Hoke Urin.pdf - LC/MS

LC – MS Meeting, Wuppertal 2005
Probleme bei der Entwicklung und Validierung
von Urin Methoden
G Bioanalytik, A DMPK

Standardvorgehen (1)
Urinmethode wird in aller Regel notwendig für die 1. Humanstudie
Methode für die Substanz in Humanplasma meistens vorhanden
(isotopenmarkierter Standard, Auswertung über Peakflächenverhältnis,
SPE 1) , LC-MS/MS ESI+ ,)
Standardansatz: Urinproben werden analog zu Plasmaproben
bearbeitet, d.h.
- Spiken von C/QC Proben in Urin
- Aufarbeitung / Messung
Probleme /Effekte
1) solid phase extraction, Automatisiert mit Tecan-Pipettierroboter oder auch Hand

Standardvorgehen (2)
Vergleich mit Plasma gibt erste Aufschlüsse über evtl. Probleme
-Adsorption (Auswertung über Response)
-Suppression (Auswertung über Flächen)
-Probleme bei der SPE
Lösung der möglichen Adsorptionprobleme
-Zugabe von verschiedenen Säuren in unterschiedlichen Stärken
-Vergleich Kunststoff/Glas
Lösung von evtl. Supression
-Zugabe von BSA oder Plasma zur Aufarbeitung
Lösung der Aufarbeitungsprobleme

Analyte 1
Versuch
Cs Plasma/QCs Urin
Cs Plasma/QCs Urine in Kunststoff/Glas
Cs Plasma/[QCs Urin/Plasma (1:1)]
Cs Plasma/[QCs Urin/0.2 N HCl)]
QCs mit verschiedenen
Zitronensäure Konzentrationen
Zugabe Säure vorher/nachher
Ergebnis
QCs -30% bezogen auf Response
Plasma
Suppression 60-70% bezogen auf
Fläche
Urin in Kunststoff -25% gegen
Plasma
→ Adsorption
valide
valide → neutralisieren notwendig
0.01 – 0.2 M valide
→ Endkonzentration 0.1 M
Valide (kein Unterschied)

Analyte 1
Adsorptionseffekt an Plastik aufgrund fehlender Plasmaproteine
Durch Zusatz von Zitronensäure (vorher oder nachher) wird Analyte in
Lösung gehalten bzw. wieder gebracht.
Bei den ersten Klinikproben wurde Säure hinterher zugegeben, danach
Vorlegen von Säure
Neutralisieren der Säure für SPE notwendig
Wiederfindung ca. 70 %, kein Matrixeffekt
Je mehr Säure, desto besser im Vergleich zu Plasma, aber desto mehr
Signalunterdrückung

Analyte 2
Versuch
Cs/QCs in Urin gespikt
Cs/QCs in Urin gespikt, anschl.
1:1 mit Plasma verdünnt
Cs/QCs in angesäuertem Urin
gespikt (1:1 mit 0.1N HCl)
Test mit radioaktiver Substanz
hinsichtlich Wiederfindung
Cs/QCs in angesäuertem Urin
gespikt (1:1 mit 0.1N HCl),
Zugabe von Plasma (1:1) vor der
SPE
Ergebnis
Nicht valide
Nicht valide
Valide, allerdings geringe Empfindlichkeit
Ohne HCl: Q04: 80%, Q03: 60%, Q02:
50%
mit HCl: alle QCs 90-100%
Valide, Empfindlichkeit ok

Analyte 2
Adsorptionseffekt an Plastik aufgrund fehlender Plasmaproteine
durch Zusatz von HCl wird Substanz in Lösung gehalten
auch nachträgliche Zugabe von HCl bringt Substanz wieder vollständig in
Lösung, d.h. Proben aus der Klinik wurden nachträglich in BA angesäuert
aufgrund der Säure schlechte Wiederfindung, deshalb Zugabe von Plasma

