Goebel Chromatographie vs Ionisierung.pdf - LC/MS

Chromatographie vs. Ionisierung
Anke Göbel, Oliver Rechel
BASF AG
Jens Dahlmann
Applied Biosystems

BASF Limburgerhof
1

BASF Limburgerhof
Horst Becker Reinhard Dötzer Jürgen Gerdon Nicole Gonzalez-Nevado
Christian Dietz Wolfgang Dreher Anke Göbel Ute Gröschel
Gerald Gütter Sonja Krause Maren Piel Heike Ruf
Ralf Hettich Sabine Leonhardt Oliver Rechel Hermann Wendel
2

Applied Biosystems
Norddeutsche Sturmfrisur
3

Hintergrund: Mitarbeit im DIN Ausschuss
DIN Deutsches Institut für Normung e. V.
76 Normenausschüsse
DIN NAW Normenausschuss Wasserwesen (NAW)
Unterteilung in 6 Fachbereiche
DIN NAW I Umwelt (Abfall, Boden, Wasser)
Unterteilung in 3 Arbeitsausschüsse
DIN NAW I.3 Arbeitsausschuss I.3 Wasseruntersuchungen HA I
der Wasserchemischen Gesellschaft in der GDCh
7 Unterausschüsse
Arbeitskreis im UA 2 = Verfahren mit LC-MS/MS
Beispiel Pflanzenschutzmittel
4

Das analytische Dilemma:
Gefordert werden folgende Punkte:
• Ausreichende Retention für sehr
polare Verbindungen
• Symmetrische Peaks für basische
Verbindungen
• Stabile chromatographische Bedingungen
für saure Verbindungen und Erhöhung der
Sensitivität/Ionenausbeute für negative
Ionen
5

Cl
Cl
Substanzbeispiele
N
Clopyralid
pKs = 2,0
CH 3
O
O
Cl
CH 3
Mecoprop
pKs = 3,8
OH
OH
O
O
Cl
O
O
Sulcotrion
pKs = 3,1
O OH
Cl
N
Quinmerac
pKs = 4,3
O
S
O
CH 3
CH 3
6

LC Parameter
Gerät: HPLC System HP1100 (Agilent)
Eluent A: Wasser / CHOOH (1000/1, v/v)
/ CHOOH (1000/6, v/v)
/ CH3COOH (pH 4.3)
Eluent B: Methanol / CHOOH (1000/1, v/v)
/ CHOOH (1000/6, v/v)
Säule: Betasil C18, 100 x 2.1 mm, 5um (Thermo Electron)
Fluss: 0.4 mL/min bei 25°C
Injektionsvolumen: 50 uL (100 uL)
Gradient: 7 min Zykluszeit
MS Parameter
Methode Pflanzenschutzmittel
Gerät: Tandem Massenspektrometer (API 4000, Applied Biosystems)
Detektion: ESI pos. und ESI neg., 2 Injektionen, 2 MRM Übergänge
7

XIC of -MRM (36 pairs): 190,0/146,0 amu from Sample 1 (Std. 10ng/ml Pestizid Mix 22 neg) of BetasilC18_CH3COOH.wiff (Turbo Spray) Max. 9,0e4 cps.
9,0e4
8,0e4
7,0e4
6,0e4
5,0e4
4,0e4
3,0e4
2,0e4
1,0e4
1,56
0,0
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
Time, min
2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0
XIC of -MRM (36 pairs): 190,0/146,0 amu from Sample 1 (Std. 10ng/ml Pestizid Mix 22 neg) of BetasilC18_01%HCOOH_2.wiff (Turbo Spray) Max. 4,2e4 cps.
4,0e4
3,5e4
3,0e4
2,5e4
2,0e4
1,5e4
1,0e4
5000,0
0,0
1. Retention: Beispiel Clopyralid
0,63
RT < 2k
2,12
Essigsäure, pH 4,3
0,1% Ameisensäure, pH 2,3
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0
Time, min
8

2. Peakform basischer Verbindungen
Lösungsansätze:
• Optimierung der stationären Phase
Beispiel: PSM auf unterschiedlichen C18 Phasen
• Zugabe von Puffersubstanzen zur mobilen Phase, z.B. NH 4Ac
Beispiel: Sulcotrione
• Hohe Säurekonzentrationen in der mobilen Phase
Beispiel: Quinmerac
9

Beispiel: PSM auf unterschiedlichen C18 Phasen
10

Beispiel: Sulcotrion und NH 4Acetat
MeOH/H2O 0.05 Vol. % AA: Std
pocatlantis012 1: MRM of 5 Channels ES+
14.35
339.85 > 227.85
2.49e5
%
0,05 % Essigsäure
0
Time
14.00 15.00 16.00
MeOH/H2O 2mM NH4Ac: Std
pocatlantis028 1: MRM of 5 Channels ES+
8.66 339.85 > 227.85
2.25e5
%
0
8.00 8.50 9.00 9.50
2 mM Ammoniumacetat
Säule: Atlantis dC18
Messung: Markus Winkler
Waters GmbH
Time
11

