OPTICKÉ BIOSENZORY.pdf - FBMI
OPTICKÉ BIOSENZORY.pdf - FBMI
OPTICKÉ BIOSENZORY.pdf - FBMI
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>BIOSENZORY</strong><br />
Zpracováno s využitím : Pradas, Biofototonika, Willey,<br />
U.E.Spichinger- Keller, Chemical Sensors and Biosensors…., Willey<br />
L. Cudzik, Diplomová práce FJFI ČVUT, 2006<br />
F.S.Liegler, Optical Biosensors, Elsevier,<br />
KPO www – inteferometrické biosenzory<br />
Biosenzory jsou analytická zařízení, která mohou detekovat chemické nebo<br />
biologické látky či mikroorganizmy. Používají k detekci vybrané typy molekul nebo<br />
organizmů.<br />
Biosenzor se skládá v zásadě ze dvou částí:<br />
bioreceptoru a<br />
převodníku.<br />
Bioreceptory jsou molekuly, které rozpoznávají analytický cíl (tj. látku, která má být<br />
analyzována), ale jejich informaci nám zprostředkuje až<br />
převodník, který analytický cíl převede na měřitelný signál.<br />
A pak je tu ještě třetí prvek, který zdánlivě nevstupuje do hry - nosič bioreceptoru.<br />
V odborném jazyce se mu říká substrát (analyt).
<strong>OPTICKÉ</strong> <strong>BIOSENZORY</strong><br />
Rozpoznání molekul je převedeno na optickou změnu (absorpce,<br />
luminiscence, index lomu)<br />
Optické biosenzory :<br />
biosenzory s vláknovou optikou, planární vlnovodné biosenzory,<br />
biosenzory s evanescenční vlnou, interferometrické biosenzory,<br />
biosenzory na povrchové plazmonové rezonanci,……..<br />
OWLS- optical waveguide lightmode spectroscopy (mřížkové, rez.<br />
zrcadlo)<br />
SERS- surface enhanced Raman spectroscopy<br />
SPR - surface plasmon resonance<br />
EWF –evanescent wave fluorescence (TIRF), etc.
<strong>OPTICKÉ</strong> <strong>BIOSENZORY</strong><br />
Metody navázání světla do vlnovodu: a) přímé navázání – endfiring; b)<br />
navazování optickým hranolem; c) navazování optickou mřížkou
<strong>OPTICKÉ</strong> <strong>BIOSENZORY</strong><br />
1. INTERFEROMETRICKÉ (v.t. www stránky KPO)<br />
2. MŘÍŽKOVÉ<br />
3. REZONANČNÍ ZRCADLO<br />
4. REZONANCE POVRCHOVÉHO PLAZMONU<br />
5. TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence = fluorescence<br />
daná úplným vnitřním odrazem)
1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY<br />
Interferometrie je optická metoda, která sleduje rozdíly mezi dvěma<br />
optickými svazky, jež uběhly podobné dráhy. Pozorování<br />
biokonjugované reakce, která se odehrává v dráze jednoho ze svazků,<br />
tvoří základ biosensoru.<br />
Nejoblíbenější platformou interferometrických senzorů jsou planární<br />
vlnovody.<br />
Ty jsou preferovány z důvodu delší interakční dráhy.<br />
Evanescentní pole planárního vlnovodu je citlivé na změny indexu<br />
lomu materiálu, který je nad vlnovodem.<br />
Toto pole je schopné proniknout až do vzdálenosti 500 nm nad povrch<br />
vlnovodu.<br />
Pokud nad povrch umístíme chemicky aktivní vrstvu, chemická reakce<br />
se odehraje v tomto poli.<br />
Chemické i fyzikální interakce mění index lomu a tím ovlivňují rychlost<br />
šíření a fázi optického svazku (větší index lomu pak sníží rychlost šíření<br />
a naopak).
1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY
1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY<br />
Abychom mohli měřit tuto změnu (indexu lomu), je potřeba umístit<br />
do blízkosti citlivého vlnovodu (citlivého na danou reakci), vlnovod<br />
referenční.<br />
Svazky z těchto dvou kanálů jsou pak opticky zkombinovány a<br />
vytvoří charakteristické interferenční proužky.<br />
Chemická, nebo fyzikální změna v senzorické části interferometru<br />
vede k posuvu interferenčních proužků.
