Mekanismer for brun- og hvidmuld svampes nedbrydning af tr - Nature

Me k a n i s M e r f o r b r u n- o g h v i dM u l d
s va M p e s n e d b r y d n i n g a f t r æ
Enzymatisk såvel som non-enzymatisk
Peter Nebelong
Armillaria ostoyae Side 1

Me k a n i s M e r f o r b r u n- o g h v i d M u l d s va M p e s n e d-
b r y d n i n g a f t r æ
Cellulose <strong>og</strong> lignin er henholdsvis nr. 1 <strong>og</strong> 2 på listen over de mest udbredte
organiske <strong>for</strong>bindelser på Jorden. Det skønnes at der hvert år bliver opbygget
<strong>og</strong> nedbrudt 180 mia ton cellulose [Blomqvist K. et el. (2007)].
USA’s nuværende <strong>for</strong>brug <strong>af</strong> benzin er ca. 400 mia liter p.a. hvilket energimæs-
sigt svarer til 520 mia liter ethanol. Dette svarer igen til 2.860 mia kg lignifiseret
biomasse [Vassão D.G. et al. (2008)] eller 5.720 mia kg lignifiseret biomasse
hvor kun cellulose anvendes (hvis 50% <strong>af</strong> biomassen er cellulose). Set i <strong>for</strong>-
hold til den <strong>for</strong>modede celluloseomsætning på 180.000 mia kg p.a. udgør det
3,7% <strong>for</strong> USA alene. USA står generelt <strong>for</strong> 1/4 <strong>af</strong> verdens energi<strong>for</strong>brug <strong>og</strong>
hvis al bioethanol skulle erstatte benzin ville det betyde at ca. 15% <strong>af</strong> cellu-
loseproduktionen skulle <strong>af</strong>brændes som ethanol.
Cellulose <strong>og</strong> lignin udgør en meget stor del <strong>af</strong> vaskulære planter <strong>og</strong> <strong>for</strong> fuld-
voksne træers vedkommende, er det langt hovedparten, <strong>og</strong> <strong>af</strong>hængig <strong>af</strong> træ-
sorten kan mellem 25 % <strong>og</strong> 45% være cellulose, ca. 25% hemicellulose, <strong>og</strong> ca.
25% være lignin.
Træer bruger meget lidt energi til vedligeholdelse set i lyset <strong>af</strong> deres ofte
enorme størrelser. Dette skyldes især at kun ca. 1% udgøres <strong>af</strong> levende celler,
da størstedelen <strong>af</strong> kærnetræet er dødt væv <strong>og</strong> primært består <strong>af</strong> lignocellulose
fra den sekundære cellevæg [Blomqvist K. et al. (2007)]. Hvis man tænker
over hvor meget et træ kan stå model til, ofte over hundreder <strong>af</strong> år, kan man
måske begynde <strong>af</strong> <strong>for</strong>nemme hvor effektiv <strong>og</strong> hårdfør en struktur de under-
liggende kemiske <strong>for</strong>bindelser må have. Det er da tilsyneladende <strong>og</strong>så kun en
gruppe <strong>af</strong> organismer, nemlig basidiomyceterne, som har udviklet evnen til at
nedbryde kulstoffet i lignin fuldstændig ved at mineralisere det til CO2
[Hofrichter M. et al. (2002)].
Side 2

En <strong>for</strong>ståelse <strong>af</strong> de mekanismer som disse svampe benytter sig <strong>af</strong>, vil måske
kunne gøre det muligt at dække en stor del <strong>af</strong> vores energibehov, f.eks. via
delvis <strong>nedbrydning</strong> <strong>af</strong> lignocellulosen til mere overkommelige <strong>for</strong>bindelser,
<strong>og</strong> efterfølgende fermentering. En anden potentiel udnyttelse <strong>af</strong> denne viden
kunne være storskala <strong>for</strong>ureningsbekæmpelse. Det <strong>for</strong>holder sig nemlig sådan
at de selv samme svampe, er istand til at nedbryde komplekse aromatiske
<strong>for</strong>bindelser, som mange stæder ligger ligger i jorden under tidligere eller nu-
værende kemiske industrier.
Det er der<strong>for</strong> med stor glæde at jeg kaster mig ud i dette emne, i et <strong>for</strong>søg på
at sammenfatte n<strong>og</strong>et <strong>af</strong> det vi tror vi <strong>for</strong>står, om måden hvorpå disse organis-
mer klarer ud<strong>for</strong>dringen.
Side 3

in d h o l d s f o r t e g n e l s e
ke M i s k s t r u k t u r a f in v i v o s u b s t r at e t ..................................5
Lignin ...................................................................................5
CeLLuLose ........................................................................... 10
He m i C e L L u L o s e .................................................................... 15
hø j e r e o r d e n s s t r u k t u r a f in v i v o s u b s t r at e t ................... 17
Va s k u L æ r e p L a n t e r ............................................................. 17
Ce L L e V æ g ........................................................................... 17
or g a n i sM e r n e .................................................................... 25
ne d b r y d n i n g s M e k a n i s M e r n e ................................................ 27
CeLLuLose n e d b r y d n i n g ....................................................... 27
En d o g l u c a n a s E ....................................................................................... 30
cE l l o b i o h y d r o l a s E ................................................................................. 32
β-g l u c o s i d a s E .......................................................................................... 33
cE l l o b i o s E d E h y d r o g E n a s E ..................................................................... 35
Lignin n e d b r y d n i n g .............................................................. 41
PE r o x i d a s E r ............................................................................................ 42
li g n i n PE r o x i d a s E ................................................................................... 43
Ma n g a n a f h æ n g i g PE r o x i d a s E................................................................. 51
VE r s at i l E P E r o x i d a s E .............................................................................. 52
la c c a s E ................................................................................................... 53
ko n k l u s i o n ........................................................................ 57
re f e r e n c e l i s t e .................................................................. 58
Side 4

ke M i s k s t r u k t u r a f in v i v o s u b s t r at e t
Lignin
Ordet lignin kommer <strong>af</strong> det latinske ord lignum, som betyder træ, hvilket er
meget passende, da det er her vi finder den største mængde <strong>af</strong> denne hetero-
gene polymer.
Lignin har en kemisk sammensætning, som er meget anderledes end andre
biol<strong>og</strong>isk syntetiserede polymerer som f.eks. amylose, amylopectin, xylan,
chitin, cellulose <strong>og</strong> hemicellulose. Udover at lignin indeholder en stor mængde
aromatiske grupper, er den måde hvorpå den syntetiseres <strong>og</strong>så en væsen-
tlig årsag til <strong>for</strong>skelligheden. Lignin er en polymer, men hvor de fleste andre
polymerer dannes via en eller anden <strong>for</strong>m <strong>for</strong> <strong>for</strong> energi<strong>for</strong>brug i <strong>for</strong>m <strong>af</strong> ATP
eller lignende pr. binding, så dannes lignin ved radikal-polymerisering.
Radikal polymerisering <strong>for</strong>løber ved en initierings reaktion, som danner en fri
radikal. Denne radikal kan så eksempelvis via addition, bindes til et kulstof
atom som er dobbeltbundet til et andet kulstof, hvorved der opstår en polymeri-
sering, men samtidig dannes en ny fri radikal. Denne process kan <strong>for</strong>løbe så
længe der er substrat nok tilstede <strong>og</strong> der dannes derved mere <strong>og</strong> mere høj-
molekylære <strong>for</strong>bindelser. Dette kaldes <strong>for</strong> propageringsreaktionen i radikal
polymerisering. På et tidspunkt møder den fri radikal en anden fri radikal, <strong>og</strong>
disse har så muligheden <strong>for</strong> at parre elektroner med hinanden, hvilket medfør-
er at 2 radikaler tages ud <strong>af</strong> propageringsreaktionen. Dette kaldes <strong>for</strong> termine-
ringsreaktioner, da de således <strong>af</strong>slutter polymeriseringen <strong>for</strong> de to radikaler.
En vigtig konsekvens ved radikal polymerisering, set i <strong>for</strong>hold til eksempelvis
kontrolleret enzymatisk katalyse <strong>af</strong> glycosid bindinger i polysaccarider, er at
kontrollen med hvilke bindinger som bliver etablerer, betydeligt mindskes.
De monomerer som er til stede når initieringen <strong>for</strong>etages, har naturligvis stor
indflydelse på sammensætningen <strong>af</strong> den færdige polymer, <strong>og</strong> <strong>for</strong> eksempelvis
Side 5

ethylen ved man at resultatet <strong>af</strong> radikalpolymerisering bliver polyethylen, som
er en alkan <strong>og</strong> dermed uden dobbeltbindinger mellem kulstof som i den oprin-
delige monomer. Også phenyl grupper deltager gerne i radikal dannelse, <strong>og</strong>
disse er specielt stabile idet de via delokalisering <strong>af</strong> radikal elektronen er det
som kaldes resonansstabiliseret. Det betyder <strong>og</strong>så at radikaler kan flytte sig
hen over π orbitalen som omkredser hele benzen ringens periferi, <strong>og</strong> derved
videreføre polymeriseringen i flere retninger. Oxygen kendes <strong>og</strong>så som villige
bærere <strong>af</strong> frie radikaler, bl.a. i superoxider. Det er der<strong>for</strong> naturligt at valget <strong>af</strong>
monomerer i disse radikal reaktioner, er en vigtig faktor når det gælder kontrol
over processens slutprodukt.
Monomererne som polymeriseres til lignin kaldes monolignoler, <strong>og</strong> de er <strong>for</strong>
gymnosperm (blødtræ) <strong>og</strong> angiosperms (hårdtræ) vedkommende alle phe-
nylpropenoler (hydroxycinnamyl alkoholer). De tre primære er para-coumaryl
alkohol, coniferyl alkohol <strong>og</strong> sinapyl alkohol <strong>og</strong> varierer kun i tilstedeværelsen
<strong>af</strong> methoxy substituenter <strong>og</strong> placeringen <strong>af</strong> disse i phenyl ringen (fig. 1).
Fig. 1
p-coumaryl alkohol, coniferyl alkohol <strong>og</strong> sinapyl alkohol. For p-coumaryl alkohol er navngivningen
<strong>af</strong> kulstoratomerne vist. Kulstofatomerne i ringen er nummererede, mens propenyl
alkohol atomerne har græske b<strong>og</strong>staver.
Efter polymeriseringen benævnes disse som henholdsvis p-hydroxyphenyl
(H), guaiacyl (G) <strong>og</strong> syringyl (S) enheder. I meget grove træk har blødtræ
en sammensætning <strong>af</strong> H:G:S = 4:96:~0 <strong>og</strong> hårdtræ har sammensætningen
H:G:S = ~0:50:50. Der er d<strong>og</strong> variationer træer imellem <strong>og</strong> ligeledes hete-
r<strong>og</strong>enitet i ligninsammensætningen i det enkelte træ. Tendensen er d<strong>og</strong> at
Side 6

lødtræ <strong>for</strong>etrækker coniferyl som monomer med en smule coumaryl <strong>og</strong> kun
sporstof mængder <strong>af</strong> sinapyl, mens hårdtræ blander coniferyl <strong>og</strong> sinapyl i
lige store dele <strong>og</strong> kun har sporstof mængder <strong>af</strong> coumaryl [Wong D.W.S. et al.
(2009) i][Christiernin M. et al. (2005) i].
De æter <strong>og</strong> kulstof-kulstof polymeriserings<strong>for</strong>bindelser som man oftest finder
i lignin er β-O-4 (50% i gymnasperm, 80% i angiosperm), β-1 (2% i gym-
nasperm), β-5 (10% i gymnasperm), β-β, 5-5 (25% i gymnasperm), 5-O-4 (4%
i gymnasperm). Den hyppigste binding, β-O-4 er samtidig den mest labile <strong>og</strong>
brydes let i kemiske delignificering (Fig. 2).
Fig. 2
De hyppigst <strong>for</strong>ekomne polymeriserings<strong>for</strong>bindelser i lignin [Wong D.W.S. et al. (2009) i]
Hvis man kigger lidt nærmere på hvordan de ovenstående polymeriserings-
<strong>for</strong>bindelser dannes, kan man inddele dem i 2 typer.
De liniere ende til ende <strong>for</strong>bindelser som dannes fra β-kulstoffet i en mono-
lignol til hydroxyl gruppen i benzen ringen, eller direkte til et kulstof atom i
benzen ringen (fig. 3).
Side 7

Fig. 3
Eksempler på ende til ende polymeriseringer ved <strong>for</strong>skellige kombinationer <strong>af</strong> monolignoler
[103]. Det karakteristiske mønster er at der primært dannes β-5 <strong>og</strong> β-O-4 bindinger fra monolignoler
til guaiacyl, mens den kun dannes β-O-4 fra monolignoler til syringyl da denne har en
methoxy gruppe substitueret på C5 [Wong D.W.S. et al. (2009) i].
Polymer til polymer koblings<strong>for</strong>bindelser hvor to endestillede monolignoler
<strong>for</strong> bindes via benzen kulstof til benzen kulstof <strong>for</strong>bindelse, eller via æter bind-
ing fra hydroxyl gruppen på benzen ringen til et kulstof atom på benzen ringen
(fig. 4).
Side 8

Fig. 4
Polymer til polymer koblings<strong>for</strong>bindelser. Disse resulterer oftest i 5-5 <strong>og</strong> 4-O-5 bindinger når
endestillede guaiacyl <strong>og</strong> syringyl reagerer, mens to endestillede syringyl enheder ikke er
tilbøjelige til at <strong>for</strong>bindes direkte [Wong D.W.S. et al. (2009) i].
Side 9

CeLLuLose
Cellulose, β-1-4 Glucan, dannes som u<strong>for</strong>grenede kæder i cellemembranen
<strong>af</strong> det membran indlejrede enzym Cellulose Syntase [Heldt HW. (2005)]. Sub-
stratet <strong>for</strong> Cellulose Syntase er UDP-glucose hvor diphosphat bindingen driver
polymeriseringen.
Selvom det umiddelbart, ud fra den kemiske struktur, ser meget enkelt ud, så
har det vist sig at være relativt kompliceret at <strong>af</strong>dække cellulose strukturen,
<strong>og</strong> den er endnu ikke helt <strong>for</strong>stået. Dette skyldes bl.a. den måde hvorpå det
syntetiseres, hvilket heller ikke er <strong>af</strong>dækket <strong>og</strong> der er endnu ikke lavet krystal-
l<strong>og</strong>r<strong>af</strong>isk bestemmelse <strong>af</strong> den rumlige struktur. Den følgende beskrivelse er
der<strong>for</strong> ikke nagelfast, men et relativt godt bud.
Cellulose syntase (CesA) er navnet på det protein eller enzym som katalyserer
dannelsen <strong>af</strong> glycosid bindingen i glucan polymeren ud fra UDP-glucose <strong>og</strong>
det er kodet <strong>af</strong> en <strong>af</strong> allellerne i cesA genet. Cellulose syntase kompleks (CSC)
består <strong>af</strong> 36 CesA enheder som alle syntetiserer 1 glucan.
Der eksisterer mange iso<strong>for</strong>mer <strong>af</strong> dette genprodukt, men det menes at mu-
ligvis 3 <strong>for</strong>skellige indgår i det færdige CSC, <strong>og</strong>så kaldet terminal komplekset
eller cellulose syntase rosetten. CesA enhederne (cellulose syntaserne) er
organiseret således at de danner 6 ringe eller hexagon, <strong>og</strong> disse 6 hexagoner
danner herefter igen en hexagon med en total diameter på 25 - 30 nm. Ex-
pressionsanalyse i byg har vist at 3 alleler (HvCesA1, HvCesA2 <strong>og</strong> HvCesA6)
udtrykkes samtidig i mange <strong>for</strong>skellige væv <strong>og</strong> at transskriptionen ca var i <strong>for</strong>-
holdet 3:2:1 disse 3 alleler imellem. I Arabidopsis thaliana har man fundet at 3
alleler co-ekspresseres i xylem celler under dannelsen <strong>af</strong> sekundær cellevæg,
men ellers ikke transskripteres. Man har der<strong>for</strong> <strong>for</strong>eslået at hver <strong>af</strong> de 6 hexa-
mere i CSC består <strong>af</strong> 3 <strong>for</strong>skellige proteiner, kaldet α1, α1 <strong>og</strong> β. Der har været
flere <strong>for</strong>skellige <strong>for</strong>slag til hvorledes den indbyrdes placering, de 3 enheder
imellem skulle være, men det er stadig mest spekulation (fig. 5) [Ding SY et al.
(2006)].
Side 10

