6. LC/MS Diskussionstreffen, 29. Nov. 2005, Wuppertal ABSTRACTS

Abstracts: 6. LC/MS Diskussionstreffen, 29. Nov. 2005, Wuppertal 1
6. LC/MS Diskussionstreffen, 29. Nov. 2005, Wuppertal
A B S T R A C T S

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I. Abstracts Session A: Pharma-Bioanalytik
Quantifizierung von freien und veresterten Pflanzensterolen
mit LC-APPI-MS/MS
Uta Ceglarek, Jan Lembcke, Sven Baumann, Joachim Thiery
Universität Leipzig, Institut für Laboratoriumsmedizin, uta.ceglarek@medizin.uni-leipzig.de
Die Anwendung der APPI-MS/MS erlaubt eine schnelle Bestimmung von freien und
veresterten Pflanzensterolen und Cholesterol aus Serum. Die Probenvorbereitung der
Serumproben besteht aus einer Verdünnung bei gleichzeitiger Zugabe isotopenmarkierten
internen Standards. Die HPLC-Trennung der Analyten erfolgte auf einer monolithischen
Trennsäule mit nachfolgender APPI-Ionisierung und MS/MS Detektion. Im Rahmen von
klinischen Studien wurden in mehr als 5000 Proben Pflanzensterolkonzentrationen mit
dieser Methode bestimmt.
Im Vortrag werden Probleme bei der Quantifizierung der Analyten sowie der
Langzeitstabilität (Reproduzierbarkeit) der analytischen Methode vorgestellt.

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Erste Erfahrungen mit der Bestimmung von Streptomycin im Serum mittels
LC-MS/MS und Pentafluorophenyl-modifizierter stationärer Phase
Hartmut Kirchherr, Medizinisches Labor Bremen
Die Bestimmung von polaren Analyten in biologischer Matrix mit der LC-MS/MS bereitet oft
Schwierigkeiten. Sowohl die Möglichkeiten bei der Probenaufarbeitung als auch die Auswahl
der mobilen Phasen sind begrenzt. Hersteller von stationären Phasen versuchen durch neue
Entwicklungen die Einschränkungen bei den Fließmitteln auszugleichen. Am Beispiel der
Bestimmung von Streptomycin im Serum sollen die Besonderheiten dieser Problematik
diskutiert werden. Die MonoChrom MS-Trennsäule mit Pentafluorophenyl-modifizierter
stationärer Phase zeigt laut Herstellerangabe für etliche Analyten ein U-förmiges
Retentionszeitprofil. Hierhin könnte ein Ansatz gefunden worden sein, auch bei sehr polaren
Analyten eine ausreichende Retention auf der Säule zu erhalten. Entscheidend wäre hier
aber auch, wie sich die Matrix verhält und ob das Problem der schlechten Ionisierung und
Signalunterdrückung im Elektrospray nicht einfach zu größeren Retentionszeiten verlagert
wird. Streptomycin verhält sich auf der Säule ganz anders als erwartet. Aminoglykoside wie
Streptomycin haben zusätzlich die analytisch unangenehme Eigenschaft, sehr gut löslich in
Wasser aber fast schon unlöslich in Alkoholen zu sein. Eine klare Verbesserung des
Retentionsverhaltens und die Etablierung einer brauchbaren Routinemethode wird trotzdem
erreicht.

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Von der LC-MS/MS zur automatisierten online-SPE-LC-MS/MS
- Beispiel antiretrovirale Pharmaka -
T. Koal, V. Kaever, Medizinische Hochschule Hannover; E. Koster, Spark Holland;
M. Svoboda, Applied Biosystems
Antiretrovirale Pharmaka werden zur Behandlung von Patienten, die mit HIV infiziert bzw.
and AIDS erkrankt sind, eingesetzt. Dabei werden in der Regel Kombinationen
verschiedener antiretroviraler Pharmaka verabreicht, die es gilt patientenindividuell zu
dosieren. Für die Quantifizierung im Plasma ist die LC-MS/MS die Methode der Wahl um
eine möglichst hohe Analysenmethoden-Selektivität bzw. -Sensitivität bei kurzen
Analysenzeiten zu erzielen.
Er werden neue Alternativen zur üblichen Probenvorbereitung mittels Proteinfällung
vorgestellt, die den Probenvorbereitungsaufwand minimieren bzw. vereinfachen und somit
auch das Infektionsrisiko einschränken. Dabei stehen Quantifizierungsmethoden in Dried
Blood Spots (DBS) und direkte Analysen aus Plasma-Proben im Mittelpunkt. Der Einfluss
und die Notwendigkeit der online SPE (einfache Säulenschaltung und vollständig
automatisierte online SPE) werden hinsichtlich Matrix- und Carry-over Effekten diskutiert.

