανικών (µη πολικών) µορίων και µε συµµετοχή του ίδιου του διαλύτη στην αντίδραση. Επίσης, στις περισσότερες περιπτώσεις που ο διαλύτηςείναι το νερό, δε λαµβάνεται υπόψη η πιθανή συµµετοχή τουστην αντίδραση, ενώ µπορεί να εφυδατώνει το ενεργό κέντροτου ενζύµου ή/και το υπόστρωµα.Tότε, η ενζυµική αντίδραση περιλαµβάνει και µετακίνησηµορίων νερού ως εξής:Ε-Η 2 Ο + S-Η 2 Ο → ΕS + 2Η 2 Ο.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣΑΠΟ ΤΗ ΠΙΕΣΗ Η πίεση επιδρά στην ταχύτητα της ενζυµικής αντίδρασης,µόνο στην περίπτωση, που ένα από τα συστατικά τηςαντίδρασης είναι αέριο. Αν η αντίδραση οδηγεί σε µείωση του όγκου τουσυστήµατοςευνοείται µε αύξηση της πίεσης Αν η αντίδραση οδηγεί σε αύξηση του όγκου τουσυστήµατος ευνοείται µε µείωση της πίεσης. Η επίδραση της πίεσης στην κιvητική της όλης εvζυµικήςαvτίδρασης (οπότε και στην ταχύτητα της εvζυµικήςαvτίδρασης), συµβαίvει γιατί επηρεάζεται η σταθεράταχύτητας της αvτίδρασης και κατά συvέπεια η σταθερά Κ Μ .

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣΑΠΟ ΤΟ ΧΡΟΝΟ(ΓΕΝIΚΕΥΜΕΝΗ ΕΞIΣΩΣΗ MICHAELIS-MENTEN) Σε όλες τις προηγούµενες περιπτώσεις της επίδρασης τωνδιαφόρων παραγόντων στην ταχύτητα της ενζυµικήςαντίδρασης, έχει γίνει η παραδοχή ότι αναφερόµαστε σεαρχικές ταχύτητες (δηλαδή σε πολύ µικρούς χρόνους µετάτην προσθήκη του ενζύµου, όταν ακόµα οι συγκεντρώσειςτων προϊόντων είναι αµελητέες).E+S ES → E+P Στην περίπτωση που η µείωση της ταχύτητας οφείλεταιαποκλειστικά και µόνο στη µείωση του κορεσµού τουενζύµου από το υπόστρωµα, καθώς η συγκέντρωση τουυποστρώµατος µειώνεται συνεχώς, η πορεία της ενζυµικήςαντίδρασης περιγράφεται από τη γενικευµένη εξίσωσηΜichaelis-Μenten, η οποία προκύπτει µε ολοκλήρωση τηςΜichaelis-Μenten.

Αν S 0 είναι η αρχική συγκέντρωση υποστρώµατος σεχρόνο t 0 =0 και µετά από κάποιο χρονικό διάστηµα, έστω σεχρόνο t, έχει αλλοιωθεί ψ ποσότητα υποστρώµατος, τότε ηποσότητα υποστρώµατος που έχει παραµείνει σε χρόνο tείναι S 0 -ψ και η ταχύτητα της αντίδρασης, σύµφωνα µε τηνεξίσωση Μichaelis-Μenten, δίνεται από την ακόλουθηεξίσωση:v=dψdt=(VSmax0-(ψS0-ψ)+ K)M(1) Με ολοκλήρωση της (1) λαµβάνεται η εξίσωση (2) και µεκατάλληλο µετασχηµατισµό η (3)∫Vmaxψ=ψK +(S -ψ)Sdt=∫M 0dψ(2), V t= ψ+Kln0max M(S -ψ)(S -ψ)ψ=0 00(3)

Τελικά µε ανάλογους µετασχηµατισµούς λαµβάνεται ηακόλουθη τελική σχέση, η οποία αποτελεί τη γενικευµένηεξίσωση Μichaelis-Μenten,2,303t Η γραφική παράστασητης σχέσης:2,303tlog(SS0 V max 1 ψlog = -( S 0 -ψ) K M K M tS0-ψ)σε συνάρτηση µε το ψ/t,δίνει ευθεία µε κλίση -1/Κ Μτέµνει τον χ στο ψ/tτέµνει τον ψ στο Vmax/K M0(4)

2,303tlog(SS 0 V max 1 ψ= --ψ) K M K M t0(4) Η παραπάvω σχέση (4) χρησιµοποιείται στις περιπτώσειςπoυ είvαι δυvατή, µε κάπoια γρήγoρη µέθoδo (π.χ. UV), ηπαρακoλoύθηση της εξαφάvισης τoυ υπoστρώµατoς (µεάµεσo ή έµµεσo τρόπo) µε τηv πάρoδo τoυ χρόvoυ, για vαυπoλoγιστoύv τα Vmax και Κ Μ τoυ εvζυµικoύ συστήµατoςαπό την αντίστοιχη γραφική παράσταση. Επίσης, µπορούν να γίνουν οι ακόλουθες τροποποιήσεις:Αν S 0 >>ψ και Κ Μ , τότε log(S 0 /S 0 -ψ)≈log1=0 και η (4)απλοποιείται και παίρνει τη µορφή Vmax t = ψ. Αν S 0 (και άρα και η τιµή ψ)

2,303tlogSS0-=V0 maxψKM(5) Όταν λοιπόν η καµπύλη της σχέσης [log S o /S o -ψ], σεσυvάρτηση µε τo χρόvo [t] είvαι οριζόντια ευθεία γραµµή, τότε ισχύει η εξίσωση (5) και συµπεραίνεται ότιη τιµή S 0 που χρησιµοποιήθηκεστο πείραµαείναι πολύ µικρότερηαπό την Κ Μ .

ΑΝΑΣΤΟΛΕIΣ ΕΝΖΥΜIΚΩΝ ΑΝΤI∆ΡΑΣΕΩΝ Όταv εκτός από τα αvτιδρώvτα σώµατα και τα πρoϊόvτα τηςαvτίδρασης, υπάρχoυv και άλλα µόρια, τότε είvαι δυvατόv vατρoπoπoιηθεί η κιvητική της όλης αvτίδρασης (vα επιταχυvθείή vα επιβραδυvθεί η αvτίδραση), oπότε τα µόρια αυτά ταovoµάζoυµε εvεργoπoιητές ή αvαστoλείς, αvτίστoιχα. Στo κεφάλαιo αυτό θα µελετηθεί η επίδραση τωv διαφόρωvαvαστoλέωv (I) στηv κιvητική τωv εvζυµικώv αvτιδράσεωv,εξετάζovτας τηv επίδραση αυτώv τωv αvαστoλέωv στηvταχύτητα της όλης αvτίδρασης. Με τov όρo "αvαστoλή" (inhibition), δεv oρίζεται η µείωσητης ταχύτητας της εvζυµικής αvτίδρασης λόγω καταστρoφής τoυ εvζύµoυ (από τη θερµoκρασία,τo pH κ.λπ.), αλλά λόγω της επίδρασης της αvτίδρασης Ε+IΕI στηvκιvητική τoυ εvζυµικoύ συστήµατoς και µόvo. ∆ηλαδή, της σύvδεσης τoυ αvαστoλέα µόvo µε τo έvζυµoκαι όχι µε τo υπόστρωµα.

Μια αvαστoλή λέγεται αvτιστρεπτή: Όταv απoκαθίσταται ισoρρoπία στηv αvτίδραση I+ΕΕIπoυ µπoρεί vα µετακιvηθεί πρoς τα δεξιά ή αριστερά(απoµακρύvovτας π.χ. τov I από τηv αvτίδραση µεδιαπίδυση). Οι δεσµoί σύvδεσης τoυ Ε µε τov Ι, είvαι ασθεvείς καιυπάρχει κάπoια σταθερά αστάθειας (Κ I ), πoυ απoτελεί καιτo µέτρo της συγγέvειας τoυ Ε πρoς τo I. Μια αvαστoλή λέγεται µη αvτιστρεπτή:Όταν oι δεσµoί τoυ Ε και I είvαι σταθερoί και ηαvτίδραση είvαι µόvιµα µετατoπισµέvη πρoς τα δεξιά(δηλαδή Ε+I→ΕI). ∆εv απελευθερώvεται τo Ε, όταv απoµακρυvθεί o Ι(όπως συµβαίvει στηv πρoηγoύµεvη περίπτωση µεδιαπίδυση). Υπάρχει µια σταθερά ταχύτητας (κ), πoυ δηλώvει τoκλάσµα τoυ Ε πoυ αvαστέλλεται σε oρισµέvη χρovικήπερίoδo και από oρισµέvη συγκέvτρωση Ι.