Fig. 5
A: Model <strong>af</strong> CseA Hexamer. Modellen prøver
at <strong>for</strong>klare <strong>for</strong>holdet i ekspression <strong>af</strong> 3 CesA
alleler som co-transskripteres i <strong>for</strong>holdet 1:2:3
[Ding SY. et al. (2006)].
B: Model <strong>af</strong> alle 36 enzymer som de ses i
fryse frysefraktur skanning elektronmikroskopi.
Hexamererne ses d<strong>og</strong> som 1 enhed, muligvis
p.gr.<strong>af</strong> opløsningen [Ding SY et al. (2006)]
[Festucci-Buselli R.A., et al. (2007)].
C: Model <strong>af</strong> 7 CSC sat sammen i det som
kaldes bikube kon<strong>for</strong>mation. I den sekundære
cellevæg ser man ofte meget store cellulose
fibriller, kaldet cellulose makro fibriller (CMF),
som kan være i størrelsesordnen 10 nm i diameter
<strong>og</strong> mange μm i længde [Terashima N. et
al. (2004)][Terashima N. et al. (2009)][Ding SY
et al. (2006)].
Da der således bliver dannet 36 glucan kæder, mere eller mindre synkront,
mener man at at disse, aktivt eller passivt, danner et kompakt bundt <strong>af</strong> 36
glucan kæder. Denne poly-glucan kaldes en cellulose fibril [Gomez L.D. et al.
(2008)][Ding SY et al. (2006)].
Cellulose fibrillen vokser fra cellemembranen ud i cellevægen hvor den inkor-
poreres i plan med cellemembranen (fig. 6).
Fig. 6
Cellulose fibril syntitiseret <strong>af</strong> et kompleks (rosette)
indlejret i cellemembranen. Hvert cellulose syntase
kompleks menes at indeholde 6 syntase katalitiske sites
som producerer cellulose i en koordineret process, som
danner en subfibril som sammen med subfibrillerne fra
de 5 andre syntase komplekser danner den mikrokrystallinske
cellulose mikrofibrillen med tilsammen 36 cellulose
molekyler. Der er <strong>og</strong>så vist amorf region. [Gomez L.D. et
al. (2008)]
Mikrofibrillen er i omegnen <strong>af</strong> 3 nm i diameter <strong>og</strong> Polymeriseringsgraden er i
Side 11

størrelsesordnen 10.000 glucose monomerer [Leppänen K. et al. (2009)][Kirk
T.K. et al. (1998)]. Hastigheden <strong>for</strong> polymeriseringen er ud fra en elektronmik-
roskopisk bestemmelse <strong>af</strong> mængden <strong>af</strong> aktive syntaser, sammenholdt med
mængden <strong>af</strong> tilføjet cellulose, bestemt til ca. 900 nm ~ 1800 monomerer min -1 .
I spidsen <strong>af</strong> cellen hvor væksten <strong>for</strong>egår var tætheden <strong>af</strong> rosetter ca. 42 μm -2 ,
<strong>og</strong> faldt til ca. 4 μm -2 , 25 μm fra spidsen (fig. 7) [Reiss HD. et al. (1984)].
Fig. 7
Fryse fraktur elektron mikroskopi <strong>af</strong>
Funaria hygrometrica (mos), hvor
plasma membranen er kløvet midt i
lipid bi-lagets hydrofobe midte, hvor
den alifatiske del <strong>af</strong> glyceriderne
mødes. A: Kort pil peger med vækst
apex <strong>af</strong> cellen hvortil der er ca. 2
μm. Billedet viser den side <strong>af</strong> membranen
som vender ind mod cellens
cytomlasma (Plasma Face, PF), <strong>og</strong>
pilene peger på det som tolkes som
cellulose syntase rosetter. De lange
<strong>for</strong>dybninger tolkes som <strong>af</strong>tryk fra
cellulose fibriller. Det er en primær
cellevæg <strong>og</strong> fibrillerne er isotropisk
<strong>af</strong>lejret. Forstørrelse 100.000 gange.
B: Højere <strong>for</strong>størrelse <strong>af</strong> A, 200.000
gange, <strong>og</strong> her ses rosetterne meget
tydeligt <strong>og</strong> tætheden <strong>af</strong> disse er i
størrelsesordnen 40 μm -2 . C: 200.000
gange <strong>for</strong>størrelse <strong>af</strong> membransiden
som vender mod cellevægen. Her ses
fibril <strong>af</strong>tryk som <strong>for</strong>højninger da de
“presses” ind mod celle membranen.
De runde <strong>for</strong>højninger kunne være
den extracellulære del <strong>af</strong> rosetterne,
<strong>og</strong> cellulose kæderne så at sige
trådes gennem denne struktur, men
det er ren spekulation [Reiss HD. et
al. (1984)].
Det er en relativ kompliceret <strong>af</strong>fære at bestemme den 3-dimensionelle struk-
tur på cellulose fibriller da de er mikro krystallinske, <strong>og</strong> dermed ikke lader sig
krystallisere på normal vis. Mikro kommer <strong>af</strong> at de muligvis har en krystallinsk
kerne, som er 2 X 3 glucose molekyler i areal, som er omgivet <strong>af</strong> 2 lag glucose
<strong>af</strong> varierende krystallinsk grad (fig. 8).
Side 12

Fig. 8
Modeller <strong>af</strong> cellulose fibril
(CF). glucanerne er pakket
som de findes i cellulose-Iβ
krystallen [Ding SY et al.
(2006)].
A: Viser graden <strong>af</strong> krystallinitet.
De 6 glucaner i
kærnen anses som helt krystallinske
<strong>og</strong> herfra <strong>og</strong> udefter
<strong>af</strong>tager krystalliniteten.
B: Nummererede glucan
kæder. Forholdet, de 3 lag
imellem, svarer interessant
nok til <strong>for</strong>holdet mellem de 3
iso enzymer i CSC modellen.
C: Model <strong>for</strong> aggregering <strong>af</strong>
CF til CMF som det muligvis
findes som i sekundær cellevæg
<strong>og</strong> evt. syntetiseret <strong>af</strong>
en bikube <strong>for</strong>mation <strong>af</strong> CSC.
D: Længde snit <strong>af</strong> CF. Det
yderste grå lag viser hemicellulose
elekrtostatisk
bundet til CF. Denne kaldes
en mikrofibril, <strong>og</strong> er muligvis
den native <strong>for</strong>m i primær cellevæg.
E: Mikrofibril set i tværsnit,
igen med hemicellulose.
Krystall<strong>og</strong>r<strong>af</strong>isk data viser en 180° rotationen <strong>af</strong> hver anden glucose monomer
omkring glucosid bindingen, <strong>og</strong> cellobiose anses der<strong>for</strong> som den repeterende
enhed [Kirk T.K. et al. (1998)]. Cellulosekæderne holdes sammen via hydro-
genbindinger i en tilnærmelsesvis krystallinsk struktur, men periodevis i fibril-
lens længderetning, er der mere amorfe segmenter. For gran fandt man de
krystallinske segmenter var ca. 35nm lange [Leppänen K. et al. (2009)] hvilket
svarer til ca. 10 mikrofibril diametre eller ca. 70 glucose monomerer (fig. 9).
De tæt pakkede krystallinske strukturer betyder at cellulose ikke er opløselig
i vandige opløsninger selv med relativ høj ionstyrke (syre/base) da vand ikke
kan penetrere strukturen. En årsag til de amorfe segmenter kan være ter-
mineringer i en eller flere cellulose syntaser, men kan <strong>og</strong>så være indlejring <strong>af</strong>
hemicellulose ender.
Side 13

Fig. 9
Øverst: Den kemiske struktur <strong>af</strong> cellulose som den <strong>for</strong>ekommer i β-1,4-glucan
polymeren, eller rettere cellubiose polymeren, da hver på hinanden efterfølgende
glycosid binding er roteret 180˚ i <strong>for</strong>hold til den <strong>for</strong>rige. Dette er vist ud fra krystall<strong>og</strong>r<strong>af</strong>isk
data. Helt så enkelt er det måske ikke <strong>og</strong> muligvis indgår der
<strong>og</strong>så en helix kom<strong>for</strong>mation i fibrillen [French A.D. et al. (2009)].
Til Venstre: Model <strong>af</strong> cellulose fibrillen med de 36 glucan kæder i krystallinsk
netværk, ca. 3 nm i diameter <strong>og</strong> med amorfe regioner repeteret hver ca. 35 nm
[Leppänen K. et al. (2009)].
Ved hjælp <strong>af</strong> et gult fluorescerende protein (yellow fluorescent protein, YFP),
genetisk splejset til Cellulose Syntase Komplekset, har man via fluorecens
blegnings <strong>for</strong>søg <strong>af</strong> typen fluorescens tab i fotoblegning (fluorescens loss in
photobleaching (FLIP), undersøgt mobiliteten <strong>af</strong> CSC i frø fra Arabidopsis
under dannelsen <strong>af</strong> den sekundære cellevæg (fig. 10).
Via n<strong>og</strong>le matematiske modeller <strong>for</strong> udbredelse <strong>af</strong> blegede CSC som funktion
<strong>af</strong> cellens radius, bredden <strong>af</strong> det blegede område, CSC’s hastighed <strong>og</strong> bag-
grunds fluorescensen, fandt man at CSC bevæger sig med hastighed <strong>af</strong> ca.
8,5 μm s -1 . Med en glucosemonomer længde på 0,5 nm dannes der følgelig
17.000 glycosid bindinger pr sekund.
For de undersøgte xylem celler, med en diameter på 10 μm <strong>og</strong> en omkreds
på 31 μm, svarer det til en tur rundt på godt 3 s. Det blev samtidig sandsynlig-
gjort at CSC bevæger sig begge veje rundt. Endvidere, ud fra n<strong>og</strong>le antagelser
omkring en tæthed <strong>af</strong> CSC på 100 μm -2 , en cellevægtykkelse på 1μm <strong>og</strong> en
mikrofibrildiameter på 5 nm, vurderede man at de ca 200 lag cellulose fibriller
ville kunne syntetiseres på ca. 1 min [Wightman R. et al. (2009)].
Side 14

Fig. 10
Gult-fluorecerende proteinmærket CSC. Dobbeltpil viser cellens længderetning. Massivt
pilehoved viser ophobninger <strong>af</strong> CSC som <strong>for</strong>modes at stamme fra intracellulære organeller,
så som golgi eller lign. åbne pile viser de ringe, eller måske helixoide baner som der blev
målt på i <strong>for</strong>søgene. Det nederste billed er samme som øverste, men med 2 pixel Gaussisk
sløring [Wightman R. et al. (2009)].
He m i C e L L u L o s e
Hemicellulose er en bred betegnelse <strong>for</strong> <strong>for</strong>grenede pentose <strong>og</strong> hexose
polymerer. For løvtræs vedkommende er det overvejende xylose som udgør
den primære monomer i β-1-4 glycosid kæden, med ca. 70% <strong>af</strong> xylose mono-
mererne acetylerede I C-2 positionen <strong>og</strong> ca. 10% har en O-glucuronsyre,
ligeledes I C-2 positionen. For Nåletræs vedkommende består β-1-4 saccha-
rid kæden <strong>af</strong> en blanding <strong>af</strong> glucose <strong>og</strong> mannose I <strong>for</strong>holdet 1:3, igen delvis
acetyl eret <strong>og</strong> med galactose æter bundet til C-6 på ca. hver 4. monomer [Kirk
T.K. et al. (1998)].
Hemicellulosen som er i størrelsesordnen 150-200 monomerer, fungerer mu-
ligvis som en binder som i større eller mindre udstrækning binder cellulosefi-
brillerne samme, <strong>og</strong> <strong>for</strong>hindrer <strong>for</strong>mentlig at disse aggregere i tykkere bundter.
Et muligt sted <strong>for</strong> <strong>for</strong>ankring <strong>af</strong> hemicellulosen på cellulose mikrofibrillerne
kunne være de amorfe regioner.
Generelt er disse polymerer svært opløselige i vand <strong>og</strong> har en tendens til at
aggregere via hydr<strong>og</strong>enbindinger sukkerstofferne imellem. Det er d<strong>og</strong> mulig at
opløse hemicellulosen i sure eller basiske opløsninger. I modsætning til cellu-
lose som syntetiseres direkte i cellemembranen, bliver hemicellulose, ligesom
så mange andre polysaccarider, dannet i golgi <strong>og</strong> herfra sendt til cellemem-
branen i exocytose vesikler (fig. 11) [Driouich A. et al. (1993)].
Side 15