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Turbulent Flow Chromatography as an Effective Tool for Reducing Matrix
Effects in ESI-MS-Based Enzymatic Bioassays
André Liesener and Uwe Karst
University of Twente, Chemical Analysis Group and
MESA + Institute for Nanotechnology, P.O. Box 217,
7500 AE Enschede, The Netherlands
In the analysis of samples originating from enzymatic bioassays by means of electrospray
ionization mass spectrometry (ESI-MS), one of the major issues regarding the reliability of
the method is the possible influence of matrix constituents. ESI-MS is known to be very
susceptible to both, ionization suppression and ionization enhancement of low molecular
weight analytes in the presence of large biomolecules such as enzymes. In order to minimize
these disturbing effects, it is desirable to remove matrix components prior to the ESI-MS
analysis. Due to the typically large number of samples, which have to be analyzed during a
complete assay, sample preparation has to be fast and automated. A sample preparation
method fulfilling these criteria is the so-called turbulent flow chromatography (TFC). In this
approach, the samples are directly injected into a high flow rate aqueous mobile phase
stream and transferred onto a microbore column containing a large particle size stationary
phase, where the low molecular weight analytes are retained, while the high molecular
weight compounds and salts are rapidly washed off.
The effectiveness of TFC as means to reduce matrix effects in samples originating from
simultaneous multianalyte mass spectrometric bioassays is explored. In this study, the
effects of enzymes present in the sample on the signal response of five analytes were
simultaneously investigated over a protein content range from 0 �g/mL to 38 �g/mL by
means of direct flow injection mass spectrometry. As model enzymes, trypsin, thrombin and
chymotrypsin were selected. Without TFC, the matrix effects caused both signal suppression
and signal enhancement depending on the nature of the analyte and the amount of matrix in
the sample and were found to be generally intolerably large. The deviation from the mean
signal response as a measure of distortion was found to be between 14% up to 112%. The
addition of an excess of methanol as means of sample clean-up was investigated and found
not to be sufficient. By employing TFC for on-line sample preparation, it was possible to
reduce the matrix effects to a minimum for all model systems investigated. In case of trypsin,
the distortion could be lowered from 41.9% to 2.6%, thus demonstrating clearly the efficiency
of the TFC-based on-line sample clean-up.

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Kontamination von Proben und erste Messungen mit dem API 5000
C. Madetzki, Pharmakokinetik, Schering AG, Berlin
Für einen hochpotenten Wirkstoff wurde eine LC-MS/MS-Methode entwickelt,
die für die Quantifizierung der Substanz unter GLP in einen
Konzentrationsbereich von 0.05 – 50000 ng/mL in verschiedenen Matrices
verwendet wurde. Bei Versuchen, die Nachweisgrenze auf 0.01 ng/mL zu
reduzieren, traten Probleme mit der Robustheit der Methode in Form von
Verschleppungen und Kontamination des Messsystems auf. Als Quelle dieser
Verunreinigungen konnten allgemeine Laborgeräte sowie Arbeitsabläufe
identifiziert werden. Im Zuge immer empfindlicherer Messtechniken ist die
Aufklärung solcher Kontaminationswege von wachsender Bedeutung. Dies gilt
insbesondere bei Betrachtung der Anschaffung eines Massenspektrometers des
Typs API 5000. Erste Ergebnisse, die während einer Gerätedemonstration
gesammelt wurden, werden vorgestellt.

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Dihydralazin - Ein altes Medikament mit großen Tücken
Hermann Mascher, Werner Tscherwenka, Klaus Kubesch und Daniel Mascher
Pharm-analyt, Pichlergasse 2, A-2500 Baden
eMail: hermann.mascher@pharm-analyt.at
In der Literatur zum Nachweis aus den Jahren 1978-1985 (mehr gibt es nicht) ist die
Rede von freiem und "apparentem" Dihydralazin. Das Dihydralazin wird dabei durch
saure Hydrolyse aus "Bindungen" freigesetzt und gleichzeitig derivatisiert, um der
großen Reaktivität Einhalt zu gebieten. Andeutungsweise wird auch klar, daß die
Stabilität in Plasma ganz erbärmlich gering ist. Soweit die Literatur - und wie kommt
man mit modernster Analysentechnik (HPLC - Tandem MS) an das Thema heran ?
Kann man bei so einem reaktiven Stoff, den man gut und gerne früher als
Derivatisierungsmittel verwendet hätte, ein valides Verfahren entwickeln ?
Stationen einer Odysee.