1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY<br />
Při šíření světla optickým vlnovodem dochází k periodicky se opakujícím totálním<br />
odrazům vlny na rozhraní vlnovodné vrstvy a vrstev okolních. Změna fáze způsobená<br />
tímto odrazem je závislá na indexech lomu obou těchto vrstev.<br />
Pokud se tedy nad vlnovodnou vrstvou změní (třeba v důsledku chemické, či<br />
biologické reakce) index lomu, dojde k fázovému posunu.<br />
Tuto změnu samu o sobě nerozeznáme, potřebujeme k tomu nějaký druh reference.<br />
Často se využívají směrové odbočnice, které rozdělí výkon do dvou kanálů. Jeden<br />
slouží jako referenční a druhý jako citlivý kanál. Reakce probíhá pouze nad citlivým<br />
kanálem, referenční naopak musí být od ní co nejlépe izolován.<br />
Oba kanály jsou poté opět spojeny a lze pozorovat změny interferenčních proužků.<br />
Toto uspořádaní (Mach-Zenderovo) je citlivější, než ostatní druhy biosenzorů (až<br />
10x), ale je obtížněji vyrobitelné, dražší a je problém rozlišit vliv detekované události<br />
od ostatních vlivů (teploty,lokálních variací indexu lomu apod).<br />
Pro kompenzaci těchto efektů se interferometrické senzory provozují na více<br />
vlnových délkách, nicméně celá konstrukce se tímto komplikuje.
1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY<br />
Schéma dvou typů kanálkového Mach-<br />
Zenderova interferometru<br />
Schéma Youngova interferometru
2. MŘÍŽKOVÝ SENZOR (1. varianta)
2. MŘÍŽKOVÝ SENZOR<br />
Tyto senzory si získaly asi největší popularitu, protože je u nich největší<br />
naděje na širší praktické aplikace. Nevýhodou je nutnost zařazení mřížky<br />
do vlnovodu, pozitivem je zase snadná integrovatelnost a možnost využití<br />
méně náročných depozičních metod (např. Sol-gel).<br />
Teoretický základ byl rozpracován v pracech Lukosze a Tiefenthalera<br />
publikovaných v 80. tých let minulého století.<br />
V dielektrickém vlnovodu je vytvořena mřížka, jež slouží k zavedení<br />
světla do vlnovodu. Ta má řádově 2000 čar/mm.<br />
Na povrchu vlnovodu je imobilizována látka biokonjugovaná k<br />
detekované. Aktivní zóna je omezena na oblast navázání světla<br />
(incoupling area).<br />
Má rozměry zhruba 0.5 mm 2 - 10 mm 2 . Světlo se zavádí do vlnovodu ze<br />
strany substrátu.
2. MŘÍŽKOVÝ SENZOR<br />
Detektor je umístěn na konci vlnovodu. Laser je namířen na mřížku a<br />
celý čip se v průběhu měření postupně otáčí v rozsahu cca. 7° na obě<br />
strany od ideálního vazebního úhlu. Ten se mění v závislosti na indexu<br />
lomu svrchního prostředí (a tedy na koncentraci detekované látky).<br />
Podle umístění detektoru rozlišujeme dvě experimentální uspořádání<br />
(výše uvedené a …...<br />
Druhou možností umístit detektor pod čip a sledovat intenzitu světla<br />
vyvázaného z vlnovodu v závislosti na úhlu. Uspořádání laseru a<br />
detektoru je tedy přesně obrácené.
