Mausgenetik - Familie Fensterle im Internet

Genetisches
Grundpraktikum
13.02.2006 – 17.02.2006
Mausgenetik
Dr. Stefan Albert
Dr. Joachim Fensterle
Prof. Dr. Albrecht Müller
und Mitarbeiter
Zusammenfassung und Ziel:
Je nach eingesetztem Gen sind homozygot transgene Mäuse nicht lebensfähig oder lassen sich
aus anderen Gründen nicht züchten. Daher erfolgt die Zucht von transgenen Mäusen in vielen
Fällen mit heterozygoten Zuchtpaaren. Das bedeutet, dass entsprechend den Mendelschen
Gesetzen auch nicht transgene Mäuse im Wurf vorkommen können. Somit müssen bei einer
heterozygoten Zucht alle Mäuse des Wurfs mit einer geeigneten Methode genotypisiert
werden, um negative und positive Tiere zu identifizieren. Ziel dieses Praktikumteils ist es,
eine PCR gestützte Methode zur Genotypisierung von BxB Raf transgenen Mäusen kennen zu
lernen. Dabei soll DNA aus Mäuseschwänzen isoliert werden und die daraus isolierte DNA
mit Hilfe einer PCR Reaktion auf die Anwesenheit des Transgens und auf X- und Y
chromosomale Marker untersucht werden. Anschließend sollen die Daten aller 8 Gruppen
zusammengefasst werden und daraus auf den Zuchtplan geschlossen werden.
Das Buch "Mouse Genetics - Concepts and Applications", Lee M. Silver, Oxford University
Press, 1995 ist für vertiefende Studien empfehlenswert. Dieses Buch ist als Volltext über
folgende Adresse im Internet verfügbar:
http://www.informatics.jax.org/silver/framepreface.shtml
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Allgemeine Hinweise zum Arbeiten im Labor:
Bei einigen Teilen des Versuches muss steril und mit giftigen Chemikalien (z. B.
Ethidiumbromid) gearbeitet werden. Aus diesem Grund bitte Handschuhe tragen, bei UV-
Licht Schutzbrille benutzen, mit Umsicht arbeiten und den Hinweisen der Betreuerinnen
folgen.
Um Kontamination zu vermeiden soll grundsätzlich mit einer Pipette oder Pipettenspitze nur
einmal pipettiert werden.
Enzyme und Nukleotide sind ausschließlich auf Eis zu halten, da dies die Haltbarkeit dieser
Komponenten verlängert.
Bei Unsicherheiten und Fragen bitte die Betreuer/innen ansprechen.
Zusammenfassung des Ablaufs
Arbeitsschritte
� Pipettieren der PCR Reaktion
� PCR im Thermocycler
� DNA Präparation
� Gel gießen
� Gelelektrophorese
� Gel auf UV Tisch fotographieren
Ausführliche Beschreibung des Experiments
Material
1,5 ml Eppendorf-Tubes
0,2 ml PCR Tubes
Qiagen DNeasy Tissue Kit inclusive enthaltenen Puffern
Pipettensatz mit Spitzen
Heizblock
Eppendorf Zentrifuge
Vortex
PCR Thermocycler (TGradient Biometra)
Real time PCR-Gerät (Rotor-Gene, RG-3000)
Apparatur zur Agarose Gelelektrophorese mit Netzgerät
PCR Puffer, MgCl2, YMT/2B s/a, Myogenin-Primer s/a und SP-C-BxB s/a
Taq Polymerase, dNTPs
männliche, weibliche Kontroll-DNA
Agarose Gel, EtBr, pTZ18 /Hinf1 Größenmarker
Loading Puffer, Sichtschutzbrille
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Primer Name Sequenz Fragment
YMT/2B sense Primer 5’ CTG GAG CTC TAC AGT GAT GA 3’
antisense Primer 5’ CAG TTA CCA ATC AAC ACA TCA C 3’
Myogenin sense Primer 5’ TTA CGT CCA TCG TGG ACA GC 3’
antisense Primer 5’ TGG GCT GGG TGT TAG TCT TA 3’
SPC-BxB 5' SPC 5' GAG GAG AGG AGA GCA TAG CAC 3'
3' BxB 5' ACA TCT CCG TGC CAT TTA CCC 3'
Vorbemerkung:
Jede Gruppe bestimmt den transgen Status ODER das Geschlecht aus bereits extrahierter
DNA zweier Mäuse. Eine weitere Gruppe bestimmt das Geschlecht durch Real-Time PCR.
