Mausgenetik - Familie Fensterle im Internet

Für die PCR Reaktionen mit DNA aus dem DNeasy Kit sollen 2 µl DNA je Reaktion
verwendet werden. Die BxB-Raf Plasmid DNA für die positive Kontrolle hat eine
Konzentration von 50 µg/ml. Die DNA wird mit einer 1-10 µl Pipette in PCR Teströhrchen
pipettiert.
Für alle Reaktionen mit BxB bzw. Myogenin Primer soll jeweils ein "Master Mix" pipettiert
werden, der alle Bestandteile der PCR Reaktion bis auf die DNA enthält. Damit genug Master
Mix für alle Reaktionen zur Verfügung steht, wird eine 0,5 x höhere Menge als benötigt
angesetzt. Damit wird für drei Reaktionen ein Mastermix mit der 3,5 x Menge der jeweiligen
Komponenten pipettiert und die jeweilige Menge zur DNA in den PCR-Tubes zugegeben.
b.) Der Thermocycler wird auf folgendes Programm eingestellt:
Temperatur Zeit Zyklen
94°C 3 ' 1
94°C 30 ''
58°C 30'' 35
72°C 1 '
72°C 5' 1
4°C hold 1
c.) Die Proben werden in den Thermocycler überführt und das Programm wird.
B) Durchführung, Geschlechtsanalyse mittels Y-Chromosomen spezifischer
YMT/2B-PCR
Vorbemerkung
Die Sequenz, die die Primer YMT/2B erkennen, befindet sich auf dem Y-Chromosom. Wir wollen
PCR-Primer, die die Y-Chromosomen spezifische YMT/2B Sequenz erkennen, einsetzen, um
weibliche von männlichen Tieren zu unterscheiden. Myogenin ist ein Gen, das in allen Zellen
beider Geschlechter vorhanden ist. Primer, die das Myogenin-Gen erkennen, können daher als
interne Kontrolle der PCR Reaktion verwendet werden.
Die folgenden Proben sollen in der PCR Analyse eingesetzt werden:
-genomische DNA von 2 Tieren,
-genomische DNA von einer weiblichen Maus,
-genomische DNA von einer männlichen Maus,
-keine DNA.
Ansetzen einer konventionellen PCR Reaktion: 6x Mix (Auf EIS arbeiten!!!)
PCR Mix vorbereiten, die Reihenfolge einhalten.
Erst destilliertes Wasser vorlegen,
dann 10x PCR Puffer, dNTP`s und Primer dazugeben.
Als Letztes wird die Taq Polymerase dem Mix zugeben
Mausgenetik 2006 S. 4