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Quantifizierung von 3-Nitro-4-hydroxyphenylessigsäure in Humanurin
mittels LC-NP-ESI-MS/MS
M. Urban, H.W. Hagedorn, ABF GmbH, München
„Reactiv nitrogen species“ (RNS), wie z.B. Peroxynitrit, sind in der Lage, freies oder
proteingebundenes Tyrosin zu nitrieren. Das entstehende 3-Nitrotyrosin wird metabolisiert
und als 3-Nitro-4-hydroxyphenylessigsäure (NHPA) im Urin ausgeschieden. Diese
Reaktionsprodukte und ihre Metaboliten stellen somit mögliche Biomarker für die in vivo-
Bildung von RNS dar. So kommt NHPA in Humanurin in Konzentrationen bis 7,9 µg/24 h vor.
Allerdings stellt bei einer Vielzahl der bekannten Methoden die artifizielle Bildung der
Analyten während der Probenvorbereitung ein Haupthindernis für eine sichere
Quantifizierung dar. Vorgestellt wird eine neuentwickelte Methode zur artefaktfreien
Bestimmung von NHPA in Humanurin mit LC-MS/MS, die auf einer flüssig/flüssig-Extraktion
und anschließender HPLC-Fraktionierung beruht. Für die LC-MS/MS-Messung erlaubt die
Kombination von Luna Cyanopropyl-Säulen und Normalphasen-HPLC eine spezifische
Abtrennung des Analyten von störenden Matrixkomponenten. Das verwendete
umweltfreundliche, perfluorierte Laufmittel Ethoxynonafluorobutan (ENFB) führt zu einer im
Vergleich zu herkömmlichen Reversed-phase-Trennverfahren für diesen Analyten deutlich
verbesserten Chromatographie. Die spezifische Detektion ist durch ESI(-)-MS/MS-Messung
von je 2 MRM für Analyt und d5-markierten internen Standard gewährleistet. ENFB stellt
somit eine Alternative zu klassischen Normalphasenlaufmitteln wie Hexan dar. Die
Anwendung auf Realproben und erste Methodenkenndaten werden entsprechenden
Ergebnissen unter Reversed-phase-Bedingungen gegenübergestellt.

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Bestimmung von 5-Methyltetrahydrofolat in Humanplasma und Vollblutlysat
mittels Turbulent Flow Chromatography-MS/MS - TFC als Alternative zur off-
line SPE?
Doris Quack, ACI Analytik Consulting Institut GmbH, Neuss (d.quack@aci-labor.de)
Im Rahmen einer Machbarkeitssudie soll5-Methyltetrahydrofolat in Humanplasma und
Vollblutlysat mittels MS/MS quantifiziert werden. Eine bei der Literatur-Recherche
gefundene, scheinbar bestens geeignete Methode, erweist sich in der Probenvorbereitung
als sehr zeitintensiv. Die für die SPE erforderlichen Schritte werden, wie in der
Literaturmethode beschrieben, umgesetzt. Somit können 12 Proben in einer Stunde
aufgearbeitet werden.
In diesem Vortrag wird eine Alternative zur SPE und LC-MS/MS mit stabil isotopen-
markiertem ISTD gezeigt. Die Turbulent Flow Chromatography mit anschließender ESI-
Ionisierung und MS/MS Detektion ermöglicht eine einfache und schnelle Bestimmung von 5-
Methyltetrahydrofolat in Humanplasma und Vollblutlysat. Somit können 96 Proben in einer
Stunde aufgearbeitet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Quantifizierung auch mit dem
Strukturanalog Methotrexat als internem Standard möglich ist.

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II. Abstracts Session B: Rückstandsanalytik
Ein komplett automatisiertes online-Festphasenextraktionssystem mit direkter
LC-MS/MS-Kopplung zur Quantifizierung von Antibiotika und Pestiziden in
Oberflächengewässern
G. Boehm, Flux Instruments AG, Basel, CH
Durch Einspritzung grosser Volumina (18mL Wasserproben) in das online-
Festphasenextraktionssystem mit direkter LC-MS/MS-Kopplung wurden Empfindlichkeiten
im ng/L-Bereich erreicht. Die direkte Kopplung der Festphasenextraktionssäule an das LC-
MS/MS-System wurde durch automatische Säulenschaltung bewerkstelligt. Besonderer Wert
wurde auf eine minimierte Probenverschleppung gelegt. Die absoluten
Wiedergewinnungsraten liegen bei 85-112%, die Tag zu Tag-Präzision bei 1-6% im
Vergleich zu Standards.