2. MŘÍŽKOVÉ SENZORY (2. varianta)
3. REZONANČNÍ ZRCADLO
3. REZONANČNÍ ZRCADLO<br />
Optical Biosensors, F. S. Ligler, C. A. R. Taitt (ELSEVIER 2002)
3. REZONANČNÍ ZRCADLO<br />
Tento druh senzoru pracuje na podobném principu, jako mřížkový<br />
odrazný vazebný člen (reflection coupler).<br />
Místo mřížky je v tomto uspořádání použita optická prizma.<br />
To výrobu na jednu stranu zjednoduší, protože leptání mřížky není<br />
úplně snadnou záležitostí.<br />
To je ovšem vykompenzováno složitějším postupem při depozici.<br />
Zatímco v prvním případě stačilo na podložku s připravenou mřížkou<br />
nadeponovat vlnovodnou vrstvu, zde je situace komplikovanější.<br />
Horní strana vlnovodu je již rezervována pro transduktor a zkoumaný<br />
vzorek a světlo je tedy třeba zavádět ze strany podložky. Aby došlo k<br />
navázání světla do vlnovodu, je nutné, aby mezi prizmou a vrstvou<br />
byla tenká vrstva z materiálu o nižším indexu lomu, než má vlnovodná<br />
vrstva a prizma. To lze vyřešit dvěma způsoby.
3. REZONANČNÍ ZRCADLO<br />
Buď se přímo na optickou prizmu nadeponuje dielektrická vrstva<br />
s nízkým indexem lomu a na ní vlnovodná vrstva. Musí platit, že<br />
spodní vrstva (tzv. buffer vrstva n b) má nejnižší index lomu<br />
n b >= n g > n b.<br />
Rovněž tloušťka vrstvy je omezena na několik desítek nm, aby<br />
se světlo z prizmy mohlo protunelovat do vlnovodné vrstvy.<br />
Tento postup má tu nevýhodu, že depozice probíhá přímo na<br />
prizmu, tím ovšem dochází k jejímu znehodnocení.<br />
Druhou variantou je vlnovodnou a buffer vrstvu deponovat na<br />
podložku z materiálu shodného s materiálem prizmy.<br />
Podložky musí být dobře vyleštěny, aby na rozhraní prizmapodložka<br />
došlo k co nejmenším energetickým ztrátám. Prizma v<br />
tomto případě zůstává mimo depoziční proces a je tedy<br />
ušetřena.
4. REZONANCE POVRCHOVÉHO PLAZMONU
4. REZONANCE POVRCHOVÉHO PLAZMONU<br />
(Surface Plasmon Resonance)<br />
SPR senzory se skládají z tenké kovové vrstvy o tloušťce cca. 50 nm<br />
deponované na skleněném povrchu.<br />
Do tohoto povrchu je poté zavedeno světlo (obvykle prizmou), načež<br />
se při určitém úhlu dopadu na rozhraní metalické vrstvy a vrstvy<br />
zkoumaného materiálu generuje zvláštní druh vlny, tzv. povrchový<br />
plazmon.<br />
Při tomto úhlu dojde k rezonanční vazbě mezi příchozím světlem a<br />
povrchovým plazmonem a můžeme pozorovat dip v grafu závislosti<br />
odražené energie na úhlu dopadajícího světla.<br />
Jeho přesná poloha je závislá také na indexu lomu svrchní vrstvy, kde<br />
se odehrává biologická reakce.
4. REZONANCE POVRCHOVÉHO PLAZMONU<br />
Monitorováním úhlu, kdy dochází k rezonanci lze pozorovat změny<br />
indexu lomu svrchní vrstvy.<br />
Pro generaci povrchového plazmonu je potřeba světlo s p-polarizací.<br />
Nejčastěji se používají vrstvičky ze stříbra, nebo zlata. Stříbro nabízí<br />
užší minimum dipu, tedy větší rozlišení, na druhou stranu zlato je<br />
stabilnější a má lepší adhezi ke skleněné podložce.
4. Optické biosenzory - SPR<br />
L: light source, D: photodiode array, P: prism, S: sensor surface, F: flow cell.<br />
Dvě černé čáry v odraženém svazku symbolizují pokles intenzity světla v důsledku<br />
rezonančního jevu v čase t 1 a t 2.<br />
Čára t 1 znázorňuje situaci před navázáním antigenu na protilátky na povrchu vrstvy a<br />
t 2 znázorňuje pozici po navázání.
