Isolierung und Charakterisierung des porcinen c-Fos ...

Aus dem Institut für Tierzucht und Haustiergenetik
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Isolierung und Charakterisierung des porcinen c-Fos
Protoonkogens im Hinblick auf Fleischfülle und
Merkmalantagonismus beim Schwein
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades beim
Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen
Eingereicht von
Jacqueline Heinricy
Gießen 2000

Aus dem Institut für Tierzucht und Haustiergenetik
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Betreuer: Prof. Dr. V. Dzapo
Isolierung und Charakterisierung des porcinen c-Fos Protoonkogens im
Hinblick auf Fleischfülle und Merkmalantagonismus beim Schwein
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades beim
Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen
Eingereicht von
Jacqueline Heinricy
Tierärztin aus Luxemburg
Gießen 2000

Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Dekan: Prof. Dr. M. Reinacher
1. Berichterstatter: Prof. Dr. V. Dzapo
2. Berichterstatter: Prof. Dr. A. Herzog
Tag der mündlichen Prüfung: 27. Oktober 2000

Fir meng Mamm

Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis Seite
1 EINLEITUNG........................................................................................................ 1
2 LITERATURÜBERSICHT .................................................................................... 3
2.1 Zellphysiologische Grundlagen..................................................................................... 3
2.1.1 Muskelhypertrophie und Stressanfälligkeit beim Schwein ....................................... 3
2.1.2 Muskelhypertrophie, Kalzium und Protoonkogene................................................... 5
2.1.2.1 Myogenese und Muskelwachstum ......................................................................... 6
2.1.2.2 Muskelwachstum und Protoonkogene ................................................................... 7
2.2 Das c-fos Protoonkogen ............................................................................................... 12
2.2.1 Protoonkogene......................................................................................................... 12
2.2.2 c-fos ......................................................................................................................... 14
2.2.2.1 Das Gen ................................................................................................................ 14
2.2.2.2 Regulation der Genexpression ............................................................................. 16
Transkription .................................................................................................................. 16
2.2.3 Das c-fos Protein ..................................................................................................... 19
2.2.3.1 Struktureller und funktioneller Aufbau ................................................................ 19
2.2.3.1.1 Das bZIP-Motiv.............................................................................................. 20
2.2.3.1.2 Transaktivierungs- und Transrepressionsdomäne des Fos Proteins ............... 22
2.2.3.2 Regulation der Aktivität des Proteins................................................................... 23
3. MATERIAL UND METHODIK ......................................................................... 25
3.1 Übersicht zur Versuchsanlage..................................................................................... 25
3.2 Material ......................................................................................................................... 26
3.3 Methodik ....................................................................................................................... 27
3.3.1 Isolation von DNA aus Vollblut.............................................................................. 27

Inhaltsverzeichnis II
3.3.1.1 Isolation von DNA aus Vollblut durch Aussalzen............................................... 27
3.3.1.2 Isolation von DNA aus Vollblut durch Phenol/Chloroform-Extraktion .............. 28
3.3.2 Polymerasekettenreaktion........................................................................................ 28
3.3.2.1 DNA ..................................................................................................................... 29
3.3.2.2 Primer................................................................................................................... 29
3.3.2.3 Polymerasen, Ionenmilieu und Nukleotide .......................................................... 30
3.3.2.4 Reaktion ............................................................................................................... 30
3.3.2.5 Ergebniskontrolle ................................................................................................. 31
3.3.3 Isolation eines Genes aus einer genomischen Genbank vom Schwein ................... 31
3.3.3.1 Herstellung einer spezifischen Sonde zum Screenen der Genbank ..................... 31
3.3.3.1.1 Amplifikation eines geeigneten Sequenzabschnittes des gesuchten Genes ... 31
3.3.3.1.2 Radioaktive Markierung des Amplifikats mittels der Oligo-Labeling-
Methode.......................................................................................................... 31
3.3.3.2 Screenen der Genbank.......................................................................................... 32
3.3.3.2.1 Vorbereitungen: Titrieren der Phagen, Bestimmung des Dichtewachstums.. 32
3.3.3.2.2 Ausplattieren der Genbank; Übertragen des Phagenmaterials auf
Nitrozellulosefilter.......................................................................................... 33
3.3.3.2.3 Plaque-Lift- Hybridisierung ........................................................................... 34
3.3.3.2.4 Eingrenzen der positiven Plaques................................................................... 35
3.3.3.2.5 Anlegen eines High-Titer-Stocks ................................................................... 36
3.3.3.2.6 Ergebniskontrolle............................................................................................ 37
3.3.3.2.7 Isolierung des Genmaterials aus dem High-Titer Stock................................. 37
3.3.4 Restriktionsverdaus ................................................................................................. 38
3.3.5 Southern-Blot-Hybridisierung................................................................................. 38
3.2.5.1 Southern-Transfer................................................................................................. 38
3.2.5.2 Markierung der Sonde.......................................................................................... 39
3.2.5.3 Vorhybridisierung, Hybridisierung, Exprimieren ................................................ 39
3.3.6 Präparation und Aufreinigung von DNA-Fragmenten ............................................ 40
3.3.6.1 Aufreinigung über präparative Gele..................................................................... 40

Inhaltsverzeichnis III
3.3.6.2 Aufreinigung aus flüssigen Ansätzen................................................................... 40
3.3.7 Erstellen von Plasmidklonen ................................................................................... 41
3.3.7.1 Ligation ................................................................................................................ 41
3.3.7.2 Transformation ..................................................................................................... 41
3.3.8 Präparation der Plasmid-DNA................................................................................. 42
3.3.8.1 Minipräparation.................................................................................................... 42
3.3.8.2 Plasmidmaxipräparation....................................................................................... 43
3.3.9 Sequenzierung ......................................................................................................... 43
3.3.10 Physikalische Kartierung......................................................................................... 44
4. ERGEBNISSE ................................................................................................. 46
4.1 Isolierung und Charakterisierung von c-fos.............................................................. 46
4.1.1 Isolierung von c-fos aus einer genomischen Genbank vom Schwein ..................... 46
4.1.1.1 Amplifikation eines spezifischen Genabschnittes des c-fos Genes ..................... 46
4.1.1.2 Isolierung des c-fos Genes aus der genomischen Genbank vom Schwein .......... 47
4.1.2 Kartierung von c-fos................................................................................................ 47
4.1.2.1 Kartierung des gesamten Klons............................................................................ 47
4.1.2.2 Erstellen von Sekundärklonen.............................................................................. 48
4.1.2.3 Kartierung von c-fos............................................................................................. 48
4.1.3 Komplette Nukleotidsequenz des porcinen c-fos Protoonkogens ........................... 49
4.1.3.1 Übersicht .............................................................................................................. 49
4.1.3.2 Nukleotidsequenz ................................................................................................. 52
4.1.3.2.1 Das 5´ Ende .................................................................................................... 56
4.1.3.2.2 Sekundärstrukturen......................................................................................... 57
4.1.3.3 Homologievergleich mit dem Menschen ............................................................. 59
4.1.4 Das c-Fos Protein..................................................................................................... 60
4.1.4.1 Die Aminosäuresequenz von c-Fos...................................................................... 60
4.1.4.2 Räumliche Anordnung ......................................................................................... 62

Inhaltsverzeichnis IV
4.1.4.3 Vergleich zu anderen Spezies .............................................................................. 64
4.2 Chromosomale Lokalisation von c-fos ....................................................................... 67
4.3 Sequenzunterschiede des c-fos Genes bei Schweinen unterschiedlicher Rasse
und Konstitution........................................................................................................... 68
4.3.1 Sequenzinformationen bei Pietrain und Meishan.................................................... 68
4.3.2 Homologievergleiche zwischen Pietrain ( P ) und Meishan ( M ) .......................... 70
4.3.2.1 Nukleotidsequenz ................................................................................................. 70
4.3.2.2 Aminosäurensequenz ........................................................................................... 72
4.3.3 Weitergehende Analyse der gefundenen Mutationen.............................................. 74
4.3.3.1 Etablierunng von PCR/Restriktionssystemen zur RFLP-Analyse ....................... 74
4.3.3.1.1 Kartierung der entsprechenden Sequenzabschnitte ........................................ 75
4.3.3.1.2 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen................................................. 76
5 DISKUSSION ..................................................................................................... 79
6 ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................................... 87
7 SUMMARY ......................................................................................................... 89
8. LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................ 91

Verzeichnis der Tabellen V
VERZEICHNIS DER TABELLEN
Tab.1: Virale und zelluläre Onkogene und ihre Produkte 13
Tab.2: Übersicht über die Herkunft der untersuchten Tiere 26
Tab.3: Übersicht über die eingesetzten Primer zur Sequenzanalyse 51
Tab.4: Regulatorische Elemente im SRE-Bereich des c-fos Genes 56
Tab.5: Prozentualer Anteil der einzelnen Basen an der c-DNA von c-fos 60
Tab.6: Anzahl der benutzten Kodons für die Translation von c-Fos 62
Tab.7: Übereinstimmung und Differenz der Aminosäurenzusammensetzung von
Fos bei Schwein, Mensch, Maus und Huhn 64
Tab.8: Häufigkeit der Austausche zwischen den einzelnen Aminosäuren 66
Tab.9: Eckdaten des c-Fos Proteins von Schwein, Mensch, Maus und Huhn 67
Tab.10: Wahrscheinlichkeiten und Korrelationen zur Lokalisation der chromosomalen
Region vom c-fos Gen des Schweines 67
Tab.11: Primerkombinationen zur Amplifikation verschiedener Bereiche des c-fos
Protoonkogens aus genomischer DNA unterschiedlicher Schweinerassen 68
Tab.12: Primersequenzen, Tm ( Schmelzpunkt ) und Annealingtemperatur 69
Tab.13: Lokalisation und Ausprägung der Basenaustausche des c-fos Genes bei
Pietrain ( P ) und Meishan ( M ) im Vergleich zur Genbank ( G ) 71
Tab.14: Verschiedene Parameter des c-fos Proteins bei unterschiedlichen
Rassen 74
Tab.15: Synthenie zwischen Chromosom 7 des Schweines und den entsprechenden
Chromosomen beim Menschen 82

Verzeichnis der Abbildungen VI
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN
Abb.1: Zellphysiologische und molekularbiologische Zusammenhänge der c-fos-
Beteiligung an der Entstehung von Muskelzellhypertrophie 11
Abb.2: Schema von v-fos und c-fos 14
Abb.3: Grundstruktur von c-fos 15
Abb.4: Funktionelle Domäne von Fos 19
Abb.5: Sekundärstruktur des Fos-Proteins 21
Abb.6: Aufbau von AP 1 22
Abb.7: Übersicht der Versuchsdurchführung 25
Abb.8: PCR-Bedingungen 30
Abb.9: Retsriktionskarte des isolierten Inserts 47
Abb.10 Lokalisation der markierten Bereiche im Insert 48
Abb.11 Restriktionskarte des porcinen c-fos Protoonkogens 49
Abb.12 Klonierungsstrategie für c-fos aus einem 11Kbp Lamda-FixII Fragment 49
Abb.13: Nukleotidsequenz des porcinen c-fos protoonkogens 54
Abb.14: Schema des porcinen c-fos Protoonkogens mit Exon- und Intronbereichen 54
Abb.15: Serum Response Element von Schwein, Mensch und Maus 56
Abb.16: Calcium Response Element von Schwein, Maus und Mensch 57
Abb.17: Hairpin-Loops im Bereich Intron 1, 2 und Exon 4 58
Abb.18: Homologie zwischen Schwein und Mensch 59
Abb.19: Aminosäurensequenz vom porcinen und humanen c-Fos 61
Abb.20: Räumliche Anordnung des Fos-Proteins 63
Abb.21: Lokalisation der einzelnen Amonosäurenaustausche bei Mensch ( 2.Zeile ),
Maus ( 3.Zeile ) und Huhn ( 4.Zeile ) im Vergleich zum Schwein( 1.Zeile ) 65
Abb.22: PCR-Bedingungen für die Amplifikation definierter Sequenzabschnitte bei
Pietrain und Meishan 69
Abb.23 Überblick über die Lokalisation der zur Sequenzierung gelangten
Amplifikate 70
Abb.24: Proteinsequenz von c-fos der Rassen Pietrain und Meishan im Vergleich zur
aus der Genbank abgeleiteten Sequenz 73
Abb.25: Restriktionsschnittstellen von AluI und TaqI in Poly 9 bei Pietrain
und Meishan 75
Abb.26: Restriktionsschnittstellen von TaiI bei Pietrain und Meishan 76
Abb.27: Darstellung der gefundenen RFLP´s 77

Verzeichnis der Abkürzungen VII
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN
3´ 3-prime ( zur OH-Gruppe hin, strangabwärts )
5´ 5-prime ( zur Phosphatgruppe hin, strangaufwärts )
As Aminosäure
bp Basenpaare
c-fos c-fos Gen
c-Fos c-Fos Protein
CRE cAMP-response-element
DSE dyad-symmetry-element
EGF epidermal growth factor
FIRE fos intragenic response element
kbp 1000 Basenpaare
LTR long terminal repeat
M Meishan
MHS Malignes Hyperthermie-Syndrom
NGF nerve growth factor
P Pietrain
PCR polymerase chain reaction
PDGF plateled derived growth factor
QTL quantitative trait loci
RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
SRE serum-response-element
SRF serum-response-factor
UTR untranslated region