Fig. 11
Transmisions Elektron Mikroskopi (TEM) <strong>af</strong> cellevæg fra Linum
usitatissimum (hør) under dannelsen <strong>af</strong> cellevæg. Vesiklerne
kommer fra golgi apparatet <strong>og</strong> indeholder (1→4)-β-galactan (vist
Via guldmærkede antistoffer mod (1→4)-β-galactan). Hvordan
denne tilsyneladende massive kerne <strong>af</strong> materialet i disse vesikler
bliver nærmest trådet ud mellem cellulose fibrillerne, er så vidt
jeg ved ukendt.
cw = cellevæg, pm = plasma membran, bw = bifarvede verkuole,
ml = midtlamel, tp = tonoplant, bar = 1 μm [Salnikov V.V. et al.
(2008)].
Side 16

hø j e r e o r d e n s s t r u k t u r a f in v i v o s u b s t r at e t
Va s k u L æ r e p L a n t e r
Vaskulære planter eller højerestående planter er de planter som har lignifi-
ceret væv til transport <strong>af</strong> vand, mineraler <strong>og</strong> fotosyntetiske produkter gennem
planten. Vaskulære planter inkluderer bregner, mos, blomsterbærende planter.
Det vi normalt kalder træ, hører til de to hovedgrupper gymnosperm (nåletræ,
nøgenfrøede, blødtræ), <strong>og</strong> angiosperm (løvtræ, dækfrøede, hårdtræ). Uden at
gå i detaljer, så menes gymnosperm at være den ældste, ca. 450 mio. år gam-
mel, <strong>og</strong> angiosperm som en udspringer <strong>af</strong> gymnosperm, menes at være ca.
200 mio. år gammel. Det interessante i <strong>for</strong>bindelse med <strong>nedbrydning</strong> <strong>af</strong> ligno-
cellulytiske <strong>for</strong>bindelser er, at der er <strong>for</strong>skel på sammensætningen <strong>af</strong> ligninen
de to grupper imellem. Hvis man har prøvet at save med en håndsav i hen-
holdsvis gran <strong>og</strong> eg, så ved man måske hvad syringyl kan gøre <strong>for</strong> en <strong>for</strong>skel.
Ce L L e V æ g
Cellevæggen består <strong>af</strong> flere på hinanden følgende lag <strong>af</strong> cellulose mikrofi-
briller. Den primære cellevæg er den første som dannes på ydersiden <strong>af</strong> cel-
lemembranen. Heri indlejres cellulose mikrofibrillerne tilsyneladende isotropisk
i en matrix <strong>af</strong> hemicellulose, pectin <strong>og</strong> lignin. Forholdet mellem mængden <strong>af</strong>
cellulose <strong>og</strong> hemicellulose er generelt mindre i den primære cellevæg end den
er i den sekundære [Christiernin M. et al. (2005)].
På et tidspunkt efter cellerne er fuldt udviklede <strong>og</strong> ikke længere skal vokse,
begynder de at danne den sekundære cellevæg. Denne dannes ligeledes
på ydersiden <strong>af</strong> cellemembranen, men da den primære cellevæg allerede er
opbygget, vil den sekundære cellevæg blive indskudt mellem den primære cel-
levæg <strong>og</strong> cellemembranen. Den sekundære cellevæg inddeles I 3 lag kaldet
S1, S2, S3 <strong>og</strong> opbygges i nævnte rækkefølge. Udover tykkelsen, adskiller
disse lag sig ved at cellulose fibrillerne inkorporeres mere eller mindre aniso-
Side 17

tropisk i hvert lag, men med <strong>for</strong>skellig retning lagene imellem (fig. 12).
Fig. 12
Transmission electron mikroskopi <strong>af</strong> deignificerede
tracheid celler fra Pinus radiata (fyr). Billederne skal
vise hvorledes collulose fibrenes retning er <strong>for</strong>skellig de
3 sekundære cellevægsleg imellem. S1, det yderste <strong>og</strong>
først dannede lag, har en tilsyneladende mere isotropisk
struktur end S2 od S3 <strong>og</strong> overgangen mellem S1 <strong>og</strong> S2 er
flydende.
Snittet er lagt skråt gennem cellerne <strong>for</strong> at gøre cellevægens
areal større. De lange pile viser længdeaksen på
cellerne.
A <strong>og</strong> B: Bar = 500 nm. C: Bar = 200 nm [Donaldson L. et
al. (2005)]
Den største del <strong>af</strong> træ’s masse findes i S2 laget <strong>af</strong> den sekundære cellevæg,
<strong>og</strong> på grund <strong>af</strong> den kemiske struktur, udgør denne del nok den største <strong>for</strong>-
hindring når det gælder biol<strong>og</strong>isk <strong>nedbrydning</strong>. Følgende tekst vil prøve at
belyse det mest omfangsrige substrat som skal nedbrydes hvis slutproduktet
skal være kuldioxid <strong>og</strong> vand.
I den sekundære cellevæg indlejres cellulose fibrillerne i en matrix <strong>af</strong> hemicel-
lulose <strong>og</strong> lignin. Mekanismen <strong>for</strong> opbygningen <strong>og</strong> måden hvorpå de 3 hoved-
komponenter indgår i netværket er ikke helt kendt, men <strong>for</strong>mentlig sker lignin
dannelsen efter cellulose/hemicellulose netværket er opbygget (fig. 13 <strong>og</strong> 14)
[Terashima N. et al. (2004)].
Fig. 13
Field Emission Scanning Elektron Mikroskopi (FESEM)
<strong>af</strong> cellevæg fra . Figuren viser midt lamellen, S1 <strong>og</strong> S2
opdelt i en S2 ydre (S2o) <strong>og</strong> S2 indre (S2i). Der ses en
ligninifisering <strong>af</strong> S2o men ikke i S2i, hvor cellulose fibrillerne
fremtræder tydeligt [Terashima N. et al. (2004)].
Side 18

Fig. 14
Cellulose fibriller fra den inderste del <strong>af</strong> S2 før lignificeringen
påbegyndes. [Terashima N. et al. (2004)]
Lignins struktur i cellevægen er svær at bestemme. Det ligger lidt i den rolle
som det <strong>for</strong>mentlig har, som krydsbinder <strong>og</strong> tætner, <strong>og</strong> ligeledes i den <strong>for</strong>-
modede polymeriserings mekanisme, radikal polymerisering.
Ved brug <strong>af</strong> <strong>for</strong>skellige <strong>for</strong>mer <strong>for</strong> elektron mikroskopi, <strong>og</strong> omhyggelig anal-
yse <strong>af</strong> billedmaterialet, begynder der at kommer der n<strong>og</strong>le interessante bud
på hvordan nanoskala strukturen <strong>af</strong> den sekundære cellevæg ser ud. Mikro-
skopiske data sammenholdt med detaljeret kendskab til den kemiske sammen-
sætning <strong>af</strong> veldefinerede supkomponenter i cellevægen, er en metodik som
vil kunne give en <strong>for</strong>ståelse <strong>af</strong> kemiske struktur <strong>og</strong> rumlige sammensætning i
mangel på absolut krystall<strong>og</strong>r<strong>af</strong>isk bestemmelse.
Det er fundet at lignin polymeriseret via peroxidase initieret reaktion, danner
moduler, som samler sig i større moduler, som igen samler sig i større moduler
[Micic M. et al. (2004)]. Modulerne er dråbelignende strukturer, som dannes
p.gr.<strong>af</strong> lignins amphipatiske natur <strong>og</strong> plasticitet (fig. 15).
Side 19

Fig. 15
Strukturbestemmelse <strong>af</strong> lignin ved en kombination <strong>af</strong> near-field
scanning optical microscopy <strong>og</strong> atomic <strong>for</strong>ce microscopy
[Micic M. et al. (2004)].
Reagenserne 0,005 M coniferyl alkohol, 0,005 M H 2 O 2 <strong>og</strong>
25 nM peberrod peroxidase i 50mM fosfat buffer, dannede over
48 timer ved stuetemperatur det analyserede lignin.
Modellen viser hvorledes man ud fra analyse <strong>af</strong> resultaterne
<strong>for</strong>estiller sig at lignin polymeriseres.
Først polymeriserer lokale områder, ved initiering spredt ud i
reaktionsblandingen. De efterfølgende propergeringer <strong>for</strong>egår i
lokalmiljøet omkring de frie radikaler. Disse terminerer med en
given frekvens, ved kontakt med radikal monomerer eller små
polymerer <strong>og</strong> danner de mindste moduler.
Efterfølgende initieringer danner radikaler med størrer <strong>og</strong> størrer
grad <strong>af</strong> polymerisering <strong>og</strong> anal<strong>og</strong>t kan man <strong>for</strong>estille sig at
der dannes større <strong>og</strong> større moduler.
Lignins amfipatiske natur gør at den vil vende de polære dele
ud mod det vandige miljø <strong>og</strong> der<strong>for</strong> opstår de velkendte micellignende
strukturer.
Der er i Ginkgo biloba tracheid celler fundet store mængder <strong>af</strong> små dråber i
cellehjørnerne, hvor der ikke er cellulose fibriller. Disse dråber minder om de
førnævnte lignin moduler (fig. 16).
Fig. 16
FESEM <strong>af</strong> cellevæg fra Ginkgo biloba xylem celler
[Ding SY. et al. (2006)].
I et hjørne <strong>af</strong> cellen, hvor den primære cellevæg <strong>og</strong> midt
lamellen mødes, ses en stor mængde lignin moduler <strong>af</strong>
varierende størrelse, <strong>og</strong> det ses <strong>og</strong>så hvordan de smelter
mere eller mindre sammen.
Der er <strong>og</strong>så fundet modul lignende strukturer placeret med en regelmæssig
indbyrdes <strong>af</strong>stand på ca. 16 nm, langs S2 cellulose fibriller (fig. 17).
Side 20

Fig. 17
FESEM <strong>af</strong> cellevæg fra Ginkgo biloba xylem celler. Snittet
er parallel med cellulose fibrillerne i S2 [Ding SY. et al.
(2006)].
Øverst: fuldt lignifiseret ydre S2 cellevæg (S2o) hvor Cellulose
fibrillerne ses indlejret i ligninen <strong>og</strong> letttere sløret. Til
højre i billedet ses cellulose fibrillerne tydeligere idet denne
del <strong>af</strong> cellevægen (S2i), som vender ind mod lumen, endnu
ikke er fuldt lignifiseret.
midt: Større <strong>for</strong>størrelse <strong>af</strong> S2o fra øverste billed. Her ses
det som tolkes som lignin moduler. Pilene peger på steder
hvor regelmæssigheder <strong>af</strong> modulplaceringerne ses tydeligst.
Nederst: Tværsnit skåret vinkelret på fibrillernes
længdeakse. Som det ses er disse meget tæt pakkeds <strong>og</strong>
ensartede i areal.
Disse cellulosebundne moduler bliver mindre ved delignifisering med klorit,
men <strong>for</strong>svinder ikke helt (fig. 18).
Fig. 18
FESEM <strong>af</strong> cellevæg fra Ginkgo biloba xylem. [Ding SY. et
al. (2006)].
Vævet er delignificeret, men med intakte polysaccerider
(cellulose, Hemicellulose).
Øverst: Tværsnit hvor regelmæssigheden stadig er intakt,
trodt fjernelse <strong>af</strong> lignin.
Nederst venstre: Længdesnit parallelt med cellulose fibrillerne
i S2. Pile viser moduler som ligeledes stadig er at finde
efter lignin er fjernet.
Nederst højre: stor <strong>for</strong>størrelse hvor modulerne
bedre ses. Pilene peger på meget
regelmæssigt placerede moduler.
bar = 100 nm [127]
Hvis <strong>for</strong>uden ligninen, hemicellulosen <strong>og</strong>så fjernes ved ekstraktion med KaOH
Side 21

<strong>og</strong> B(OH) 3 , kollapser strukturen <strong>og</strong> cellulosefibrillerne klumper sammen
(fig. 19). Dette kan være <strong>for</strong>årsaget <strong>af</strong> mangel på krydsbindinger fra hemicel-
lulosen, som måske mere har til <strong>for</strong>mål at holde fibrillerne adskilt. Dette kræver
d<strong>og</strong> at hemicellulosen er <strong>for</strong>ankret i rumligt stabile strukturer i enderne <strong>af</strong> net-
værket.
Fig. 19
FESEM <strong>af</strong> cellevæg fra Ginkgo biloba xylem. [Ding SY. et
al. (2006)].
Vævet er delignificeret, <strong>og</strong> efterfølgende er amorfe polysaccarider
fjernet med KaOH <strong>og</strong> B(OH) 3 .
Øverst: Længdesnit - Cellulose fibrillerne aggregerer i tykke
bundter, <strong>og</strong> er mange steder over 50 nm i diameter.
Nederst: tværsnit - Også enderne udviser en stor grad <strong>af</strong>
uregelmæssighed <strong>og</strong> minder om termisk støj.
Der er <strong>og</strong>så fundet fine strukturer som fra modulerne <strong>og</strong> vinkelret på fibrilak-
sen, synes at krydsbinde fibrillerne (fig. 20).
Fig. 20
FESEM <strong>af</strong> cellevæg fra Ginkgo biloba xylem. [Terashima N. et al. (2009)].
Billedet er taget på et tidligt tidspungt i dannelsen <strong>af</strong> S2 . Det ses i høj opløsning,
strukturer som kunne se ud til at gå på stærs <strong>af</strong> cellulose fibrillernes
lodrette orientering.
Bar = 100 nm.
På baggrund <strong>af</strong> bl.a. FESEM-optagelserne, opmålinger <strong>af</strong> disse, kemisk ana-
lyse <strong>af</strong> cellevægen, densitets målinger <strong>og</strong> kvalificerede skøn, er der lavet en
model som omfatter hele S2 laget <strong>af</strong> den sekundære cellevæg i tracheid væv
fra Ginkgo biloba.
En del <strong>af</strong> modellen er 2 tabeller som beskriver de komponenter som er ob-
Side 22

serverede eller deducerede, <strong>og</strong> hvis sandhedsværdi modellen <strong>af</strong>hænger <strong>af</strong>
(tabel 1 <strong>og</strong> 2) [Terashima N. et al. (2009)].
Tabel 1 (øverst): Dimensioner <strong>og</strong> massefylde <strong>af</strong> dele som indgår i cellevægsmodellen.
Tabel 2 (nederst): Kvantitative skøn over indhold <strong>af</strong> hemicellulose-lignin moduler (HML).
[Terashima N. et al. (2009)].
Den rumlige del <strong>af</strong> modellen beskriver hvorledes de <strong>for</strong>skellige kemiske stof-
grupper interagerer <strong>og</strong> opbygges i en nanometer målestok (fig. 21).
Side 23