4. Optické biosenzory - SPR
4. Optické biosenzory - SPR<br />
SPR – je jev nastávající po odrazu světla od tenké kovové vrstvy. Část<br />
energie záření dopadajícího pod definovaným úhlem může interagovat s<br />
delokalizovanými elektrony v tenké kovové vrstvě (plasmony) a tím se<br />
sníží intenzita světla odraženého.<br />
Tento úhel dopadu lze přesně určit.<br />
Záleží na změně indexu lomu v místech „zadní“ strany tenké kovové<br />
vrstvy – tj. v místě kde jsou zachycovány detekované molekuly na<br />
ligandech.<br />
Dojde- li k navázání detekovaných molekul, tak se změní index lomu,<br />
což vede ke změně úhlu pro vznik SPR – a tím dojde ke změně intenzity<br />
odraženého světla.
4. Optické biosenzory -<br />
SPR
5. TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence)
5. TIRF<br />
Optical Biosensors, F. S. Ligler, C. A. R. Taitt (ELSEVIER 2002)
5. TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence =<br />
fluorescence daná úplným vnitřním odrazem)<br />
Metoda byla teoreticky objevena zhruba v polovině 70.tých let minulého<br />
století.<br />
Jako v ostatních druzích senzoru je jeden z reaktantů imobilizován na<br />
povrchu vlnovodu, do kterého je laserem zavedeno světlo.<br />
V případě TIRF může být interakční oblast větší - nejsme omezeni jen na<br />
oblast vazebního členu. Druhý reaktant ovšem musí být v tomto případě<br />
označkován nějakou fluorescenční látkou.<br />
Pokud se tyto molekuly naváží na imobilizované látky na povrchu<br />
vlnovodu, dostanou se do dosahu evanescentního pole a toto pole budí<br />
fluorescenci daného labelu (značkovače).Ta je poté detekována CCD<br />
kamerou, nebo konfokálním mikroskopem.<br />
Výhodou tohoto uspořádání je, že nejsme omezení při detekci na úzkou<br />
část senzoru.<br />
Nevýhodou je nutnost použití fluorescenčních značkovačů, které zužují<br />
možnost praktického použití.
Aplikace biosenzorů<br />
Aplikací je celá řada - detektory plynů, měřiče vlhkosti, pro<br />
charakterizaci tenkých vrstev apod.<br />
Klíčová je schopnost monitorovat chemické a biologické reakce a to<br />
téměř v reálném čase. Při nalezení vhodných biokonjugovaných látek<br />
se dají použít také pro detekci neznámých látek, kdy známé vhodné<br />
kandidáty.<br />
Doposud jsme tvrdili, že proměny na povrchu vlnovodu se odrazí ve<br />
změně efektivního indexu lomu. Nicméně tato veličina sama o sobě<br />
neříká nic o množství adsorbovaného materiálu na povrchu.<br />
K tomu slouží veličina pokrytí povrchu (surface coverage) Г [pg.mm -2 ].<br />
Citlivost se udává jako hmotnost detekované látky schopné vyvolat<br />
dostatečný signál na jednotku plochy citlivého povrchu.<br />
Běžně udávaná citlivost těchto zařízení se pohybuje mezi 5-10 pg mm -2 ,<br />
interferometry jsou zhruba 10x citlivější.
Aplikace biosenzorů<br />
Další význačnou charakteristikou je tzv. detekční limit, neboli minimální<br />
koncentrace látky v roztoku,kdy je schopen ji senzor detekovat.<br />
Tento limit závisí na konkrétní úloze.<br />
Např. pro reakce typu receptor - protilátka se udává běžně detekční limit<br />
200μg/l., metoda TIRF je schopna dosáhnout až 0.5 μg/l<br />
Prvním impulzem pro vývoj optických biosenzorů byl výzkum interakcí<br />
mezi proteiny a toto zůstalo nejdůležitější oblastí aplikace.<br />
Z biologických aplikací je třeba také zmínit monitorování kinetiky<br />
adheze a růstu buněk na povrchu.