Κάθε όµως κατηγορία περιλαµβάνει διάφορεςυποκατηγορίες ανάλογα µε το αν ο αναστολέας συνδέεται µε το ένζυµο στο ενεργό κέντρο, κοντά στο ενεργό κέντρο ή µακριά απ’ αυτό ή αν κάθε µόριο ενζύµου συνδέεται µε περισσότερα απόένα µόρια αναστολέα. Η µελέτη των αναστολέων των ενζυµικών αντιδράσεων, βοηθάει στη διαλεύκανση του µηχανισµού δράσης τωνενζύµων βοηθάει στη διαλεύκανση της δοµής των ενζύµων βοηθάει στη διαλεύκανση της βιοχηµικής πορείας, έχει εφαρµογές στη φαρµακολογία και στην τοξικολογία.

ΑΝΤIΣΤΡΕΠΤΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ Μια αvτιστρεπτή αvαστoλή, αvάλoγα µε τo αv θα µεταβληθείτo Κ Μ ή Vmax, διακρίvεται στις εξής κατηγoρίες :I. Αvταγωvιστική αvαστoλή, όταv αυξάvεται η τιµή τoυΚ Μ και µέvει αµετάβλητη η τιµή τoυ Vmax.II. Μη αvταγωvιστική αvαστoλή, όταv µειώvεται η τιµήτoυ Vmax και µέvει αµετάβλητη η τιµή τoυ Κ Μ .III. Συvαγωvιστική αvαστoλή, όταv µειώvεται η τιµή τoυVmax και τoυ Κ Μ και µάλιστα κατά τo αυτό πoσό.IV. Μικτή αvαστoλή, όταv µειώvεται η τιµή τoυ Vmax,αλλά αυξάvεται η τιµή τoυ Κ Μ .

Γραφικές παραστάσεις ανταγωνιστικής αναστολής Το Vmax παραµένειαµετάβλητο (V Ρ = Vmax)και το Κ Μ αυξάνεται. Tο Κ Ρ συµβολίζειτη νέα τιµή της σταθεράςΜichaelis-Μenten,παρουσία αναστολέα. ∆εν µπορεί να γίνειδιάκριση της πλήρως καιτης µερικώς ανταγωνιστικήςαναστολής από τιςγραφικές παραστάσεις.

Η χρησιµότητα τωv γραφικώv αυτώv παραστάσεωv είvαιµεγάλη, γιατί βοηθά στη διαπίστωσητoυ µηχαvισµoύ δράσηςεvός αvαστoλέα και στov υπoλoγισµό τωvδιαφόρωv αγvώστωvΜεγεθώv (Vmax,Kp,K I )Στην περίπτωση της πλήρωςανταγωνιστικής αναστολής,το Κ I υπολογίζεται µε τον τύποKp⎡⎢1+⎣[ I]= KMKIK⎤⎥⎦I=[ I]Kp−1KM

Γραφικές παραστάσεις µη ανταγωνιστικής αναστολής Το Κ Μ παραµένει αµετάβλητο ενώ το Vmax µειώνεται. ∆εν είναι δυνατή η διάκριση των δύο περιπτώσεων της µηανταγωνιστικής αναστολής, από τα διαγράµµατα.

Γραφικές παραστάσεις συναγωνιστικής αναστολής• Χαρακτηριστικό για την πλήρως συναγωνιστική αναστολή,είναι το διάγραμμα Lineweaver-Βurk, απότοοποίοφαίνεταιότι η ευθεία που αντιστοιχεί σ’αυτό τον τύπο αναστολής είναιπαράλληλη με την ευθεία που λαμβάνουμε απουσίααναστολέα, αφού η κλίση παραμένει η ίδια.Κλίση=Vmax⎛ [] I ⎞1V⎜ + ⎟p K 'I V=⎝ ⎠=K KpM K⎛ [] I ⎞⎜1+⎟⎝ K 'I ⎠maxM⎛ ⎜1+⎝V[ I]K'maxI⎞⎟⎠−⎛⎜⎝1+K[KMI]'I⎞⎟⎠

Γραφικές παραστάσεις µικτής αναστολήςΑπό τις γραφικές παραστάσεις φαίνεται ότι το Κ Μ αυξάνεταιενώ το Vmax µειώνεται. ∆ιάκριση των περιπτώσεων της µικτής αναστολής δεν µπορείνα γίνει από τα διαγράµµατα.

ΜΗ ΑΝΤΙΣΤΡΕΠΤΕΣ ΑΝΑΣΤΟΛΕΣ Στις µη αντιστρεπτές αναστολές, ο αναστολέας σχηµατίζεισταθερό σύµπλοκο µε το ένζυµο και η αντίδρασηΕ+Ι → ΕΙείναι µόνιµα µετατοπισµένη προς το σχηµατισµό τουσυµπλόκου ΕΙ. Στην περίπτωση αυτή, δεν έχουµε σταθερά αστάθειας Κ Ι ,αλλά σταθερά ταχύτητας κ, η δε ταχύτητα της αντίδρασηςδίνεται από τον τύποv= κ([Ε t ] - [ΕΙ]) ([Ι t ] - [ΕΙ]) Στην κατηγορία τωνµη αντιστρεπτών αναστολέωνανήκουν τα βαρέα µέταλλαπ.χ. ο Ηg, ο οποίος σχηµατίζεισταθερά σύµπλοκα µε τιςθειοαλκοολικές οµάδες τωναµινοξέων του ενζύµου.

Μη αντιστρεπτοί αναστολείς είναι και οιοργανοφωσφορικοί εστέρες, οι οποίοι έχουν τηνιδιότητα να αντιδρούν µε τη σερίνη και να απενεργοποιούνκατά συνέπεια τα ένζυµα που περιέχουν σερίνη(στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα αέρια νεύρων). Ενώσεις που δρουν µη αντιστρεπτά µε συγκεκριµένααµινοξέα µίας πρωτεΐνης, έχουν χρησιµοποιηθεί σεδιάφορα ένζυµα για να δώσουν πληροφορίες, για τηφύση της περιοχής του ενζύµου, στην οποία οφείλεται ηκαταλυτική του δράση. Tέλος, στο σχήµα, παρουσιάζεταιένα διάγραµµα v = f(Ι/Ε)για µία µη αντιστρεπτή αναστολήσε υδρολυτική πορεία, όπουη αντίδραση ενζύµου και υποστρώµατοςείναι στοιχειοµετρική.

ΑΛΛΟΣΤΕΡΙΣΜΟΣ Tα ένζυµα χαρακτηρίζονται από σηµαντικές ιδιότητες,οι οποίες οφείλονται στη δοµή της πρωτεϊνικήςτους φύσης. Όπως είναι γνωστό, η οργάνωση των πρωτεϊνώνκαι κατ’ επέκταση των ενζύµων, περιλαµβάνει την1/ταγή, 2/ταγή, 3/ταγή, 4/ταγή και 5/ταγή δοµή. Tα ένζυµα, τα οποία έχουν τεταρτοταγή δοµή,δηλαδή διαθέτουν περισσότερες από µία υποµονάδες,έχουν τις ακόλουθες χαρακτηριστικές ιδιότητες: Ενώ οι υποµονάδες τους (πρωτοµερή) δενεµφανίζουν ενζυµική δράση, το σύµπλοκο τηςτεταρτοταγούς δοµής είναι ενζυµικά ενεργό. Η ενζυµική δράση της τεταρτοταγούς δοµήςεπιδέχεται αλλοστερ(εοχηµ)ική ρύθµιση µε δύοτρόπους:

Η ενζυµική δράση της τεταρτοταγούς δοµήςεπιδέχεται αλλοστερ(εοχηµ)ική ρύθµιση µε δύοτρόπους: Η δραστικότητα της κάθε υποµονάδαςεπηρεάζεται από το είδος και τη χωροταξικήδιαµόρφωση των άλλων υποµονάδων.(Όταν το φαινόµενο αυτό γίνεται µε επαγωγήτότε ονοµάζεται συνεργιστικό φαινόµενο). Όταν υπάρχουν περισσότερα από ένα είδηυποµονάδων, τότε οι δυνατοί συνδυασµοίαυτών, οδηγούν σε ένζυµα µε την ίδιαεξειδίκευση, αλλά µε διαφορετικήδραστικότητα, τα οποία ονοµάζονταιισοένζυµα.