XIC of +MRM (11 pairs): 222.0/141.0 amu from Sample ... Max. 5.8e4 cps.
5.8e4
5.5e4
5.0e4
4.5e4
4.0e4
3.5e4
3.0e4
2.5e4
2.0e4
1.5e4
1.0e4
5000.0
Beispiel: Quinmerac und Säure
2.94
0.0
2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0
Time, min
XIC of +MRM (11 pairs): 222.0/141.0 amu from Sample 7... Max. 7.2e4 cps.
0,6 % Ameisensäure 6.0e4
Essigsäure, pH 4,6
Intensity, cps
7.2e4
7.0e4
6.5e4
5.5e4
5.0e4
4.5e4
4.0e4
3.5e4
3.0e4
2.5e4
2.0e4
1.5e4
1.0e4
5000.0
0.0
2.98
Verdoppelung der Peakbreite
an der Basis
2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
Time, min
12

Stabile chromatographische Bedingungen – insbesondere bei
hoher Matrixbelastung – erfordern einen pH Wert des Eluenten
unter dem pKs Wert der Analyten.
Kombiniert mit einer geeigneten stationären Phase werden
weiterhin optimale Peaksymmetrien erreicht.
Bei der Detektion negativer Ionen kann dies allerdings zu
einer reduzierten Ionenausbeute in der ESI Quelle führen.
Frage:
3. Sensitivität für negative Ionisierung
Lässt sich dieses Problem durch die Nachsäulenzugabe
basischer Stickstoffverbindungen lösen?
13

XIC of -MRM (36 pairs): 212.9/140.8 amu from Sample 10 (10ng/mL_STD_neg_long) of Phenoxys_DIN_041105.wiff (Turbo Spray) Max. 2.2e5 cps.
2.2e5
2.1e5
2.0e5
1.9e5
1.8e5
1.7e5
1.6e5
1.5e5
1.4e5
1.3e5
1.2e5
1.1e5
1.0e5
9.0e4
8.0e4
7.0e4
6.0e4
5.0e4
4.0e4
3.0e4
2.0e4
1.0e4
0.0
Beispiel: Nachsäulenzugabe Ammoniak
Mecoprop, 500 pg on column
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Time, min
10.55
0,6 % Ameisensäure
0,6 % Ameisensäure
+ 2 % NH 4 OH, 50 uL/min, pH 11
14

XIC of -MRM (36 pairs): 213,0/141,0 amu from Sample 4 (Std. 0.1ng/ml Pestizid Mix 22 neg) of BetasilC18_01%HCOOH_2.wiff (Turbo Spray) Max. 7500,0 cps.
1,6e4
1,5e4
1,4e4
1,3e4
1,2e4
1,1e4
1,0e4
9000,0
8000,0
7000,0
6000,0
5000,0
4000,0
3000,0
2000,0
1000,0
0,0
Beispiel: Nachsäulenzugabe TRIS
Mecoprop, 5 pg on column
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5
Time, min
3,82
0,1 % Ameisensäure
+ 1 mM Tris, 50 uL/min,
pH unverändert
0,1 % Ameisensäure
15

Ergebnisse aus der Literatur
Diplomarbeit Christian Götz,
ETH Zürich/EAWAG, 2002
Gomides-Freitas et al., 2004
J. Chromatogr. A, 1028, 277-286
16

Aktueller Stand der Methode
XIC of -MRM (36 pairs): 370.0/127.0 amu from Sample 1... Max. 3.6e6 cps.
3.6e6
3.4e6
3.2e6
3.0e6
2.8e6
2.6e6
2.4e6
2.2e6
2.0e6
1.8e6
1.6e6
1.4e6
1.2e6
1.0e6
8.0e5
6.0e5
4.0e5
2.0e5
0.0
18 Sub. ESI neg.
0.6 % FA, +TRIS
3.76
1 2 3 4
Time, min
Intensity, cps
XIC of +MRM (11 pairs): 222.0/141.0 amu from Sample ... Max. 6.3e5 cps.
6.3e5
6.0e5
5.5e5
5.0e5
4.5e5
4.0e5
3.5e5
3.0e5
2.5e5
2.0e5
1.5e5
1.0e5
5.0e4
0.0
4 Sub. ESI pos.
0.6 % FA
2.78
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Time, min
17

� Die Nachsäulenzugabe von TRIS-Puffer steigert für 80%
der Substanzen das Signal-Rausch Verhältnis, während die Verwendung von
Ammoniumhydroxid eine Verschlechterung der Empfindlichkeit zeigt.
Warum?
Zusammenfassung und Diskussion
� Durch die richtige Auswahl des Säulenmaterials (hier C18) lassen sich für
die untersuchten Analyte optimale Peaksymmetrien erhalten.
Mögliche Gründe? Kohlenstoffbeladung?
� Um mögliche Matrixeffekte zu minimieren, sollte eine hohe Säurekonzentration
gewählt werden.
Einverstanden?
18