Fig. 21
Til Venstre: Ort<strong>og</strong>onal projektion <strong>af</strong> samlingsprocessen
(fra top til bund) <strong>for</strong> 2 cellulose
makro fibriller, hemicellulose <strong>og</strong> lignin
sammen med deres anslåede størrelser i S2
laget <strong>af</strong> den sekundære cellevæg i tracheid
væv fra Ginkgo biloba.
Øverst til højre: Tværsnit <strong>af</strong> samlet tilstand <strong>for</strong> 2 tilstødende cellulose makro fibriller, <strong>for</strong>bundet
<strong>af</strong> hemicellulose <strong>og</strong> lignin.
Nederst til højre: Samlingsmekanisme <strong>for</strong> sammensmeltning at voksende hemicelluloselignin
moduler i deres kontaktpunkter, ved dannelse <strong>af</strong> 5-5’, 4-O-5’, 4-O-α <strong>og</strong> 4-O-β bindinger
mellem de kolliderende polymerer. π-orbitaler i aromatiske <strong>for</strong>bindelser har en tendens til at
interagere positivt <strong>og</strong> man <strong>for</strong>venter der<strong>for</strong> at alle phenyl-ringene statistisk set er i samme
plan. Samtidig <strong>for</strong>ventes det at dette penyl-plan er parallelt med cellemembranen som er
parallel med fibrillerne som er ort<strong>og</strong>onale til tegningen. Man burde der<strong>for</strong> se phenyl-ringene
endestillet, med det bliver <strong>for</strong> uoverskueligt <strong>og</strong> der<strong>for</strong> er de <strong>for</strong>tegnede.
[Terashima N. et al. (2009)]
Side 24

or g a n i sM e r n e
Kun en gruppe <strong>af</strong> organismer, nemlig basidiomyceterne, har udviklet evnen
til at nedbryde kulstoffet i lignin fuldstændig ved at mineralisere det til CO2
[Hofrichter M. (2002)]. Trænedbrydende basidiomyceter inddeles i <strong>hvidmuld</strong>s-
<strong>og</strong> <strong>brun</strong>mulds nedbrydere. Hvidmulds svampe nedbryder enten lignin <strong>og</strong> cel-
lulose samtidig, eller nedbryder lignin præferentielt. Dette medfører at træet får
et hvidligt udseende stammende fra den blottede cellulose. Brunmulds svampe
nedbryder hovedsaglig cellulosen <strong>og</strong> efterlader et <strong>brun</strong>ligt udseende som
stammer fra det tilbageværende mere eller mindre modificerede lignin. Den
sidste <strong>nedbrydning</strong>stype kaldes blødmuld da den medfører en svampet tekstur
<strong>og</strong> blødhed i træets overflade. blødmulds svampe er ofte ascomyceter and
deuteromyceter <strong>og</strong> blødheden skyldes muligvis at disse primært vokser i S2 i
den sekundære cellevæg. blødmuld, ligesom <strong>brun</strong>muld, nedbryder cellulose
<strong>og</strong> hemicellulose, <strong>og</strong> modificerer lignin, men nedbryder den ikke [Schwarze
F.W.M.R. (2007)].
Den mest studerede basidiomycet er nok Phanerochaete chrysosporium, som
oprindeligt kun var kendt i dens anamorphe tilstand under navnet Sporotrichum
pulverulentum, men i 1974 opdagede man at den havde en telemorph tilstand
<strong>og</strong> den fik derefter det nuværende navn Phanerochaete chrysosporium
[Burdsall H.H. et al. (1974)].
P. chrysosporium er en <strong>hvidmuld</strong> svamp <strong>og</strong> dermed i stand til at mineralisere
træ fuldstændig. Samtidig er det komplette genom blevet sekventeret
[Martinez D. (2004)], hvilket gør den til en ideel organisme <strong>for</strong> studier i meka-
nismen <strong>for</strong> træ<strong>nedbrydning</strong>. Den nedbryder både blødtræ <strong>og</strong> hårdtræ <strong>og</strong> findes
i tempererede skove i Nord Amerika <strong>og</strong> Europa. Den vokser optimalt ved 40°C,
danner aseksuelle sporer <strong>og</strong> kan nedbryde lignin præferentielt.
Ud over naturlig træ, nedbryder P. chrysosporium en lang række syntetiske
<strong>for</strong>bindelser <strong>og</strong> fabrikerede produkter, <strong>og</strong> til denne <strong>nedbrydning</strong> syntetiseres <strong>og</strong>
secerneres en række <strong>nedbrydning</strong>saktive <strong>for</strong>bindelser (tabel 3).
Side 25

Tabel 3. Nedbrydningsegenskaber <strong>og</strong> syntetiserede biol<strong>og</strong>iske <strong>for</strong>bindelser <strong>for</strong> P. chrysosporium
[Singh D. et al. (2008)].
Mycelie<strong>svampes</strong> morfol<strong>og</strong>i må være en <strong>af</strong> de meget vigtige egenskaber, som
gør disse i stand til at påtage sig den vanskelige opgave som trænedbryd-
ning udgør. Disse lange tynde hyfer hvor igennem svampen kan transportere
næringsstoffer til <strong>og</strong> fra lokale områder hvor de enten behøves, eller udgør et
problem. Alene evnen til at kunne føre vand frem til områder med aktiv vækst,
er en uvurderlig <strong>for</strong>del <strong>for</strong> myceliesvampene som de fleste andre mikroorganis-
mer mangler.
De regelmæssigheder i radialt <strong>og</strong> aksialt væv som træ ofte besidder, giver
gode muligheder <strong>for</strong> mycelie<strong>svampes</strong> lange hyfer <strong>og</strong> specielt rørsystemet i
tracheid <strong>og</strong> vessel celler, er et godt angrebspunkt. Tilstødende celler kan nås
via pit huller, som er <strong>for</strong>bindingskanaler.
Side 26

ne d b r y d n i n g s M e k a n i s M e r n e
Nedbrydningssystemerne som svampene benytter består <strong>af</strong> enzymer <strong>og</strong> me-
diatorer. De enzymer som vides indgå heri er Lignin peroxidaser (Lip), Mangan
peroxidaser (MnP), Versatile peroxidaser (VP), glyoxal oxidaser, superoxid dis-
mutaser, aryl alcohol oxidaser, Laccaser, type B carboxyl esteraser (lipaser),
Peptidaser <strong>og</strong> Cellulaser.
CeLLuLose n e d b r y d n i n g
Basidiomyceter kan nedbryde cellulose ved hjælp <strong>af</strong> 3 hydrolytiske enzymer,
end<strong>og</strong>lucanase, cellobiohydrolase <strong>og</strong> β-glucosidase.
Nedbrydning <strong>af</strong> cellulose <strong>for</strong>egår generelt ved at end<strong>og</strong>luconaser hydrolyserer
glucosid bindinger et sted midt i polymeren, hvorved denne splittes op i mindre
dele. Herefter kan type I <strong>og</strong> II cellobiohydrolaser fra hver deres ende <strong>af</strong> de min-
dre poly- eller oligosaccarider, hydrolysere videre til di- eller tetrasaccarider,
som β-glucosidaser kan hydrolysere til monosaccarid, glucose.
Cellulolytiske enzymer er grupperet i mindst 15 ud <strong>af</strong> 80 kendte strukturelle
familier <strong>af</strong> glycosyl hydrolaser (tabel 4). Ud over ægte cellulaser, er 2 familier
<strong>af</strong> <strong>for</strong>skelligartede xylanaser (10/F <strong>og</strong> 11/G) inkluderet, muligvis <strong>for</strong>di de ud-
viser en bred specificitet <strong>for</strong> substrat. Andre enzymer i familie 11/G er medtaget
selvom de er strengt specifikke <strong>for</strong> xylan. Der er <strong>og</strong>så eksempler på enzymer,
f.eks. β-glucosyl hydrolaser som er i stand til at hydrolysere korte cellulooligo-
saccarider (familie 1 <strong>og</strong> 3), som ikke er familiegrupperet sammen med cel-
lulolytiske enzymer. Ligeledes anses familie 16 <strong>og</strong> 17, som inkluderer 1,3(4)-
β-glucanaser, ikke <strong>for</strong> medlemmer <strong>af</strong> cellulase familierne, uanset at disse
enzymer udviser samme specificitet over<strong>for</strong> 1,4-β-glucosid bindinger od deler
tertiær struktur med typiske cellulaser.
Klassifikationen <strong>af</strong> cellulolytiske enzymer sker ud fra strukturelle egenskaber i
deres katalytiske domæne, baseret på hydrofobisk kloster analyse.
Side 27

Det er interessant at observere at mens enzymer som nedbryder α-glucosid
bindinger er samlet i de 3 familier 13,14 <strong>og</strong> 5, så er 1,4-β-glucosyl hydrolaser
delt i 15 familier. En anden interessant observation er at xylan nedbrydende
enzymer fra organismer <strong>af</strong> fjerntliggende evolutionær oprindelse, er samlet i
kun 2 familier, 10/F <strong>og</strong> 11/G. Skønt xylan er et mere kemisk komplekst substrat
end cellulose, har xylanaser, ligesom amylaser en mere ensartet opbygning,
hvilket kunne tyde på at xylan <strong>og</strong> α-glucan opstod senere i evolutionen end
cellulose [Rabinovich M.L. (2002)].
Side 28

Tabel 4. <strong>for</strong>tsættes på næste side...
Side 29

...<strong>for</strong>tsat fra <strong>for</strong>rige side.
Tabel 4
Systematisk placering <strong>af</strong> enzymer som er istand til at spalte 1,4-β-glucosid bindinger
tilhørende den strukturelle klasse <strong>af</strong> glucosyl hydrolaser.
EC enzym klassifikation ifølge International Union of Biochemistry (IUB).
(cryst): Proteinets krystallinske struktur er bestemt [Rabinovich M.L. (2002)].
En d o g l u c a n a s E
End<strong>og</strong>lucanase (Endo-1,4-β-glucanase, EC 3.2.1.4, endocellulase) er et en-
zym som hydrolyserer glucosidbindinger udefinerede steder i cellulosefibril-
lerne, <strong>og</strong> der er således ikke et krav at glucosidbindingen skal have n<strong>og</strong>en
relation til hverken den reducerende eller ikke-reducerende ende <strong>af</strong> glucan
kæden.
Fos<strong>for</strong>syre hydreret cellulose <strong>og</strong> carboxymethylcellulose er gode substrater <strong>for</strong>
end<strong>og</strong>lucanase hvilket tyder på at det generelt er amorfe regioner i cellulose-
Side 30

fibriller som er det naturlige substrat. End<strong>og</strong>lucanase med carboxymethylcel-
lulose som substrat har K M værdier som spænder fra 0,26 til 13 gL -1 <strong>og</strong> der er
meget lav aktivitet over<strong>for</strong> kompakt mikrokrystallinsk cellulose.
End<strong>og</strong>lucanase er et monomer protein, med en molekylevægt på 22-45 kDa
[Baldrian P. et al. (2008)], med et isoelektrisk punkt mellem 2,6 <strong>og</strong> 4,9
(2 undtagelser med basiske pI) <strong>og</strong> glucosyleret til en carbohydrat vægtprocent
på mellem 1 <strong>og</strong> 12%. pH optimum ligger generelt i det sure område omkring
pH 4 - 5 (tabel 5).
Tabel 5
Udvalgte egenskaber fra isolerede end<strong>og</strong>lucanaser [Baldrian P. et al. (2008)].
* BR = Brunmuld, LD = Kompost nedbryder, P = Plante pat<strong>og</strong>en, S = Symbiotisk,
WR = Hvidmuld, Y = Gær.
† Substrat = carboxymethyl cellulose
[Baldrian P. et al. (2008)]
Side 31

I familie 7 end<strong>og</strong>lucanase fra Phanerochaete chrysosporium er en del <strong>af</strong> en-
zymet et 4 kDa cellulosebindende domæne som kan frakobles med papain
peptidase, men der er <strong>og</strong>så eksempler på end<strong>og</strong>lucanaser som ikke har dette
domæne [Baldrian P. et al. (2008)].
cE l l o b i o h y d r o l a s E
Cellobiohydrolase (CBH, EC 3.2.1.91, exocellulase) findes i to varianter. Type I
som hydrolyserer 2. eller 4. glucosid binding fra den reducerende 1´ eller hemi-
acetal ende, <strong>og</strong> type 2 som hydrolyserer 2. eller 4. glucosid binding fra den
ikke-reducerende 4´ ende <strong>af</strong> glucan kæden. Begge danner produkterne cello-
biose <strong>og</strong> cellotetrose. Enzymet er processivt <strong>og</strong> <strong>for</strong>tsætter med at hydrolysere
hver 2. eller 4. glucosidbinding indtil det disassocierer fra cellulosen.
Cellobiohydrolase er et monomer protein med en molekylevægt på 50-65 kDa,
med et isoelektrisk punkt mellem pI 2,3 <strong>og</strong> pI 4,9 <strong>og</strong> glucosyleret til en carbo-
hydrat vægtprocent på mellem 0 <strong>og</strong> 12%. pH optimum ligesom end<strong>og</strong>lucanase
i det sure område omkring pH 4 - 5 (tabel 6) [Baldrian P. et al. (2008)].
Cellobiohydrolase er generelt aktivt på mikrokrystallinsk cellulose hvilket <strong>for</strong>-
mentlig skyldes at endestillede hydr<strong>og</strong>enbindinger alt andet lige lettere hy-
dreres, samt enzymets elektrostatiske vekselvirkning med substratet. Cellobio-
hydrolase fra Phanerochaete chrysosporium <strong>og</strong> Pleurotus ostreatus har ingen,
eller meget ringe <strong>af</strong>finitet over<strong>for</strong> carboxymethylcellulose.
Cellobiohydrolase har ligesom end<strong>og</strong>lucanase fra familie 7 et ca. 4 kDa stort
cellulosebindende domæne <strong>og</strong> et sammenkædningsdomæne, som dels hjæl-
per med at binde cellulosen, <strong>og</strong> dels fungerer i <strong>for</strong>bindelse med translokationen
<strong>af</strong> det katalytiske domæne til næste substrat glucosidbindin. P. chrysosporium
producerer 3 cellobiohydrolaser, CBH58 <strong>og</strong> CBH62 er type I <strong>og</strong> det cellulose-
bindende domæne er placeret i <strong>for</strong>længelse <strong>af</strong> C terminalen <strong>af</strong> det katalytiske
domæne, mens CBH60 er type II <strong>og</strong> det cellulosebindende domæne er pla-
ceret i <strong>for</strong>længelse <strong>af</strong> N terminalen <strong>af</strong> det katalytiske domæne [Baldrian P. et
Side 32

al. (2008)]. Det er meget besnærende at give det cellulosebindende domæne
en bestemmende rolle, i <strong>for</strong>hold til hvilken retning enzymet skal bevæge sig,
efter hydrolyse <strong>af</strong> den aktuelle glucosidbinding [Rabinovich M.L. et al. (2002)].
Eftersom Cellobiohydrolase på mange måder har en central placering i det cel-
lulolytiske, er det overraskende at den ikke er isoleret fra ret mange <strong>brun</strong>muld
svampe, men derimod oftere fra <strong>hvidmuld</strong> svampe. Dette til trods <strong>for</strong> at <strong>brun</strong>-
muld svampe per intuition, burde være mere specialiseret i <strong>for</strong>hold til cellulose
<strong>nedbrydning</strong>.
Tabel 6
Udvalgte egenskaber <strong>for</strong> isolerede cellobiohydrolaser [Baldrian P. et al. (2008)].
* BR = Brunmuld, P = Plante pat<strong>og</strong>en, S = Symbiotisk, WR = Hvidmuld.
† Substrat = p-nitrophenyl cellobiosid.
‡ Substrat = p-nitrophenyl cellobiosid.
§ Substrat = p-nitrophenyl lactosid.
Substrat = p-nitrophenyl lactosid.
װ Isoleret fra termit Macrotermes muelleri, men stammer fra den symbiotiske svamp.
[Baldrian P. et al. (2008)]
β-g l u c o s i d a s e
β-glucosidase (EC 3.2.1.21) katalyserer hydrolysering <strong>af</strong> β-1-4 glucosidbind-
ingen i cellobiose. Produktet er glucose <strong>og</strong> β-glucosidase <strong>af</strong>slutter dermed
depolymeriseringen <strong>af</strong> cellulose. En 45 kDa ekstracellulær β-glucosidase fra
Phanerochaete chrysosporium, hydrolyserer ud over det naturlige substrat
<strong>og</strong>så p-nitrophenyl-β-D-glucosid (pNPG), p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside
(pNPX) <strong>og</strong> laminaribiose (3-β-D-glucosyl-D-glucose). Fra <strong>brun</strong>muld svampe
Side 33

finder man at β-glucosidase hydrolyserer oligosaccarider <strong>af</strong> xylose, mannose
<strong>og</strong> galactose [Baldrian P. et al. (2008)]. Det er med andre ord en relativt us-
pecifik hydrolyse <strong>af</strong> pyranosid, skønt der naturligvis er <strong>for</strong>skel på K M de <strong>for</strong>skel-
lige substrater imellem, med glucosid som det <strong>for</strong>etrukne.
β-glucosidaser udviser stor strukturel heter<strong>og</strong>enitet, som delvist må skyldes
at de både findes som intracellulære, cellevæg associerede <strong>og</strong> ekstracel-
lulære enzymer. β-glucosidaser produceres <strong>af</strong> de fleste mikroorganismer <strong>og</strong>
er isoleret fra adskillige trænedbrydende basidiomyceter, både <strong>brun</strong>muld- <strong>og</strong>
<strong>hvidmuld</strong>svampe. Molekylevægten spænder over et faktor 20 område fra 35
kDa <strong>og</strong> helt op til 640 kDa. De mindre β-glucosidaser med molekylevægte
op til ca. 100 kDa er monomere proteiner, <strong>og</strong> oftest ekstracellulære, mens de
intracellulære eller membran associerede, kan være oligomere. En 300 kDa
β-glucosidase from Trametes versicolor er monomer men er 90% clucosyleret.
De isoelektriske punkter ligger i området fra pI 3,5 til pI 5,2 <strong>for</strong> ekstracellulære
enzymer <strong>og</strong> fra pI 6,2 til pI 7,0 <strong>for</strong> intracellulære enzymer (tabel 7).
Den relative <strong>for</strong>deling <strong>af</strong> enzym aktivitet mellem extracellulær, cellevæg as-
socieret <strong>og</strong> intracellulære fraktioner varierer meget <strong>og</strong> <strong>for</strong> Pleurotus ostreatus,
Trametes versicolor and Piptoporus betulinus blev henholdsvis 65%, 13%, <strong>og</strong>
35% fundet i cellevæg fraktionen <strong>af</strong> mycelia [Valásková & Baldrian, 2006]. For
Volvariella volvacea var 10% ekstracellulær, 26% cellevæg associeret <strong>og</strong> 64%
intracellulært [Cai et al.,1999].
Side 34