Einleitung 1
1 Einleitung
Die Entwicklung der Schweinezucht in den letzten vierzig Jahren war vor allem durch ein
Hauptziel gekennzeichnet, die Selektion auf Fleischfülle. Tierproduzenten wie auch
Verbraucher wünschten Tiere mit guter Fleischleistung und niedrigem Fettgehalt.
Durch die gezielte Einkreuzung fleischbetonter Rassen wie vor allem Pietrain konnten große
Fortschritte hinsichtlich der Muskelmasse erzielt, und die Fleischproduktion an den Markt
angepasst werden. Der Wandel vom früheren fettreichen Mehrzweckschwein zum relativ
mageren Fleischschwein erfolgte rasch. Das moderne Mastschwein liefert einen
Schlachtkörper mit hohem Schinkenanteil und ausgeprägter Rückenmuskel- und
Kotelettfläche sowie einem sehr geringen Fettanteil.
Die Nachteile dieser Entwicklung wurden nach und nach offensichtlich und äußern sich
einerseits in einer Verschlechterung der Konstitution, was sich durch erhöhte
Stressanfälligkeit und verminderte Fruchtbarkeit manifestiert, andererseits in einer
Verminderung der Fleischbeschaffenheit, gekennzeichnet durch Myopathien. Das Porcine
Stress Syndrom ist ein etablierter Begriff, man versteht darunter Auswirkungen einer erhöhten
Stressanfälligkeit eines Teils der Fleischschweinepopulation, verbunden mit Problemen auf
dem Gebiet der Fleischqualität ( SMIDT et al., 1988 ). In den Zuchtpopulationen moderner
Fleischschweine dominieren drei Antagonismen, die alle als Folge der dramatischen
Zuchtfortschritte in Fleischanteil und Bemuskelung anzusehen sind: zum ersten die hohe
Stressanfälligkeit und schlechte Fleischbeschaffenheit, dann sinkende Aufzuchtleistungen und
schließlich vermehrte Beinschwächeprobleme ( GLODEK, 1988 ).
Das Ziel der modernen Schweinezucht ist eine Verbesserung der Konstitution und der
Fleischbeschaffenheit bei gleichzeitiger Erhaltung der Fleischfülle. Dieses kann nur durch
eine Aufklärung der genetischen Zusammenhänge erreicht werden. Wie in anderen Bereichen
der Tierzucht ist hier vor allem auch die Molekularbiologie gefordert.
Mit der Darstellung des Halothangens ( BRENIG und BREHM, 1992 ) konnte ein Teil des
Porcinen Stress Syndromes molekulargenetisch aufgeklärt, und ein eindeutiger
Zusammenhang zwischen Muskelstoffwechselentgleisung und Kalziumregulation festgestellt
werden. Bei den betroffenen stressanfälligen Tieren kommt es durch eine Mutation am MHS-
Gen zu einem Defekt am Ryanodinrezeptor der Kalziumkanäle und somit zu einem erhöhten
intrazellulären Kalziumspiegel in den betroffenen Muskelzellen.
Bisher fehlen jedoch Ansätze zur Aufklärung der Zusammenhänge zwischen
Muskelstoffwechselentgleisung und der Hypertrophie der betroffenen Zellen.

Einleitung 2
Der Zusammenhang zwischen Muskelzellhypertrophie und Stressanfälligkeit einerseits,
zwischen Sressanfälligkeit und Kalziumregulationsstörung andererseits, führten zu der
Hypothese eines Zusammenhanges zwischen Kaziumregulationsstörung und
Muskelzellhypertrophie ( REINER, 1993 ).
Der Identifizierung von Einzelgenen mit Effekten auf die Regulation von muskelspezifischen
Strukturgenen kommt eine große Bedeutung zu. Verschiedenen Untersuchungen zufolge
spielen die Produkte einiger Protoonkogene in Form von Transkriptionsfaktoren bei dieser
Regulation eine entscheidende Rolle. Als Kandidaten kommen hier die Protoonkogene c-fos
und c-myc in Frage, die erwiesenermaßen in Zusammenhang mit Muskelhypertrophie stehen.
Diese Gene sind in der Lage, extrazelluläre Reize in zellspezifische Antworten umzusetzen.
Neuere Untersuchungen an Skelettmuskulatur ( WHITELAW, HESKETH, 1992;
OSBALDESTON, LEE, 1995; DAWES et al., 1996; PUNTSCHART et al., 1998 ) oder
Herzmuskulatur ( SADOSHIMA, IZUMO, 1993; KOLBECK, HORBAN, 1993; GREEN et
al., 1997; HORBAN, KOLBECK, 1997; ZIMMER, 1997; MEGHJI et al., 1997 ) deuten auf
eine entscheidende Rolle dieser Protoonkogene bei der Entstehung von
Muskelzellhypertrophie hin. Das Vorhandensein von cAMP regulierten Elementen im
Promotor dieser Gene ( FISCH et al., 1989; HARTIG et al., 1991 ) lassen zudem eine
Verbindung zu den erhöhten Kalziumspiegeln in den betroffenen Zellen vermuten.
Untersuchungen am c-fos Promotor deuten auf eine direkte Rolle von Kalzium bei der
Regulation dieses Protoonkogens hin ( SHENG et al., 1988 ).
Das c-fos Protoonkogen könnte somit in seiner Rolle als Transkriptionsfaktor ein wichtiges
Zwischenglied bei der Aufklärung der aufgezeigten Zusammenhänge darstellen.
In dieser Arbeit soll, auch im Hinblick auf die Vervollständigung der Genomanalyse beim
Schwein, das porcine c-fos Gen charakterisiert und sequenziert werden. Dabei wird auf
Homologieunterschiede zu anderen Spezies geachtet.
In einem zweiten Schritt soll dann nach eventuell vorhandenen Sequenzunterschieden
zwischen den in Konstitution und Bemuskelungsgrad sehr differierenden Rassen Pietrain und
Meishan gesucht werden.

2 Literaturübersicht 3
2 Literaturübersicht
2.1 Zellphysiologische Grundlagen
2.1.1 Muskelhypertrophie und Stressanfälligkeit beim Schwein
Die gezielte Entwicklung der Schweinezucht hat in den letzten Jahrzehnten eine wesentliche
Verbesserung der Wachstumsraten, Futterverwertung, sowie des Fleisch-Fettverhältnisses der
Mastschweine hevorgebracht. Die genetische Selektion von Schweinen mit größerem
Muskelbildungsvermögen und geringerem Potential des Fettansatzes wurde über einen langen
Zeitraum praktiziert. Durch diesen Selektionsdruck erfolgte der Wandel zum mageren,
muskelbetonten Schwein ( POWELL und ABERLE, 1975 ).
Jedoch hat die einseitige Selektion auf Fleischfülle auch Negativentwicklungen wie das
Problem des Porcinen Stress Syndroms begünstigt, das vor allem bei Schweinen mit extremer
Muskelhypertrophie auftritt. Schon in den sechziger Jahren wurde ein Zusammenhang
zwischen dem Auftreten von PSE-Fleisch ( pale, soft, exsudative ) und einer verminderten
Hitzetoleranz der Tiere erkannt und als Stressanfälligkeit bezeichnet ( JUDGE et al., 1966;
FORREST et al., 1968 ). TOPEL et al.( 1968 ) beobachteten plötzliche Todesfälle bei
Stressfaktoren ausgesetzten Schweinen und bezeichneten das Phänomen als Porcines Stress
Syndrom.
Dieses beim Menschen als Maligne Hyperthermie bekannte Krankheitsbild ist gekennzeichnet
durch eine Entgleisung des Muskelstoffwechsels infolge verschiedener Stressfaktoren. Die
Folgen beim Schwein sind Myopathien mit einer deutlichen Reduzierung der Fleischqualität
in Form von PSE-Fleisch, bis hin zu Tierverlusten infolge cardiogenem Schock.
Die Mechanismen die zu diesem Krankheitsbild führen sind inzwischen gut erforscht. Als
Auslöser wird eine Störung der Kalziumregulation der betroffenen Zellen angesehen
( MICKELSON et al., 1987; NELSON, 1988 ), ausgelöst durch einen Defekt des
Skelettmuskel-Ryanodin-Rezeptors ( CARRIER et al., 1991; FILL et al., 1991; GALLANT
und LENZ, 1992, MC LENNAN und PHILLIPS, 1992 ). Es kommt zu einem erhöhten
Kalzium-Ausstrom aus den terminalen Zisternen des sarkoplasmatischen Retikulums in das
Myoplasma. Defekte Ryanodin-Rezeptoren öffnen sich bei niedrigeren Konzentrationen von
Aktivatoren und bleiben länger geöffnet als intakte Rezeptoren. Die Ca/Mg-ATPase ist nicht
mehr in der Lage das Kalzium schnell genug in das sarkoplasmatische Retikulum
zurückzupumpen, und so kommt es zu erhöhten Kalziumspiegeln in den betroffenen

2 Literaturübersicht 4
Muskelzellen. Der erhöhte cytoplasmatische Kalziumspiegel greift regulierend in
verschiedene Stoffwechselwege ein. Es kommt zu einer anhaltenden Muskelkontraktur mit
gesteigerter Wärmeproduktion. In den Muskelfasern TypIIb, in denen Energie hauptsächlich
durch anaerobe Glykolyse gewonnen wird, kommt es zu einer erhöhten Laktatproduktion die
zur metabolischen Azidose mit allen bekannten Folgen führen kann ( BRENIG, 1992 ). Die
Schädigung der Muskelfasern führt zu einer erheblichen Verschlechterung der Fleischqualität
bei den betroffenen Tieren und somit zu wirtschaftlichen Verlusten.
Die Aufklärung des molekularen Defektes am Ryanodinrezeptor des sarkoplasmatisch-
retikulären Kalziumkanals ( FUJII et al., 1991) stellt den aktuellen Stand der Erforschung des
Merkmalantagonismus zwischen Muskelfülle und Stressresistenz beim Schwein dar.
Diese autosomal rezessiv vererbte Punktmutation im Skelettmuskel-Ryanodin-Rezeptor-Gen
des Kalziumkanals wird beim Schwein bisher als alleiniger Auslöser des beschriebenen
Krankheitsbildes angesehen ( BRENIG und BREHM, 1992; OTSU et al., 1991 ). Auch beim
Menschen wird die Mutation am Ryanodinrezeptor für das mit einer
Kalziumregulationsstörung einhergehende Krankheitsbild der Malignen Hyperthermie
verantwortlich gemacht ( MC LENNAN et al., 1990).
Betroffen sind ausschließlich homozygote Träger des Defektes, wobei es sich ohne Ausnahme
um Tiere mit ausgeprägter Muskelmasse handelt. Dem auch als Halothangen angesprochenen
Gen wird daher eine wichtige Rolle bei der Enstehung von Muskelhypertrophie zugeschrieben
( OLLIVIER,1982; WITTMANN et al., 1993 ). Jedoch fehlen bis jetzt Ansätze zur genauen
Klärung der Zusammenhänge zwischen Kalziumregulationsstörung und Stressanfälligkeit auf
der einen, und Fleischfülle auf der anderen Seite. Eine wichtige Rolle wird hier dem Kalzium
als second-messenger zugeschrieben, da es durch den besagten Defekt zu erhöhten
Kalziumspiegeln in den Muskelzellen kommt ( REINER, 1993 ).

2 Literaturübersicht 5
2.1.2 Muskelhypertrophie, Kalzium und Protoonkogene
Wie das Muskelwachstum beim Schwein unter dem Einfluß des Halothangens und anderer
Gene ausgelöst wird ist bislang ungeklärt. Aufgrund der hohen Bedeutung dieser Frage für die
Schweinezucht gibt es vielfache Ansätze zur Aufklärung der zugrunde liegenden
zellphysiologischen und genetischen Hintergründe.
Der Frage nach dem Verständnis der genetischen Grundlagen für die Entstehung der seit
Jahrzehnten selektierten Muskelhypertrophie verschiedener Schweinerassen kommt eine
tragende Bedeutung für die moderne Schweinezucht zu.
Die bisherigen Untersuchungen konzentrieren sich vor allem auf die Rolle des Halothangens
und die Identifikation verschiedener QTL´s für spezifische Merkmale wie Muskelwachstum
und Fettansatz. Nach und nach werden auch andere Gene mit eventuellen Einflüssen auf die
o.g. Merkmale charakterisiert.
Dem Halothangen wird verschiedenen Untersuchungen zufolge einen Einfluß auf
Muskelwachstum und Fettansatz zugeschrieben. ZHANG et al. ( 1992 ) fanden signifikante
Unterschiede zwischen Halothan-positiven ( Genotyp nn ) und Halothan-negativen ( Genotyp
Nn ) Tieren hinsichtlich der intramuskulären Fettkonzentration, der Fleischbeschaffenheit und
des Muskelwachstums. Dabei zeigten die Halothan-positiven Tiere bei besserem
Muskelwachstum und geringerem Fettanteil vor allem Einbußen in der Fleischqualität.
Weitere Untersuchungen betreffend der Wachstumsleistung, Schlachtkörpercharakteristiken
und der Fleischqualität zwischen Halothan-Trägern ( Nn ) und Halothan-negativen ( NN )
Tieren wurden von LEACH et al. ( 1996 ) durchgeführt. Hier zeigten sich Vorteile für die
Trägertiere hinsichtlich der Futterverwertung, des Magefleischanteils und des gesamten
Muskelanteils. Diese Tiere zeigten jedoch auch einen höheren Anteil an PSE-Fleisch.
Das ausgeprägte Muskelwachstum verschiedener Schweinerassen kann jedoch, obwohl eine
direkte Korrelation zwischen den verschiedenen Genotypen und etlichen Leistungsmerkmalen
besteht, nicht alleine durch das Halothangen erklärt werden. Der genetischen Aufklärung der
Zusammenhänge in Form einer Identifikation weiterer beteiligter Gene und Genloci kommt
somit eine wichtige Rolle zu. Hierbei spielt sowohl die Identifikation von relevanten QTL´s
als auch die Charakterisierung von Einzelgenen eine große Rolle.
ANDERSSON et al. ( 1994 ) konnten QTL´s für Wachstum und Fettansatz auf dem
Chromosom 4 von Wildschwein x Large-White Kreuzungstieren lokalisieren, welche auch bei
Meishan x Large-White Kreuzungstieren identifiziert wurden ( WALLING et al., 1998 ).