Die Qualität der Proben wird durch die Amplifikation eines Mausgens, das in allen Proben
vorhanden sein muss kontrolliert. Die PCR Reaktion auf den transgenen Status oder das
Geschlecht wird durch entsprechende Positivkontrollen kontrolliert. Die Spezifität der
Reaktion wird durch PCR Reaktionen ohne den Zusatz von DNA kontrolliert. Um die
Zersetzung von DNA und Enzymen zu verhindern werden alle Schritte auf Eis pipettiert.
A) Durchführung, Bestimmung Transgenstatus
Vorbemerkung
SPC-BXB Raf transgene Mäuse exprimieren lungenspezifisch eine konstitutiv aktive Variante des
Raf Moleküls. Die Zucht erfolgt normalerweise heterozygot. Myogenin ist ein Gen, das in allen
Zellen beider Geschlechter vorhanden ist. Primer, die das Myogenin-Gen erkennen, können daher
als interne Kontrolle der PCR Reaktion verwendet werden.
a.) Jede Gruppe erhält folgende DNA:
10 µl BxB-Raf Plasmid DNA (Positivkontrolle)
2 x DNA aus transgenen Mäusen mit unbekanntem BxB-Raf Status.
Es sollen folgende 7 Ansätze für die PCR pipettiert werden:
Reaktion (-) 1 (-) 2 (+) 1 ? 1 (+) 2 ? 2 (+)
DNA H2O H2O BxB DNA Maus 1
Plasmid
Maus 1 Maus 2 Maus 2
Primerset BxB-Raf Myogenin BxB-Raf BxB-Raf Myogenin BxB-Raf Myogenin
Ein PCR Ansatz enthält die folgenden Komponenten:
PCR Puffer 5,0 µl
MgCl2 (25 mM) 3,0 µl
dNTP (10 mM) 1,0 µl
3' Primer (BxB3' oder Myogenin 3') 1,0 µl
5' Primer (BxB5' oder Myogenin 5') 1,0 µl
DNA (~ 100 ng), aus DNeasy Kit x µl
Taq Polymerase 0,25 µl
H2O ad 50 µl
Ansatz 1x Ansatz X x Ansatz X x
BxB Raf Myogenin
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Für die PCR Reaktionen mit DNA aus dem DNeasy Kit sollen 2 µl DNA je Reaktion
verwendet werden. Die BxB-Raf Plasmid DNA für die positive Kontrolle hat eine
Konzentration von 50 µg/ml. Die DNA wird mit einer 1-10 µl Pipette in PCR Teströhrchen
pipettiert.
Für alle Reaktionen mit BxB bzw. Myogenin Primer soll jeweils ein "Master Mix" pipettiert
werden, der alle Bestandteile der PCR Reaktion bis auf die DNA enthält. Damit genug Master
Mix für alle Reaktionen zur Verfügung steht, wird eine 0,5 x höhere Menge als benötigt
angesetzt. Damit wird für drei Reaktionen ein Mastermix mit der 3,5 x Menge der jeweiligen
Komponenten pipettiert und die jeweilige Menge zur DNA in den PCR-Tubes zugegeben.
b.) Der Thermocycler wird auf folgendes Programm eingestellt:
Temperatur Zeit Zyklen
94°C 3 ' 1
94°C 30 ''
58°C 30'' 35
72°C 1 '
72°C 5' 1
4°C hold 1
c.) Die Proben werden in den Thermocycler überführt und das Programm wird.