Tabel 7
Udvalgte egenskaber <strong>for</strong> isolerede β-glucosidaser [Baldrian P. et al. (2008)].
* BR = Brunmuld, LD = Kompost nedbrydere, M = Mycorrhizal, P = Plante pat<strong>og</strong>en, S =
Symbiotisk, WR = Hvidmuld, Y = Gær.
† Substrat = p-nitrophenyl cellobiosid.
‡ Intercellulær enzym.
§ Også β-xylosidase aktivitet.
Også 1,3-β-glucosidase aktivitet.
װ Rekombinant protein udtrykt i Escherichia coli.
† † Substrat = o-nitrophenyl glucosid.
cE l l o b i o s E d E h y d r o g E n a s E
Cellobiose dehydr<strong>og</strong>enase (CDH, EC 1.1.99.18) har tidligere figureret under
navne som cellobiose quinone oxidoreductase (CBQ) <strong>og</strong> cellobiose oxidase
(CBO) p.g.a henholdsvis ufuldstændig oprensning <strong>og</strong> fejlagtig karakterise-
ring <strong>af</strong> elektronaccepter. CDH som det nu kaldes, har vist sig at indeholde et
flavin-adenin dinukleotid (FAD) domæne <strong>og</strong> et ferroprotoporphyrin (heme, cyto-
Side 35

chrom) domæne, <strong>og</strong> CBQ er CDH hvor heme domænet mangler, <strong>for</strong>mentlig
<strong>for</strong>årsaget <strong>af</strong> proteolytisk spaltning [Henriksson G. et al. (2000)][Baldrian P. et
al. (2008)][Zamocky M. et al. (2006)].
CDH er isoleret fra flere <strong>hvidmuld</strong>s svampe, men den eneste kendte <strong>brun</strong>-
mulds svamp som danner CDH er Coniophora puteana (tabel 8).
CDH se ud som om det danner en slags bro mellem cellulose- <strong>og</strong> lignin ned-
brydning, idet det er i stand til indirekte at danne hydroxyl radikaler, men det
er værd at nævne at der i stor udstrækning er tale om spekulationer når det
gælder CDH funktion in vivo.
CDH er et ekstracellulært enzym som oxiderer cellobiose, cellodextrin(cellu- looligosaccarid), mannodextrin <strong>og</strong> lactose. Produktet er en lacton <strong>af</strong> det sac-
carid som befandt sig i den reducerende ende <strong>af</strong> disaccariden eller dextrinen.
I vandige opløsninger hydrolyseres lacton til carboxylsyre (fig. 22). De to
elektron-ækvivalenter fra oxidationen kan kanaliseres over til elektronaccep-
torer som quinoner, phenoxy funktionelle grupper, Fe(III), Cu(II) <strong>og</strong> cytocrom c,
<strong>og</strong> derved restituere enzymet [Henriksson G. et al. (2000)][Baldrian P. et al.
(2008)][Zamocky M. et al. (2006)].
Fig. 22
Oxidation <strong>af</strong> det reducerende C1 carbon
atom i cellobiose til korrosponderende
lacton, som spontant hydrolyserer til en
carboxyl syre.
CDH er typisk et monomer protein med en størrelse på ca. 90-110 kDa. Glu-
cosyleringen ligger mellem 10 <strong>og</strong> 20% <strong>og</strong> et isoelektrisk punkt pI = ca. 4. pH
optimum ligger i området pH 4-5 (tabel 8) [Baldrian P. et al. (2008)].
Side 36

Tabel 8
Udvalgte egenskaber <strong>for</strong> isolerede cellubiose dehydr<strong>og</strong>enaser [Baldrian P. et al. (2008)].
* BR = Brunmuld, P = Phytopat<strong>og</strong>en, WR = Hvidmuld
† Substrat = cellobiose.
‡ Quininer som elektronacceptorer, andre acceptorer kan udvise anderledes optima.
Elektron acceptoren i CDH er FAD som via saccarid oxidationen reduceres
til FADH 2 . Dette domæne kaldes det katalytiske domæne, <strong>og</strong> som antydet <strong>af</strong>
at man tidligere troede at dette domæne var det komplette enzym CBQ, kan
FADH 2 genoxideres direkte <strong>af</strong> elektron acceptorer som f.ek. quinoner. Ofte
<strong>for</strong>egår oxidationen <strong>af</strong> FADH 2 d<strong>og</strong> via 2 successive elektron overførsler fra
det katalytiske domæne til cytochrom domænets Fe(III) i ferroprotoporphyrin.
I første oxidation <strong>af</strong> FADH 2 til FADH, reduceres ferroprotoporphyrin, men før
anden oxidation <strong>af</strong> FADH til FAD kan ske, skal ferroprotoporphyrin oxideres <strong>af</strong>
en ekstramolekylær 1 elektron accepter, da der er én ferroprotoporphyrin pr.
flavin i holoenzymet.
CDH har via de 2 domæner <strong>og</strong> den intramolekylære elektrontransport imel-
lem disse, mulighed <strong>for</strong> at katalysere redox reaktioner på et utal <strong>af</strong> måder. Der
eksisterer mindst 3 <strong>for</strong>skellige katalytiske modeller, som tilsammen ser ud til at
udgøre alle tænkelige kombinationer <strong>af</strong> elektronoverførsler til <strong>og</strong>/eller fra FAD,
FADH, FADH 2 , Fe(II)ferroprotoporphyrin <strong>og</strong> Fe(III)ferroprotoporphyrin (fig 23).
Side 37

Fig. 23
Øverst: En mekanistisk model hvor ferroprotoporphyrinen
fungerer som en slags overløb
hvor FADH kan komme <strong>af</strong> med sin elektron <strong>og</strong>
genvinde sin fuldt oxiderede tilstand. I denne
model <strong>for</strong>egår reduktion <strong>af</strong> CDH substrater via
FADH 2 <strong>og</strong> <strong>for</strong>eslår at overløbselektronen, på
den anden side <strong>og</strong>så kan reducere FADH til
FADH 2 . Det er med andre ord en mekanisme
som sørger <strong>for</strong> at FAD “altid” er enden fuldt oxideret
til oxidation <strong>af</strong> divalente elektron-donorer,
eller fuldt reduceret til reduktion <strong>af</strong> monovalente
elektron-acceptorer [Henriksson G. et al.
(1993)] [Henriksson G. et al. (2000)].
Midderst: En model hvor det katalytiske
domæne modtager elektronerne fra oxidationen
<strong>af</strong> saccaridet, <strong>og</strong> kanaliserer dem intramolekylært
over i ferroprotoporphyrinen domænet via
2 successive oxidationer <strong>af</strong> henholdsvis FADH 2
<strong>og</strong> FADH, med Fe(III)-ferroprotoporphyrinen
som oxidant. Dette kræver d<strong>og</strong> Fe(III) genoxideres
<strong>af</strong> en monovalent elektron acceptor efter
hver intramolekylær elektron translokation
[Henriksson G. et al. (1993)][Henriksson G. et
al. (2000)].
Nederst: En model som stort set samler de
ovenstående 2 modeller. c 3+ <strong>og</strong> x svarer til A, <strong>og</strong>
c 2+ <strong>og</strong> x - svarer til A - i de 2 ovenstående modeller.
Forskellen er tilføjelsen <strong>af</strong> divalent reduktion
<strong>af</strong> substrat (Z), med fuld oxidation <strong>af</strong> FADH 2
som følge. Endvidere er monovalent reduktion
<strong>af</strong> substrat flyttet fra FADH 2 tilstanden til FADH
tilstanden <strong>af</strong> det katalytiske domæne. Som i
midterste model kan ferroprotoporphyrin domænet
(b)modtage elektroner fra både FADH 2 <strong>og</strong>
FADH samt videregive disse til oxyderende substrater,
men kan ikke reducere FADH intramolekylært
[Zamocky M. et al. (2006)].
CDH kan benytte en række di- <strong>og</strong> oligosaccarider som elektron donorer i den
oxidative katalyse, men antallet <strong>af</strong> rapporterede <strong>for</strong>bindelser som kan fungere
som elektron acceptorer er endnu større <strong>og</strong> inkluderer organiske, såvel som
uorganiske <strong>for</strong>bindelser som både enkelt- <strong>og</strong> dobbelt-elektron acceptorer
(tabel 9).
Side 38

Tabel 9
Oxidanter <strong>og</strong> reduktanter <strong>for</strong> CDH [Henriksson G. et al. (2000)].
Side 39

Som skrevet tidligere kan CDH virke som en bindeled mellem cellulose- <strong>og</strong>
lignin <strong>nedbrydning</strong>. Af de mange mulige elektron acceptorer <strong>for</strong> CDH er spe-
cielt Fe(III), som enkelt-elektron acceptor <strong>og</strong> O 2 som 2-elektron acceptor inter-
essante i denne <strong>for</strong>bindelse. Produkterne Fe(II) <strong>og</strong> H 2 O 2 danner derefter via
Fenton reaktionerne (se senere) hydroxyl radikaler, som både har mulighed <strong>for</strong>
at depolymerisere cellulose <strong>og</strong> lignin.
I fig. 24 ses en mekanisme hvorpå hydroxyl radikal depolymeriseringen <strong>af</strong> cel-
lulose <strong>for</strong>eslås at <strong>for</strong>egå [Henriksson G. et al. (2000)][Kruså M. et al. (2005)].
Fig. 24
CDH katalyseret elektroner hentet fra eksempelvis
cellobiose, giver anledning til dannelse <strong>af</strong>
Fe(II) <strong>og</strong> H 2 O 2 via CDH katalyseret reduktion.
Disse produkter kan via Fenton reaktioner danne
hydroxyl radikaler <strong>og</strong> på figuren ses en <strong>for</strong>eslået
mekanisme <strong>for</strong> depolymerisering <strong>af</strong> cellulose
<strong>for</strong>årsaget <strong>af</strong> en hydroxyl radikal.
Princippet er generelt <strong>og</strong> burde hvis det gælder
<strong>for</strong> cellulose <strong>og</strong>så gælde <strong>for</strong> hemicellulose
[Henriksson G. et al. (2000)][Kruså M. et al.
(2005)].
Hydroxyl radikaler kan modificere lignin ved substitution <strong>af</strong> methoxy grupper
med hydroxyl grupper. Dette kan gøre ligninen mere egnet til <strong>nedbrydning</strong> via
mangan <strong>af</strong>hængig peroxidase <strong>og</strong> lacase enzymerne fra <strong>hvidmuld</strong> svampene.
Hvis methoxy gruppen i stedet er en æter binding som indgår i lignin
polymeren vil substitution medføre at denne binding brydes. C-C bindingerne
angribes ikke, <strong>og</strong> denne type lignin modificering er rapporteret <strong>for</strong> <strong>brun</strong>- <strong>og</strong>
blødmuld svampe [Henriksson G. et al. (2000)].
Side 40

I fig. 25 ses en <strong>for</strong>eslået mekanisme, svarende til cellulose <strong>nedbrydning</strong>smeka-
nismen, <strong>for</strong> depolymerisering <strong>af</strong> lignin [Henriksson G. et al. (2000)].
Lignin n e d b r y d n i n g
Fig. 25
CDH katalyseret elektroner hentet fra eksempelvis
cellobiose, giver anledning til dannelse <strong>af</strong> Fe(II) <strong>og</strong>
H 2 O 2 via CDH katalyseret reduktion.
Disse produkter kan via Fenton reaktioner danne
hydroxyl radikaler <strong>og</strong> på figuren ses en <strong>for</strong>eslået
mekanisme <strong>for</strong> depolymerisering <strong>af</strong> lignin <strong>for</strong>årsaget
<strong>af</strong> en hydroxyl radikal [Henriksson G. et al.
(2000)].
Kun få mikroorganismer er i stand til at nedbryde lignin [Wong D.W.S. (2009)].
I naturlige omgivelser er det <strong>for</strong>mentlig kun <strong>hvidmuld</strong> basidiomyceter som
effektivt kan nedbryde lignin til CO 2 <strong>og</strong> vandopløselige produkter. Hvidmulds
<strong>nedbrydning</strong> efterlader ofte et <strong>af</strong>bleget udseende som bl.a. skyldes oxidation <strong>af</strong>
aromatiske <strong>for</strong>bindelser som ofte er stærkt farvede.
Ceriporiopsis subvermispora, Phellimus pini, Phlebia spp., <strong>og</strong> Pleurotus spp.
tilhører en gruppe <strong>af</strong> <strong>hvidmuld</strong>s basidiomyceter som har en særlig præference
<strong>for</strong> lignin, <strong>og</strong> nedbryder dette hurtigere end cellulose <strong>og</strong> hemicellulose
[Blanchette R.A. (1984)] [Otjen L. et al. (1987)]. Denne “oprensning” <strong>af</strong> cel-
lulose har stor interesse i papirindustrien, som ofte har brug <strong>for</strong> fjerne lignin i
fremstil-lingsprocessen.
Trametes versicolor, Heterobasidium annosum <strong>og</strong> Irpex lacteus tilhører en an-
den gruppe <strong>hvidmuld</strong> basidiomyceter som udviser samtidig <strong>nedbrydning</strong> <strong>af</strong> cel-
Side 41