2 Literaturübersicht 6
Diese Ergebnisse wurden 1999 von MARKLUND et al. unterstrichen, wobei auf Chromosom
4 hier auch signifikante QTL-Effekte für Fettansatz, Schlachtkörperlänge und Wachstum
gefunden wurden. Auch Chromosom 7 wird mit QTL´s für Wachstum und verschiedene
Schlachtkörpermerkmale in Verbindung gebracht ( WANG et al., 1998 ). ROHRER et al.
( 1998 ) untersuchten Meishan x White Kreuzungstiere und fanden verschiedene relevante
Regionen für QTL´s betreffend verschiedener Schlachtkörpermerkmale wie Muskelmasse und
Fettansatz auf den Chromosomen 1, 5, 7, 8, 9, 10, 13 und 14.
Es handelt sich also bei den angesprochenen Merkmalen um multifaktorelle Geschehen, deren
Aufklärung nicht allein durch die Lokalisierung von QTL´s sondern auch durch die
Identifikation und Charakterisierung von eventuell beteiligten Einzelgenen vorangetrieben
werden kann. So untersuchten TE PAS et al. ( 1999 ) den Einfluß verschiedener homozygoter
Myogenin-Genotypen auf Geburtsgewicht, Wachstumsrate und Muskelmasse und konnten
signifikante Unterschiede feststellen.
2.1.2.1 Myogenese und Muskelwachstum
Die Neubildung von Muskelfasern, Myogenese, erfolgt ausschließlich während der
Embryonalphase unter der Kontrolle der MyoD Genfamilie bestehend aus Myogenin,
MyoD1, myf-5 und myf-6 ( TE PAS et al., 1999 ).
Die Myogenese ist durch die Fusion undifferenzierter Myoblasten gekennzeichnet, die dann
zum vielkernigen Myotubus differenzieren. Während dieser Periode erfolgt eine Umschaltung
von den Zellzyklus regulierenden Genen auf muskelspezifische Gene ( WHITELAW und
HESKETH, 1992 ). Das Wachstum der Muskelzellen erfolgt durch proliferative Vorgänge in
Form von Hyperplasie die mit der Geburt abgeschlossen sind ( GOLDSPINK, 1972 ).
Eine spätere Zunahme der Muskelmasse in Form von Hypertrophie entspricht einer reinen
Massenzunahme des einzelnen Myotubus ohne Kernteilung. Histologisch handelt es sich bei
der Hypertrophie der Muskelzellen um eine Vermehrung der weißen TypIIb-Fasern
gekennzeichnet durch die Expression embryonaler Isoenzyme des Myosins ( BREUER,
1990 ), d.h. bestimmter Strukturproteine. Es kommt zu einem Wachstum der einzelnen
Muskelzellen in Form einer vermehrten Expression dieser Strukturproteine. Ist ein bestimmter
Zelldurchmesser erreicht kommt es unweigerlich zum Aufspleissen der einzelnen Myotuben
ohne Kernteilung. Welche Zusammenhänge und Signale im Einzelnen zu dieser
Massenzunahme führen, ist noch weitestgehend ungeklärt. Es handelt sich um eine
langfristige Anpassung der Muskulatur an bestimmte Reize.

2 Literaturübersicht 7
2.1.2.2 Muskelwachstum und Protoonkogene
Generell gibt es in der Zelle bestimmte Signalübermittlungswege die, ausgelöst durch
extrazelluläre Stimuli, spezielle Zellreaktionen auslösen. Durch die Bindung bestimmter
Liganden an Zellrezeptoren werden second-messenger Systeme aktiviert, die einerseits gleich
eine kurzfristige Zellantwort auslösen können oder aber im Zellkern zur Aktivierung von
sogenannten Early Response Genen führen ( CURRAN, 1985 ). Diese auch als Immediate
Early Genes bezeichneten Gene stellen die erste Genantwort der Zelle auf den Reiz dar und
exprimieren Transkriptionsfaktoren, die dann über die Aktivierung der Zielgene zur späten
langfristigen Zellantwort führen ( VOGT et al., 1990 ) ( siehe Abb. 1 ).
Die einzelnen Muskelfasern reagieren auf unterschiedliche Aktivierungsmechanismen: Über
an der motorischen Endplatte der Nervenendigungen ankommende Signale entstehen
Aktionspotentiale die sich über die Plasmamembran als Depolarisierung der Zellmembran
entlang der T-Tubuli ins Zellinnere fortsetzen. Diese Signalkaskade wird dann am retikulären
sarkoplasmatischen Retikulum durch eine Freisetzung von Kalzium aus den Kalziumkanälen
fortgeführt. Dadurch steigt der Kalziumspiegel im Sarkoplasma von 10 -8 auf 10 -3 , was eine
Schwelle zur Kontraktion bestimmter Proteine sowie eine Aktivierung verschiedener Enzyme
und second-messenger Systeme bewirkt. Die benötigte Energie wird durch Glykolyse
bereitgestellt. Hier scheinen auch Adrenalin und andere ß-Sympathomimetika eine Rolle zu
spielen. Sie aktivieren an der Zelloberfläche befindliche ß-Rezeptoren, was zu einem Anstieg
von cAMP und schließlich zur Aktivierung verschiedener am Glykogenabbau und an der
Lipolyse beteiligter Enzyme führt ( CARAFOLI und PENNISTON, 1986 ). Die anabole
Wirkung der ß-Sympathomimetika scheint dabei sowohl über eine Steigerung der
Proteinbiosynthese als auch über eine Hemmung des Proteinabbaus erreicht zu werden
( MACRAE et al., 1988 ).
Kalzium und cyclo-AMP sind ubiquitäre Botenstoffe der Zellen die in verschiedenste
Regelmechanismen eingreifen. Es gibt einige Hinweise auf eine bedeutende Rolle dieser
second-messenger bei der Enstehung der Muskelzellhypertrophie durch langfristige
Anpassung an bestimmte Reize. Dazu gehören die bereits erwähnten erhöhten Kalziumspiegel
in den betroffenen hypertrophierten Zellen ebenso wie eine erhöhte Dichte von ß-Rezeptoren
an deren Zelloberfläche. ß-Agonisten führen beim Schwein zu einem deutlichen Anstieg des
Faserdurchmessers der TypIIb-Fasern ( OKSBJERG et al., 1989 ).
Ein deutlicher Zusammenhang zwischen der Aktivierung von ß-Rezeptoren und der
Stimulation von c-fos ist an corticotropen Zellen nachgewiesen, wo es über die Aktivierung

2 Literaturübersicht 8
der Proteinkinase A und das CREB zur Induktion von c-fos kommt ( BOUTILLIER et al.,
1992 ). Auch die Proteinkinase C bewirkt eine Induktion von c-fos in ruhenden Fibroblasten
( GAUTHIER-ROUVIERE et al., 1992 ).
Bei der weiteren Übermittlung der Signale an den Zellkern scheint dem cAMP-Response-
Element-Bindungsprotein ( CREB ) eine Schlüsselrolle zuzukommen. Es gibt deutliche
Hinweise auf eine Mittlerrolle von CREB zwischen second-messenger und Zellwachstum an
exzitatorischen Zellen ( SHENG et al., 1991 ). CREB ist ein Transkriptionsfaktor der durch
verschiedene second-messenger wie Kalzium und Calmodulin ( MORGAN und CURRAN,
1986; SCHONTHAL et al., 1991 ), cyclo-AMP und der membranständigen Proteinkinase C
mit dem Phosphatidyl-Inositol-Triphosphat-Zyklus aktiviert wird. Es kommt dabei zu
Synergien zwischen den einzelnen Systemen ( MEHMET und ROZENGURT, 1991 ).
CREB wird so zu einer zentralen Sammelstelle bei der Übertragung von extrazellulären
Reizen zum Zellkern. Im Herzmuskel konnte CREB als Bindeglied zwischen adrenergen
Signalen und Muskelhypertrophie nachgewiesen werden ( KNOELL et al., 1994 ). CREB ist
ein universeller Transkriptionsfaktor der im Zellkern die Expression von c-fos und anderen
Protoonkogenen veranlaßt ( EVAN, 1991). Hierauf deutet auch die im Promotor von c-fos
vorhandene Bindungsstelle für CREB, CRE ( Calcium Response Element ), hin. Die
Induktion des c-fos Protoonkogens erfolgt somit durch erhöhte Spiegel von cAMP in der
Zelle und leitet dann Zellwachstums- und Zelldifferenzierungsmechanismen ein ( SASSONE-
CORSI et al., 1988 ).
Es deutet vieles darauf hin, daß die zur Hypertrophie führende Zielantwort im Zellkern ganz
eng mit der Expression von Early Response Genen wie c-fos oder c-myc gekoppelt ist, wobei
Kalzium und cAMP über CREB als second-messenger fungieren ( REINER, 1993 ). Die
Membrandepolarisation aktiviert die frühen Gene c-fos und jun-B ( BARTEL et al., 1989 ).
Versuche an stimulierten Rattenherzen haben ergeben, daß die gesteigerte Expression von c-
fos mit einem erhöhten cAMP- und Proteinkinase A-Spiegel, sowie mit einem erhöhten
Proteinkinase C-Spiegel einhergeht ( OSAKI et al., 1997 ). Dies spricht für eine hypothetische
Kalzium-CREB-FOS/MYC-Hypertrophie-Achse ( REINER, 1993) wie in Abbildung 1
dargestellt.
Die molekularbiologische Antwort von Muskelzellen auf verschiedene Stressfaktoren scheint
eng mit der Expression von Immediate Early Genes verbunden zu sein. Dies zeigen auch
Versuche an einer zeitweisen Ischämie ausgesetzten Schweineherzen, infolgedessen es zu

2 Literaturübersicht 9
einer starken Steigerung der Expression von c-fos und anderen Protoonkogenen kommt
( BRAND et al., 1992 ).
Die vermehrte Laktatproduktion sowie die Erhöhung der Kalziumionen in den betroffenen
Zellen ( HAMMOND et al., 1982 ) scheinen in einem kausalen Zusammenhang zur
Transkription der Protoonkogene zu stehen ( BRAND et al., 1992 ).
Etliche Forschungsergebnisse zeigen, daß die Hypertrophie von Skelett- und
Herzmuskelzellen eng mit der Expression von c-fos und c-myc korreliert ist.
Untersuchungen an verschiedenen Hühnerrassen haben ergeben, daß c-fos und c-myc vor
allem im Skelettmuskelgewebe von schnellwachsenden hypertrophen Broilerrassen exprimiert
werden ( KIM et al., 1992 ).
Bei der induzierten Skelettmuskelhypertrophie der Ratte wurden erhöhte m-RNA-Spiegel von
c-fos und c-myc gefunden ( WHITELAW und HESKETH, 1992 ).
Auch die mechanische Stimulation der latissimus dorsi-Muskulatur des Kaninchens ergibt
einen deutlichen Anstieg der Early Response Gene c-fos und c-jun ( DAWES et al., 1996 ).
Der temporäre Ablauf der c-fos Expression in mechanisch stimulierten Rückenmuskeln des
Kaninchens zeigt einen deutlichen Peak 60 Minuten nach Stimulation. Es handelt sich also
um eine erste Antwort der Zelle auf diesen Reiz und stellt wahrscheinlich einen wichtigen
Teilschritt auf dem Weg zur Hypertrophie dar ( OSBALDESTON et al., 1995 ).
Weitere Hinweise auf eine entscheidende Rolle von Protoonkogenen bei der Entstehung der
Muskelhypertrophie gibt es vor allem im Bereich der Humanmedizin.
Es wird angenommen, daß die Induktion von c-fos und anderen Protoonkogenen eine
wichtige Rolle bei der Regulation muskelspezifischer Gene spielt. Diese werden auch in der
menschlichen Skelettmuskulatur nach Stimulation durch Training exprimiert
( PUNTSCHART et al., 1998).
Des weiteren gibt es Versuche an transgenen Mäusen die den direkten Einfluß von dem
Protoonkogen c-ski am Muskelwachstum zeigen. Die betroffenen Mäuse zeigen ein sehr viel
stärkeres Muskelwachstum als die Vergleichsgruppen ( SUTRAVE et al., 1990).
Auch auf dem Gebiet der Kardiologie gibt es deutliche Hinweise auf eine Rolle der
Protoonkogene bei der Entstehung der Herzmuskelhypertrophie.
Die Stimulation von isolierten Herzmuskelzellen mit Angiotensin II führt über die Expression
von c-fos zur Hypertrophie, wobei die Phopholipase C und die Proteinkinase C eine

2 Literaturübersicht 10
entscheidende Rolle spielen. Das Vorhandensein von Kalzium scheint dabei ein wichtiger
Faktor zu sein
( SADOSHIMA, IZUMO, 1993 ). Bei Versuchen an in-situ Schweineherzen die einer
chronischen Überbeanspruchung durch erhöhte Blutzufuhr ausgesetzt waren kam es zu einer
gesteigerten Expression von c-fos und c-myc in den betroffenen hypertrophen Arealen
( MEGHJI et al., 1997 ).
Ein deutlicher Anstieg der c-fos Expression wurde auch bei der mit hypertrophem
Muskelwachstum einhergehenden Reperaturphase des Myokards nach einem Infarkt
gemessen ( GIDH-JAIN et al., 1998 ).
Die Stimulation isolierter Rattenherzen durch Norepinephrin und Überdruck führt zu einer
vermehrten Expression von c-fos und von c-myc ( HORBAN et al., 1997 ) genau wie die
alpha- und beta-adrenerge Stimulation alleine ( ZIMMER,1997 ).
Durch adrenerge Stimulation wird in Herzmuskelzellen eine vermehrte Expression von alpha-
actin Genen ausgelöst die mit der Hypertrophie der betroffenen Zellen einhergeht. Dabei
scheinen Fos und Jun als Transkriptionsfaktor AP1 eine entscheidende Rolle zu spielen.
Obwohl im Promotor des alpha-actin Gens keine AP1-Bindungsstelle vorhanden ist, kommt
es zu einer Transaktivierung dieses Gens durch Fos und Jun in Herzmuskelzellen
( BISOPHRIC et al., 1991 ). Diese beiden Protoonkogene werden als erste Antwort der Zelle
auf den Stimulus gebildet und beeinflussen dann die zur Hypertrophie führende Expression
bestimmter Proteine ( BISOPHRIC et al., 1992 ).
Somit ist ein entscheidender Einfluß von c-fos und anderen Early Response Genen wie auch
c-myc bei der Entstehung von Muskelzellhypertrophie, wie hier mehrfach beschrieben, sehr
wahrscheinlich. Daß die Expression dieser Transkriptionsfaktoren eng mit den second-
messengern Kalzium und verschiedenen Proteinkinasen gekoppelt ist gilt als gesichert. Die
physiologischen Begebenheiten im Cytoplasma der hypertrophen Muskelzellen von
frohwüchsigen Schweinen deuten auch hier auf eine wichtige Rolle dieser Protoonkogene hin.
Einen ersten Schritt zur Aufklärung dieser Rolle ist von REINER ( 1999 ) durch die
Charakterisierung des c-myc Genes bei Schweinen unterschiedlicher Konstitution mit
anschließenden Assoziationsstudien zwischen unterschiedlichen c-myc Genotypen und
verschiedenen Leistungsmerkmalen gemacht worden. Hier konnte eine modulierende
Wirkung des c-myc-Genotyps auf das MHS-Gen in den Merkmalsbereichen
Schlachtkörperverfettung und Fleischfülle gezeigt werden.