Αν συγκρίνει κανείς την επίδραση της τριτοταγούςκαι τεταρτοταγούς δοµής στην ενζυµικήσυµπεριφορά, οδηγείται στο συµπέρασµα ότι µε την τριτοταγή δοµή τα πρωτεϊνικά µόριααποκτούν µία ενδογενή ενζυµική ικανότητα, ηοποία εκδηλώνεται ή δεν εκδηλώνεταιπρωτογενώς µε την τεταρτοταγή δοµή, τα πρωτεϊνικά µόριααποκτούν µία δευτερογενή ενζυµική δράση, πουείναι συνυφασµένη µε την ενεργοποίησή τους.

Για να γίνουν κατανοητά τα παραπάνω, θα αναφερθείτο παράδειγµα της γλουταµινικής αφυδρογονάσηςTο ένζυµο αυτό έχει τεταρτοταγή δοµή µε 4 όµοιεςυποµονάδες.Κάθε µία από τις υποµονάδες εµφανίζει σε πολύµικρό βαθµό δράση αφυδρογονάσης αλανίνης το ένζυµο έχει ισχυρή δράση αφυδρογονάσηςγλουταµίνης. Φαίνεται λοιπόν, ότι από την τριτοταγή δοµή καθορίζεται το είδος της αντίδρασηςπου καταλύει το ένζυµο (η ενδογενής ενζυµικήικανότητα π.χ. της αφυδρογονάσης) µε την τεταρτοταγή δοµή, αλλάζει η διαµόρφωση τουενεργού κέντρου του ενζύµου µε αποτέλεσµα να γίνεται αφ’ ενός δραστικότερο, αφ’ ετέρου δε να αλλάζει η εξειδίκευσή του ως προς τουπόστρωµα (η δευτερογενής ενζυµική δράση π.χ. τηςγλουταµινικής αφυδρογονάσης)

Επειδή συχνά, ο όρος αλλοστερικό ένζυµο χρησιµοποιείταιγια να προσδιορίσει οποιοδήποτε ένζυµο στοοποίο εκδηλώνεται συνεργιστικό φαινόµενο (και ταπερισσότερα αλλοστερικά ένζυµα εκδηλώνουνσυνεργιστικά φαινόµενα), γι΄αυτό υπάρχει µία σύγχυσηανάµεσα σε αυτούς τους όρους. Ο όρος αλλοστερικό φαινόµενο πρωτοαναφέρθηκεαπό τους Μonod, Changeux και Jacob, για να εξηγήσειτην ανταγωνιστική αναστολή των ενζύµων από ενώσειςπου έχουνε µικρή οµοιότητα στη δοµήµε το υπόστρωµα. Σαν ισοστερικός αναστολέας µπορείνα χαρακτηρισθεί ο ανταγωνιστικόςαναστολέας που είναι δοµικό ανάλογοτου υποστρώµατος, ενώ Σαν αλλοστερικός αναστολέας,όταν είναι διαφορετικής δοµήςαπό το υπόστρωµα.

Ο Μonod στη συνέχειαπρότεινε ότι αυτοί οιαλλοστερικοί αναστολείςδεσµεύονται σε θέσειςδιαφορετικές, και πιθανώςαποµακρυσµένες από τοενεργό κέντρο του ενζύµουοι οποίες ονοµάζονταιαλλοστερικές θέσεις. Εκδηλώνουν δε τα ανταγωνιστικά τους φαινόµενα, µεµεταβολή της διαµόρφωσης του ενζύµου, έτσι ώστε ηδέσµευση του αναστολέα να εµποδίζει τη δέσµευση τουυποστρώµατος και το αντίστροφο. Μηχανισµοί όµως τέτοιας φύσης, όπου η δέσµευση µίαςένωσης σε περιοχή διαφορετική από το ενεργό κέντρο,οδηγεί σε αλλαγή της χωροταξικής διαµόρφωσης τουενζύµου, µπορούν να εξηγήσουν και άλλες περιπτώσειςεκτός από την ανταγωνιστική αναστολή.

Γι’ αυτό, εισήχθηκε ο όρος αλλοστερικός τροποποιητής, γιανα καλύψει και αναστολείς και ενεργοποιητές, που δρουνµ’αυτό τον τρόπο και εκδηλώνουν αντίστοιχα, αρνητικό καιθετικό αλλοστερικό φαινόµενο. Tα ένζυµα, που διαφοροποιείται η δράση τους από άλλοστερικούςτροποποιητές, καλούνται αλλοστερικά ένζυµα.

Θεωρητικά, έναµονοµερές ένζυµο(δηλαδή µε τριτοταγήδοµή), µπορεί ναυποστεί αλλαγή τηςδιαµόρφωσής του,µετά τη σύνδεση ενόςυποκαταστάτη σ’αυτό. Σαν υποκαταστάτεςθεωρούνται τουπόστρωµα, οαναστολέας και ο ενεργοποιητής. Στην πράξη, είναι γνωστά µόνο δύο µονοµερήαλλοστερικά ένζυµα: Η πυροσταφυλική-UDΡ-Ν-ακετυλογλυκοζαµινο-τρανσφεράσηκαι Η αναγωγάση του διφωσφοριβονουκλεοζιδίου.

Tα περισσότερα αλλοστερικά ένζυµα είναιολιγοµερή, (δηλαδή έχουν π.χ. τεταρτοταγή δοµή). Υπάρχουν δε οι ακόλουθες περιπτώσεις: Η δέσµευση ενόςυποκαταστάτη στοένα πρωτοµερές τωνενζύµων, µπορεί ναεπηρεάσει τη δέσµευση άλλων µορίων του ίδιου υποκαταστάτη,στα άλλα πρωτοµερή του ενζύµου (οµότροπεςαλληλεπιδράσεις). Η δέσµευση ενόςυποκαταστάτη στο έναπρωτοµερές επηρεάζειτη δέσµευση διαφορετικούυποκαταστάτη στο πρωτο-µερές αυτό (ετερότροπηαλληλεπίδραση ).(π.χ.επίδραση αναστολέα στη δέσµευση υποστρώµατος).

Όταν η δέσµευση ενόςυποκαταστάτη στο έναπρωτοµερές επηρεάζειτη δέσµευση διαφορετικούυποκαταστάτη στο πρωτο-µερές αυτό (ετερότροπηαλληλεπίδραση ).Αυτού του τύπου οι αλληλεπιδράσεις είναι θετικές ήαρνητικές και µπορεί να συµβούν και στα µονοµερήαλλοστερικά ένζυµα. Η µεταβίβαση των οµότροπων και ετερότροπωναλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα πρωτοµερή του ενζύµου,οφείλεται στοσυνεργιστικόφαινόµενο. Όταν συµβαίνουν και τα δύο φαινόµενα (αλλοστερικοίτροποποιητές είναι και το υπόστρωµα και άλλες ενώσεις),τότε έχουµε οµοετερότροπες (µικτές) αλληλεπιδράσεις.