lulose, hemicellulose <strong>og</strong> lignin [Blanchette R.A. (1991)] [Wong D.W.S. (2009)].
Lignin <strong>nedbrydning</strong>ssystemet som det <strong>for</strong>stås, er i stor udstrækning baseret på
radikal kemi. Mange <strong>af</strong> reaktionerne kræver tilstedeværelsen <strong>af</strong> peroxider <strong>og</strong>
enzymer indeholdende jern, <strong>for</strong> at danne frie radikaler som kan <strong>for</strong>estå depo-
lymeriseringen <strong>af</strong> lignin.
Tilbage fra slutningen <strong>af</strong> det 19. århundrede blev dannelse <strong>af</strong> <strong>for</strong>skellige oxy-
gen radikaler via reaktion med jern, <strong>og</strong>så kendt som Fenton reaktionen eller
Fenton reagens i <strong>for</strong>m <strong>af</strong> hydr<strong>og</strong>en peroxid <strong>og</strong> FeSO 4 , beskrevet.
Fenton reaktionen er [Dun<strong>for</strong>d H.B. (2002)][Kremer M.L. (1999)]
(1) Fe 2+ + H 2 O 2 → Fe 3+ + •OH + HO –
(2) Fe 2+ + •OH → Fe 3+ + HO –
(3) •OH + H 2 O 2 → HO 2 • + H 2 O
(4) HO • + Fe 2 2+ → Fe3+ – + HO2 (5) HO 2 • + Fe 3+ → Fe 2+ + O 2 + H +
muligvis skal reaktion (5) skrives som
– 3+ 2+ (5´) O • + Fe → Fe + O2
2
Jern(II) optræder som katalysator i Fenton reaktionerne, da det regenereres i
reaktion (5).
PE r o x i d a s E r
Lignin Peroxidase var det første ekstracellulære enzym man fandt som var i
stand til at spalte C-C bindingen <strong>og</strong> C-O-C bindinger mellem to coniferyl en-
heder i lignin model stoffer. Det blev fundet i starten <strong>af</strong> 80’erne i <strong>hvidmuld</strong>s-
svampen Phanerochaete chrysosporium, som er blevet en model organisme
<strong>for</strong> studier i <strong>nedbrydning</strong> <strong>af</strong> cellevægmateriale. Senere i slutningen <strong>af</strong> 80’erne
fandt man en anden peroxidase, som var <strong>af</strong>hængig <strong>af</strong> tilstedeværelsen <strong>af</strong>
Side 42

mangan (Mn) <strong>og</strong> den fik der<strong>for</strong> navnet mangan <strong>af</strong>hængig peroxidase (MnP, EC
1.11.1.13). P. Chrysosporium udskiller begge peroxidaser. Den seneste per-
oxidase variant som man har fundet, blev isoleret fra Pleurotus eryngii i 2002
[110i] <strong>og</strong> kaldes Versatile (alsidig) Peroxidase (VP, EC 1.11.1.16), da den ser
ud til at kombinere både LiP <strong>og</strong> MnP’s egenskaber.
Baseret på deres sekvenser <strong>og</strong> katalytiske egenskaber, hører LiP, MnP <strong>og</strong>
VP til super familien <strong>af</strong> heme peroxidaser [Wong D.W.S. (2009)]. Enzymerne
indeholder en ferroprotoporphyrin (heme-gruppe) med Jern, som er kendt fra
mange enzymer som er involveret i redox reaktioner, hvor de faciliterer ud-
vekslingen <strong>af</strong> elektroner mellem doner <strong>og</strong> acceptor.
Selvom den underliggende mekanisme <strong>for</strong> <strong>nedbrydning</strong>en <strong>af</strong> lignin endnu ikke
er fuldt <strong>af</strong>dækket, følger peroxidaserne generelt den klassiske katalytiske per-
oxidase cyklus:
E(Fe 3+ ) + H 2 O 2
li g n i n PE r o x i d a s E
E1(Fe 4+ = O,P •+ ) + e - (S) + H +
E2(Fe 4+ = O) + e - (S) + H +
E1(Fe 4+ = O,P •+ ) + H 2 O
E2(Fe 4+ = O) + S •
E(Fe 3+ ) + S • + H 2 O
Lignin peroxidase (LiP, EC 1.11.1.14) er en oxidoreductase hvor oxidanten er
hydr<strong>og</strong>en peroxid. Det oxiderede LiP katalyserer herefter en relativ uspecifik
oxidation <strong>af</strong> en række phenol derivater såvel som en række ikke-phenol lignin
model <strong>for</strong>bindelser. Generelt oxiderer LiP organiske <strong>for</strong>bindelser med et redox
potentiale op til 1,4V under tilstedeværelsen <strong>af</strong> hydr<strong>og</strong>en peroxid. Det høje
redox potentiale gør LiP i stand til at oxidere <strong>for</strong>bindelser som normalt ikke er
peroxidase substrater [Kersten P.J. et al. (1990)]. Veratryl alkohol (VA), som
secerneres sammen med LiP, er et effektivt substrat <strong>for</strong> Lip som oxiderer dette
til veratryl aldehyd (VAD), med <strong>for</strong>øget absorption ved λ=310 nm til følge. En
mere sandsynlig rolle <strong>for</strong> VA er d<strong>og</strong> at det efter 1-elektron oxidation til positiv
Side 43

ladet radikal, fungerer som mediator <strong>for</strong> oxidation <strong>af</strong> lignin eller andre orga-
niske- eller uorganiske <strong>for</strong>bindelser involveret i lignin <strong>nedbrydning</strong>.
LiP er et 38-46 kDa glucoprotein med en pI mellem 3,2 <strong>og</strong> 4,0. pH optimum
ligger i et meget surt område nær pH 3. LiP indeholder én ferroprotoporphy-
rin pr enzym <strong>og</strong> strukturen er krystall<strong>og</strong>r<strong>af</strong>isk bestemt (fig. 26) [Choinowski
T. et al. (1999)]. LiP måler 50x40x40 Å <strong>og</strong> indeholder 2 domæner, hvor ferro-
protoporphyrinen er placeret i en sprække mellen disse. Der er adgang til
ferroprotoporphyrinen fra opløsningen via en smal sprække med plads til små
aromatiske substrater. Derudover er der en mindre kanal med adgang til den
distale side <strong>af</strong> ferroprotoporphyrinen, hvor hydr<strong>og</strong>en peroxid oxiderer enzymet
<strong>og</strong> vand fraspaltes. Denne kanal er <strong>for</strong>mentlig <strong>af</strong> en størrelse, som ikke tillader
molekyler større end hydr<strong>og</strong>en peroxid adgang.
En fuldstændig konserveret <strong>og</strong> usædvanlig C-β hydroxyleret tryptophan
aminosyre rest, trp171, placeret på overfladen <strong>af</strong> LiP menes <strong>af</strong> indgå i en
langdistance elektron overførsel fra VA til ferroprotoporphyrinen <strong>og</strong> samtidig
sta bilisere kation radikalen <strong>af</strong> VA. Udskiftning <strong>af</strong> trp171 med alenin (W171A
mutation), medfører således komplet tab <strong>af</strong> VA oxiderende funktion, mens
visse andre reducerende substrater stadig kunne oxideres. trp171 er omgivet
<strong>af</strong> et ligeledes konserveret kloster <strong>af</strong> negativt ladede aminosyre rester som
menes at stabilisere den oxidativt positiv ladede VA kation radikal [Doyle W.A.
et al. (1998)].
Enzymet består <strong>af</strong> 8 større <strong>og</strong> 8 mindre α-helix <strong>og</strong> der er 8 Cys rester som
alle indgår i disulfid bindinger. Asn257 danner N-glucosylering <strong>og</strong> Ser334 <strong>og</strong>
Thr320 danner O-glucosylering <strong>og</strong> alle befinder de sig på det C-terminale do-
mæne.
Side 44

Fig. 26
3 dimensionelle struktur <strong>af</strong> lignin peroxidase
fra Phanerochaete chrysosporium.
ferroprotoporphyrinen ses i midten <strong>af</strong>
modellen.
Det N-terminale domæne er beliggende
under ferroprotoporphyrinen <strong>og</strong> kaldes
<strong>og</strong>så <strong>for</strong> det distale domæne.
Det C-terminale domæne er beliggende
over ferroprotoporphyrinen <strong>og</strong> kaldes
<strong>og</strong>så <strong>for</strong> det proximale domæne.
[Choinowski T. et al. (1999)]
Jern-atomet er udover koordinatbindingerne til de 4 centrale nitr<strong>og</strong>en atomer i
porphyrin, koordinatbundet til His176 i C-terminal domænet <strong>og</strong> danner ligele-
des elektrostatisk binding, via den 6. orbital i Fe(III) til oxygen i et vand moleky-
le (Wat339) som co-krystalliserer med proteinet <strong>og</strong> er hydr<strong>og</strong>enbundet til His46
i det N-terminale domæne (fig. 27).
Fig. 27
ferroprotoporphyrinen med koordinatbindinger
fra proximal (C-domæne)
<strong>og</strong> distale (N-domæne).
Venstre: ferroprotoporphyrinen set
fra en position ort<strong>og</strong>onal til ringens
plan.
Højre: ferroprotoporphyrinen set
fra en position i ringens plan. Her
ses interaktionerne til henholdsvis
den proximale His176 <strong>og</strong> det distale
vand molekyle Wat339, hydr<strong>og</strong>enbundet
til His47. [Wong D.W.S.
(2009)]
Den katalytiske cyklus <strong>for</strong> LiP har udover de tre generelle peroxidase redox
Side 45

eaktioner, en 4. tilstand. LiP kan ved overskud <strong>af</strong> hydr<strong>og</strong>en peroxid, eller ved
mangel på reducerende substrater, overgå til en katalytisk inaktiv tilstand kal-
det compound III (LiP-III) (fig. 28).
Fig. 28
LiP katalytisk cyklus.
VA: Veratryl alkohol.
VAD: Veratryl aldehyd
[Wong D.W.S. (2009)]
I 1. reaktion oxideres det hvilende enzym <strong>af</strong> hydr<strong>og</strong>en peroxid ved en 2-elek-
tron overførsel via atomar oxygen som trækker en elektron fra henholdsvis
Fe 3+ <strong>og</strong> porphyrin ringen som chelaterer jernet (fig. 29). Fe 3+ bliver dermed til
Fe 4+ som ud over porphyrinen, stabiliseres <strong>af</strong> n<strong>og</strong>le meget konserverede his-
tidin <strong>og</strong> aspargin rester i enzymet. Porphyrin kation radikalen stabiliseres <strong>af</strong>
delokaliserede π orbitaler, men er ikke desto mindre en relativ reaktiv mekanis-
tisk intermediær <strong>og</strong> kaldes i denne tilstand compound I (Lip-I).
Side 46

Fig. 29
En mekanistisk model <strong>for</strong> dannelse <strong>af</strong> LiP-I.
a: donering <strong>af</strong> elektroner fra den proximale histidin til den distale histidin via hydr<strong>og</strong>enbindinger
i enzymet som <strong>for</strong>binder de to histidin resters imidazoler. Elektronoverførslen
medfører at den distale imidazol’s bliver en svagere syre, med højere dissociationskonstant
pK a som følge.
b: Transitions tilstanden hvor der er ligevægt i elektron-bevægelsen.
c: modsat rettet elektron bevægelse fra distal imidazol til proximal imidazol, som gør den
distale imidazol til en stærkere syre, hvilket faciliterer donation <strong>af</strong> hydr<strong>og</strong>en til O α ,
d: Det færdige LiP-I med vand molekylet dannet <strong>og</strong> O β er bundet til Fe. [Dun<strong>for</strong>d H.B.
(2001)]
I 2. reaktion oxiderer enzymet substratet <strong>og</strong> <strong>og</strong> genvinder dermed en <strong>af</strong> de
tabte elektroner. Det er porphyrin ringen som først reduceres <strong>og</strong> enzymet kal-
des i denne tilstand <strong>for</strong> compound II (Lip-II). Der er ved denne reaktion dannet
et substrat med en fri radikal som kan udføre alle de propageringsreaktioner,
som specielt aromatiske radikaler, vides at undergå.
I 3. reaktion oxiderer enzymet endnu et substrat, som ender med at blive en fri
radikal <strong>og</strong> Fe 3+ gendannes. Enzymet er herved tilbage i grundtilstanden (LiP)
Side 47

<strong>og</strong> klar til en ny redox cyklus.
Ved overskud <strong>af</strong> hydr<strong>og</strong>en peroxid kan enzymet overgå til en katalytisk inaktiv
tilstand, idet LiP-II kan reagere med hydr<strong>og</strong>en peroxid under dannelse <strong>af</strong> en
(Fe3+ ● - O ) Fe(IV)-superoxo <strong>for</strong>bindelse kaldet compound III (LiP-III). Lip-III kan
2
d<strong>og</strong> undergå spontan autooxidation eller oxideres <strong>af</strong> aromatiske kation radikal-
er <strong>og</strong> derved genvinde sin katalytiske aktivitet [Wong D.W.S. (2009)].
Substrater <strong>for</strong> LiP’s reduktion tilbage til hviletilstanden før oxidation <strong>af</strong> hydro-
gen peroxid, deles generelt op i phenol- <strong>og</strong> ikke-phenol <strong>for</strong>bindelser.
Phenol <strong>for</strong>bindelserne er phenol med en eller flere substituenter som f.eks.
2-methoxyphenol, 4-Hydroxy-3-methoxybenzo syre <strong>og</strong> 4-hydroxy-3,5-dime-
thoxybenzo syre (fig. 30). LiP oxiderer generelt phenol <strong>for</strong>bindelser bedre end
ikke-phenol <strong>for</strong>bindelser [Harvey P.J. et al. (1990)]. Et intermediært produkt er
ofte en methoxy radikal som efterfølgende, under aerobe <strong>for</strong>hold fører til ring
åbning.
Fig. 30
Venstre: guaiacol (2-methoxyphenol)
Midt: vanillin syre (4-Hydroxy-3-methoxybenzo syre)
Højre: syringin syre (4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzo syre)
Ikke-phenol <strong>for</strong>bindelser er eksempelvis 3,4-dimethoxy benzyl alcohol (vera-
tryl alkohol, VA) <strong>og</strong> dimethylphenylenediamine (fig. 31).
Side 48

