Mausgenetik - Familie Fensterle im Internet

Empfehlungen

Info

Allgemeine Hinweise zum Arbeiten im Labor: Bei einigen Teilen des Versuches muss steril und mit giftigen Chemikalien (z. B. Ethidiumbromid) gearbeitet werden. Aus diesem Grund bitte Handschuhe tragen, bei UV- Licht Schutzbrille benutzen, mit Umsicht arbeiten und den Hinweisen der Betreuerinnen folgen. Um Kontamination zu vermeiden soll grundsätzlich mit einer Pipette oder Pipettenspitze nur einmal pipettiert werden. Enzyme und Nukleotide sind ausschließlich auf Eis zu halten, da dies die Haltbarkeit dieser Komponenten verlängert. Bei Unsicherheiten und Fragen bitte die Betreuer/innen ansprechen. Zusammenfassung des Ablaufs Arbeitsschritte � Pipettieren der PCR Reaktion � PCR im Thermocycler � DNA Präparation � Gel gießen � Gelelektrophorese � Gel auf UV Tisch fotographieren Ausführliche Beschreibung des Experiments Material 1,5 ml Eppendorf-Tubes 0,2 ml PCR Tubes Qiagen DNeasy Tissue Kit inclusive enthaltenen Puffern Pipettensatz mit Spitzen Heizblock Eppendorf Zentrifuge Vortex PCR Thermocycler (TGradient Biometra) Real time PCR-Gerät (Rotor-Gene, RG-3000) Apparatur zur Agarose Gelelektrophorese mit Netzgerät PCR Puffer, MgCl2, YMT/2B s/a, Myogenin-Primer s/a und SP-C-BxB s/a Taq Polymerase, dNTPs männliche, weibliche Kontroll-DNA Agarose Gel, EtBr, pTZ18 /Hinf1 Größenmarker Loading Puffer, Sichtschutzbrille Mausgenetik 2006 S. 2
Primer Name Sequenz Fragment YMT/2B sense Primer 5’ CTG GAG CTC TAC AGT GAT GA 3’ antisense Primer 5’ CAG TTA CCA ATC AAC ACA TCA C 3’ Myogenin sense Primer 5’ TTA CGT CCA TCG TGG ACA GC 3’ antisense Primer 5’ TGG GCT GGG TGT TAG TCT TA 3’ SPC-BxB 5' SPC 5' GAG GAG AGG AGA GCA TAG CAC 3' 3' BxB 5' ACA TCT CCG TGC CAT TTA CCC 3' Vorbemerkung: Jede Gruppe bestimmt den transgen Status ODER das Geschlecht aus bereits extrahierter DNA zweier Mäuse. Eine weitere Gruppe bestimmt das Geschlecht durch Real-Time PCR. Die Qualität der Proben wird durch die Amplifikation eines Mausgens, das in allen Proben vorhanden sein muss kontrolliert. Die PCR Reaktion auf den transgenen Status oder das Geschlecht wird durch entsprechende Positivkontrollen kontrolliert. Die Spezifität der Reaktion wird durch PCR Reaktionen ohne den Zusatz von DNA kontrolliert. Um die Zersetzung von DNA und Enzymen zu verhindern werden alle Schritte auf Eis pipettiert. A) Durchführung, Bestimmung Transgenstatus Vorbemerkung SPC-BXB Raf transgene Mäuse exprimieren lungenspezifisch eine konstitutiv aktive Variante des Raf Moleküls. Die Zucht erfolgt normalerweise heterozygot. Myogenin ist ein Gen, das in allen Zellen beider Geschlechter vorhanden ist. Primer, die das Myogenin-Gen erkennen, können daher als interne Kontrolle der PCR Reaktion verwendet werden. a.) Jede Gruppe erhält folgende DNA: 10 µl BxB-Raf Plasmid DNA (Positivkontrolle) 2 x DNA aus transgenen Mäusen mit unbekanntem BxB-Raf Status. Es sollen folgende 7 Ansätze für die PCR pipettiert werden: Reaktion (-) 1 (-) 2 (+) 1 ? 1 (+) 2 ? 2 (+) DNA H2O H2O BxB DNA Maus 1 Plasmid Maus 1 Maus 2 Maus 2 Primerset BxB-Raf Myogenin BxB-Raf BxB-Raf Myogenin BxB-Raf Myogenin Ein PCR Ansatz enthält die folgenden Komponenten: PCR Puffer 5,0 µl MgCl2 (25 mM) 3,0 µl dNTP (10 mM) 1,0 µl 3' Primer (BxB3' oder Myogenin 3') 1,0 µl 5' Primer (BxB5' oder Myogenin 5') 1,0 µl DNA (~ 100 ng), aus DNeasy Kit x µl Taq Polymerase 0,25 µl H2O ad 50 µl Ansatz 1x Ansatz X x Ansatz X x BxB Raf Myogenin Mausgenetik 2006 S. 3
Seite 1: Genetisches Grundpraktikum 13.02.20
Seite 5 und 6: (Diese immer erst bei Bedarf aus de
Seite 7 und 8: � Nach Erkalten werden die Kleber
Seite 9: Abb. 1 qPCR zur quantitativen Besti

Mausgenetik - Familie Fensterle im Internet

Erfolgreiche ePaper selbst erstellen

Template löschen?

Als Template speichern?