Η θεωρία του συνεργιστικού φαινοµένου προτάθηκε για ναεξηγήσει την αλληλεπίδραση ανάµεσα στις θέσεις δέσµευσηςτων υποκαταστατών στις υποµονάδες (πρωτοµερή) τωνολιγοµερών ενζύµων. Ο όρος συνεργιστικό φαινόµενο, αναφέρεται στο φαινόµενοκατά το οποίο η δέσµευση ενός µορίου υποκαταστάτη σε έναπρωτοµερές του ενζύµου, επηρεάζει τη δέσµευση τουδεύτερου µορίου ίδιου υποκαταστάτη σε άλλο πρωτοµερέςτου ίδιουενζύµου.Θετικό συνεργιστικό φαινόµενο συµβαίνει όταν στηνοµότροπη αλληλεπίδραση, η δέσµευση του µορίου τουυποκαταστάτη αυξάνει την ικανότητα του ενζύµου γιαδέσµευση των άλλων µορίων του υποκαταστάτη, ενώ Αρνητικό συνεργιστικό φαινόµενο ή µη συνεργιστικόσυµβαίνει όταν µειώνεται η ικανότητα του ενζύµου γιαδέσµευση των άλλων µορίων του υποκαταστάτη.

Από τα παραπάνω φαίνεται, ότι αλλοστερικό φαινόµενοκαλείται η αλλαγή στη διαµόρφωση ενός πρωτοµερούς, µετάαπό δέσµευση υποκαταστάτη σε αλλοστερική θέση τουπρωτοµερούς. Ενώ, το συνεργιστικό φαινόµενο αναφέρεται στην αλλαγήτης διαµόρφωσης ενός πρωτοµερούς, στο οποίο έχειδεσµευτεί τροποποιητής και η οποία αλλαγή έχει σα συνέπειανα µετατραπεί η δοµή και του γειτονικού πρωτοµερούς,έτσι ώστε να αλλάξει η ικανότητα και αυτού για δέσµευσηάλλου µορίου του ίδιου ή διαφορετικού υποκαταστάτη. Για όλα τα ένζυµα που εµφανίζουν συνεργιστικό φαινόµενοέχουν βρεθεί αλλοστερικοί τροποποιητές. Ενώ, υπάρχουν ολιγοµερή ένζυµα που εµφανίζουν άλλοστερικόφαινόµενο, χωρίς όµως να υπάρχει συνεργιστικόφαινόµενο. Για παράδειγµα, στην αφυδρογονάση της αλκοόλης,αλλάζει διαµόρφωση το ένα πρωτοµερές µετά απόδέσµευση αλλοστερικού τροποποιητή, χωρίς όµως ναεπηρεάζεται το άλλο πρωτοµερές.

Στο Πίνακα συνοψίζονται όλα τα παραπάνω.

Η αµέσως ανώτερη -από την τεταρτοταγή δοµήβαθµίδαοργάνωσης των πρωτεϊνικών µορίων, είναιη πεµπτοταγής δοµή. Στα πρωτοµερή της πεµπτοταγούς δοµής, ηεξειδικευµένη δραστικότητα υπάρχει εκ τωνπροτέρων και µάλιστα διατηρείται και µετά τηδιάσπαση του ενζυµικού συστήµατος. Επιπλέον χαρακτηριστικό της πεµπτοταγούςδοµής, είναι ότι τα ένζυµα που την αποτελούν, δενέχουν δράση άσχετη µεταξύ τους αλλά εκτελούν µίασειρά δράσεων µε ελεγχόµενο ρυθµό. Αυτές οιδράσεις αντιπροσωπεύουν µία διάκριτη πορείαβιοχηµικών αντιδράσεων (π.χ. οξειδωτική αποκαρβοξυλίωσητου πυροσταφυλικού οξέος ή de novoβιοσύνθεση των λιπαρών οξέων) ή ένα βιολογικόµηχανισµό (π.χ. µυϊκή συστολή).

Αλλοστερικά φαινόµενα παρουσιάζονται και σταένζυµα µε πεµπτοταγή δοµή και µάλιστα αυξάνεται ηποικιλία των περιπτώσεων που συναντώνται. Σαν αλλοστερικός ενεργοποιητής µπορεί να χρησιµοποιηθείµια πρόδροµη ένωση, οπότε λέγεται ενεργοποίησηµητρικής ένωσης.A A 1 A v X Ψ ΖΈτσι, η ταχύτητα µετατρoπής του Χ σε Ζ βρίσκεταιυπό αλλoστερική ρύθµιση και τo όλo σύστηµασυµπεριφέρεται σαv αυτoρυθµιζόµεvo σύστηµα. Σαν αλλοστερικός αναστολέας µπορεί να χρησιµοποιηθείτο τελικό προϊόν οπότε λέγεται αναστολή τελικούπροϊόντος (end-product inhibition) ή αναδραστικήαναστολή (retro-inhibition) ή έλεγχος µε αντίστροφητροφοδότηση (feed back control).X Ψ Ζ

Συνοψίζοντας πρέπει να αναφερθεί ότι, ταπερισσότερα αλλοστερικά ένζυµα συµµετέχουνστις βραδείες αντιδράσεις των µεταβολικώνπορειών. Και έτσι ο µεταβολισµός στο σύνολό του,ρυθµίζεται από έναν πολύπλοκο συνδυασµόδιαδοχικών και πλήρως εξειδικευµένωναλλοστερικών φαινοµένων. Η δε πεµπτοταγής δοµή των ενζύµων,αντιπροσωπεύει τον κύριο συντελεστή τηςκανονικής πορείας του µεταβολισµού στο σύνολότου.

ΠΡΟΤΥΠΑ (ΜΟΝΤΕΛΑ) ΑΛΛΟΣΤΕΡΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝΕΞΗΓΗΣΗ ΤΟΥ ΣΥΝΕΡΓΙΣΤΙΚΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ Στα αλλοστερικά ένζυµα µε τεταρτοταγή ή πεµπτοταγήδοµή, η δραστικότητα κάθε υποµονάδας µεταβάλλεταιεπαγωγικά από την χωροταξική διαµόρφωση και το είδοςτων άλλων υποµονάδων. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα η καµπύλη της αρχικήςταχύτητας σε συνάρτηση µε τη συγκέντρωση τουυποστρώµατος, να εµφανίζει σιγµοειδή µορφή για µικρέςσυγκεντρώσεις υποστρώµατος. ∆ηλαδή, ενώ στην αρχή η ταχύτητατης αντίδρασης είναι πολύµικρή, καθώς αυξάνει η συγκέντρωσητου υποστρώµατος,αυξάνει γρήγορα και η ταχύτηταχωρίς να διατηρείται σταθερόςο ρυθµός της µεταβολής της.

Για να εξηγηθεί µε µαθηµατικό τρόπο η σιγµοειδήςµορφή της καµπύλης µε βασική παραδοχή ότι το σύστηµα βρίσκεταιστην κατάσταση ισορροπίας (standard state)έχουν προταθεί διάφορα µοντέλα, τα οποίααποτελούν τα µοντέλα σύνδεσης ισορροπίας(equilibrium binding models), µε πιο σηµαντικάτο µοντέλο των Μonod-Wyman-Changeux και τουΚoshland. µε βασική παραδοχή ότι το σύστηµα βρίσκεταισε µια σταθεροποιηµένη ισορροπία (steady state)έχουν προταθεί άλλα µοντέλα, τα οποίααποτελούν τα κινητικά µοντέλα (kinetic models)µε πιο σηµαντικά το µοντέλο του Rabin και τουFerdinand .

Μοντέλο Μonod - Wyman -Changeux ή συνδυασµένοµοντέλο (concerted model) Αν και το συγκεκριµένο µοντέλοπεριλαµβάνει πολλές παραδοχές, απόαυτό έχει προέλθει το µεγαλύτερο µέροςτης ονοµατολογίας που σχετίζεται µε τοναλλοστερισµό και το συνεργιστικόφαινόµενο. Οι παραδοχές που γίνονται στοµοντέλο αυτό είναι οι εξής:1) Tα πρωτοµερή των ενζύµων πουεµφανίζουν συνεργιστικό φαινόµενοείναι πανοµοιότυπα και συνδυασµένα µετέτοιο τρόπο, ώστε να καταλαµβάνουνισοδύναµες θέσεις στο ένζυµο (υπάρχειτουλάχιστον ένας άξονας συµµετρίαςστο πρωτεϊνικό µόριο).

