Mausgenetik - Familie Fensterle im Internet
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add 20µl H20<br />
1x Ansatz Myogenin-PCR Mix<br />
5µl 2x real t<strong>im</strong>e PCR Puffer<br />
1µl Myogenin Pr<strong>im</strong>er, sense 10pmol<br />
1µl Myogenin Pr<strong>im</strong>e,r antisense 10pmol<br />
1µl gDNA (200ng/µl)<br />
add 20µl H20<br />
Parameter für real t<strong>im</strong>e PCR (Rotor-Gene, RG-3000):<br />
YMT2B/myogenin:<br />
5min,94 o C;30x (94 o C,30sec; 58 o C, 30sec; 72 o C,60sec); 5min,72 o C; 4°C 8 (Programm ??)<br />
Gelelektrophorese der PCR Produkte und DNA Extraktion<br />
1. Agarose Gelelektrophorese der PCR Produkte<br />
Vorbemerkung:<br />
DNA kann in einem elektrischen Feld in einem Gel mit geeignetem Puffer entsprechend der<br />
Fragmentgröße aufgetrennt werden. Kleine Fragmente wandern dabei schnell, große<br />
entsprechend langsam. Die Auflösung hängt vom Geltyp ab. Sequenziergele (Acrylamid Gele)<br />
erlauben Auflösungen bis zu einem Basenpaar (bp), bei Agarose Gelen lassen sich je nach<br />
Fragmentgröße Auflösungen bis max<strong>im</strong>al 30 bp erreichen. Ein Agarose Gel lässt sich jedoch<br />
sehr schnell herstellen und soll hier zur Analyse der PCR Reaktion benutzt werden. Agarose<br />
löst sich bei Temperaturen über 90°C in wässrigen Puffern und bildet bei Erkalten unter 45°C<br />
ein Gel. Die PCR Reaktionen werden auf das Gel aufgetragen, getrennt und mit einem<br />
Farbstoff sichtbar gemacht. Der Farbstoff, Ethidiumbromid (Cave: krebsserregend,<br />
Handschuhe und Schutzbrille unabdingbar!) interkaliert mit DNA und ändert dadurch sein<br />
UV Emissionsspektrum. Die DNA Banden werden dadurch <strong>im</strong> Gel auf einem UV Tisch<br />
sichtbar und können fotographisch dokumentiert werden. Durch die Verwendung eines DNA<br />
Längenmarkers lassen sich dann die Größen der Fragmente abschätzen und damit der<br />
Transgenstatus der Tiere best<strong>im</strong>men.<br />
Durchführung<br />
Herstellung eines 1,5 % Agarose Gels<br />
� 1,5 g Agarose wird abgewogen und in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mit 0,5 x TBE<br />
Puffer auf 100 ml aufgefüllt<br />
� Die Agarose wird in der Mikrowelle unter Sichtkontrolle zum Kochen gebracht und<br />
gelöst (die Lösung sollte keine Schlieren mehr enthalten, sonst noch mal kurz<br />
aufkochen)<br />
� Nach Abkühlung auf 50°C-60°C (Kolben lässt sich ohne Probleme anfassen) wird 1 µl<br />
Ethidiumbromidlösung zugesetzt (Cave: hochgiftig!) und durch vorsichtiges<br />
Schwenken verteilt<br />
� Die warme Lösung wird zügig in einen vorbereiteten Gelträger gegossen (abgeklebt,<br />
Kamm eingesetzt)<br />
<strong>Mausgenetik</strong> 2006 S. 6
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