2 Literaturübersicht 11
Die Sequenzierung des porcinen c-fos Protoonkogens und die anschließende Suche nach
Polymorphismen zwischen den Extremrassen Pietrain und Meishan ist ein weiterer Schritt zur
Aufklärung dieser Phänomene.
E xtrazell.S timu li
nerv. R eiz C lenbuterol
m ot.E P ß-R ez.
Ach ⇓
C a-F reisetzung Aden ylat-cyclase
aus SR
⇓
⇓ cAM P + + +
C a-C almodulin
⇓
⇓ P roteinkinase A
C aM kinase
In trazell. S ign alü
b erm ittlu n g
C R E B
⇓
P hospho-CR E B
⇓
P R O TO O N KO GE N E
S ign alan twort im c-fos, c-m yc
K ern ⇓
Transkriptionsfaktoren
( F os-, M yc-P rotein )
⇓
Aktivierung d er
Strukturgene
⇓
HY P E R TR O P H IE
Abb. 1: Zellphysiologische und molekularbiologische Zusammenhänge der c-fos-
Beteiligung an der Entstehung von Muskelzellhypertrophie ( Schematische
Zusammenfassung verschiedener Literaturangaben ).

2 Literaturübersicht 12
2.2 Das c-fos Protoonkogen
2.2.1 Protoonkogene
Die Entdeckung der Protoonkogene basiert auf der Erforschung der Retroviren , die schon um
1910 mit der Induktion von Tumoren infolge Übertragung zellfreier Extrakte aus
Tumorgewebe auf Hühner durch ROUS, ELLERMANN und BANG ihren Anfang hatte.
Diese Viren haben zelltransformierende Eigenschaften ( BISHOP, 1978, 1981; BISHOP und
VARMUS, 1982 ), die auf bestimmten im Virusgenom integrierten Nucleotidsequenzen ( v-
onc ) basieren. Es sind inzwischen eine Vielzahl von v-onc Sequenzen enthaltende Retroviren
bei einer Reihe von Spezies entdeckt worden ( BISHOP, 1982 ). Die Onkogensequenzen sind
von den RNA-Viren aus dem Säugetiergenom integriert worden und sind verantwortlich für
deren zelltransformierende Eigenschaften.
Für jedes dieser viralen Onkogene ( v-onc ) existiert somit ein zelluläres Pendant ( c-onc) mit
leicht veränderter Sequenz am COOH-Ende, das als Protoonkogen bezeichnet wird und
zahlreiche Aufgaben im Säugetierorganismus zu übernehmen scheint. Die genaue Rolle dieser
zellulären Onkogene beginnt man erst ganz allmählich zu verstehen.
Diese Gensequenzen existieren in allen Säugetiergenomen und werden in einer Vielzahl von
Gewebezellen exprimiert ( CHEN, 1980 ; SHIBUYA et al., 1982 ). Die hohe Homologie
dieser Gene zwischen verschiedenen Spezies, das heißt die hohe Konservierung der
Sequenzen während der Evolution ( BISHOP, 1983; SHILO und WEINBERG, 1981 ), deuten
auf eine bedeutende Rolle im Säugetierorganismus hin ( VAN STRAATEN et al., 1983 ).
Die zellulären Onkogene sind sowohl für normale Wachstums- und Differenzierungsprozesse
als auch für Zellregenerationsprozesse verantwortlich. Die Produkte dieser Onkogene reichen
von Proteinkinasen über Wachstumsfaktoren und verschiedene Rezeptoren bis hin zu DNA-
bindenden Proteinen als transaktivierende Faktoren ( BIELKA und BÖRNER, 1995 ). Ihre
Lokalisation ist je nach Funktion unterschiedlich.
Die im Zellkern lokalisierten Protoonkogene wie c-fos oder c-myc bilden eine Gruppe von
Immediate Early Genen, das heißt sehr früh exprimierten Genen, die bei vielen
Signalkaskaden die erste Antwort der Zellen auf extra-oder intrazelluläre Reize darstellen und
deren Produkte als Transkriptionsfaktoren die Aktivierung der späten Genantwort
veranlassen.

2 Literaturübersicht 13
Diese Early Response Gene werden durch eine Vielzahl von externen Wachstums- und
Differenzierungssignalen aktiviert ( CURRAN, 1985; GREENBERG, 1984 ) und sind dann
zuständig für die Umschaltung dieser kurzlebigen externen Signale in langanhaltende
zelluläre Antworten ( VOGT et al., 1990 ). Die Protoonkogene werden sehr schnell nach dem
Stimulus exprimiert, die RNA hat eine sehr kurze Halbwertszeit von maximal 30 Minuten
( YOU et al., 1992 ), und ist daher nur über einen begrenzten Zeitraum nachweisbar.
Einige Beispiele für solche Onkogene und ihre zellulären Pendants werden in Tabelle 1
dargestellt.
Tabelle 1: Virale und zelluläre Onkogene und ihre Produkte. ( nach KNIPPERS )
Onkogen transd. Tumor Proto- Genpodukt
Virus onkogen
v-jun Avian Sarkoma Fibrosarkom c-jun Transkriptionsfaktor
Virus Huhn
v-fos Murine Osteo- Osteosarkom c-fos Transkriptionsfaktor
sarkom Virus Maus
v-myc Avian Myelo- Leukämie c-myc Transkriptionsfaktor
cytomatosis Sarkom
Virus Karzinom
Huhn

2 Literaturübersicht 14
2.2.2 c-fos
2.2.2.1 Das Gen
Die Isolation eines FBJ-Virus-Komplexes aus einem spontanen Tumor der Maus ( FINKEL et
al., 1966 ) steht am Anfang der Entdeckung des c-fos Protoonkogens. Dieser Komplex besteht
aus einem replikationsfähigen murinen Leukämievirus ( FBJ-MuLV ) und einem nicht
replikationsfähigen murinen Sarkomavirus ( FBJ-MuSV ) ( LEVY et al., 1973, 1978 ), wobei
FBJ-MuSV durch eine homologe Rekombination zwischen FBJ-MuLV und dem zellulären c-
fos der Maus entstanden ist ( VAN BEEVEREN et al., 1983 ).
Das Onkogen v-fos ist das transformierende Gen des FBJ ( Finkel-Biskis-Jinkins )
Osteosarkomvirus der Maus und homologe Sequenzen wurden in mehreren Spezies
nachgewiesen ( CURRAN et al., 1982 ).
Das RNA-Genom des FBJ-MuSV-Virus besteht insgesamt aus 4026 Basenpaaren, wovon der
mittlere Bereich die 1639 Basenpaare umfassende v-fos Sequenz darstellt. Durch Integration
dieser v-fos Sequenz erlangt das Virus tumorbildende Eigenschaften.
Die Sequenz entspricht bis auf eine 104 Nucleotide umfassende Deletion im 3´-Bereich
weitestgehend der c-fos m-RNA Sequenz. Diese Deletion ist wahrscheinlich bei der Genese
des FBJ-MuSV Genes entstanden ( VAN BEEVEREN, 1983 ). Im Gegensatz zur c-fos
Sequenz enthält die virale Sequenz von fos keine Intronbereiche.
TAG
FBJ-MuSV 5´LTR 3´LTR
c-fos
TGA
5 E1 E2 E3 E4 3´
104bp
Abb. 2: Schema von v-fos und c-fos ( nach RANSONE und VERMA, 1990 )

2 Literaturübersicht 15
Die Retrovirussequenz ist in Form der integrierten Provirus-DNA, eingerahmt von den beiden
LTR-Elementen ( long-terminal-repeats, dient als Promotor für die Transkription der
integrierten DNA ) dargestellt. Die 104bp-Deletion am 3´Ende bewirkt ein unterschiedliches
Carboxy-Ende der Proteinsequenz. Das Stopkodon von v-fos ist TAG, das von c-fos TGA.
Die vier Exonbereiche des c-fos Gens werden durch die dunkelgrauen Boxen dargestellt
( Abb. 2 ).
Das zelluläre Protoonkogen c-fos ist seit 1983 bei verschiedenen Spezies isoliert worden und
zählt als Hauptvertreter der Gruppe der Immediate Early Response Gene. Die komplette
Gensequenz liegt vor für Mensch ( VAN STRAATEN et al., 1983 ), Maus ( VAN BEVEREN
et al., 1983 ), Ratte ( CURRAN et al., 1987 ), Huhn ( FUJIWARA et al., 1987 ), Hamster
( SARABIA und LIEHR, 1998 ) und den Pufferfisch ( Tetraodon fluviatilis ) ( CHANG et al.,
1996 ). Wie bei anderen Protoonkogenen. Sie beträgt für Mensch und Maus 90% ( VAN
STRAATEN et al., 1983), Mensch und Ratte 94%, für Huhn und Maus immerhin noch 79%
( FUJIWARA, 1987 ).
Das c-fos Protoonkogen besteht bei allen bisher untersuchten Spezies aus ca 3500
Basenpaaren, die sich in vier Exon- und drei Intronbereiche aufteilen.
TATA ATG TGA Poly-A
Promotor/ Intron Exon
Enhancer
Abb. 3: Grundstruktur von c-fos ( modifiziert nach KNIPPERS )
Das menschliche c-fos Gen erstreckt sich von der TATA-Box bis zum Poly-A-Signal über
3415 Nukleotide und kodiert für ein 380 Aminosäuren umfassendes Protein, welches
hydrophil und sauer ist ( VAN STRAATEN et al., 1983 ).

2 Literaturübersicht 16
Die vier Exonbereiche sind 140, 251, 107 und 636 Basenpaare lang. Die dazwischen
liegenden Introns umfassen 732, 432 und 115 Basenpaare.
Das ATG-Codon befindet sich an Position 289, das Terminationskodon TGA an Position
2729.
Die 5´-Region des Genes, die wichtig für die Regulation ist, zeigt einen hohen Anteil an
Guanidin- und Cytosinresten von 63%. Des weiteren können hier zwei Repeats von 8
Basenpaaren im Abstand von 6 Nukleotiden an Position 35-42 und 49-56 lokalisiert werden,
deren Bedeutung jedoch unklar ist. Die TATA-Box befindet sich an Position 100-108, die
CAP-Site an Position 130.
Das 3´ Ende ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein von zwei Poly-A Signalen, wobei
das zweite an Position 3510 für den Transkriptionsstop verantwortlich ist. Das erste Poly-A
Signal befindet sich an Position 3233, und hätte ein um 270 Nucleotide kürzeres Transkript
zur Folge.
2.2.2.2 Regulation der Genexpression
Die Regulation der Genexpression von c-fos kann auf mehreren Ebenen erfolgen. Neben
Transkription, Elongation und Translation hat vor allem die RNA-Stabilität einen großen
Einfluß.
Transkription
Die Transkription des c-fos Genes ist in verschiedenen Zellinien untersucht worden, wobei
vor allem Fibroblasten und Phäochromocytoma PC12-Zellen als Modell dienten. Die
Expression des c-fos Genes wird sehr schnell durch eine Reihe unterschiedlicher Faktoren
induziert. Dazu gehören Wachstumsfaktoren wie NGF ( nerve growth factor ), EGF
( epidermal growth
factor ) oder PDGF ( plateled derived growth factor ), Insulin, Phorbolesther und second-
messenger wie Kalzium und cAMP ( CURRAN und MORGAN, 1985,1986; GREENBERG
et al., 1985, 1986 ; MÜLLER et al., 1984 ) sowie Membrandepolarisation ( BARTEL et al.,
1989). Diese Faktoren nehmen auf die eine oder andere Weise Einfluß auf die Expression des
Genes, wobei für die meisten ein direkter Bezug zum Promotorbereich besteht.
Der Promotor des c-fos Genes beinhaltet neben der TATA-Box mehrere regulatorische
Bereiche die eine hohe Konservierung zwischen den einzelnen Spezies aufweisen. Die
Nukleotidsequenz der 5´-Region zeigt eine Homologie von 93 % zwischen Maus und Ratte,