2) Κάθε πρωτοµερές έχει µία εξειδικευµένη θέσηδέσµευσης για κάθε υποκαταστάτη.(Στην περίπτωση που το αλλοστερικόένζυµο αποτελείται από διαφορετικούςτύπους υποµονάδων, ο όρος πρωτοµερέςδεν αντιστοιχεί σε κάθε µία ξεχωριστάυποµονάδα αλλά σε κάθε διαφορετικότύπο υποµονάδων). Οι δύο πρώτες παραδοχές οδηγούν στοσυµπέρασµα ότι οι θέσεις δέσµευσης για κάθευποκαταστάτη είναι ισοδύναµες. Επιπλέον, η αλλαγή διαµόρφωσης ενόςπρωτοµερούς µετά τη σύνδεση τουυποκαταστάτη σε αυτό, οδηγεί σεπανοµοιότυπη αλλαγή διαµόρφωσης και τωνάλλων πρωτοµερών, έτσι ώστε ναδιατηρείται η συµµετρία του πρωτεϊνικούµορίου.

3) Κάθε πρωτοµερές µπορεί ναβρίσκεται σε δύο χωροδιατάξεις Ακαι Β.4) Tο ελεύθερο ένζυµοχαρακτηρίζεται από δύο ακραίεςκαταστάσεις, όπου στη µία απ’αυτές, την T (tense) όλα ταπρωτοµερή έχουν τη µορφή Α καιστην άλλη, τη R (relaxed) έχουν τηµορφή Β. Επιπλέον, οι καταστάσεις T καιR βρίσκονται σε ισορροπία και Lορίζεται η σταθερά ισορροπίας ήαλλιώς η αλλοστερική σταθερά.Συνήθως το ελεύθερο ένζυµοβρίσκεται σε µεγαλύτερηαναλογία στην κατάσταση T απ’ότι στην κατάσταση R.

5) Οι υποκαταστάτεςπου δρουν σαν υποστρώµατα ήσαν ενεργοποιητέςέχουν µεγαλύτερησυγγένεια µε τοένζυµο πουβρίσκεται στηνκατάσταση R, ενώεκείνοι που δρουνσαν αναστολείς έχουνµεγαλύτερησυγγένεια µε τοένζυµο στηνκατάσταση T

Οι παραδοχές που γίνονται στο µοντέλοαυτό εξηγούν τη σιγµοειδή µορφή τηςκαµπύλης v=f([S]) ως εξής: Όταν το ένζυµο είναι ελεύθερο, ησυγκέντρωση της δραστικής µορφής του(R) είναι µικρή και κατά συνέπεια και ηταχύτητα της αντίδρασης είναι µικρή. Όταν το υπόστρωµα αρχίζει να δεσµεύεταιστα πρωτοµερή, σχηµατίζονταιτα σύµπλοκα Β 4 S 1 , Β 4 S 2 , Β 4 S 3 καιΒ 4 S 4 . Tο αποτέλεσµα είναι, να µειώνεται ησυγκέντρωση της R µορφής και για ναδιατηρηθεί η ισορροπία, µετατρέπονταισυνεχώς νέες ποσότητες του ενζύµου απότη µορφή T στη R, (συνεχής αύξηση τηςποσότητας της δραστικής µορφής του Ε µετην αύξηση της συγκέντρωσης του S.

Γι’αυτό το λόγοστην καµπύληv=f([S])η ταχύτητα τηςαντίδρασης (µε τηναύξηση της [S])αυξάνεται πολύ γρήγορακαι µε µη σταθερόρυθµό. Πρέπει να αναφερθεί ότι, αν και το συγκεκριµένοµοντέλο βρίσκει εφαρµογή στην κινητικήσυµπεριφορά πολλών ενζύµων, δεν µπορεί ναεξηγήσει το αρνητικό συνεργιστικό φαινόµενο.

Μοντέλο Κoshland ή διαδοχικόµοντέλο (sequential model) Οι παραδοχές που γίνονται στοµοντέλο αυτό είναι οι εξής:1) Η κάθε υποµονάδα (πρωτοµερές)µπορεί να βρίσκεται σε δύοµορφές, Α και Β, όπως άλλωστείσχυε και στο µοντέλο Μonod.2) ∆εν υπάρχουν όµως µόνοακραίες καταστάσεις του ενζύµου,δηλαδή καταστάσεις που όλες οιυποµονάδες είναι ή Α ή Β, αλλάδέχεται ότι είναι δυνατό ναυπάρχουν και ενδιάµεσες µορφέςτου ενζύµου, δηλαδή εισάγει έναµηχανισµό επαγώγιµηςπροσαρµογής.

3) Tο συγκεκριµένο µοντέλοπροτείνει ότι η δέσµευση τουυποστρώµατος σε µίαυποµονάδα του ενζύµου οδηγεί σε χωροταξικήαλλαγή της υποµονάδαςαυτής η οποία έχει σαναποτέλεσµα να αλλάζει ησταθερότητα των γειτονικώνυποµονάδων (και όχιαπαραίτητα η χωροδιάταξήτους) έτσι ώστε ναδιαφοροποιείται η ικανότηταδέσµευσης των υπόλοιπωνµορίων του υποστρώµατοςσε αυτές.

Η δέσµευση τουυποστρώµατος σε οποιαδήποτευποµονάδα του ενζύµου µε τηµορφή Β, εξαρτάται από τα εξής: Tη σταθερά διάστασης τουσυµπλόκου ΒS (Κs)όπου Κs = [Β][S]/[ΒS], [Β] ησυγκέντρωση του ελεύθερουενζύµου στη Β µορφή και [ΒS] ησυγκέντρωση του συµπλόκου ΒS. Tη σταθερά ισορροπίας τηςµετατροπήςΑ Β (L)όπου L = [Β]/[Α] και [Α] ησυγκέντρωση του ελεύθερουενζύµου στην Α µορφή. Tις αλληλεπιδράσεις στιςυποµονάδες.

Σε ένα διµερές ένζυµο, οι αλληλεπιδράσεις αυτέςχαρακτηρίζονται από τις σταθερές Κ ΑΑ, Κ ΑΒκαι Κ ΒΒ όπου θεωρείται ότι η Κ ΑΑ=1 και οι άλλες δύο δίνονταιαπό τους ακόλουθους τύπους:Κ ΑΒ= [ΑΒ][Α]/[ΑΑ][Β] καιΚ ΒΒ= [ΒΒ][Α][Α]/[ΑΑ][Β][Β] Εάν Κ ΑΒ>1, τότεείναι µεγαλύτερη ηαλληλεπίδρασηανάµεσα στα Α και Β,από ότι ανάµεσα σταΑ και Α και άραευνοείται η µετατροπήτου ενζύµου στηνκατάσταση ΑΒ.

Έστω ένα διµερές ένζυµο, όπου οι δύο υποµονάδες του ενζύµου συνδέονται µε δεσµούςυδρογόνου και δυνάµεις Van der Waals και τα δε ηλεκτροστατικά φορτία είναι αποµακρυσµένα και εξουδετερώνονται από ανιόντα και κατιόντα τουδιαλύµατος.Όταν συνδεθεί το πρώτοµόριο υποστρώµατος σεµία υποµονάδα, σύµφωναµε το µοντέλο Κoshlandαλλάζει η χωροδιάταξη τηςυποµονάδας αυτής και τοένζυµο από ΑΑµετατρέπεται είτε σε ΑΒ είτεσε ΓΒ.

Στην περίπτωση που το ένζυµο βρίσκεται στην κατάστασηΑΒ, η αλλαγή της χωροδιάταξης της µίας υποµονάδας έχεισαν αποτέλεσµα να πλησιάσουν τα φορτία και να δηµιουργηθείένας περισσότερο σταθερός δεσµός (Κ ΑΒ >Κ ΑΑ ). Στην άλλη περίπτωση, το ένζυµο βρίσκεται στην κατάστασηΓΒ, επειδή σύµφωνα µε τη θεωρία, το πλησίασµα τωνφορτίων αλλάζει τησταθερότητα της άλληςυποµονάδας, η οποίαπαίρνει µία ενδιάµεσηµορφή Γ, µε αποτέλεσµα τηδηµιουργία σταθερότερουδεσµού (Κ ΓΒ >Κ ΑΑ ).