Analyte 3
Versuch
Cs/QCs in Urin gespikt
Cs/QCs in Urin gespikt,
Verdünnungs QCs mit unterschiedlichen
Medien (Urin oder
Puffer) verdünnt bzw. Aufarbeitung
variiert (manuell, Tecan)
Cs/QCs in Urin gespikt,
Auswertung gg. Plasma-Cs
Cs/QCs in angesäuertem Urin
gespikt (1M Zitronensäure, 1:1)
Auswertung gg. Plasma-Cs
Vgl. Zugabe Zitronensäure
vorher/nachher
Ergebnis
Valide, aber QCs -5% bis -20%
Verdünnungs QCs: -14% bis -17 %
Valide
Verdünnungs QCs: Abw. -10% bis -
50 %
Abweichungen von -15% bis -23%
Verdünnungs QCs: -15% bis -32%
Valide; Verdünnungs QCs: ok;
Zugabe nachher nicht valide

Analyte 3
Adsorptionseffekte an Plastik aufgrund fehlender Plasmaproteine
im Vergleich zu Analyte 2 allerdings weniger stark ausgeprägt, d.h. nicht
so deutlich erkennbar, Abweichung eher grenzwertig
Zugabe von Säure, um Substanz in Lösung zu halten
allerdings ist es nicht möglich, Substanz anschließend durch Säurezugabe
wieder in Lösung zu bringen, d.h. Proben müssen bereits in der Klinik
durch Vorlage von Zitronensäure behandelt werden

Analyte 4
Versuch
Cs/QCs in Urin
Cs/QCs in Urin
Cs/QCs in Urin
Cs/QCs in Urin
Aufarbeitung
Tecan
Manuell
Proben+Interner Standard manuell
vorgelegt, Aufarb. Tecan
Manuell mit Plasma verdünnt
(9+1/6+1), Aufarb. Tecan
Am Tecan mit Plasma verdünnt
(6+1), Aufarb. Tecan
Ergebnis
Nicht valide
Valide
Valide
Valide
Nicht valide
Adsorptionseffekt an Tecan-Spitzen (nicht an normale Eppendorf-
Plastik-Spitzen oder Plastik-Gefäße)
manueller Zusatz von Plasma, dann Aufarbeitung am Tecan

Zusammenfassung 1
Fehlende Plasmaproteine sowie hohe Salzkonzentrationen können
Probleme machen, bspw.
- In Adsorptionseffekten resultieren
- Suppression verursachen
- Aufarbeitungsprobleme bei der SPE verursachen

Zusammenfassung 2
Auftretende Adsorptionseffekte können gelöst werden durch
- Zugabe von Säuren (HCl, Zitronensäure)
- Zugabe von organischen Lösungsmittel (für Kliniken eher nicht
geeignet)
Durch die Bearbeitung des Adsorptionseffektes können wiederum
Probleme mit der Suppression und der SPE auftreten
- Auftretende Suppression kann gelöst werden durch die Zugabe von
BSA-Lösung oder Plasma vor der Aufarbeitung
- Bei der SPE oftmals vorher neutralisieren der angesäuerten Urin
Proben notwendig. Zusätzlich die Waschschritte anpassen.
Geringere Empfindlichkeit (Suppression) wird in Kauf genommen, wenn
sicher ist, dass dann keine Adsorptionseffekte mehr da sind.
Möglichst wenig Probe aufarbeiten (10-20µL) ausreichende
Empfindlichkeit durch meist höheren Range der Standardgerade

Zusätzliche Effekte
stark schwankende Werte, nicht reproduzierbar
- Nach Reinigung des MS bis Q0 (Sciex) und Hex2 (Micromass) Werte
i.O.
mit Urine auf SPE Platte keine Validen Ergebnisse
- es gingen nur bestimmte Chargen der SPE Platten
nur bestimmte Plastikarten betroffen (Polypropylen mit Graphit)
- andere Plastikspitzen verwenden

Schlussfolgerung
→ Im Vergleich zu Plasma ist Urin die komplexere Matrix
→ Es gibt kein „Mittel der Wahl“, um diese Effekte zu lösen.
Immer eine individuelle Entwicklung notwendig.