2 Literaturübersicht 17
von 73% immerhin noch zwischen Mensch und Ratte. Die cis-regulierenden Elemente wie
das SIE, DSE, die AP-1-Bindestelle, das Ca/CRE und die TATA-Box sind bei Ratte, Mensch
und Maus gleichermaßen vorhanden ( WANG et al., 1994 ).
SHENG et al. ( 1988 ) haben zwei Hauptwege der Aktivierung des Gens definiert denen
unabhängige regulatorischen Sequenzen im Promotorbereich zugeordnet werden können.
Die Untersuchung der in vitro Aktivität des Promotorbereiches hat gezeigt, daß vor allem der
Bereich von -124 bis -58 für die primäre Aktivität verantwortlich ist. Zwei Elemente, die
direct-repeats und die überlappenden MLTF/USF und CREB/ATF Bindungsstellen sind in
diesem Bereich wichtig. Im weiteren 5´-Bereich kommt dann nur noch dem DSE eine
Hauptrolle für die Grundaktivität des Promotors zu ( HIPSKIND und NORDHEIM, 1991 ).
Das Hauptelement für die Aktivierung des Gens ist das Serum-Response-Element ( SRE ),
auch Dyad Symmetry Element ( DSE ) (-GGATGTCCATATTAGGACATCTGCGTCA-)
( TREISMAN, 1985 ).
Dieses Element bindet eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und vor allem das Protein SRF
( serum response factor ). Es ist für die Serum-Induktion des c-fos Genes wichtig ( SHENG et
al., 1988 ).
Überlappend mit dem SRE stellen sich dar: eine CArG-Box (-CCATATTAGG-) die für die
Bindung des serum response faktors verantwortlich ist, eine E-Box (-ACATCTGC-) als
Bindestelle für MyoD und schließlich eine AP1-Bindungsstelle (-CTGCGTCA-). Das Dimer
AP1, bestehend aus Jun und Fos, bindet an diese Stelle und trägt so zur Autoregulation des
Genes bei.
Das Serum Response Element interagiert mit der AP1-Bindestelle in der
Transkriptionsregulation je nach Zellstatus. In ruhenden Zellen bewirkt diese Kooperation
eine Repression, in wachsenden Zellen eine Aktivierung der Transkription ( MORGAN und
BIRNIE, 1992 ).
Um die Position -60 befindet sich ein cAMP-Response Element ( CRE ) (-TGACGTTT-),
welches für die Induktion des Genes durch Kalzium oder cAMP verantwortlich ist und sich
als unabhängig von dem DSE erweist ( HÄRTIG et al., 1991 ). Diese Sequenz zeigt eine hohe
Homologie zwischen Maus, Mensch und Huhn ( SHENG et al., 1988 ).
Für eine maximale Expression des Genes nach Stimulation mit cAMP sind weitere Elemente
im 3´-Bereich des Genes unentbehrlich. Beim Menschen findet sich so eine Sequenz an
Position +18 bis +38 ( HÄRTIG et al., 1991 ). Ein für die basale Transkription wichtiges GC-
reiches direct repeat Element befindet sich beim Menschen an Position -90 und -76
(-GCGCCACC-------GCGCCACC-) ( RUNKEL et al., 1991 ).

2 Literaturübersicht 18
An Position -350 liegt eine Bindestelle SIE (-TTCCCGTCAA-) für das Protein SIF das durch
den Wachstumsfaktor v-sis aktiviert wird.
Die Transkription des c-fos Genes hört einige Minuten nach der Aktivierung auf
( GREENBERG et al., 1985,1986 ). Die m-RNA wird dann ins Zytoplasma transportiert, wo
die Translation über einen kurzen Zeitraum stattfindet und die m-RNA sehr schnell degradiert
wird ( KRUIJER et al., 1984; MULLER et al., 1984 ).
RNA-Stabilität.
Ein wichtiger Mechanismus zur Regulation der Genexpression stellt die Kontrolle der m-
RNA Spiegel im Zytoplasma dar. Eine wichtige Rolle spielt hier die Stabilität der m-RNA.
Die Halbwertzeit des Transkriptes von c-fos liegt bei ca 15 Minuten. Der schnelle Abbau der
m-RNA ist einerseits abhängig von AU-reichen Sequenzen am untranslatierten 3`Ende
( VEYRUNE et al., 1995 ), andererseits von bestimmten Abschnitten der kodierenden
Bereiche ( SHYU et al., 1988 ).
Elongation.
Die Kontrolle der c-fos Transkription wird auch auf der Stufe der Elongation ausgeführt. Im
Bereich des ersten Exon befindet sich ein Elongationsblock ( FORT et al., 1987;
BLANCHARD et al., 1988; BONNIEU et al. 1989 ). LAMB et al. ( 1990 ) konnten die
fragliche Sequenz am Ende von Exon 1 identifizieren. Es handelt sich um eine perfekte
Palindrom Sequenz (-TCCCCGGCCGGGA-), die als FIRE ( fos intragenic regulatory
element ) betitelt wird. Dieses 14mer ist zwischen Maus, Huhn und Mensch stark konserviert.

2 Literaturübersicht 19
2.2.3 Das c-fos Protein
Das Produkt des c-fos Protoonkogens ist ein instabiles nukleäres Phosphoprotein, Fos
( SAMBUCETTI und CURRAN, 1986 ). Es besteht bei Mensch und Maus aus 380, beim
Huhn aus 367 Aminosäuren. Dieses Protein wird in den meisten Zellen auf einem niedrigen
basalen Level exprimiert ( ABATE und CURRAN, 1990 ).
Mit dem Produkt anderer Protoonkogene aus der Jun-Familie bildet es je eine Untereinheit
des Transkriptionsfaktors AP1 und reguliert so die Transkription von vielen an
Zellwachstums- und Zelldifferenzierungsprozessen beteiligten Genen ( RAUSCHER et
al.;1988, SASSONE-CORSI et al.,1988, CURRAN und FRANZA, 1988; CHIU et al.,1988 ).
Im Gegensatz zu seinem Dimerisationspartner Jun ist Fos nicht in der Lage Homodimere zu
bilden, und kann somit nicht als alleiniger Faktor an die Ziel-DNA binden ( KOUZARIDES
und ZIFF, 1988 ).
Das Hetereodimer AP1 bindet mit hoher Affinität an die symmetrischen Zielsequenzen
-TGACTCA- ( AP1-Site ) oder -TGACGTCA- ( CRE ) verschiedener Gene ( NAKABEPPU
und NATHANS, 1989 ; RANSONE et al., 1990 ) und reguliert so deren Expression
( HALAZONETIS et al.,1988; KOUZARIDES und ZIFF, 1988; NAKABEPPU et al.,1988;
RAUSCHER et al.,1988.; SASSONE-CORSI et al.,1988 ). Die AP1 Bindestelle ist das TPA
( 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate ) response element TRE welches in vielen Genen zu
finden ist ( ANGEL und KARIN, 1991 ).
2.2.3.1 Struktureller und funktioneller Aufbau
Das c-fos Protein gliedert sich in verschiedenen funktionelle Domäne die zwischen den
Spezies eine hohe Homologie aufweisen.
NH2
1 380
Transakt. bZIP-Motiv HOB Transrepr.
Abb. 4: Funktionelle Domäne von Fos
COOH
Das bZIP-Motiv im mittleren Bereich ist wichtig für die Dimerbildung mit Jun, sowie für die
spezifische DNA- Bindung ( RANSONE et al., 1990 ).

2 Literaturübersicht 20
Des weiteren stellen sich verschiedene für die Regulation der Transkription wichtige
Regionen dar. Sie befinden sich sowohl am C-terminalen als auch am N-terminalen Ende.
2.2.3.1.1 Das bZIP-Motiv
Das bZIP-Motiv setzt sich zusammen aus einer basischen Region mit einem Hauptanteil an
basischen Aminosäuren wie Arginin und Lysin, und einer Leucin reichen Domäne die als
Leucine Zipper bezeichnet wird. Die Funktion der basischen Region ist die spezifische DNA-
Bindung ( AGRE et al., 1989; NAKABEPPU und NATHANS, 1989 ), die des Leucin-
Zippers die Dimerbildung mit Jun ( KOUZARIDES und ZIFF, 1988; GENTZ et al., 1989;
TURNER und TIJAN, 1989 ). Die Heterodimerbildung wird gegenüber der
Homodimerbildung bevorzugt ( GLOVER et al., 1995 ).
Über das bZIP-Motiv wird auch die direkte Assoziation mit dem TATA-Box-Binding Protein
( TBP ) und somit eine direkte Beeinflussung der Tansskriptionsaktivierung vermittelt
( RANSONE et al., 1993 ).
Der Leucin – Zipper
Das Leucin-Zipper Motiv besteht aus einem Abschnitt von ca 30 Aminosäuren mit 5
Leucinen im Abstand von je 7 Aminosäuren. LANDSCHULZ et al. ( 1988 ) konnten dieses
Motiv als Charakteristikum für einige Onkoproteine der Fos, der Jun und der Myc Familie
beschreiben.
Die spezifische Anordnung der Aminosäuren in diesem Bereich führt zur Ausbildung einer
Sekundärstruktur in Form einer α-Helix, wobei alle Leucinreste sich auf einer Seite der Helix
anordnen. Auf der gegenüberliegenden Seite befinden sich Aminosäurenreste mit geladenen
Seitengruppen.

2 Literaturübersicht 21
Abb. 5: Sekundärstruktur des Fos-Proteins ( nach verschiedenen Autoren )
Die hellgrauen Rechtecke stellen die hydrophoben, die schwarzen die hydrophilen
Aminosäuren dar. Die amphipatische Anordnung der Aminosäuren und die
Salzbrückenbildung zwischen den geladenen Seitengruppen stabilisieren die Helixformation
( SCHULZ und SCHIRMER, 1979; CHOTIA, 1984; SUNDERALINGAM et al., 1987;
BAXEVANIS und VINSON, 1993 ).
Der Leucin-Zipper bildet das Herz der Dimerbildung mit Jun indem er mit dem Leucin-
Zipper des Jun- Proteins eine Konformation bildet die als Coiled-Coil bezeichnet wird
( O´SHEA et al.,1989, 1992 ). Die Leucin-Reste bilden die nach innen gekehrte Oberfläche
des Dimers. Coiled Coils haben eine gewisse Periodizität wodurch jede siebte Aminosäure in
die gleiche strukturelle Umgebung gelangt.
Durch diese Anordnung kommt es zu einer Juxtaposition der basischen Domäne als
Grundlage für die DNA- Bindung ( ALBER, 1992 ), wie in Abbildung 6 gezeigt.
Die basische Region.
Die basische Region besteht aus einer 16 er Sequenz von vorwiegend basischen Aminosäuren,
die genau 7 Aminosäuren vor dem ersten Leucin des Leucin-Zippers angeordnet sind
( HURST, 1994; VINSON et al., 1989 ). Diese Anordnung ist charakteristische für alle bZIP
Proteine und legt die Hypothese nahe, daß die DNA-Bindung von einer fixen
dreidimensionalen Anordnung zwischen Leucin-Zipper und basischer Region abhängt
( AGRE et al., 1989; NEUBERG et al., 1991 ).
L
L
L
L
L
L
L

2 Literaturübersicht 22
Durch die Dimerbildung ensteht ein Y-förmiges Molekül ( Abb. 6 ), wobei die basischen
Regionen sich wie Fangarme um die zu bindende DNA anordnen und der Stamm durch die
Coiled-Coil-Struktur der parallel angeordneten Leucin-Zipper gebildet wird
( VINSON et al., 1989; O´NEIL et al., 1990 ).
DNA
L = Leucine Zipper
b = Basische Region
NH2
FOS
b 380
b LLLLLLL COOH
b COOH
b LLLLLLL 340 JUN
Abb. 6: Aufbau von AP 1 ( nach KNIPPERS )
1
NH2
2.2.3.1.2 Transaktivierungs- und Transrepressionsdomäne des Fos Proteins
Die Untersuchung der transformierenden Eigenschaften des c-Fos Proteins hat wertvolle
Erkenntnisse über die Aufgaben der verschiedenen Proteinabschnitte gebracht.
Das c-Fos Protein beeinhaltet mehrere Domäne die für die Transaktivierung oder die
Transrepression anderer Gene verantwortlich sind ( ABATE et al., 1991b ).
Für die Transaktivierung ist vor allem der C-terminale Bereich von Fos wichtig ( HIRAI et
al., 1990 ; WISDON et al., 1993 ). Hier sind bis jetzt drei wichtige Proteinabschnitte bekannt.
Als HOB 1 –GLPEATTPESE- und HOB 2-EPFDDFLFPA- ( homology boxes, AS 226-236,
267-276 ) werden zwei wichtige Regionen bezeichnet die sich auch am N-terminalen Ende
von Jun als A1- Aktivierungsdomäne wiederfinden ( SUTHERLAND et al., 1992 ). Die
HOB-Motive kooperieren in der Aktivierung der Transkription.
Eine Serin-reiche Domäne befindet sich am 3´Ende ( As 332-380 ), sie wird unter anderem
durch die cAMP-abhängige Proteinkinase phosphoryliert ( ABATE et al., 1991 ). Das 90-
Aminosäuren C-Ende des c-Fos Proteins enthält somit mehrere autonome Regulationsdomäne
die durch Phosphatgruppenübertragung aktiviert werden können ( MCBRIDE und NEMER,
1998 ).