Και στις δύο περιπτώσεις (το ένζυµο βρίσκεται στηνκατάσταση ΑΒ ή ΒΓ), ευνοείται η µετατροπή του ενζύµου το οποίο στη συνέχεια δέχεται µε µεγαλύτερη ευκολίαένα άλλο µόριο υποστρώµατος και µετατρέπεται στη µορφή ΒΒ,όπου τα φορτία έχουνέρθει ακόµα πιο κοντάκαι οι υποµονάδες είναιισχυρά συνδεδεµένες(Κ ΒΒ >Κ ΑΒ , Κ ΒΒ >Κ ΓΒ ).Ένα παράδειγµα θετικούσυνεργιστικού φαινοµένουσε διµερές ένζυµο, σύµφωναµε το µοντέλο του Κoshland,δίνεται στο σχήµα.

Η σιγµοειδής µορφή της καµπύλης v=f([S])εξηγείται και µε το µοντέλο αυτό, ως εξής: Αρχικά, το ένζυµο που βρίσκεται στηνκατάσταση T, έχει µικρή συγγένεια µε τουπόστρωµα. Η δέσµευση όµως του πρώτου µορίουυποστρώµατος σε µία υποµονάδα, έχει σαναποτέλεσµα να αλλάζει η χωροδιάταξη αυτήςτης υποµονάδας και η σταθερότητα τωνγειτονικών της υποµονάδων, έτσι ώστε νααυξάνει η ικανότητα δέσµευσης για ταυπόλοιπα µόρια υποστρώµατος. Έτσι, καθώς αυξάνει η συγκέντρωση τουυποστρώµατος, αυξάνει ο ρυθµός δέσµευσηςτου υποστρώµατος από το ένζυµο πολύγρήγορα και µε µη σταθερό ρυθµό, µε τηναύξηση της [S] και η καµπύλη v=f([S])παίρνει σιγµοειδή µορφή.

Με το µοντέλο του Κoshland εξηγείται επιπλέον και το αρνητικό συνεργιστικόφαινόµενο, αφού δεν αποκλείει την περίπτωση, η δέσµευσηενός µορίου υποστρώµατος να οδηγήσει σετέτοια χωροταξική αλλαγή την υποµονάδα,ώστε να µην ευνοείται η δέσµευση τωνυπόλοιπων µορίων υποστρώµατος,(δηλαδή για ένα διµερές ένζυµο να ισχύειΚ ΑΒ ή Κ ΓΒ < 1).

Μοντέλο του Ηill (ή κινητική Ηill) Tο µοντέλο αυτό προτάθηκε το 1949 από τον Ηill, µε σκοπόνα εξηγηθεί η σιγµοειδής καµπύλη της δέσµευσης τουοξυγόνου στην αιµοσφαιρίνη. Οι συλλογισµοί που γίνονται σ’ αυτό το µοντέλο και τασυµπεράσµατα στα οποία καταλήγει είναι τα εξής: Αν ορισθεί ως Υs ο βαθµός κορεσµού του ενζύµου απόέναν υποκαταστάτη S, τότε :όπου [S b ] η συγκέντρωση τουδεσµευµένου στο ένζυµουποκαταστάτη, n ο αριθµός τωνθέσεων δέσµευσης τουυποκαταστάτη ανά µόριο ενζύµουκαι [Ε t ] η συνολική συγκέντρωσητου ενζύµου.Y =S[ Sbn[Et]]

Τότε το γινόµενο η[Εt] αντιπροσωπεύει τοσυνολικό αριθµό των θέσεων του ενζύµου πουµπορούν να δεσµευτούν από το υπόστρωµα. Επιπλέον, το κλάσµα των θέσεων του ενζύµου πουδεν έχουν συνδεθεί ακόµα από το υπόστρωµα,ισούται µε 1-Υs αφούn[Ef]n[E ] n[E ] −[S ]f= n[E ] −[S ] ⇒ =t b= 1t bn[E ] n[E ]ttόπου [Εf] η συγκέντρωση του ελεύθερου ενζύµου−YS

Για ένζυµα που είναι µονοµερή (όπου n=1) ή που έχουν τεταρτοταγή ή πεµπτοταγή δοµή, και έχουν όµως όµοιες υποµονάδες, οι οποίεςδεν αλληλεπιδρούν µεταξύ τους (δηλαδή δενεµφανίζεται συνεργιστικό φαινόµενο),ισχύουν τα εξής : v 1 κ 1E + S ES→ E + Pv -1 κ -1= ][ ] και v ES][ ]v κ1 1 [ S EfΚ S (σταθερά διάστασης)=[ EfΚα(σταθερά σύνδεσης)][[ES]== κ κ[ = S− 1 −1−1bS]=κ − 1κ1[ ES] κ 1=1=[E ][S]κ Kf − 1 S

Στην κατάσταση όµως σταθεροποιηµένηςισορροπίας (steady state) ισχύει ότι:v = v ⇒ κ [ S][ E ] = κ [ S ] ⇒1 −1 1 f −1n[ E ] n[ S ]κ [ S] = κ ⇒κ [ S] 1− Y = κ nY ⇒fb( )1 −1 1 S −1n[ Et] n[ Et]⇒YS[ S]K [ S]= =aK + [ S]1+K [ S]SaSbΌπου n=1

Η γραφική παράσταση Υs=f([S]) είναι υπερβολή,εκτός από την περίπτωση που ισχύει ένας από τουςακόλουθους λόγους: Η ταχύτητα της αντίδρασης δεν εξαρτάται µόνοαπό τη συγκέντρωση του συµπλόκου ενζύµουυποστρώµατος Λαµβάνουν χώρα και άλλες ενδιάµεσεςαντιδράσεις, εκτός από αυτές που αναφέρθηκανπαραπάνω. Στην αντίδραση συµµετέχουν περισσότερα απόένα µόρια υποστρώµατος.

Tα πολυµερή ένζυµα, στα οποία ισχύουν οιπαραπάνω λόγοι, ακολουθούν κινητική, πουπεριγράφεται από την εξίσωση Ηill. Η ενζυµική αντίδραση στην περίπτωση αυτήείναι :Ε + nS ΕSn Με ανάλογους συλλογισµούςλαµβάνεται η εξίσωση:

YS=KS[ S] Η γραφική παράστασητης σχέσηςΥ S = f( [S] ),δίνεται στο σχήµαn+ [ S]n=K1+aK[ S]an[ S]n⇒Y1−SYS=[ S]KSn Με λογαρίθµηση τηςπαραπάνω εξίσωσηςέχουµε ότι:log1Y−SYS=nHlog[S]−logKόπου n Η : ο συντελεστής Ηill.S

• Ηγραφικήπαράστασητης εξίσωσης ΗillYlog1−SYS= f (log[S])είναι ευθεία γραμμή, ηκλίσητηςοποίαςισούταιμεn Η καιτο σημείο τομής της με τονάξονα των ψ αντιπροσωπεύειτην τιμή –logΚs• Στο μοντέλο του Ηill, το n Ηαντιπροσωπεύει τον αριθμό των θέσεων δέσμευσηςτου υποστρώματος στο ένζυμο.• Στα μονομερή ένζυμα ή στα ένζυμα που δενεμφανίζεται συνεργιστικό φαινόμενο, ο n Η ισούται μετη μονάδα.

Αν εφαρµοσθεί η εξίσωση του Ηill στηναιµοσφαιρίνη, βρίσκεται ότι το n Η ισούται µε 2,8. Eνώ στην πραγµατικότητα η αιµοσφαιρίνη έχειτέσσερις θέσεις δέσµευσης για το οξυγόνο. Η απόκλιση ανάµεσα στην πειραµατική και στηνπραγµατική τιµή οφείλεται στις ακόλουθες δύοπαραδοχές, οι οποίες δεν ανταποκρίνονται στηνπραγµατικότητα και που έγιναν κατά την εξαγωγήτης εξίσωσης Ηill: Ότι όλο το ένζυµο βρίσκεται είτε στην ελεύθερη µορφή (Ε), είτε στη µορφή του συµπλόκου ΕSn και Ότι η δέσµευση του υποστρώµατος δε γίνεταισταδιακά και άρα δε σχηµατίζονται ενδιάµεσασύµπλοκα ή µόλις σχηµατίζονται µετατρέπονταιαµέσως στο σύµπλοκο ΕSn.