B) Durchführung, Geschlechtsanalyse mittels Y-Chromosomen spezifischer
YMT/2B-PCR
Vorbemerkung
Die Sequenz, die die Primer YMT/2B erkennen, befindet sich auf dem Y-Chromosom. Wir wollen
PCR-Primer, die die Y-Chromosomen spezifische YMT/2B Sequenz erkennen, einsetzen, um
weibliche von männlichen Tieren zu unterscheiden. Myogenin ist ein Gen, das in allen Zellen
beider Geschlechter vorhanden ist. Primer, die das Myogenin-Gen erkennen, können daher als
interne Kontrolle der PCR Reaktion verwendet werden.
Die folgenden Proben sollen in der PCR Analyse eingesetzt werden:
-genomische DNA von 2 Tieren,
-genomische DNA von einer weiblichen Maus,
-genomische DNA von einer männlichen Maus,
-keine DNA.
Ansetzen einer konventionellen PCR Reaktion: 6x Mix (Auf EIS arbeiten!!!)
PCR Mix vorbereiten, die Reihenfolge einhalten.
Erst destilliertes Wasser vorlegen,
dann 10x PCR Puffer, dNTP`s und Primer dazugeben.
Als Letztes wird die Taq Polymerase dem Mix zugeben
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(Diese immer erst bei Bedarf aus dem Gefrierschrank holen und anschließend gleich wieder in
den –20°C Schrank zurückstellen. Die Taq-Polymerase ist ein Enzym, das bei
Raumtemperatur nur begrenzt haltbar ist und Aktivität verliert.)
Den Mix gut mischen und je 49µl pro PCR-Reaktionsgefäß vorlegen, dann werden 200ng
genomische DNA hinzugefügt.
Das Reaktionsgefäß mit dem Finger zum Mischen ‘anschnipsen’ und in den PCR
Thermocycler stellen.
PCR Thermocycler starten.
Ein PCR Ansatz enthält die folgenden Komponenten:
1x Ansatz Myogenin-PCR Mix 6x Ansatz Myogenin-PCR Mix
41µl H20 xµl H2O
5µl 10x PCR Puffer xµl 10x PCR Puffer
1µl dNTP Lsg. (2.5mM / dNTP) xµl dNTP Lsg.
1µl Myogenin Primer sense 10pmol xµl Myogenin sense Primer
1µl Myogenin Primer antisense 10pmol xµl Myogenin antisense Primer
0.05µl Taq Polymerase (5U/µl) xµl Taq Polymerase
Gut mischen, pro Reaktionsgefäß je 49µl vorlegen,
plus
je Gefäß 1µl gDNA (200ng/µl) je Gefäß 1µl gDNA (200ng/µl)
1x Ansatz YMT2B-PCR Mix 6x Ansatz YMT2B-PCR Mix
41µl H20 xµl H2O
5µl 10x PCR Puffer xµl 10x PCR Puffer
1µl dNTP Lsg. (2.5mM / dNTP) xµl dNTP Lsg.
1µl YMT/2B sense Primer (10pmol) 6µl YMT/2B sense Primer
1µl YMT/2B Primer antisense (10pmol) xµl YMT/2B antisense Primer
0.05µl Taq Polymerase (5U/µl) xµl Taq Polymerase
Gut mischen, pro Reaktionsgefäß je 49µl vorlegen,
plus
je Gefäß 1µl genomische DNA (200ng/µl) je Gefäß 1µl genomische DNA
(200ng/µl)
Parameter für konventionelle PCR (Thermocycler):
YMT2B/Myogenin:
5min,94 o C;30x (94 o C,30sec; 58 o C, 30sec; 72 o C,60sec); 5min,72 o C; 4°C 8 (Programm 32)
Ansetzen einer quantitativen real time PCR Reaktion:
Ein PCR Ansatz enthält die folgenden Komponenten:
1x Ansatz Myogenin-PCR Mix
5µl 2x real time PCR Puffer
1µl YMT2B Primer, sense 10pmol
1µl YMT2B Primer, antisense 10pmol
1µl gDNA (200ng/µl)
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add 20µl H20
1x Ansatz Myogenin-PCR Mix
5µl 2x real time PCR Puffer
1µl Myogenin Primer, sense 10pmol
1µl Myogenin Prime,r antisense 10pmol
1µl gDNA (200ng/µl)
add 20µl H20
Parameter für real time PCR (Rotor-Gene, RG-3000):
YMT2B/myogenin:
5min,94 o C;30x (94 o C,30sec; 58 o C, 30sec; 72 o C,60sec); 5min,72 o C; 4°C 8 (Programm ??)