2 Literaturübersicht 23
Die Phosphorylierung des C-terminalen Endes spielt neben der Transaktivierung anderer
Gene eine Rolle bei der Transrepression des c-fos Promotors ( OFIR et al., 1990 ), weswegen
dieser Bereich auch als Transrepressionsdomäne bezeichnet wird. WILSON und TREISMAN
haben bereits 1988 die Bedeutung dieser Region für die schnelle negative Regulierung der c-
fos Transkription nach Serum-Stimulation festgestellt.
Die Transrepression von c-fos und anderen Immediate Early Response Genen scheint dabei
über die CArG-Box im Promotorbereich vermittelt zu werden ( GIUS et al., 1990 ).
Auch das N-terminale Ende des Proteins beinhaltet regulatorische Bereiche ( AS 60-84 ) die
für die Transaktivierung eine große Rolle spielen ( JOOSS et al., 1994 ). Das HOB 1 Motiv ist
auch hier vorhanden ( BROWN et al., 1995 ).
2.2.3.2 Regulation der Aktivität des Proteins
Die Aktivität von Fos als Teil des Transkriptionsfaktors AP1 unterliegt komplexen
Regulationsmechanismen. Hierzu zählen die Interaktionen mit anderen
Transkriptionsfaktoren wie CREB oder Myc, die Beeinflussung der Topologie der DNA,
sowie nicht zuletzt die posttranslationelle Phosphorylierung als spezifische Kontrolle der
Aktivität ( ABATE et al., 1993 ).
Die schnelle und spezifische Signalübermittlung von der Zelloberfläche zum Zellkern bedient
sich der Phosphorylierung verschiedener Proteine als Zwischenglied. Einen bekannten
Mechanismus stellt hier die Aktivierung von Proteinkinasen dar, die vom Zytoplasma in den
Zellkern migrieren und dort spezifische Transkriptionsfaktoren phosphorylieren ( KARIN und
HUNTER, 1995 ).
Die Regulation der Genexpression durch Fos und Jun resultiert aus einem Zusammenspiel
mehrerer funktioneller Domänen in beiden Proteinen ( ABATE et al., 1990 ). Dabei scheint
die Phosphorylierung bestimmter Proteinbereiche ein wichtiges Signal zu sein. Durch
Übertragung von Phosphatgruppen auf verschiedene Aminosäuren in den Transaktivierungs-
oder Transrepressionsdomänen wird die Aktivität der Transkriptionsfaktoren Fos und Jun
herauf- oder herabgesetzt.
Verschiedene Enzyme sind in diesen Ablauf eingebunden. Die Phosphorylierung durch die
PKA ( Proteinkinase A ) betrifft vor allem die C-terminalen Serinreste von Fos und scheint
ein wichtiger regulatorischer Schritt in der Aktivitätskontrolle in normalen Zellwachstums
und –differenzierungsprozessen darzustellen ( TRATNER et al., 1992 ). C-terminale
Serinreste sind auch Substrat anderer Proteinkinasen wie der MAP-Kinase ( mitogen-

2 Literaturübersicht 24
activated protein kinase ) und der RS-Kinase ( 90-kDa ribosomal S6 kinase ), die als
wachstumsregulierte Enzyme in die posttranslationelle Ummodellierung des Proteins
eingreifen und die Stabilität wie auch die Transaktivierungsaktivität erhöhen ( CHEN et al.,
1993; 1996 ).
Wichtiger noch als die Rolle bei der Transaktivierung anderer Gene scheint die Rolle des C-
terminalen Endes bei der Transrepression des c-fos Genes zu sein. OFIR et al. ( 1990 ) zeigen
daß dieser Bereich des Proteins im phosphorylierten Zustand in der Lage ist, die Transkription
am c-fos Promotor zu unterdrücken. Diese Autoregulation wird über das SRE ( serum
response element ) vermittelt ( RIVERA et al., 1990 ).
Auch die Hauptaktivierungsdomäne mit den beiden HOB Motiven wird über
Phosphatgruppenübertragungen reguliert, wobei vor allem die Phosphorylierung des
Threonins 232 im HOB 1 Motiv eine Rolle zu spielen scheint ( BANNISTER et al., 1994 ).

3 Material und Methodik 25
3. Material und Methodik
3.1 Übersicht zur Versuchsanlage
Die Aufklärung der Rolle des c-fos Protoonkogens in der Regulation verschiedener
Stoffwechselparameter in Skelettmuskelzellen konstitutionell unterschiedlicher
Schweinerassen erforderte zunächst eine Aufklärung der Primärstruktur des porcinen c-fos
Protoonkogens. Dies als Grundlage für die Untersuchung eventueller Sequenzunterschiede
des Genes bei konstitutionell differierenden Schweinen und als Beitrag zur Vervollständigung
des Schweinegenoms. Die hierzu erforderlichen Einzelschritte sind in Abbildung 1
zusammengefaßt.
Synthese spezifischer Primer anhand von Homologievergleichen ( Maus, Mensch, Ratte )
⇓
Amplifikation und Markierung einer schweinespezifischen Sonde
⇓
Screenen der Genbank
⇓
Isolation eines Lamda-Phagen-Klons aus der Genbank
⇓
Kartierung und Subklonierung des Inserts
⇓
Sequenzierung der Subklone
⇓
komplette Sequenz des porcinen c-fos Protoonkogens
⇓ → Physikalische Kartierung
Etablierung spezifischer PCR-Systeme zur Amplifikation des Genes bei verschiedenen
Schweinerassen.
⇓
Sequenzvergleiche per Computeranalyse
⇓
Darstellung gefundener Basenaustausche und RFLPs
Abb. 7: Übersicht der Versuchsdurchführung

3 Material und Methodik 26
Am Anfang stand die Isolation des porcinen c-fos Genes aus einer genomischen Lamda-FixII-
Genbank mittels einer schweinespezifischen Gensonde.
Zur Herstellung der Sonde wurden spezifische Primer anhand von Homologievergleichen der
c-fos Sequenzen von Mensch, Maus und Ratte ausgewählt. Die Amplifikation der Sonde
erfolgte aus genomischer DNA vom Schwein. Nach Isolation eines das c-fos Gen enthaltenen
Genabschnitts mittels Plaque-Hybridisierung aus der genomischen Genbank, erfolgte die
Kartierung und Subklonierung des Isolates.
Die einzelnen Subklone dienten nun als Ausgangsmaterial für die Sequenzierung des
kompletten c-fos Genes, wobei beide DNA-Stränge überlappend mit Hilfe der
vektorspezifischen Pimer oder auch mittels neu synthetisierter schweinespezifischer Primer
sequenziert wurden.
Die Suche nach eventuell vorhandenen Polymorphismen wurde vornehmlich bei den
Extremrassen Piètrain und Meishan durch direkte Sequenzierung verschiedener
Sequenzabschnitte durchgeführt. Als Primer für die Amplifikation der entsprechenden
Teilstücke aus genomischer DNA dienten teils die für die Grundsequenzierung schon
vorhandenen Primer, teils wurden spezifische Primerpaare neu synthstisiert.
Zur Untersuchung eventueller Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen in großem
Maßstab im Hinblick auf Folgearbeiten auf diesem Gebiet wurden PCR/ Retsriktionssysteme
etabliert.
3.2 Material
Als Ausgangsmaterial für die komplette Sequenzierung des c-fos Protoonkogens diente ein
Lamda-FixII-Klon genomischer Schweine-DNA der Firma Stratagene, wobei die Rasse des
Schweines nicht bekannt war.
Die Polymorphismensuche wurde an genomischer DNA der Rassen Piètrain und Meishan
durchgeführt. Die DNA wurde teils vom Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung der
Universität Hohenheim zur Verfügung gestellt, ein Teil der Tiere stammte von der Lehr- und
Forschungsstation Oberer Hardthof des Institutes für Tierzucht und Haustiergenetik der
Justus-Liebig-Universität Gießen.
Tabelle. 2: Übersicht über die Herkunft der untersuchten Tiere
Rasse Hohenheim Giessen
Meishan 5 2
Pietrain 3 4

3 Material und Methodik 27
3.3 Methodik
3.3.1 Isolation von DNA aus Vollblut
Die für die Versuche verwendete DNA wurde aus Vollblut isoliert. Die Blutentnahme erfolgte
an betäubten Tieren vor der Schlachtung und im Rahmen von bestandsdiagnostischen
Untersuchungen. Für die Entnahme wurden EDTA Röhrchen verwendet.
Die Isolation der DNA erfolgte nach unterschiedlichen Methoden, wobei sich die angewandte
Technik nach dem weiteren Verwendungszweck richtete.
3.3.1.1 Isolation von DNA aus Vollblut durch Aussalzen
Die mit dieser Methode isolierte DNA weist eine durchschnittliche Länge von 80-100kbp auf,
was mit einer recht geringen Viskosität einhergeht. Aufgrund dieser Begebenheit ist die
gewonnene DNA sehr genau zu dosieren und eignet sich sowohl für PCR als auch für
Southern-Hybridisierung. Nachteilig ist bei dieser Methode die Degradation der DNA.
Für die nun beschriebene Vorgehensweise wurden ausschließlich frische Blutproben
verwendet. 8-10ml des Vollblutes wurden in einem ersten Schritt für 20 Minuten bei 2500rpm
abzentrifugiert. Der Buffy Coat wurde dann mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze als
weißer Layer über den Erythrozyten abgenommen und in ein 1,5ml Eppendorf-Cup überführt.
Nun konnte die eigentliche Extraktion mit der Zugabe von 2,5ml eiskalten Lysispuffer
(150mM NH4Cl; 0,5mM KCl; 0,25mM Tris-HCl, pH7,4 ) beginnen. Nach Inkubation für 10
Minuten auf Eis zur Lyse der restlichen Erythrozyten erfolgte die Pelletierung der Leukozyten
durch 10-minütige Zentrifugation bei 4200rpm und 4° C. Der Überstand wurde verworfen
und das Zellpellet zweimal in eiskalter Waschlösung (140mM NaCl; 0,5 mMKCl; 0,25mM
Tris-HCl, ph 7,4 ) aufgenommen, resuspendiert und bei 300rpm , 4°C für 5 Minuten
zentrifugiert. Nun erfolgte die Resuspension der Zellen in 9ml 1xTE-Puffer und die Zugabe
von 0,5μg Proteinase K und 500μl 10% SDS unter vorsichtigem Mischen.
Nach anschließender Inkubation bei 50°C für mindestens 3 Stunden wurden 4,3ml einer
gesättigten Salzlösung zugegeben und die Lösung für 20 Sekunden durch sehr starkes
Schütteln schaumig geschlagen. Nach sofortiger Zentrifugation bei 4200rpm und
Raumtemperatur für 10 Minuten, wurde der Überstand vorsichtig zu 40ml 99,6% Ethanol
gegeben. Durch leichtes Schwenken wurde nun die DNA präzipitiert und das als weißer

3 Material und Methodik 28
Faden sichtbare Präzipitat mit einer Pipette in ein Eppendorf-Cup überführt. Nach
zweimaligem Waschen mit 70% Ethanol und anschließendem Trocknen des DNA-Pellets für
15 Minuten im Exsikkator erfolgte die Aufnahme der DNA in 500μl 1xTE. Nach Lösung der
DNA für 24 Stunden bei Raumtemperatur erfolgte schließlich die Bestimmung der
Konzentration und des Reinheitsgrades bei 260, 280 und 320 nm im Photometer.
3.3.1.2 Isolation von DNA aus Vollblut durch Phenol/Chloroform-Extraktion
Die mittels dieser Methode gewonnene DNA zeigt keine Degradationsanzeichen, ist aber
aufgrund ihrer hohen Viskosität nur schwer zu dosieren. Dies kann zu Problemen vor allem
bei der Verwendung in der PCR führen und aufgrund der Verwendung von
Phenol/Chloroform ist diese Technik als umweltbelastender zu bezeichnen.
Für die Isolation wurden frische oder aufgetaute Proben verwendet. Das Vollblut wurde in
einem Volumen von 5-10ml bei 5000rpm und 4°C 10 Minuten zentrifugiert. Nach Aufnahme
des Leukozyten-enthaltenden Pellets in 10ml 0,8% TritonX100 in 0,9% NaCl folgte ein
weiterer Zentrifugationsschritt für 25 Minuten bei 15000rpm und 4°C. Das Pellet wurde nun
in 5ml Lysispuffer ( 0,2M Tris-HCl, pH 8; 0,05M EDTA; 1% SDS; 0,5µg Proteinase K )
resuspendiert und bei 60°C für 60 Minuten inkubiert. Die DNA-Extraktion erfolgte durch
Zugabe von 1 Volumen Phenol mit anschließendem leichten Schütteln und Zentrifugation für
5 Minuten bei 6000 rpm. Nach Abnahme der wässrigen Phase wurde dieser Schritt jeweils
mit ½ Volumen Phenol, ½ Volumen Phenol/Chloroform ( 1:1 ) und mit 1 Volumen
Chloroform ( Chloroform + Isoamylalkohol, 24:1 ) wiederholt. Die Präzipitation der DNA
erfolgte durch Zugabe von 2 ½ Volumen 99,6% Ethanol zur wässrigen Phase unter leichtem
Schwenken. Die weitere Vorgehensweise entspricht der oben beschriebenen Methodik.
3.3.2 Polymerasekettenreaktion
Die Polymerasekettenreaktionen wurden je nach Ziel in einem Volumina von 20-100μl in
speziellen dünnwandigen 0,5ml Cups durchgeführt. Zu diesem Zweck stand ein Gene Amp
2400 PCR System der Firma Perkin Elmer, Langen, zur Verfügung.

3 Material und Methodik 29
3.3.2.1 DNA
Als Template dienten je nach Ziel der Amplifikation genomische DNA oder Plasmid DNA. In
einem Gesamtansatz von 100μl betrug die DNA-Menge 1μg genomische, bzw. 500ng
Plasmid- DNA. Dies entspricht ca. 10E 6 bis 10E 7 Molekülen.
Die genomische DNA wurde zwecks genauerer Dosierung als Verdünnung aus den Isolaten
eingesetzt.
3.3.2.2 Primer
Die Auswahl der spezifischen Primer für die unterschiedlichen Zielsetzungen wurde nach
bestimmten Kriterien durchgeführt, wobei das Programm Primerselekt aus dem Gesamtpaket
DNAStar zur Anwendung kam. Folgende Hauptkriterien wurden dabei beachtet, wobei oft
Kompromisse hinsichtlich der einzelnen Anforderungen gemacht werden mußten, um
bestimmte Genabschnitte abzudecken:
• durchschnittliche Länge von 16-24 Basenpaare
• mittlere Schmelztemperatur ( Tm ) von ( 2 x ( A+T ) + 4 x ( G + C ) ) = 60°C
• GC-Anteil von ca. 50-60%
• maximal drei gleiche Basen hintereinander
• keine Haarnadelstrukturen von mehr als vier Basen
• kein Annealing der beiden im Paar verwendeten Primer von mehr als 4 nebeneinander
liegenden Basen
• kein Annealing der beiden primer im Bereich der letzten 4 Basen am 3´Ende
Die Basissequenz des Genes schränkte die Auswahl nach diesen Kriterien oftmals sehr ein, so
daß Modifikationen vor allem hinsichtlich des GC-Anteils und der Tm nötig waren um alle
gewollten Abschnitte zu erfassen.
Die Synthese der Primer wurde von der Firma Roth, Karlsruhe, durchgeführt.