Fig. 31.
Venstre: Veratryl alkohol (3,4-dimethoxy benzyl alcohol)
Højre: dimethylphenylenediamine
En tredje vigtig gruppe substrater <strong>for</strong> LiP er lignin model <strong>for</strong>bindelser
bestående <strong>af</strong> monolignol dimerer (fig. 32), som benyttes til at undersøge ned-
brydningsveje <strong>for</strong> lignin polymeren.
Fig. 32.
Lignin model <strong>for</strong>bindelser.
Venstre: β-1 lignin model.
1-(3,4-diethoxyphenyl-1,3-dihydroxy(4-methoxy-phenyl)-propan.
Højre: β-O-4 model.
1-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-(2-methoxyphenoxy)-1,3-dihydroxypropan
VA har et redox potentiale på 1,36 V <strong>og</strong> kan oxideres både via LiP-I <strong>og</strong> LiP-II
med dannelse <strong>af</strong> radikal kation som følge. Denne omarrangeres via deproton-
ering <strong>af</strong> C α til en aldehyd (fig. 33) [Baciocchi E. et al. (2002)].
Fig. 33.
Oxidation <strong>af</strong> veratryl alkohol til veratryl aldehyd via deprotonering <strong>af</strong> C α . [Baciocchi E. et al.
(2002)].
Lignin model <strong>for</strong>bindelserne oxideres ligesom VA ved dannelse <strong>af</strong> radikal ka-
Side 49

tion, men da C α (fig. 34) eller alkoxy (fig. 35) substituenten ikke er endestillet
som i VA, fører oxidationen hyppigt til fragmentering <strong>af</strong> <strong>for</strong>bindelsen <strong>og</strong> dan-
nelse <strong>af</strong> <strong>for</strong>skellige aldehyder.
Fig 34
Oxidation <strong>af</strong> ikke-phenol lignin model <strong>for</strong>bindelse <strong>af</strong> typen β-1.
Fig. 35
Oxidation <strong>af</strong> ikke-phenol lignin model <strong>for</strong>bindelse <strong>af</strong> typen β-O-4.
For peroxidasers vedkommende er oxidation <strong>af</strong> substrater i stor udstrækning
uspecifik, <strong>og</strong> redox potentialet <strong>for</strong> ferroprotoporphyrinen i et givet peroxidase
enzym er i al væsentlighed bestemmende <strong>for</strong> hvilke <strong>for</strong>bindelser, som kan age-
re substrater <strong>for</strong> enzymet. LiP udmærker sig ved dets høje redox potentiale på
1,4 V, hvilket medfører at LiP er i stand til at oxidere flere substrater end andre
peroxidaser eller oxidaser (tabel 10). Det tyder ligeledes på at produkterne <strong>af</strong>
Side 50

oxidation <strong>af</strong> et givet substratet er de samme, uanset peroxidasens eller oxi-
dasens redox potentiale, under <strong>for</strong>udsætning <strong>af</strong> at dette er højere end sub-
stratets. [Kersten P.J. et al. (1990)].
Tabel 10
Lignin peroxidase (H8/H 2 O 2 ), peberrod peroxidase (horseradish peroxidase, HRP/H 2 O 2 ) <strong>og</strong>
laccase’s evnen til oxidation <strong>af</strong> 12 metoxybenzen congenerer med redox potentialer spændende
fra 0,81 til 1,76 V. [Kersten P.J. et al. (1990)]
(+) indikerer oxidation <strong>af</strong> <strong>for</strong>bindelsen
(-) indikerer mangel på oxidation <strong>af</strong> <strong>for</strong>bindelsen.
(±) indikerer oxidation <strong>af</strong> <strong>for</strong>bindelse, men med hurtig inaktivering <strong>af</strong> enzym.
(‡) indikerer direkte detektion <strong>af</strong> kation radikal.
Ma n g a n a f h æ n g i g PE r o x i d a s E
Mangan<strong>af</strong>hængig peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13) er ligesom LiP en oxi-
doreductase hvor oxidanten er hydr<strong>og</strong>en peroxid. Transkriptionen <strong>af</strong> mnp
genet reguleres koncentrations- <strong>og</strong> vekstfase <strong>af</strong>hængigt <strong>af</strong> Mn(II). mnp mRNA
produceres kun under sekundær vækstfase <strong>og</strong> koncentrationen topper ved
180 μM Mn(II) i mediet <strong>og</strong> kan ikke erstattes <strong>af</strong> hverken Fe, Zn, Co, Cu eller Ni
[Brown J.A. et al. (1991)].
Som medlem <strong>af</strong> samme heme peroxidase familie som LiP, er mange <strong>af</strong> MnP’s
strukturelle egenskaber de samme som LiP. MnP er krystall<strong>og</strong>r<strong>af</strong>isk bestemt
<strong>og</strong> indeholder samme domæner, ferroprotoporphyrin <strong>og</strong> His struktur som LiP.
MnP har ligesom LiP 4 tilstands<strong>for</strong>mer, en fuldt reduceret hviletilstand MnP, to
oxiderede tilstande MnP-I <strong>og</strong> MnP-II, <strong>og</strong> en katalytiks inaktiv tilstand MnP-III.
MnP er et monomer glucoprotein med en pI på ca. 4,5 <strong>og</strong> en molekylevægt på
Side 51

46.000 kDa. Mn(II) binder til et kation bindings sted på overfladen <strong>af</strong> enzymet
<strong>og</strong> koordinerer til carboxyl oxygen atomerne på glu35, glu39, asp179, heme
propionat oxygen <strong>og</strong> to vand oxygen atomer. Oxalat chelaterer Mn(III) efter oxi-
dationen <strong>af</strong> Mn(II) <strong>og</strong> faciliterer på den måde dissociationen <strong>af</strong> oxideret Mn fra
MnP [Sundaramoorthy M. et al. (2005)].
MnP er der hyppigst <strong>for</strong>ekomne lignin modificerende peroxidase <strong>og</strong> produce-
res <strong>af</strong> næsten alle <strong>hvidmuld</strong> trænedbrydende basidiomyceter, samt adskillige
kompost nedbrydende svampe. Som navnet antyder er MnP specialiceret i at
oxidere dets <strong>for</strong>etrukne reducerende substrat, mangan (Mn), som findes i al
træ. Det meget reaktive Mn(III) stabiliceres <strong>af</strong> chelatorer som oxalat/oxalsyre,
som svampene selv danner <strong>og</strong> udskiller. Disse chelater fungerer som lav-
molekylære oxidanter, som via diffussion kan penetrere strukturer i den kom-
pakte cellevæg der ellers ikke er tilgængelig <strong>for</strong> de højmolekylære enzymer.
[Hofrichter M. (2002)].
VE r s at i l E P E r o x i d a s E
Versatile peroxidase (VP, EC 1.11.1.16) er den seneste peroxidse som er iso-
leret fra <strong>for</strong>skellige <strong>hvidmuld</strong> svampe <strong>og</strong> den er krystall<strong>og</strong>r<strong>af</strong>isk bestemt lige-
som de andre peroxidaser. Den ligner <strong>og</strong> opfører sig som en hybrid mellem
LiP <strong>og</strong> MnP <strong>og</strong> er på mange måder et godt eksempel på hvor meget strukturel
overlap der er mellem LiP <strong>og</strong> MnP.
Eksempelvis kan en ser168trp mutation i MnP fra P. chrysosporium, introduc-
ere LiP aktivitet over<strong>for</strong> aromatiske substrater <strong>og</strong> stadig bibeholde MnP akti-
viteten. I MnP er Ser168 placeret på MnP’s overflade, på en position som er
anal<strong>og</strong> til trp171 i LiP [Timofeevski S.L. (1999)].
Et andet eksempel er introduktion <strong>af</strong> trippel mutationen asn182asp, asp183lys
<strong>og</strong> ala36glu i LiP som tilførte MnP aktivitet til LiP. Mutationerne medførte d<strong>og</strong>
ændringer <strong>af</strong> bl.a. pH optima, som blev rykket én pH værdi op, <strong>og</strong> effektiviteten
var mindre en i nativ MnP, men VA oxidationen påvirkes ikke synderligt
Side 52

[Mester T. et al. (2001)].
la c c a s E
Laccases (EC 1.10.3.2, benzenediol:oxygen oxidoreductase) tilhører en
familie <strong>af</strong> multi-kobber enzymer, <strong>og</strong> katalyserer den overordnede reaktion
4 benzenediol+O 2 ↔4 benzosemiquinone+2H 2 O. Laccase findes i alle under-
søgte <strong>hvidmuld</strong> svampe. Det bedst karakteriserede laccase enzym er fra
T. versicolar <strong>og</strong> enzymet spiller en rolle i pigment dannelse i sporer, detoxi-
fikation <strong>af</strong> phenoler <strong>og</strong> virker i synergi med peroxidaser <strong>og</strong> andre lignin ned-
brydende enzymer [Wong D.W.S. (2009)].
Laccase fra svampe findes som monomerer <strong>og</strong> dimerer, med både intra-
cellulære <strong>og</strong> extracellulære isozymer produceret <strong>af</strong> samme organisme. Det
monomere enzym har en molekylevægt i området 50 - 110 kDa <strong>og</strong> består <strong>af</strong> 3
domæner med udpræget β-tønde struktur (fig. 36).
Fig. 36
3D struktur <strong>af</strong> laccase fra T.versicolor.
[Wong D.W.S. (2009)]
Laccase indeholder 4 kobber atomer arrangeret i 3 grupper, T1, T2 <strong>og</strong> T3
Side 53

med hemholdsvis 1, 1 <strong>og</strong> 2 kobber atomer, som i oxideret hviletilstand findes
som Cu(II). T1 som er beliggende i en <strong>for</strong>dybning i domæne 3, er det primære
substrat oxiderende sted <strong>og</strong> elektroner modtaget her kanaliseres over i det tri-
nukleære T2/T3 center, beliggende i området mellem domæne 1 <strong>og</strong> 3, en efter
en. Det fuldt reducerede enzym binder dioxygen <strong>og</strong> reducerer det til 2 vand,
ved overførsel <strong>af</strong> 4 elektroner fra de 4 Cu(I) atomer, med gendannelse <strong>af</strong> det
hvilende oxiderede enzym (fig. 37) [Wong D.W.S. (2009)].
Fig. 37.
Den katalytiske cyklus <strong>for</strong> laccase.
[Wong D.W.S. (2009)].
Laccase kan oxidere phenol <strong>for</strong>bindelser <strong>og</strong> phonol lignin model <strong>for</strong>bindelser
med konvertering <strong>af</strong> phenol hydroxyl til phenoxy radikal.
Nedbrydning <strong>af</strong> phenol β-1 lignin strukturer medfører C α -C β spaltning, C α oxida-
tion, alkyl-aryl spaltning <strong>og</strong> aromatisk ring-åbning.
Side 54

Fig 38
Laccase katalyseret oxidation <strong>af</strong> phenol β-1 lignin model <strong>for</strong>bindelse. [Wong D.W.S. (2009)].
Laccase redox potentialet er ikke højt nok til at oxidere Ikke-phenol lignin <strong>for</strong>-
bindelser direkte, men kan istedet benytte mediatorer (fig. 40) som via mekan-
ismer som er <strong>for</strong>skellige fra laccase enzymets, er termodynamisk gangbare.
Fig. 40
Katalytisk cyklus <strong>for</strong> indirekte oxidation <strong>af</strong> Ikke-phenol lignin <strong>for</strong>bindelser via mediatorer
(Med)
Typiske mediatorer som laccase kan benytte til at oxidere kke-phenol lignin
<strong>for</strong>bindelser er 1-hydroxybenzotriazole (HBT), N-hydroxyphthalimide (HPI),
violuric acid (VLA) <strong>og</strong> 2,2’,6,6’-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPO) (fig. 39).
Side 55

Fig. 41
Typiske mediatorer <strong>for</strong> laccase.
1-hydroxybenzotriazole (HBT), N-hydroxyphthalimide (HPI), violuric acid (VLA) <strong>og</strong> 2,2’,6,6’tetramethylpiperidine-1-oxyl
(TEMPO)
Årsagen til at mediatorerne kan oxidere Ikke-phenol lignin <strong>for</strong>bindelser, skal
findes i at disse benytter andre metoder end elektronoverførsel til at oxidere.
Eksempelvis benytter HBT Hydr<strong>og</strong>en atom overførsel (HAT) til at oxidere
ligninen <strong>og</strong> redox potentialerne er ikke relevante i denne sammenhæng, men
istedet er det bindingsenergierne som <strong>af</strong>gør hvorvidt reaktionen kan <strong>for</strong>løbe
eller ej [Galli C. et al. (2004)] [Acunzo F. et al. (2006)].
hy d r o g E n P E r o x i d g E n E r E r E n d E E n z y M E r
Ud over cellobiose dehydr<strong>og</strong>enase, tidligere omtalt som et hydr<strong>og</strong>en peroxid
gerererende enzym, er glucose oxidase, aryl alkohol oxidase, glyoxal oxidase
en del <strong>af</strong> <strong>hvidmuld</strong> <strong>svampes</strong> hydr<strong>og</strong>en peroxid genererende enzymer. Det har
vist sig at en <strong>for</strong>øgelse <strong>af</strong> peroxidase produktionen, ikke nødvendigvis fører
til nævneværdig <strong>for</strong>øgelse <strong>af</strong> peroxidase oxidation hastigheden. Tilsætning <strong>af</strong>
oxidaser kan omvendt medføre betydelig <strong>for</strong>øgelse <strong>af</strong> peroxidase oxidation
hastigheden. Disse enzymer er der<strong>for</strong> vigtige, da de kan være det hastigheds
begrænsene led i hele det radikal genererende system. [Kotterman M.J.J. et
al. (1996)].
Da LiP-II ved overskud <strong>af</strong> hydr<strong>og</strong>en peroxid let inaktiveres ved dannelse <strong>af</strong>
LiP-III, er det vigtigt at veratryl alkohol er tilstede i rigelige mængder. Det vides
at Mn blokerer <strong>for</strong> dannelsen <strong>af</strong> veratryl alkohol, så høje koncentrationer <strong>af</strong>
Mn bør undgås hvis LiP aktivitet ønskes optimeret. [Kotterman M.J.J. et al.
(1996)].
Side 56

ko n k l u s i o n
Emnet “<strong>Mekanismer</strong> <strong>for</strong> <strong>brun</strong>- <strong>og</strong> <strong>hvidmuld</strong><strong>svampes</strong> <strong>nedbrydning</strong> <strong>af</strong> træ: en-
zymatisk såvel som ikke-enzymatisk” er ensærdelse stor mundfuld, men ikke
desto mindre en meget lærerig ud<strong>for</strong>dring.
Ikke alene er mange <strong>af</strong> enzymerne meget uspecifikke, men ud over dette
kommer redikal-kemien, som ligeledes er relativ uspecifik, med flygtige inter-
mediære hvis liv måles i split-sekunder. Dette sammenholdt med et substrat
som er nærmest ufraktionerbart <strong>og</strong> kun lader sig analysere efter kemisk mas-
sakre, gør kun emnets biokemiske vinkel mere ud<strong>for</strong>drende.
Jeg har valgt at vægte substratet, specielt S2 laget i den sekundære cellevæg,
relativ højt. Dette er gjort ud fra betraktningen, at hvis man skal rive n<strong>og</strong>et ned,
er det meget nyttigt at vide hvad det er man med at gøre, så de rigtige værk-
tøjer kan vælges. Det er ofte lettere at <strong>af</strong>montere n<strong>og</strong>et man ved hvordan er
opbygget, selvom råstyrke selvfølgelig kan destruere næsten hvad som helst,
oftest d<strong>og</strong> på bekostning <strong>af</strong> genanvendbarheden <strong>af</strong> materialerne.
Træer en n<strong>og</strong>le vidunderlige skabninger, smukke at se på, fleksible at bygge <strong>af</strong>
<strong>og</strong> varme når de brænder. Jeg er sikker på at der vil blive <strong>for</strong>sket i nedbrydn-
ing <strong>af</strong> træ som aldrig før, specielt med henblik på erstatning <strong>af</strong> fossilt brænstof.
Forhåbentlig lader vi n<strong>og</strong>le rester være tilbage til vores venner i skovbunden,
så de kan <strong>for</strong>tsætte med nedbryde <strong>og</strong> omdanne træ til gavn <strong>for</strong> alt levende
som <strong>af</strong>hænger der<strong>af</strong>.
Til sidst, men absolut ikke mindst, vil jeg gerne sige tak til Bo Jensen <strong>for</strong>di han
gav mig mulighed <strong>for</strong> at skrive denne opgave, <strong>og</strong> blive bedømt der<strong>for</strong>. Også tak
til Anne Christine Steenkjær Hastrup <strong>for</strong> hun tålmodigt så på mens jeg utilsigtet
saboterede hendes <strong>for</strong>søg. Endelig kommer en tak til alle på “Afdeling <strong>for</strong>
generel mikrobiol<strong>og</strong>i” som nu hedder “Molecular Microbial Ecol<strong>og</strong>y Group” <strong>for</strong>di
i er n<strong>og</strong>le engagerede mennesker, som hjælper hvor i kan <strong>og</strong> gør det så man
føler det bare er helt iorden.
Side 57