Aplikace biosenzorů<br />
Optické vlnovodné biosenzory jsou ideální pro monitorování těch<br />
interakcí kde reakce mají obvykle velkou molekulární hmotnost (od<br />
1000u = daltonů) a tedy produkují silnou odezvu.<br />
Biosenzory jsou schopny detekovat molekuly od hmotností několika set<br />
daltonů<br />
1u = 1 / {1000N a} =1.66.10 -27 [kg],<br />
Pro porovnání hmotnost m : m (H 2O) = 18 u,<br />
m(hemoglobinu) = 10 5 u,<br />
m(viru) = 10 7 u.<br />
Důležitým krokem při konstrukci biosenzoru je imobilizace jednoho z<br />
reaktantů na jeho povrch. Pro usnadnění tohoto úkolu se v systémech<br />
rezonančního zrcadla často imobilizuje na povrch vlnovodu vrstva<br />
karboxymethylového dextranu (carboxymethylated dextran - CMD).<br />
Tato vrstva tvoří trojrozměrnou matrici, která velmi ulehčuje navázání<br />
molekul obsahující aminy. Zároveň jim zabraňuje v přímém kontaktu s<br />
vlnovodem, které by mohlo způsobit zvýšenou odezvu senzoru.
Optické biosenzory- OWLS<br />
OWLS – Optical Waveguide Lightmode<br />
Spectroscopy (Brusatori – ITO film,<br />
10 nm, coated onto SrTiO<br />
waveguding film, serves as the<br />
working sensing electrode.<br />
Adsorption is detected by monitoring<br />
changes in the effective refractive<br />
index of the waveguide- ITO film<br />
plus adsorbed layer (indium tin<br />
oxide).<br />
Fig. 1. A schematic of the ITO coated OW 2400<br />
sensor chip (Micro Vacuum Ltd., Budapest).<br />
Fig. . A schematic of the sensor chip as a four-layer<br />
optical waveguide. Monochromatic light penetrates a<br />
glass substrate (S) at an angle and is coupled into a<br />
waveguiding film (F) via a grating. A second film (F′),<br />
representing either a conducting layer or adsorbed<br />
species, may separate the waveguiding layer from the<br />
cover (C) solution. A guided mode is detected when the<br />
phase shift of one complete period of total internal<br />
reflection equals an integral multiple of 2 . The guided<br />
mode is characterized by propagation angles F and F′.
Optické biosenzory- OWLS<br />
OWLS je založena na navázání svazku He- NE laseru do planárního<br />
vlnovodu přes difrakční mřížku. K tomuto navázání dochází pouze při<br />
dvou diskétních úhlech – pro polarizaci dopadajícího svazku TE a TM.<br />
Úhel navázání je indikován fotodiodou umístěnou na konci vlnovodu.<br />
Na rozhraní vzniká při navázání svazku evanescenční pole, které proniká<br />
do roztoku do vzdálenosti asi 100 – 200 nm. Měřením změn vazebního<br />
úhlu umožní on- line monitorování změni indexu lomu v blízkosti<br />
povrchu. Změna indexu lomu může být korelována s adsorpčním<br />
procesem.
Optické biosenzory
Biosenzory- EWF<br />
(evanescent wave fluorescence<br />
(TIRF)<br />
Array biosenzors–<br />
detection multiple<br />
targets on the surface<br />
of single waveguide.<br />
Rapid detection and<br />
monitoring of toxins.<br />
The analyte/biorecognition<br />
element/optical probe at the<br />
interface between the<br />
biomedium and the guiding<br />
medium can interact with<br />
evanescent field and produce an<br />
optical response (phase,<br />
amplitude)<br />
Change in fluorescence<br />
properties as a result of the<br />
analyte binding with the<br />
biorecognition element.<br />
Obr.9.17 Biofotonika
Otázky<br />
1. Princip biosenzoru, optické biosenzory, druhy- členění<br />
2. Navázání světla do optických biosenzorů<br />
3. Interferpmetrické biosenzory<br />
4. Mřížkové biosenzory<br />
5. Biosenzory na rezonančním zrcadle<br />
6. Biosenzory na povrchovém plazmonu (SPR)<br />
7. Biosenzory na fluorescenci s totálním vnitřním odrazem<br />
(TIRF)<br />
8. Aplikace biosenzorů, citlivost biosenzorů, detekční limit<br />
9. Biosenzory QWLS<br />
10. Biosenzory EWF