3 Material und Methodik 30
3.3.2.3 Polymerasen, Ionenmilieu und Nukleotide
Verschiedene Polymerasen kamen in einer Konzentration von 2,5–5Units pro 100μl
Gesamtansatz zum Einsatz. Es wurden vor allem die thermostabilen Taq- und Vent (exo-)-
Polymerasen der Firma MBI eingesetzt.
Die mitgelieferten Puffer mit 20mM Tris-HCL und 16mM ( NH4)2SO4 wurden zum Einstellen
des Ionenmilieus benutzt. Die Magnesiumkonzentration wurde für die einzelnen Reaktion
variiert, und sie betrug zwischen 1,5-4,5mM. Die Puffer wurden als 10x Puffer benutzt, das
verwendete Wasser war doppelt destilliert und autoklaviert.
Die Nukleotide wurden in einer Konzentration von 10nm/100μl eingesetzt. Die Lagerung
erfolgte bei –20°C als 10mmolarer Stock.
3.3.2.4 Reaktion
Die Polymerasekettenreaktion wurde mit unterschiedlichen Temperaturen in verschiedenen
Abschnitten durchgeführt. Der erste Schritt bestand in der vollständigen Denaturierung der
DNA bei 92-96°C für 2-5 Minuten, die DNA Synthese erfolgte in 25-35 Zyklen bei
unterschiedlichen Temperaturen.
92-96
2-5 ´ 92-94
15´´
72 72
48-66 15-200´´ 48-66 5
15´´ 15´´
Abb. 8: PCR-Bedingungen
Die Annealing-Temperatur wurde anhand der verwendeten Primer ( Tm ) ausgewählt und auf
15 Sekunden eingestellt. Sie lag immer zwischen 48 und 66°C, wobei oft versuchsweise mit
der niedrigsten Temperatur angefangen wurde um sich dann schrittweise den
Idealbedingungen zu nähern.
Die Dauer der Extensionstemperatur von 72°C richtete sich nach der Länge des Amplifikats
bei vorausgesetzter Syntheseleistung von 1000bp/Minute, und sie betrug zwischen 15 und 200
Sekunden.

3 Material und Methodik 31
Die entstandenen Amplifikate wurden zu Beginn jedes Zyklus jeweils bei 92-94°C erneut
denaturiert um als Template dienen zu können.
Zum Abschluß der gesamten Reaktion wurde noch einmal für 15 Minuten die Annealing-
Temparatur und für 5 Minuten die Extensionstemperatur eingestellt um die Synthese aller
Stränge als Doppelstrang zu gewährleisten. Die Proben wurden dann bis zur
Weiterverwendung bei 4°C gelagert.
3.3.2.5 Ergebniskontrolle
Die Kontrolle der Amplifikate erfolgte in 0,7-3,5% Agarosegelen, wobei die
Wanderungsgeschwindigkeit und die Dichte mit einem geeigneten Marker kontrolliert
wurden.
3.3.3 Isolation eines Genes aus einer genomischen Genbank vom Schwein
3.3.3.1 Herstellung einer spezifischen Sonde zum Screenen der Genbank
3.3.3.1.1 Amplifikation eines geeigneten Sequenzabschnittes des gesuchten Genes
Als Ausgangsmaterial für die Sonde diente ein mittels PCR amplifizierter Sequenzabschnitt
aus einem Exon des Genes. Die dazu eingesetzten Primer wurden aus Homologievergleichen
zwischen Maus und Mensch abgeleitet und synthetisiert um eine größtmögliche
Übereinstimmung auch zum porcinen Gen zu gewährleisten. Als Template diente eine
genomische, aus Vollblut isolierte DNA vom Schwein. Die PCR wurde wie oben beschrieben
durchgeführt. Das entstandene Amplifikat wurde einer Sequenzanalyse unterzogen um die
eindeutige Zuordnung zum gesuchten Gen zu gewährleisten. Dieses Amplifikat diente nun als
Ausgangsmaterial für die radioaktive Markierung.
3.3.3.1.2 Radioaktive Markierung des Amplifikats mittels der Oligo-Labeling-Methode
Das amplifizierte Sondenmaterial wurde mit 32 P-dCTP ( 10Mbq, Hartmann Analytic ) wie
folgt markiert :
25ng der Sonden-DNA wurden denaturiert ( 95°C 10min.; Eis 2min. ) und anschließend mit
einer vorgefertigten Reaktionslösung ( Oligonucleotid-Primer, Klenow-Fragment der DNA-
Polymerase, dNTP´s mit dCTP 32 P ) bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Nach erfolgter

3 Material und Methodik 32
Markierung wurde die markierte DNA von den nicht eingebauten Nukleotiden durch
Aufreinigung über eine Säule getrennt und anschließend die Radioaktivität der einzelnen
Fraktionen sowie die spezifische Aktivität der Sonde und die Anzahl der eingebauten Isotope
bestimmt.
3.3.3.2 Screenen der Genbank
Für die Isolation der Sequenzabschnitte des gesuchten Gens stand eine λ-Phagen Genbank der
Firma Stratagene zur Verfügung.
Die Transfektion erfolgte mit Bakterien des Stammes MRA. Diese Bakterien wurden in LB-
Medium mit MgSO4 und 20% Maltose bis zu einer optischen Dichte von OD = 0,4
angezüchtet, dann bei 3000rpm 10 Minuten abzentrifugiert und schließlich mit 10mM MgSO4
auf eine OD von 0,5 eingestellt.
Zum Ausplattieren wurden 150mm Agarplatten verwendet, die mit NZY-Medium ( NaCl,
MgSO4, Select Yeast Extract, Casein Hydrolysate Peptone ) vorbereitet waren.
3.3.3.2.1 Vorbereitungen: Titrieren der Phagen, Bestimmung des Dichtewachstums
Als Vorbereitung zum eigentlichen Ausplattieren der Genbank für das Screenen mußte als
Erstes der aktuelle Titer der Phagen sowie deren Wachstumsbedingungen bestimmt werden.
Die Bestimmung dieser Parameter ist wichtig um zu gewährleisten, daß die Plaques auf den
Agaroseplatten nicht zu dicht wachsen und gegeneinander abgrenzbar zu bleiben, aber der
Einzelplaque trotzdem groß genug wird. Wenn die Phagendichte auf den Platten nicht zu hoch
gewählt wird, kann man davon ausgehen, daß alle Phagen innerhalb eines Plaques vom
gleichen Ausgangsphagen abstammen und damit alle das gleiche klonierte DNA-Fragment
enthalten. Die hierfür angegebene Solldichte beträgt 5x10E 4 /Platte.
Der Titer der Phagen wurde wie folgt bestimmt: Von dem Phagenmaterial der Genbank wurde
eine Verdünnungsreihe ( 10E -2 bis 10E -6 ) mit SM-Medium ( NaCl, 1M MgSO4, Tris-Puffer )
angelegt. Die Transfektion erfolgte in sterilen Falconröhrchen mit Bakterien des Stammes
MRA, wobei je 10μl der entsprechenden Verdünnung mit 200μl der vorbereiteten Bakterien
( OD = 0,5 ; aufgenommen in 10mM MgSO4 ) für 15 Minuten bei 37°C inkubiert wurden.
Anschließend erfolgte das Ausplattieren der Bakterien mit Top-Agar ( 55°C ) auf 90mm
Agarplatten ( NZY-Medium ). Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Am
nächsten Tag wurden die entstandenen Plaques ausgezählt und so der Titer bestimmt. Der

3 Material und Methodik 33
aktuelle Titer der Genbank betrug 0,9x10E 6 /μl. Anschließend wurde die optimale
Wachstumszeit zum Erreichen der richtigen Plaquegröße durch nochmaliges Ausplattieren der
Genbank auf zwei 150mm Agarplatten in einer Solldichte von 5x10E 4 /Platte ermittelt. Hierzu
wurden 1,4μl einer 1/10 Verdünnung der Genbank mit 1,2 ml ( 600μl/Platte ) Bakterien wie
bereits beschrieben ausplattiert. Nach ca. 5 Stunden wurde die Plaquegröße in regelmäßigen
Abständen kontrolliert und so die optimale Wachstumszeit festgelegt.
3.3.3.2.2 Ausplattieren der Genbank; Übertragen des Phagenmaterials auf
Nitrozellulosefilter
Um zu gewährleisten, daß ein möglichst repräsentativer Teil der Genbank gescreent werden
konnte, mußte eine möglichst große Anzahl an Platten ausplattiert werden. Es wurden 25
150mm Agaroseplatten mit NZY-Medium zum ausplattieren vorbereitet
Das nötige Genbankmaterial wurde anhand der Solldichte ( 5x10E 5 /Platte ) und des in der
Vorbereitung bestimmten Titers von 0,9x10E 6 ausgerechnet. Für 25 Platten mußten 1,39μl
Genbank und 15ml Bakterien ( MRA; OD = 0.5; in MgSO4 ) verwendet werden. Zur
Transfektion wurden die Bakterien mit der Genbank vermischt und anschließend auf 25
sterile Falconröhrchen verteilt, die dann 15 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. Die
Agaroseplatten wurden warmgestellt ( 37°C ). Der zum Ausplattieren verwendete Top-Agar
ist auf ca 55°C vorgewärmt worden. Beim Ausplattieren wurden dann mit einer sterilen
Glaspipette 8ml Top-Agar zu jedem Falconröhrchen gegeben, durch vortexen vermischt,
unter Vermeidung von Luftblasen auf die vorgewärmten Agaroseplatten gegossen und durch
leichte Schwenkbewegungen verteilt. Die fertigen Platten wurden dann nach dem Trocknen
bei 37°C für 7 Stunden inkubiert. Nach Vollenden der Inkubationszeit wurden die Platten in
den Kühlschrank gestellt.
Der nächste Schritt bestand nun in der Übertragung des Phagenmaterials auf Nitrozellulose-
Membranen, dem sogenannten Plaque-Lifting. Sind die Phagen auf diese Membranen
übertragen, können nach Abwaschen der Proteinbestandteile die gesuchten DNA-Fragmente
mittels radioaktiv markierter Sonden gekennzeichnet werden. Diese Methode wird als Plaque-
Lift-Hybridisierung bezeichnet.
Verwendet wurden für das Plaque-Lifting Nitrozellulose-Filter der Firma Sartorius. Pro Platte
wurden zwei Filter verwendet, um falsch-positive Signale beim späteren Hybridisieren
auszuschließen. Diese Filter wurden nacheinander auf die Platten aufgelegt und markiert.

3 Material und Methodik 34
Nach ca. 3 Minuten wurden sie vorsichtig mit einer Pinzette entfernt und zum Abwaschen der
Proteinbestandteile und zum Denaturieren der DNA-Fragmente nacheinander in folgende
Lösungen überführt :
Denaturierungslösung ( 1,5M NaCl , 0,5M NaOH ); 7 Min.
Neutralisierungslösung ( 1,5M NaCl , 0,5M Tris , 0,001M NaEDTA ); 10 Min.
2 x SSC ( 0,3M NaCl , 0,03M NaCitrat ); 5 Min.
Nach dem Trocknen der Filter wurde die DNA durch Hitzeeinwirkung ( 2 Stunden, 80°C )
irreversibel an die Nitrozellulose- Membranen gebunden.
3.3.3.2.3 Plaque-Lift- Hybridisierung
Nach dem Übertragen des Phagenmaterials auf Nitrozellulose-Filter folgte der Schritt der
Hybridisierung dieser Filter mit einer spezifischen Sonde für die gesuchten Genabschnitte.
Falls die Sonde aufgrund einer Sequenzkomplementarität an eines der klonierten DNA-
Fragmente bindet, zeigte sich dies als deutliche schwarze Markierung nach Exprimieren der
Filter auf Röntgenfilm, da jedes Fragment in einem der Plaques millionenfach vermehrt
vorliegt. Die Synthese und Markierung der Sonde erfolgte wie bereits beschrieben kurz vor
dem eigentlichen Hybridisierungsschritt. Die Hybridisierung erfolgte nach dem Prinzip einer
Southern-Blot-Hybridisierung mit dem Unterschied, daß die Filter zum Abwaschen von
etwaigen Agaroseresten erst in einer Prewash-Lösung ( 50mM Tris; 1M NaCl; 1mM EDTA;
SDS 0,01% ) vorgewaschen wurden ( 1 Stunde, 42°C ). Anschließend wurden die Filter kurz
in 6x SSC-Lösung zwischengelagert. Die Vorhybridisierung erfolgte, wie auch die
Hybridisierung in einem Hybridisierungsofen mit drehbaren Zylindern bei 42°C.
Hierzu wurden die Filter luftblasenfrei auf die Hybridisierungszylinder verteilt, wobei die
markierte Seite nach außen zeigte. In einem Zylinder fanden je 5 Filter Platz ohne sich
gegenseitig zu überlappen. Die Vorhybridisierung wurde mit je 30ml Hybridisierungslösung
( 6x SSC ; 5 x Denhardt ; 50% Formamid ; 0,1% SDS ; H2O ) je Zylinder bei 42°C für 2-3
Stunden durchgeführt. Dann wurden 50ml Hybridisierungslösung mit der markierten und
zuvor denaturierten ( 95°C 4min., Eis 2min. ) Sonde vermischt und auf die Zylinder verteilt.
Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 42°C.
Zum Vermeiden von falsch positiven Signalen und zum Verhindern einer zu hohen
Hintergrundmarkierung mußten die Filter nach dem Hybridisierungsschritt mehreren Wasch-
schritten unterzogen werden um die nicht gebundene Radioaktivität zu entfernen. Dabei