e f e r e n c e l i s t e
[Acunzo F. et al. (2006)]
Francesca d’Acunzo, Carlo Galli, Patrizia Gentili and Federica Sergi
Mechanistic and steric issues in the oxidation of phenolic and non-phenolic compounds by laccase
or laccase-mediator systems. The case of bifunctional substrates
New J. Chem., 2006, 30, 583–591
[Baciocchi E. et al. (2002)]
Enrico Baciocchi, Massimo Bietti, Maria Francesca Gerini, Osvaldo Lanzalunga
The mediation of veratryl alcohol in oxidations promoted by lignin peroxidase: the lifetime of
veratryl alcohol radical cation
Biochemical and Biophysical Research Communications 293 (2002) 832–835
[Baldrian P. et al. (2008)]
Petr Baldrian, Vendula Valásková
Degradation of cellulose by basidiomycetousfungi
FEMS Microbiol Rev 32 (2008) 501–521
[Blanchette R.A. (1984)]
Robert A. Blanchette
Screening Wood Decayed by White Rot Fungi <strong>for</strong> Preferential Lignin Degradation
Applied and environmental microbiol<strong>og</strong>y, Sept. 1984, p. 647-653
[Blanchette R.A. (1991)]
Robert A. Blanchette
Delignification by Wood-Decay Fungi
Annu. Rev. Phytopathol. 1991. 29:381-98
[Blodig W. et al. (2001)]
Wolfgang Blodig, Andrew T Smith, Wendy A Doyle, Klaus Pionte
Crystal structures of pristine and oxidatively processed lignin peroxidase expressed in Escherichia
coli and of the W171F variant that eliminates the redox active tryptophan 171. Implications
<strong>for</strong> the reaction mechanism.
Journal of Molecular Biol<strong>og</strong>y (305), Issue 4, 2001, Pages 851-861
[Blomqvist K. et al. (2007)]
Blomqvist K., Djerbi S., Aspeborg H., Teeri T.T. (2007).
CELLULOSE BIOSYNTHESIS IN FOREST TREES.
Cellulose: Molecular and Structural Biol<strong>og</strong>y. Ed. R. Malcolm Brown, Jr. and Inder M. Saxena
[Brown J.A. et al. (1991)]
Julie A. Brown, Margaret Alic, Michael H. Gold
Manganese Peroxidase Gene Transcription in Phanerochaete chrysosporium: Activation by
Manganese
Journal of Bacteriol<strong>og</strong>y, july 1991, p. 4101-4106
[Burdsall H.H. et al. (1974)]
Burdsall H.H., Eslyn W.E. (1974)
A new Phanerochaete with a chrysosporium imperfect state.
Mycotaxon 1:123–133
[Christiernin M. et al. (2005)]
Christiernin M., Ohlsson A.B., Berglund T., Henriksson G. (2005).
Lignin isolated from primary walls of hybrid aspen cell cultures indicates significant differences
in lignin structure between primary and secondary cell wall.
Plant Physiol<strong>og</strong>y and Biochemistry 43 (2005) 777–785.
Side 58

[Choinowski T. et al. (1999)]
Thomas Choinowski, Wolfgang Blodig, Kaspar H. Winterhalter, Klaus Piontek
The Crystal Structure of Lignin Peroxidase at 1.70 AÊ Resolution Reveals a Hydroxy Group on
the Cb of Tryptophan 171: A Novel Radical Site Formed During the Redox Cycle
J. Mol. Biol. (1999) 286, 809-827
[Ding SY. et al. (2006)]
Ding SY., Himmel M.E. (2006).
The Maize Primary Cell Wall Microfibril: A New Model Derived from Direct Visualization.
J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 597-606
[Donaldson L. et al. (2005)]
Donaldson L., Xu P. (2005)
Microfibril orientation across the secondary cell wall of Radiata pine tracheids
Trees (2005) 19: 644–653
[Doyle W.A. et al. (1998)]
Wendy A. Doyle, Wolfgang Blodig, Nigel C. Veitch, Klaus Piontek, Andrew T. Smith
Two Substrate Interaction Sites in Lignin Peroxidase Revealed by Site-Directed Mutagenesis
Biochemistry, 1998, 37 (43), pp 15097–15105
[Driouich A. et al. (1993)]
Driouich A., Faye L., Staehelin L.A. (1993
The plant Golgi apparatus: a factory <strong>for</strong> complex polysaccharides and glycoproteins
TIBS 18 - june 1993
[Dun<strong>for</strong>d H.B. (2001)]
H. Brian Dun<strong>for</strong>d
How do enzymes work? Effect of electroncircuits on transition state acid dissociation constants
J Biol Inorg Chem (2001) 6: 819-8222
[Dun<strong>for</strong>d H.B. (2002)]
H. Brian Dun<strong>for</strong>d
Oxidations of iron(II)/(III) by hydr<strong>og</strong>en peroxide: from aquo to enzyme
Coordination Chemistry Reviews 233-234 (2002) 311-318
[Festucci-Buselli R.A. et al. (2007)]
Festucci-Buselli R.A., Otoni W.C., Joshi C.P. (2007).
Structure, organization, and functions of cellulose synthase complexes in higher plants
Braz. J. Plant Physiol., 19(1):1-13, 2007
[French A.D. et al. (2009)]
French A.D., Johnson G.P. (2009)
Cellulose and the twofold screw axis: modeling and experimental arguments
Cellulose (2009) 16:959–973
[Galli C. et al. (2004)]
Carlo Galli, Patrizia Gentili
Chemical messengers: mediated oxidations with the enzyme laccase
J. Phys. Org. Chem. 2004; 17: 973–977
[Gomez L.D. et al. (2008)]
Gomez L.D., Steele-King C.G., McQueen-Ma S.J. (2008)
Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing’s on the walls
New Phytol<strong>og</strong>ist (2008) 178: 473–485
[Harvey P.J. et al. (1990)]
P.J. Harvey, J.M. Palmer
Side 59

Oxidation of phenolic compounds by ligninase
Journal of Biotechnol<strong>og</strong>y, 13 (1990) 169-179
[Heldt HW. (2005)]
Heldt HW. (2005).
Plant Biochemistry, 3rd. ed. (2005)
[Henriksson G. et al. (1993)]
Gunnar Henriksson, Gunnar Johansson and G6ran Pettersson
Is cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium a one-electron reductase?
Biochimica et Biophysica Acta, 1144 (1993) 184-190
[Henriksson G. et al. (2000)]
Gunnar Henriksson, Liming Zhang, Jiebing Li, Pierre Ljungquist, Torbjörn Reitberger, Göran
Pettersson, Gunnar Johansson
Is cellobiose dehydr<strong>og</strong>enase from Phanerochaete chrysosporium a lignin degrading enzyme?
Biochimica et Biophysica Acta 1480 (2000) 83-91
[Henriksson G. et al. (2000)]
Gunnar Henriksson, Gunnar Johansson, Göran Pettersson (2000)
A critical review of cellobiose dehydr<strong>og</strong>enases
Journal of Biotechnol<strong>og</strong>y 78 (2000) 93–113
[Hofrichter M. (2002)]
Hofrichter M. (2002).
Lignin conversion by manganese peroxidase (MnP).
Enzyme and Microbial Technol<strong>og</strong>y 30 (2002) 454–466.
[Kirk T.K. et al. (1998)]
Kirk T.K., Cullen D. (1998).
Enzymol<strong>og</strong>y and Molecular Genetics of Wood Degradation by White-Rot Fungi.
Environmentally Friendlv Technol<strong>og</strong>ies <strong>for</strong> the Pulp and Paper Industry. p 273-307. edited by
Raymond A. Young and Masood Akhtar. 1998
[Kremer M.L. (1999)]
Mordechai L. Kremer
Mechanism of the Fenton reaction. Evidence <strong>for</strong> a new inter
Phys. Chem. Chem. Phys., 1999, 1, 3595-3605
[Kersten P.J. et al. (1990)]
Philip J. Kersten, B. Kalyanaraman, Kenneth E. Hammel, Bengt Reinhammar, T. Kent Kirk
Comparison of lignin peroxidase, horseradish peroxidase and laccase in th6 oxidation of methoxybenzenes
Biochem. J. (1990) 268, 475-480
[Kruså M. et al. (2005)]
Martin Kruså, Gunnar Henriksson, Gunnar Johansson, Torbjörn Reitberger, Helena Lennholm
Oxidative cellulose degradation by cellobiose dehydr<strong>og</strong>enase from Phanerochaete chrysosporium:
A model compound study
Holz<strong>for</strong>schung, Vol. 59, pp. 263–268, 2005
[Kotterman M.J.J. et al. (1996)]
Michiel J. J. Kotterman, René A. Wasseveld, Jim A. Field
Hydr<strong>og</strong>en Peroxide Production as a Limiting Factor in Xenobiotic Compound Oxidation by
Nitr<strong>og</strong>en-Sufficient Cultures of Bjerkandera sp. Strain BOS55 Overproducing Pero
Applied and environmental microbiol<strong>og</strong>y, Mar. 1996, p. 880–885
[Leppänen K. et al. (2009)]
Leppänen K., Andersson S., Torkkeli M., Knaapila M., Kotelnikova N., Serimaa R. (2009).
Side 60

Structure of cellulose and microcrystalline cellulose from various wood species, cotton and flax
studied by X-ray scattering
Cellulose (2009) 16:999–1015
[Martinez D. et al. (2004)]
Diego Martinez, Luis F Larrondo, Nik Putnam, Maarten D Sollewijn Gelpke, Katherine Huang,
Jarrod Chapman, Kevin G Helfenbein, Preethi Ramaiya, J Chris Detter, Frank Larimer, Pedro
M Coutinho, Bernard Henrissat,Randy Berka, Dan Cullen, Daniel Rokhsar.
Genome sequence of the lignocellulose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium
strain RP78
Nature Biotechnol<strong>og</strong>y Volume 22 Number 6 June 2004
[Mester T. et al. (2001)]
Tünde Mester, Ming Tien
Engineering of a Manganese-Binding Site in Lignin Peroxidase Isozyme H8 from Phanerochaete
chrysosporium
Biochemical and Biophysical Research Communications 284, 723–728 (2001)
[Micic M. et al. (2004)]
Micic M., Radotic K., Jeremic M., Djikanovic D., Kämmer S.B. (2004)
Study of the lignin model compound supramolecular structure by combination of near-field
scanning optical microscopy and atomic <strong>for</strong>ce microscopy
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 34 (2004) 33–40
[Otjen L. et al. (1987)]
Otjen, L., & Blanchette, R. (1987).
Assessment of 30 white rot basidiomycetes <strong>for</strong> selective lignin degradation.
Holz<strong>for</strong>schung, 41, 343–349.
[Reiss HD. et al. (1984)]
Reiss HD., Schnepf E., Herth W. (1984).
The plasma membrane of the Funaria caulonema tip cell: morphol<strong>og</strong>y and distribution of particle
rosettes, and the kinetics of cellulose synthesis
Planta (1984)160:428-435
[Rabinovich M.L. et al. (2002)]
M. L. Rabinovich, M. S. Melnick, A. V. Bolobova
The Structure and Mechanism of Action of Cellulolytic Enzymes
Biochemistry (Moscow), Vol. 67, No. 8, 2002, pp. 850-871
[Salnikov V.V. et al. (2008)]
Salnikov V.V., Ageeva M.V., Gorshkova T.A. (2008)
Homofusion of Golgi secretory vesicles in flax phloem fibers during <strong>for</strong>mation of the gelatinous
secondary cell wall
Protoplasma (2008) 233:269–273
[Singh D. et al. (2008)]
Deepak Singh, Shulin Chen (2008)
The white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium: conditions <strong>for</strong> the production of lignindegrading
enzymes
Appl Microbiol Biotechnol (2008) 81:399–417
[Schwarze F.W.M.R. (2007)]
Schwarze F.W.M.R. (2007)
Wood decay under the microscope
Fungal biol<strong>og</strong>y reviews 21 (2007) 133–170
[Sundaramoorthy M. et al. (2005)]
Munirathinam Sundaramoorthy, Heather L. Youngs, Michael H. Gold, Thomas L. Poulos
Side 61

High-Resolution Crystal Structure of Manganese Peroxidase: Substrate and Inhibitor Co
Biochemistry 2005, 44, 6463-6470
[Terashima N. et al. (2004)]
Terashima N., Awano T., Takabe K., Yoshida M. (2004).
Formation of macromolecular lignin in ginkgo xylem cell walls as observed by field emission
scanning electron microscopy
C. R. Biol<strong>og</strong>ies 327 (2004) 903–910
[Terashima N. et al. (2009)]
Terashima N., Kitano K., Kojima M., Yoshida M., Yamamoto H., Westermark U. (2009).
Nanostructural assembly of cellulose, hemicellulose, and lignin in the middle layer of secondary
wall of ginkgo tracheid
J Wood Sci (2009) 55:409–416
[Timofeevski S.L. et al. (1999)]
Sergei L. Timofeevski, Guojun Nie, N. Scott Reading, Steven D. Aust
Addition of Veratryl Alcohol Oxidase Activity to Manganese Peroxidase by Site-Directed Mutagenesis
Biochemical and Biophysical Research Communications 256, 500–504 (1999)
[Tomme et al. (1995)]
Tomme, P., Warren, R. A. J., and Gilkes, N. R. (1995).
Adv. Microb. Physiol., 37, 1-81.
[Vassão D.G. et al. (2008)]
Vassão D.G., Davin L.B., Lewis N.G. (2008).
Metabolic Engineering of Plant Allyl/Propenyl Phenol and Lignin Pathways: Future Potential <strong>for</strong>
Biofuels/Bioenergy, Polymer Intermediates, and Specialty Chemicals?
Advances in Plant Biochemistry and Molecular Biol<strong>og</strong>y. Volume 1 - Bioengineering and Molecular
Biol<strong>og</strong>y of
Plant Pathways. Ed. Hans J. Bohnert, Henry Nguyen and Norman G. Lewis
[Wightman R. et al. (2009)]
Wightman R., Marshall R., Turner S.R. (2009).
A Cellulose Synthase-Containing Compartment Moves Rapidly Beneath Sites of Secondary
Wall Synthesis
Plant Cell Physiol. 50(3): 584–594 (2009)
[Wong D.W.S. (2009)]
Wong D.W.S. (2009).
Structure and Action Mechanism of Ligninolytic Enzymes.
Appl Biochem Biotechnol (2009) 157:174–209.
[Zamocky M. et al. (2006)]
Marcel Zamocky, R. Ludwig, C. Peterbauer, B.M. Hallberg, C. Divne, P. Nicholls, D. Haltrich
Cellobiose Dehydr<strong>og</strong>enase – A Flavocytochrome from Wood-Degrading, Phytopath<strong>og</strong>enic and
Saprotropic Fungi
Current Protein and Peptide Science, 2006, 7, 255-280
[Zapanta L.S. et al. (1997)]
Laura Schick Zapanta, Ming Tien
The Roles of veratryl alcohol and oxalate in fungal lignin Degradation
Journal of Biotechnol<strong>og</strong>y 53 (1997) 93–102
Side 62