Gelelektrophorese der PCR Produkte und DNA Extraktion
1. Agarose Gelelektrophorese der PCR Produkte
Vorbemerkung:
DNA kann in einem elektrischen Feld in einem Gel mit geeignetem Puffer entsprechend der
Fragmentgröße aufgetrennt werden. Kleine Fragmente wandern dabei schnell, große
entsprechend langsam. Die Auflösung hängt vom Geltyp ab. Sequenziergele (Acrylamid Gele)
erlauben Auflösungen bis zu einem Basenpaar (bp), bei Agarose Gelen lassen sich je nach
Fragmentgröße Auflösungen bis maximal 30 bp erreichen. Ein Agarose Gel lässt sich jedoch
sehr schnell herstellen und soll hier zur Analyse der PCR Reaktion benutzt werden. Agarose
löst sich bei Temperaturen über 90°C in wässrigen Puffern und bildet bei Erkalten unter 45°C
ein Gel. Die PCR Reaktionen werden auf das Gel aufgetragen, getrennt und mit einem
Farbstoff sichtbar gemacht. Der Farbstoff, Ethidiumbromid (Cave: krebsserregend,
Handschuhe und Schutzbrille unabdingbar!) interkaliert mit DNA und ändert dadurch sein
UV Emissionsspektrum. Die DNA Banden werden dadurch im Gel auf einem UV Tisch
sichtbar und können fotographisch dokumentiert werden. Durch die Verwendung eines DNA
Längenmarkers lassen sich dann die Größen der Fragmente abschätzen und damit der
Transgenstatus der Tiere bestimmen.
Durchführung
Herstellung eines 1,5 % Agarose Gels
� 1,5 g Agarose wird abgewogen und in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mit 0,5 x TBE
Puffer auf 100 ml aufgefüllt
� Die Agarose wird in der Mikrowelle unter Sichtkontrolle zum Kochen gebracht und
gelöst (die Lösung sollte keine Schlieren mehr enthalten, sonst noch mal kurz
aufkochen)
� Nach Abkühlung auf 50°C-60°C (Kolben lässt sich ohne Probleme anfassen) wird 1 µl
Ethidiumbromidlösung zugesetzt (Cave: hochgiftig!) und durch vorsichtiges
Schwenken verteilt
� Die warme Lösung wird zügig in einen vorbereiteten Gelträger gegossen (abgeklebt,
Kamm eingesetzt)
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� Nach Erkalten werden die Kleber entfernt und das Gel mitsamt dem Träger in die
Gelkammer überführt
� Die Kammer wird mit 0,5 x TBE Puffer aufgefüllt, bis der Flüssigkeitsspiegel 1-2 mm
über dem Gel liegt
� der Kamm wird vorsichtig entfernt � die Proben können nun aufgetragen werden
Gelelektrophorese und Fotodokumentation
� 20 µl der PCR – Reaktion werden in einem frischen Eppendorf-Tube mit 2 µl 10 x
Auftragspuffer gemischt und jeweils in eine Tasche des Gels pipettiert.