Abstracts: 6. LC/MS Diskussionstreffen, 29. Nov. 2005, Wuppertal 11
Spezielle Aspekte der Stabilisotopenverdünnungsanalyse von Naturstoffen
am Beispiel von Mykotoxinen
M. Bretz, M. Beyer, B. Cramer, H.-U. Humpf
Westfälische Wilhelms-Universität, Institut für Lebensmittelchemie
Corrensstr. 45, D-48 149 Münster
Mykotoxine sind toxische Sekundärmetabolite, die von Schimmelpilzen während des
Wachstums auf Lebens- und Futtermitteln gebildet werden. Bei Verzehr stellen sie für
Mensch und Tier aufgrund verschiedener toxikologischer Effekte ein potentielles
Gesundheitsrisiko dar. Zur Zeit sind ca. 400 verschiedene Mykotoxine bekannt, wobei die
Gruppen der Aflatoxine, Fumonisine und Trichothecene, sowie Ochratoxin A, Patulin und
Zearalenon zu den bedeutendsten zählen. In den letzten Jahren wurden auf nationaler und
internationaler Ebene Grenzwerte für die wichtigsten Mykotoxine festgelegt, um die
Gefährdung der Verbraucher zu minimieren. Diese dienen der amtlichen
Lebensmittelüberwachung als Beanstandungsgrundlage und sind damit von erheblicher
wirtschaftlicher Bedeutung.
Für die Kontrolle der Grenzwerte setzen sich immer stärker HPLC-MS/MS-Multimethoden
durch, die die empfindliche und spezifische qualitative und quantitative Erfassung der
wichtigsten Toxine in einem Analysengang ermöglichen. Problematisch sind hier allerdings
Matrixeffekte die insbesondere die quantitative Bestimmung erschweren. Um trotzdem
höchste Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, stellt die
Isotopenverdünnungsanalyse unter Verwendung von stabilisotopenmarkierten Analyten als
interne Standards die Methode der Wahl dar. Mit dieser Technik lassen sich Extraktions- und
Clean-Up-Verluste sowie Matrix-Effekte und Massenspektrometer-Drift kompensieren.
Gerade bei Naturstoffen ist allerdings die Verfügbarkeit isotopenmarkierter Standards ein
limitierender Faktor, da eine Totalsynthese selten möglich, die Partialsynthese an komplexen
Molekülen schwierig und die biosynthetische Herstellung sehr aufwendig und teuer ist.
Gelingt die Produktion von isotopenmarkierten Standards trotzdem, so erreichen der Grad
der Isotopenmarkierung und das Masseninkrement oftmals nicht die aus der Pharma- und
Rückstandsanalytik bekannten Werte. Der praktische Umgang mit diesen Phänomenen und
die exakte Quantifizierung unter Verwendung derartiger isotopenmarkierter Standards werden
am Beispiel ausgewählter Mykotoxine diskutiert.

Abstracts: 6. LC/MS Diskussionstreffen, 29. Nov. 2005, Wuppertal 12
Chromatographie vs. Ionisierung
Anke Göbel, Jens Dahlmann, Oliver Rechel, BASF AG, Limburgerhof
e-Mail: anke.goebel@basf-ag.de
Bei der Bestimmung von sauren organischen Verbindungen mittels HPLC-MS/MS und
Elektrosprayionisation im negativ Modus kann sich der im Folgenden beschriebene Konflikt
ergeben. Für die Chromatographie an RP-Säulen ist ein pH Wert des Eluenten unterhalb des
pKs-Wertes der zu untersuchenden Substanzen anzustreben um eine robuste Trennung und
akzeptable Peaksymmetrien zu erhalten. Ein niedriger pH Wert ist allerdings für die Bildung
von negativen Ionen hinderlich und führt so zu einer geringeren Sensitivität der Methode.
Diese unterschiedlichen Anforderungen an den Eluenten und die hohe Polarität der
Verbindungen kann die Auswahl einer passenden Säule erschweren. Die Zudosierung
basischer Stickstoffverbindungen nach der chromatographischen Säule kann zur Steigerung
der Ausbeute in der Ionisierung dienen. Die einzelnen Aspekte werden am Beispiel
ausgewählter Pflanzenschutzmittelwirkstoffe diskutiert.