∆ηλαδή το n Η = n max , ισχύει µόνο θεωρητικά. Επειδή συνήθως n Η ≤ n , ο n Η δείχνει τον ελάχιστοαριθµό θέσεων δέσµευσης του ενζύµου (π.χ. στηναιµοσφαιρίνη όπου n Η =2,8, υπάρχουν τουλάχιστον3 σηµεία σύνδεσης Ο 2 )

Επιπλέον, η εξίσωση Ηill : Χρησιµοποιείται για να προσδιορισθεί η ύπαρξηαρνητικού και θετικού συνεργιστικού φαινοµένου Ο συντελεστής n Η, αποτελεί και µέτρο τηςαλληλεπίδρασης των θέσεων δέσµευσης µεταξύ τους. Από την εξίσωση Ηill φαίνεταιότι αν: n Η=1, τότε δεν υπάρχεισυνεργιστικό φαινόµενοκαι ακολουθείται η κινητικήτων µονοµερών ενζύµων. Η γραφική παράσταση v=f([S]) ή Υs=f([S]) είναιυπερβολή. Tο διάγραµµαLineweaver-Βurkγια n Η=1 δίνειευθεία γραµµή.

n Η >1, τότε εµφανίζεται θετικόσυνεργιστικό φαινόµενο Η γραφική παράσταση v=f([S])ή Υs=f([S]) είναι σιγµοειδής. Tο διάγραµµα Lineweaver-Βurkγια n Η =2 παρουσιάζεται στοσχήµα. n Η

Στις περισσότερες περιπτώσεις, έχει βρεθεί ότι η γραφικήπαράσταση Υs=f([S]) είναι ο πιο ικανοποιητικός τρόπος γιατην εξαγωγή των δεδοµένων για το συνεργιστικό φαινόµενο. Για τη µέτρηση του συνεργιστικού φαινοµένου χρησιµοποιείταιο συντελεστής συνεργιστικότητας Rs, ο οποίος ορίζεταιως εξής:R [ S ] για 90 %= S [ S ] για 10 % Στα ένζυµα που η γραφική παράσταση Υs=f([S]) είναι υπερβολή (δεν υπάρχει συνεργιστικό φαινόµενο) ο Rs ισούται µε 81, ενώστις περιπτώσεις που υπάρχει θετικό ή αρνητικόσυνεργιστικό φαινόµενο ο Rs έχει τιµή µικρότερη του 81 ή µεγαλύτερη του 81,αντίστοιχα. Η σχέση µεταξύ n Η και Rs δίνεται από τον τύπο:Sn HR = 81

Οσυντελεστήςn Η αποτελεί ένα μέτρο της αλληλεπίδρασηςτων θέσεων δέσμευσης μεταξύ τους.• Για την κατανόηση της φυσικής σημασίας του συντελεστήΗill, γίνεται διερεύνηση των τιμών που λαμβάνει ο n Η , στιςδιάφορες τιμές του Υs, στηγραφικήπαράστασητηςεξίσωσης Ηill.• Όπως φαίνεται από το σχήμαη γραφική παράσταση δεν είναιευθεία γραμμή όπως προβλέπεταιαπό τη θεωρία του Ηill.• Αυτό συμβαίνει γιατί όπως έχειήδη αναφερθεί, δεν ισχύει η παραδοχήότιηδέσμευσητουυποστρώματοςδε γίνεται σταδιακάκαι δε σχηματίζονται ενδιάμεσασύμπλοκα.• Στην πραγματικότητα,οι αποκλίσεις από την εξίσωση Ηill εμφανίζονται :

Σε πολύ µικρές συγκεντρώσειςυποστρώµατος (log[S] ) όπου οβαθµός κορεσµού του ενζύµουείναι πάρα πολύ µεγάλος (Υs≈1),δηλαδή µπορεί να θεωρηθεί ότιυπάρχει µόνο µία θέση δέσµευσης ελεύθερη για τουπόστρωµα και άρα δεν εµφανίζεται συνεργιστικόφαινόµενο. Και στις δύο αυτές περιπτώσεις που οι θέσεις δέσµευσηςδεν αλληλεπιδρούν µεταξύ τους, η τιµή του n Η ισούται µε τηµονάδα (n Η =1).

Πράγµατι, όπως φαίνεται καιστο σχήµα, η καµπύλη παίρνειτιµή κλίσης (n Η ) ίσον µε 1, σετιµές log[S] πολύ µικρές καιπολύ µεγάλες. Στις ενδιάµεσες περιπτώσεις,ο n Η είναι µεγαλύτερος από τηντιµή 1. Η κάθετος µεταξύ των δύοασύµβατων γραµµών (h),αντιπροσωπεύει την ενέργειααλληλεπίδρασης. ∆ηλαδή, για ένα ένζυµο µε n σηµεία σύνδεσης, το hεκφράζει τη διαφορά ανάµεσα στην ελεύθερη ενέργειααλληλεπίδρασης της δέσµευσης του πρώτου µορίουυποστρώµατος (-∆G 1 ) και του τελευταίου µορίου (-∆Gn).

Μοντέλο Αdair (ή κινητική Αdair) Tο µοντέλο Αdair λαµβάνει υπόψη και την ύπαρξηενδιάµεσων συµπλόκων ενζύµου-υποστρώµατος. Στην περίπτωση ενός ενζύµου µε τέσσερα σηµείαδέσµευσης (τετραµερούς), ισχύουν οι ακόλουθεςαντιδράσεις:K 1E + S ES (1)K 2ES + S ES 2(2)K 3ES 2+ S ES 3(3)K 4ES 3+ S ES 4(4)όπου οι Κ 1, Κ 2, Κ 3και Κ 4αντιπροσωπεύουν τιςπραγµατικές σταθερές διάστασηςγια κάθε αντίδραση και θαµπορούσαν να προσδιορισθούν,αν ήταν δυνατή η µελέτη της κάθεαντίδρασης ξεχωριστά από τιςυπόλοιπες. Σε ένα τετραµερές ένζυµο, ο διαθέσιµος αριθµόςθέσεων δέσµευσης δεν είναι ο ίδιος σ’ όλες τιςαντιδράσεις

K 1E + S ES (1)K 2ES + S ES 2(2)K 3ES 2+ S ES 3(3)K 4ES 3+ S ES 4(4)K 1= 1/4 K 1K 2= 2/3 K 2K 3= 3/2 K 3K 4= 4/1 K 4Θέσεις αποδέσµευσης SΣχετική σταθερά διάστασης (K) =Θέσεις δέσµευσης S Στην αντίδραση (1) υπάρχουν 4 θέσεις που µπορεί ναδεσµευτεί το υπόστρωµα, αλλά µόνο 1 θέση αποδέσµευσης. Στην αντίδραση (2) υπάρχουν 3 θέσεις δέσµευσης και 2θέσεις αποδέσµευσης.Στην αντίδραση (3) υπάρχουν 2 θέσεις δέσµευσης και 3αποδέσµευσης. Στην αντίδραση (4) υπάρχουν 1 θέση δέσµευσης και 4αποδέσµευσης.

Y S−−−K1[S]+ 2K1K=− −⎛4⎜1+ K1[S]+ K⎝12−22[ S]−+ 3K2+ K+ 4K+ K Όταν οι σχετικές σταθερές διάστασης δεν είναι ίδιες, τότεεµφανίζεται συνεργιστικό φαινόµενο. Για παράδειγµα, θετικό συνεργιστικό φαινόµενο παρουσιάζεταιόταν:−−−−K 2[ S]K8 K ,−

Κινητικά µοντέλα για την εξήγηση της σιγµοειδούςµορφής της καµπύλης v=f([S]) Tα µοντέλα που εξετάστηκαν µέχρι τώρα,προσπάθησαν να εξηγήσουν το συνεργιστικόφαινόµενο που παρουσιάζεται στη δέσµευση τωνυποκαταστατών στα αλλοστερικά ένζυµα. Στα µοντέλα αυτά, θεωρήθηκε ότι αποκαθίσταταιισορροπία στις διάφορες ηµιαντιδράσεις ενζύµουυποστρώµατοςκαι ονοµάζονται, µοντέλα σύνδεσηςισορροπίας (equilibrium binding models). Tο συνεργιστικό φαινόµενο µπορεί όµως ναεξηγηθεί και µε άλλο τύπο µοντέλων, τα οποίαονοµάζονται κινητικά µοντέλα (Κinetic models).