Pipettierschema:
Lane 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
PCR
Volumen
� Die Kammer wird an ein Netzgerät angeschlossen (- DNA ist negativ geladen -) und
die Elektrophorese wird bei einer Spannung von 5 V / cm Gel (hier 70 V)
durchgeführt. Nach ca. 40 min, wenn sich der dunkelblaue Farbstoff
(Bromphenolblau, wandert in diesen Bedingungen ungefähr wie ein DNA Fragment
von 500 bp) in der Mitte des Gels befindet wird die Elektrophorese gestoppt.
� Das Gel mit dem Träger wird vorsichtig in eine Plastikschale überführt (Cave:
Ethidiumbromid wandert während Elektrophorese auch in Puffer!) und die Banden
anschließend auf einem UV Tisch visualisiert (Cave: kurzwellige Strahlung,
Abschirmung vor allem der Augen [Plexiglasscheibe, Schutzbrille] notwendig). Das
Bandenmuster wird für jeden Teilnehmer fotographisch dokumentiert.
� Durch Vergleich mit dem Marker wird die Länge der Fragmente abgeschätzt und das
Resultat sowie die kurze Beurteilung der PCR in die Tabelle eingetragen.
Lane 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fragmentgröße
Positiv?
Gesamtbeurteilung (PCR auswertbar? Warum ja, warum nicht? Transgenstatus bzw.
Geschlecht der Tiere?)
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2. DNA Extraktion, Teil 2
Die Aufreinigung genomischer DNA wird entsprechend dem Qiagen Protokoll fortgeführt,
der RNAse Verdau ist nicht notwendig. Schwanzbiopsien wurden vorgenommen und die
Proben über Nacht in Proteinase K-Puffer verdaut.
� Der Lyseansatz wird aus dem Heizblock genommen und 15 sec. gevortext.
� 400 µl Puffer AL wird zugegeben und gründlich gevortext (AL - Ethanol Puffer
enthält chaotrope Salze, die die Bindung der DNA an die Silika-Matrix ermöglichen)
� ein DNeasy Säulchen wird in ein 2 ml Sammelröhrchen gesteckt, der komplette
Ansatz wird in das Säulchen gegeben und für 1 min bei 8000 rpm in einer Eppendorf
Tischzentrifuge zentrifugiert
� die Säule wird in ein neues Sammelröhrchen gesteckt und die gebundene DNA wird
durch Zugabe von 500 µl AW1 Puffer (entfernt Proteine und andere
Verunreinigungen) und anschließende Zentrifugation bei 8000 rpm für eine Minute
gewaschen
� die Säule wird in ein neues Sammelröhrchen gesteckt und überschüssiges Salz wird
durch Zugabe von 500 µl AW2 entfernt und die Membran gleichzeitig durch 3 min
Zentrifugation bei 8000 rpm getrocknet
� die Säule wird in ein beschriftetes (Gruppennummer, Datum) 1,5 ml Eppendorf Gefäß
überführt, 200 µl AE werden auf die Membran pipettiert und die DNA wird nach
einminütiger Inkubation bei Raumtemperatur durch einminütige Zentrifugation bei
8000 rpm eluiert.
Die anschließende DNA Quantifizierung und PCR Analyse auf den Transgenstatus erfolgt
durch die Betreuer.
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Abb. 1 qPCR zur quantitativen Bestimmung der Oct4 Expression.
A. NSCs (Oct4-eGFP transgene NSCs aus E14.5 Embryonen (Prof. H. Schöler, Münster)) wurden für
96 Stunden mit TSA/AzaC inkubiert, RNA wurde isoliert und in cDNA überschrieben. Die cDNA
wurde nach HPRT-Abgleich einer Oct4-spezifischen quantitativen (q) RT-PCR unterzogen (Rotor-
Gene, RG3000). B. Zur Standardisierung wurden qRT PCRs an ES Zell RNAs durchgeführt, die in
limitierenden Verdünnungsschritten eingesetzt wurde. Die Quantifizierung der Menge an Oct4
Transkripten ist in Tabelle 1 abgebildet.
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