Abstracts: 6. LC/MS Diskussionstreffen, 29. Nov. 2005, Wuppertal 13
Zuckerrübe, Hopfen & Co: Mit 2D-LC on-line gegen Matrixeffekte
Stephan Sack & Albrecht Glänzel
RCC Ltd, Zelgliweg 1, CH-4452 Itingen, Switzerland, sack.stephan@rcc.ch
API-MS/MS instruments now provide sufficiently high sensitivity for the majority of small
molecule analytes at a detection level clearly below 1 ng/mL, i.e., typical extracts at the ‘baby
food’ residue limit of 10 ppb are accessible without the need of analyte enrichment that is
typically achieved in combination with classical clean-up steps such as SPE or LLP.
However, extensive HPLC gradient separations and the injection of a few µL of an even
diluted crop extract cannot routinely avoid disturbing effects of co-eluted matrix fractions on
the atmospheric pressure ionization (typically seen as ion suppression in the case of ESI
type API interfaces or signal enhancement in APCI).
Undoubtedly the best measure to compensate for these effects is the use of isotopic labelled
internal standards. However, in everyday practice these standards are typically not available
for all analytes of a residue method. So as a widespread work-around matrix-matched
standards are used in residue analysis assuming that they are suppressed or enhanced to
the same extend as given in the samples to be analyzed. However, already minor changes in
e.g. the crop growing stage can cause different matrix effects making the choice of the best
matching matrix often to be a compromise.
In the present study the potential of 2-dimensional HPLC (LC-LC column switching) as
efficient tool for the reduction of matrix effects is successfully demonstrated for the
carbamate pesticide carbofurane and its plant metabolite 3-hydroxycarbofuran in various
plant substrates (among them sugar beets, sunflower seeds, hops). This can be considered
as a typical example of target residue analyses with harsh extraction (here 0.25 N HCl
solution has to be used for 3-hydroxycarbofuran).
The column switching method developed for the two analytes consists of two isocratic
reversed phase separations on an Intersil Phenyl-3 and an Inertsil ODS-3 column (2mm x
100 mm each) with on-column focussing of the injected volume and of the two eluent fraction
switched from column 1 to 2. This system combined with narrow (“heart”) cutting of analyte
peaks from column 1 provide significant better reduction of matrix effects than could be
reached with gradient separation that were up to about 3 times longer in cycling. Staggered
separations on columns 1 and 2 in LC-LC can further speed up the LC process without
loosing the clean-up effect.

Abstracts: 6. LC/MS Diskussionstreffen, 29. Nov. 2005, Wuppertal 14
Test:
DESI-MS (Desorption Electrospray) zur Detektion von Pestiziden auf Kleidung
D. Zimmer, Bayer CropScience AG; L.A. Leuthold, G. Hopfgartner, Univ. Genf, CH
DESI wurde erstmals 2004 von der Arbeitsgruppe um R.G. Cooks (Purdue Univ. Layette, IN)
publiziert [1]. Da DESI unter Atmosphärendruck (API) arbeitet, können Oberflächen sehr
einfach untersucht werden, ohne die Probe über eine Schleuse ins Hochvakuum des MS
einbringen zu müssen. Seit 2004 wurden zahlreiche Applikationen von DESI-MS zur direkten
Analyse von z.B. Pharmaka in Tabletten und Gewebeproben, Sprengstoffen und
Rauschgiften auf Koffern, Haut und Textilien z.B. auf Flughäfen publiziert. Kürzlich wurde
von Cooks et al. in der „Angewandten Chemie“ vom 04. Nov. 2005 die Unterscheidung von
Tumorgewebe und gesundem Gewebe in der Leber mittels DESI veröffentlicht [2].
Wir haben mit einer home-made DESI-Quelle [3] ein Insektizid auf der Oberfläche von
Kleidungsstücken, die Arbeiter bei der Saatgut Beizung tragen, qualitativ detektiert. Es bleibt
abzuwarten, ob DESI ausreichend meßempfindlich und zur Quantifizierung geeignet ist.
Abbildung aus [1]
[1] Z. Takats, J.M. Wiseman, B. Gologan, R.G. Cooks, Science 2004, 306, 471
[2] J. M. Wiseman , S. M. Puolitaival, Z. Takáts, R. G. Cooks, R. M. Caprioli,
Angewandte Chemie Int. Ed. 44 (43), 2005, 7094-7097
[3] L.A. Leuthold, J-F. Mandscheff, M. Fathi, C. Giroud, M. Augsburger, E. Varesio,
G. Hopfgartner,Rapid Commun. Mass Spectrom., in press