Download som PDF her - Det Nationale Forskningscenter for ...
Download som PDF her - Det Nationale Forskningscenter for ...
Download som PDF her - Det Nationale Forskningscenter for ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Genotoksikologi<br />
thymidinkinase- (TK-) lokus, <strong>som</strong> fører til funktionsfald eller -<br />
bortfald af enzymet.<br />
Ikke-muterede celler indeholder aktivt thymidinkinase, der er<br />
involveret i cellernes biosyntese af DNA-precursorer via phosphorylering<br />
af thymidin, der anvendes <strong>som</strong> byggesten i DNA.<br />
DNA-basen thymin dannes normalt via de novo syntese. Eksponering<br />
<strong>for</strong> pyrimidinanalogerne 5-bromodeoxyuridin, fluorodeoxyuridin<br />
eller trifluorithymidin fører til phosphorylering med<br />
TK og indbygning i DNA med efterfølgende celledød. Mutationer<br />
i TK-lokus, <strong>som</strong> resulterer i inaktiv thymidinkinase, fører til resistens<br />
af de muterede celler over <strong>for</strong> pyrimidinanalogerne, idet<br />
disse celler kun får thymin fra de novo syntese.<br />
TK-lokus findes på et auto<strong>som</strong>alt kromo<strong>som</strong>, hvor<strong>for</strong> hemieller<br />
heterozygot mouse lymphoma celler anvendes. Cellerne dyrkes<br />
i suspensionskultur tilsat testsubstansen og med eller uden<br />
metabolisk aktivering (S9-mix). Fordoblingstiden er kort (9-10<br />
timer), og cellerne udsættes <strong>for</strong> teststoffet i denne periode, hvorefter<br />
der skiftes medie med pyrimidinanalog, og efter ca 2 uger<br />
scores antalllet af muterede kolonier. Anvendes trifluorothymidin<br />
<strong>som</strong> selektionsstof, giver mange teststoffer et bifasisk respons i<br />
<strong>for</strong>m af små kolonier med lang<strong>som</strong>t voksende mutanter (kromo<strong>som</strong>al<br />
og/eller punktmutationer) og større kolonier med hurtigt<br />
voksende mutanter (især genmutationer). I opgørelser af mutationsfrekvenser<br />
bør både små og store kolonier medtages.<br />
KOMET assay<br />
Komet-metoden er en ny metode, der er udviklet <strong>som</strong> en hurtig<br />
screenings-test inden <strong>for</strong> den genetiske toksikologi. Metoden anvendes<br />
ved in vitro <strong>for</strong>søg på cellekulturer og i mindre grad på celler<br />
fra <strong>for</strong>søgsdyr. Ved biomoniteringsstudier har metoden har også<br />
fundet anvendelse <strong>som</strong> screeningsmetode.<br />
Celler støbes ind i en agarose-gel, og cellemembranen ødelægges,<br />
og proteiner nedbrydes ved lysering. Herved fjernes cytosolære<br />
proteiner, mens DNA <strong>for</strong>bliver i gelen. <strong>Det</strong> tilbageværende<br />
DNA behandles alkalisk (alternativt neutralt), og gelen udsættes<br />
<strong>for</strong> et elektrisk felt, elektro<strong>for</strong>ese. Ved en efterfølgende farvning<br />
af DNA med fluorescerende farvestof kan DNA visualiseres i fluorescens-mikroskop.<br />
Celler med skader på DNA ligner kometer i<br />
mikroskopet, hvorimod ubeskadiget DNA bevarer sin struktur og<br />
har et kugle<strong>for</strong>met udseende. Komet-metoden detekterer strengbrud<br />
i DNA. Under neutrale elektro<strong>for</strong>ese betingelser måles dobbelt<br />
strengbrud, mens der ved alkaliske betingelser detekteres<br />
alle <strong>for</strong>mer <strong>for</strong> direkte strengbrud og DNA-skader, der konverteres<br />
til strengbrud (såkaldte alkali-labile skader og strengbrud<br />
<strong>for</strong>årsaget af DNA-reparationsmekanismer).<br />
Metoden har været anvendt til at analysere stoffer, der <strong>for</strong>årsa-<br />
35
Change language