Struktur und biologische Aktivitäten der chitinbindenden Mistellektine

Material und Methoden
2.2.8 Reduktion und Alkylierung von Cysteinresten
Für die Reduktion und S-Pyridylethylierung der cbML-Isoformen werden jeweils 2.5-3 mg
Proteinlyophilisat aus Abschnitt 2.2.4.1 in 950-980 µl 0.25 M Tris/HCl, 6 M
Guanidiniumchlorid, 1 mM EDTA, pH 8.5 gelöst. Nach Zugabe von β-Mercaptoethanol (ca.
100-fach molarer Überschuß bezogen auf die Cysteinreste) werden die Ansätze mit Stickstoff
begast und fest verschlossen 16 h bei Raumtemperatur im Dunkeln geschüttelt. Dann wird
unter Stickstoffbegasung Vinylpyridin in 100-fach molarem Überschuß, bezogen auf die
erwarteten Cysteinreste, zugegeben und die Proben weitere 4 h im Dunkeln bei
Raumtemperatur geschüttelt. Zur Entsalzung der S-pyridylethylierten Proteine werden diese
auf eine Aquapore RP 300 C8-Säule (7µm, 2.1 x 30 mm) injiziert und unter folgenden
Bedingungen eluiert: Eluent A = 0.1% TFA in H2O, Eluent B = 80% Acetonitril in A;
Gradient: 0% B für 5 min, dann von 0 auf 100% B in 10 min, 100% B für 15 min; Flussrate:
0.2 ml/min; Detektionswellenlänge: 214 nm. Die Fraktionen mit den modifizierten Proteinen
werden gesammelt und lyophilisiert.
2.2.9 Enzymatische Spaltung der alkylierten cbML-Isoformen
Je 200 µg der S-pyridylethylierten cbML-Isoformen werden in je 500 µl 25 mM Tris/HCl, 1
mM EDTA, 5% Acetonitril, pH 8.5, gelöst. Dann wird Endoproteinase LysC in einem
Enzym:Substrat-Verhältnis von 1:40 zugegeben, und die Spaltansätze werden bei 37°C 16 h
geschüttelt. Nach Abstoppen der Reaktion mit TFA erfolgt die Trennung der Fragmente
mittels RP HPLC. Dazu werden die Proben auf eine Grom-Sil 100 C18-Säule (5µm, 250 x 4.6
mm) injiziert und die Spaltpeptide unter den folgenden Bedingungen getrennt: Eluent A =
0.1% TFA in H2O, Eluent B = 80% Acetonitril in A; Gradient: 0% B für 5 min, dann von 0
auf 50% B in 50 min und von 50 auf 100% B in 10 min; Flussrate: 0.75 ml/min;
Detektionswellenlänge: 214 nm. Die Fraktionen werden manuell gesammelt und lyophilisiert.
2.2.10 Massenspektrometrie
Massenspektren werden mit einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer der Firma Shimadzu
aufgenommen [119]. Die in der Matrix eingebetteten Probenmoleküle werden über einen
fokussierten gepulsten Stickstofflaser der Wellenlänge 337 nm (Energiedichte: 10 6 -10 8
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