Struktur und biologische Aktivitäten der chitinbindenden Mistellektine

Material und Methoden
2.2.4 Nachreinigung der chitinbindenden Mistellektine über RP HPLC
2.2.4.1 Nachreinigung der affinitätsgereinigten cbMLs unter gleichzeitiger Auftrennung
in die Isoformen
Das cbML-Lyophilisat aus Abschnitt 2.2.3 wird in 0.1% TFA in H2O gelöst (Konzentration: 2
mg/ml) und durch ein 0.45 µm Filter-Reaktionsgefäß filtriert. 500µl des Filtrats werden auf
eine Parcosil ProRP 300 C4-Säule (5 µm, 160 x 15 mm) injiziert. Die Trennung erfolgt unter
den folgenden Bedingungen: Eluent A = 0.1% TFA in H2O, Eluent B = 80% Acetonitril in A;
Gradient: 20% B für 5 min, dann von 20 auf 35% B in 30 min; Flussrate: 2 ml/min;
Detektionswellenlänge: 214 nm. Die manuell gesammelten Proteinfraktionen werden
lyophilisiert. Identifizierung und Reinheitskontrolle erfolgt mittels N-terminaler
Sequenzanalyse und MALDI MS.
2.2.4.2 Nachreinigung der cbMLs bei niedriger TFA-Konzentration
Das cbML-Lyophilisat aus Abschnitt 2.2.3 wird in 0.025% TFA in H2O gelöst
(Konzentration: 2 mg/ml) und durch ein 0.45 µm Filter-Reaktionsgefäß filtriert. Die Trennung
erfolgt über eine Parcosil ProRP 300 C4-Säule (5 µm, 160 x 15 mm) unter den folgenden
Bedingungen: Eluent A = 0.025% TFA in H2O, Eluent B = 80% Acetonitril in A; Gradient:
15% B für 2 min, von 15 auf 30% B in 38 min, von 30 auf 100% B in 10 min, 100% B für 5
min; Flussrate: 2 ml/min; Detektionswellenlänge: 214 nm. Da bei dieser TFA- Konzentration
keine Trennung in die einzelnen cbML-Isoformen möglich ist, werden diese gemeinsam
gesammelt und lyophilisiert. N-terminale Sequenzanalyse und MALDI MS werden wieder
zur Identifizierung und Reinheitskontrolle eingesetzt.
2.2.5 Proteinbestimmung nach Bradford
Die Proteinbestimmungen für die einzelnen Reinigungsstufen von der Herstellung des
Mistelextrakts bis zur Affinitätschromatographie zur Isolierung der chitinbindenden
Mistellektine (vgl. Abschnitt 2.2.1 bis 2.2.3) erfolgen nach Bradford [118]. Jeweils 100 µl
Probe wird mit 2 ml Bradford-Reagenz versetzt und die Absorption bei einer Wellenlänge
von 595 nm gemessen. Eine Eichgerade wird mit BSA als Standard in einer Konzentration
von 1–50 µg/100 µl erstellt. Die Probenwerte sollten innerhalb des linearen Bereichs der
Geraden liegen, ansonsten muss vorher entsprechend verdünnt werden.
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