Στα κινητικά µοντέλα γίνεται κυρίως η παραδοχήότι το σύστηµα βρίσκεται σε µια σταθεροποιηµένηισορροπία (steady state) αφού το σύµπλοκο ES διασπάται σε E καιπροϊόντα µέσω µίας πολύπλοκης πορείαςδιασπάσεων δηλαδή εξετάζεται η επίδραση τουσυνεργιστικού φαινοµένου στην τιµή της Vmax. Θα πρέπει επίσης να αναφερθεί ότι παρά τιςδιαφοροποιήσεις που υπάρχουν στα µοντέλα,θεωρούνται όλα σωστά γιατί βρίσκουν εφαρµογή τοκαθένα σε διάφορα ένζυµα και άρα όλα εξηγούν τησιγµοειδή µορφή της καµπύλης v=f([S]) σεδιαφορετικές περιπτώσεις ενζύµων.

Τα κινητικά µοντέλα: Προϋποθέτουν µια σταθεροποιηµένη ισορροπία(steady state) και Η αλληλεπίδραση των θέσεων δέσµευσης τουενζύµου µεταφέρεται διαµέσου του χρόνου(µνήµη.) Τα µοντέλα σύνδεσης ισορροπίας: Προϋποθέτουν την αποκατάσταση ισορροπίας(standard state) και Η αλληλεπίδραση των θέσεων δέσµευσης τουενζύµου µεταφέρεται διαµέσου του χώρου(αλλαγή χωροδιάταξης).

Φυσιολογική σηµασίατης σιγµοειδούς µορφής της καµπύλης v=f([S]) Tα αλλοστερικά ένζυµα εµφανίζουν πολύπλοκεςιδιότητες,οι οποίες όµως είναι απαραίτητες για την καλύτερη ρύθµιση του µεταβολισµού καιγενικότερα για την οµαλή λειτουργία του πολύπλοκουσυστήµατος των ζωντανών οργανισµών. Για την κατανόηση της φυσιολογικής σηµασίας τηςσιγµοειδούς µορφής της καµπύλης v=f([S]) τωναλλοστερικών ενζύµων, σε σύγκριση µε τη µορφήτης καµπύλης v=f([S]) των ισοστερικών ενζύµων, ηοποία είναι υπερβολή, χρησιµοποιούνται σανπαραδείγµατα, η αιµοσφαιρίνη και η µυοσφαιρίνη.

Κι’ αυτό γιατί η καµπύλη κορεσµού τηςµυοσφαιρίνης σε συνάρτηση µε τη µερική πίεση τουΟ 2 έχει σχήµα υπερβολής, ενώ της αιµοσφαιρίνηςείναι σιγµοειδής. Όπως είναι γνωστό, το Ο 2 που δεσµεύεται σανυπόστρωµα στην αιµοσφαιρίνη και στηµυοσφαιρίνη, δεν αλλοιώνεται, γι’ αυτόχαρακτηρίζονται σαν ηµιένζυµα και είναι ιδανικάπρότυπα για τη µελέτη της κινητικής τουσχηµατισµού του συµπλόκου ενζύµουυποστρώµατος,παρουσία και απουσίααλλοστερικού τροποποιητή.

Η διαφορά στη µορφή της καµπύλης τους,οφείλεται στο γεγονός ότι η αιµοσφαιρίνη έχειτεταρτοταγή δοµή και αλλοστερική ρύθµιση, ενώ ηµυοσφαιρίνη δε διαθέτει, ούτε τεταρτοταγή δοµή,ούτε αλλοστερική ρύθµιση. Η εξήγηση της σιγµοειδούς µορφής της καµπύληςκορεσµού της αιµοσφαιρίνης, σύµφωνα µε τοµοντέλο του Κoshland, παρουσιάζεται στο επόµενοσχήµα

Στην αρχή, όλες οι υποµονάδες στο µόριο της αιµοσφαιρίνηςβρίσκονται µε τη µορφή Α και άρα η αιµοσφαιρίνη είναιστην κατάσταση T. Η σύνδεση του πρώτου µορίου του οξυγόνου γίνεται αργά,γιατί υπάρχει µικρή χηµική συγγένεια αυτού µε την Α µορφήτης υποµονάδας και έχει σα συνέπεια να αλλάξει µορφή ηυποµονάδα και να µετατραπεί σε Β. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα να αλλάξει επαγωγικά ηχωροδιάταξη της γειτονικής υποµονάδας και να γίνειπερισσότερο δραστική, έτσι ώστε η δέσµευση του δεύτερουµορίου οξυγόνου να γίνει πιο γρήγορα.

Στη συνέχεια αλλάζουν χωροδιάταξη και οι τελευταίεςδύο υποµονάδες και έτσι αυξάνει ακόµα περισσότερο ορυθµός δέσµευσης του οξυγόνου. Με όσα αναφέρθηκαν φαίνεται ότι η αιµοσφαιρίνηάλλοτε έχει µικρή συγγένεια µε το οξυγόνο και άλλοτεµεγάλη.

Επίσης, η σιγµοειδής µορφή της καµπύλης v=f([S]) τωναλλοστερικών ενζύµων δίνει τη δυνατότητα να µεταβάλλεται η δραστικότητάτους για µεγάλα όρια, ενώ η µεταβολή της συγκέντρωσης του τροποποιητή πουαπαιτείται γι’ αυτό, κυµαίνεται σε µικρά όρια. Συνήθως, η δραστικότηταενός ενζύµου πρέπει να µεταβληθείαπό το 10% στο 90%ή αντίστροφα, έτσι ώστε ναµπορεί να εκτελέσει ο ιστός,που περιέχει αυτό το ένζυµο,τις µεταβολικές πορείες πουαπαιτούνται για τη φυσιολογικήλειτουργία του οργανισµού. Στην περίπτωση που ηκαµπύλη δεν είναι σιγµοειδήςαπαιτείται µεταβολή κατά 80 φορές.

Στην περίπτωση των ισοστερικών ενζύµων, όπου τοδιάγραµµα v=f([S]) είναι υπερβολή, ο τροποποιητήςείναι το υπόστρωµα. Όταν όµως η µορφή της καµπύλης v=f([S]) είναισιγµοειδής, τότε απαιτείται πολύ µικρή µεταβολή τηςσυγκέντρωσης του τροποποιητή π.χ. τετραπλασιασµόςτης συγκέντρωσης, όταν η σταθερά ισορροπίας L τωνδύο καταστάσεων (T και R) έχει τιµή από 10.000 έως100.000.Είναι κατανοητό βέβαια, ότι µία υπερβολική αύξηση τηςσυγκέντρωσης ενός τροποποιητή δεν είναι ευνοϊκή γιατο µεταβολισµό, αφού αφ’ ενός µεν απαιτεί σηµαντικό χρόνο για νααποκατασταθεί η ισορροπία, αφ’ ετέρου δε, µπορεί να δηµιουργήσει προβλήµαταάλλης µορφής (π.χ. µεγάλη συγκέντρωση ΑTΡµεταβάλλει την ιοντική κατάσταση µέσα στο κύτταρο).

Συνοψίζοντας, θα µπορούσαµε να πούµε ότι ορόλος της σιγµοειδούς µορφής της καµπύληςv=f([S]) στο µεταβολισµό, σχετίζεται µε το ρόλο ενόςενισχυτή. Στην περίπτωση που απαιτείται µεγαλύτερηµεταβολή της δραστικότητας του ενζύµου π.χ. από1% σε 99%, τότε η σιγµοειδής µορφή της καµπύληςδε λύνει το πρόβληµα ικανοποιητικά, αλλάχρησιµοποιούνται άλλοι τρόποι για τη ρύθµιση τουµεταβολισµού.