3 Material und Methodik 35
entschied die Waschzeit sowie die Waschtemperatur über das Entfernen mehr oder weniger
unspezifischer Bindungen der Sonde. Die Waschschritte erfolgten in drei verschiedenen
Lösungen mit unterschiedlichen Temperaturen. Als Erstes wurden die Filter in einer Schale
mit Waschlösung 1 ( 2x SSC; 0,1% SDS ) bei 45°C für 20 Minuten im Wasserbad leicht
geschüttelt. Dieser Waschschritt wurde dreimal mit jeweils frischer Lösung wiederholt.
Danach wurden die Filter in Waschlösung 2 ( 0.1 % SDS ; 0.1 x SSC ) bei 68°C für 20
Minuten geschwenkt. Die Filter wurden anschließend mit einem Geigerzähler auf die
verbleibende Radioaktivität untersucht um erforderlicherweise den letzten Waschschritt
wiederholen zu können. Nachdem nur noch vereinzelte Signale mit dem Geigerzähler
feststellbar waren, wurden die Membranen in 2 x SSC bei Raumtemperatur gelagert.
Die Signale der Filter wurden anschließend in Röntgenkassetten exprimiert. Hierzu wurden
die Filter in Plastikfolien wasserdicht eingeschweißt und für 1-3 Tage bei -70°C exprimiert.
Nach dem Entwickeln der Filme konnten dann die einzelnen Signale begutachtet werden. Hier
hat es sich als sehr hilfreich erwiesen, daß von jeder Agaroseplatte zwei identische Filter
vorhanden waren, da so die spezifischen Signale durch Vergleich der beiden Filter besser
lokalisiert werden konnten. Alle möglichen Positivsignale wurden als Punkte auf den Filmen
markiert und numeriert.
3.3.3.2.4 Eingrenzen der positiven Plaques
Durch direkten Vergleich der Agaroseplatten mit den exprimierten Filtern konnten die
Plaques die ein positives Signal ergeben hatten genau identifiziert werden. Die
entsprechenden Stellen wurden auf den Agaroseplatten markiert und das zum
Hybridisierungssignal gehörige Areal wurde mit einer Kapillare aus dem Agar ausgestochen
und in ein vorbereitetes Eppendorf-Cup mit 500μl SM-Medium und 70μl Chloroform
überführt. Die Phagen diffundieren bei Raumtemperatur aus dem Agarosepellet in das SM-
Medium und sind durch das beigefügte Chloroform in dieser Form monatelang haltbar.
Die weitere Vorgehensweise bestand nun darin, durch ein nochmaliges Ausplattieren der
positiven Phagen und durch einen zweiten Hybridisierungsschritt die falsch-positiven Phagen
zu eliminieren und aus den gepickten Arealen die Einzelplaques zu isolieren. Auch hier war
der Phagentiter sehr wichtig um zu verhindern, daß die Plaques sich nach dem nochmaligen
Ausplattieren überlappen und nicht mehr gegeneinander abgrenzbar sind. Der angenommene
Titer betrugt hier 1x10E 5 bis 1x10E 7 /ml SM-Medium. Die Plaquedichte sollte viel geringer

3 Material und Methodik 36
als beim Ausplattieren der Genbank sein, da Einzelplaques differenziert werden müssen.
Versuchsweise wurden zwei Verdünnungsstufen ( 10E -5 und 10E -6 ; 10μl ) des
herausdiffundierten Phagenmaterials auf 90mm Agarplatten nach der beschriebenen Methode
ausplattiert. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C. Die 10E -5 Verdünnungsstufe zeigte
die erwünschte Plaquesdichte von mehr oder weniger 200/Platte.
Das Plaque-Lifting und der Hybridisierungsschritt wurden nach der beschriebenen Methode
durchgeführt, wobei die beim ersten Hybridisierungsschritt eingefrorene
Hybridisierungslösung nach vorherigem Denaturieren ( 10min. 70°C ) nochmals verwendet
wurde. Nach Exprimieren der Filter in Röntgenkassetten konnten die positiven Signale auf
zwei beschränkt werden. Die korrespondierenden Plaques wurden wie bereits beschrieben aus
dem Agar ausgestochen und in SM-Medium überführt.
Dieses Phagenmaterial der Einzelplaques lieferte nun das Ausangsmaterial für eine weitere
Differenzierung der darin enthaltenen DNA-Fragmente.
3.3.3.2.5 Anlegen eines High-Titer-Stocks
Das Anlegen eines High-Titer Stocks von einem Plattenlysat bildet die Grundvoraussetzung
für die weiteren Arbeiten.. Hierzu wurde das Phagenmaterial der positiven Klone auf 150mm
Agaroseplatten nach bekannter Methode ausplattiert, wobei zur Transfektion 20μl des SM-
Phagenmaterials verwendet wurden. Die gewählte Dichte war hier nicht mehr so wichtig, da
es sich um Einzelplaques handelte und man eine möglichst große Anzahl an Plaques
anstrebte. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Platten am nächsten Tag mit 5ml
SM-Medium überschichtet und für 1-2 Stunden im Schüttelinkubator bei Raumtemperatur
leicht geschwenkt. Dabei diffundierten die Phagen aus den Plaques in das SM-Medium. Das
SM-Medium wurde mit einer Pasteurpipette abgenommen und in ein steriles Falconröhrchen
mit 700μl Chloroform gegeben.
Es wurden nochmals 2ml SM-Medium auf die Platten gegeben und nach weiteren 30 Minuten
abgenommen. Dieser High-Titer Stock bildete nun die Grundlage für die weitere Isolation und
Differenzierung der darin enthaltenen DNA-Fragmente und war in dieser Form monatelang
haltbar.

3 Material und Methodik 37
Zur weiteren Verwendung mußte der genaue Titer des Stocks bestimmt werden. Es wurden
20μl verschiedener Verdünnungsstufen auf 90mm Platten ausplattiert, die entstandenen
Plaques ausgezählt, und so die Titer bestimmt.
3.3.3.2.6 Ergebniskontrolle
Um die eindeutige Zugehörigkeit der in den Phagen klonierten DNA zu dem gesuchten Gen
zu
überprüfen, wurde die DNA vorerst in kleiner Menge aus den Phagen zu isoliert und mit den
für die Sonde synthetisierten Primern in einer PCR eingesetzt. Die Isolation aus den Phagen
erfolgte mit einem Isolierungskit der Firma Quiagen. Die isolierte DNA wurde dann mit den
spezifischen Primern in eine PCR eingesetzt. Die Bedingungen entsprachen denen der
Sondenamplifikation. Das Amplifikat wurde auf einem 1% Agarose-Gel mit einer 100bp-
Leiter als Marker aufgetrennt.
3.3.3.2.7 Isolierung des Genmaterials aus dem High-Titer Stock
Um eine ausreichende Menge an DNA für die weiteren Arbeiten zu haben, mußte das
Genmaterial aus den Lambda-Phagen isoliert werden. Dazu wurden aus dem High-Titer Stock
1x10E 8 Phagen mit 2x10E 9 Bakterien des Stammes MRA in LB-Medium ( Maltose,
Glukose ) bei 37°C und 220rpm inkubiert. Nach einem Anstieg der optischen Dichte auf ca 1-
1,2 ( 7-9 Stunden ) kam es, bedingt durch die vermehrte Transfektion der Bakterien, zu einem
Abfall der optischen Dichte auf 0,2-0,3. Bei Erreichen dieses Wertes konnte mit der
eigentlichen Isolierung begonnen werden.
Zuerst wurden die Proben nach Zugabe von 2ml Chloroform 10 Minuten weitergeschüttelt,
danach nach Zugabe von 6g NaCl eine Stunde auf Eis ruhen gelassen und schließlich die
Bakterienwandbestandteile bei 9250rpm 10 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde in
ein steriles Gefäß umgefüllt und mit 10g Polyethylenglykol eine Stunde auf Eis inkubiert.
Nach einem zweiten Zentrifugationsschritt bei 9000rpm für 10 Minuten wurde das Pellet in
8ml LB-Medium resuspendiert. Nach Zugabe von 150μl 3% Gelatine/0,1% Na-Azid-Lösung
und DE 52 ( Whatman ) wurde die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur geschwenkt und
schließlich bei 3000rpm abzentrifugiert bis der Überstand klar war. Es wurden nun 400μl
EDTA sowie 50μl Proteinase K zugefügt und die Probe bei 45°C für 15 Minuten inkubiert.
Nach Zugabe von 200μl 5% CTAB/10% NaCl erfolgt ein weiterer Inkubationsschritt bei

3 Material und Methodik 38
68°C für 3 Minuten. Nach zwei weiteren Zentrifugationsschritten bei 13000rpm wurde die
DNA mit NaCl und Ethanol abs. gefällt. Nach zweimaligem Waschen mit 70% ETHO und
anschließendem Trocknen erfolgte die Lösung der DNA in 50μl 1x TE-Puffer über Nacht bei
Raumtemperatur. Durch die Messung der optischen Dichte am Photometer bei 260 bzw. 320
nm wurde die Konzentration der Probe bestimmt.
3.3.4 Restriktionsverdaus
Die Restriktionsenzyme zur enzymatischen Spaltung von DNA wurden in einer
Konzentration von 1-2,5Units/μg DNA eingesetzt, wobei eine Überschreitung von 10% des
Gesamtvolumens des Ansatzes vermieden wurde. Mit Hilfe der mitgelieferten 10x Puffer
wurde das erforderliche Ionenmilieu eingestellt. Des weiteren wurde je nach Reaktion 0,1mg
pro ml BSA, sowie zur Stabilisierung 10% Spermidin zugegeben.
3.3.5 Southern-Blot-Hybridisierung
Die genaue Lokalisierung der gesuchten DNA-Abschnitte in der recht umfangreichen Phagen-
DNA erfolgte mittels Southern-Blot-Hybridisierung.
3.2.5.1 Southern-Transfer
Für den Transfer wurde die Phagen-DNA mit verschiedenen Enzymen gespalten, wobei
jeweils 10μg DNA zum Einsatz kamen. Die verdaute DNA wurde dann elektrophoretisch im
Agarosegel aufgetrennt ( 30V, 20 Stunden ), denaturiert und auf eine Nylonmembran
transferiert.
Zur Denaturierung der DNA wurde das Gel 30 Minuten in Denaturierungspuffer ( 1,5M
NaCl; 0,5M NaOH ) bei 50rpm geschüttelt. Nach kurzem Abspülen mit destilliertem Wasser
erfolgte die Inkubation in Neutralisierungspuffer ( 1,5M NaCl; 0,5M Tris-HCl, PH7,2 ) für
weitere 15 Minuten.
Die Transfervorrichtung wurde wie folgt aufgebaut: In eine Plastikschale mit einer Glasplatte
als Brücke wurde Transferpuffer ( 0,25M NaOH; 1,5M NaCl ) gefüllt, auf die Glasplatte 3
Lagen Whatman 3MM Papier gelegt, die zu beiden Seiten in den Transferpuffer reichten. Das
Gel wurde auf das Whatman-Papier aufgelegt, mit einer Pinzette die genau
zurechtgeschnittene Nylonmebran ( Hybond-N, Amersham ) blasenfrei aufgelegt und mit 3
weiteren Lagen angefeuchtetem Whatman-Papier, einem 20cm hohen Stapel aus

3 Material und Methodik 39
Papierhandtüchern und einem 500g schweren Gewicht bedeckt.Der Transfer wurde für 10-16
Stunden durchgeführt. Nach Markierung der Ladeschächte und der Orientierung wurde die
Membran vorsichtig entfernt und 2 Stunden bei 80°C inkubiert um die DNA irreversibel zu
binden.
3.2.5.2 Markierung der Sonde
Die Hybridisierung wurde mit einer durch Nick-Translation radioaktiv ( 32P dCTP,
50μCurie ) markierten humanen c-fos-Sonde durchgeführt. Dabei wurde ein Nick Translation
Kit der Firma Boehringer Mannheim verwendet.
100ng der c-fos-Sonde wurden mit jeweils 1μl dATP, dGTP, dTTP sowie 2μl 10x Puffer und
2μl Enzym-Mixtur zusammenpipettiert und mit H20 dest. auf ein Volumen von 17,5μl
eingestellt. Nach Zugabe von 2,5μl 32P cdCTP wurde die Probe eine Stunde bei 15°C
inkubiert.
Die freien, von der radioaktiv markierten Gensonde nicht eingebauten Nukleotide wurden
dann durch Säubern der Probe über eine Nick-Säule ( Nick Columns, Pharmacia ) entfernt.
Dabei enstand durch Zugabe von 1x TE-Puffer, pH7,6, ein Endvolumen von 450μl radioaktiv
markiertem Genmaterial. Durch Zugabe von 300μl Salmon Testes Sperm zu der radioaktiv
markierten Gensonde und anschließender 10minütiger Inkubation bei 100°C wurden die nicht
markierten Sondenfragmente gebunden. Danach wurde die Probe bis zur Verwendung auf Eis
aufbewahrt.
3.2.5.3 Vorhybridisierung, Hybridisierung, Exprimieren
Die Hybridisierungsreaktionen wurden in einem Folienschlauch mit 40ml Hybridisierungsmix
( 20ml Formamid, 8ml 50% Dextransulfat, 10ml H2Odest.,2ml 20% SDS ) durchgeführt.
Nach Entfernen aller Luftblasen erfolgte die Vorhybridisierung der transferierten Filter bei
42°C für 1-2h im Wasserbad. Die Hybridisierung erfolgte nach Zugabe der frisch markierten
Sonde für 12h bei 42°C.
Es folgten mehrere Waschschritte zur Entfernung der überschüssigen, unspezifisch
gebundenen DNA. Dazu wurde die Membran in 200ml Waschlösung ( 1xSSC, 0,5% SDS )
zweimal 30 Minuten bei 68°C leicht geschüttelt und anschließend kurz in 0,2x SSC
geschwenkt. Das Exprimieren der Filter erfolgte für 30-60 Minuten im Phosphorimager.
Die dabei markierten DNA-Fragmente bilden die Grundlage für die folgende Umklonierung
in Plasmidvektoren.

3 Material und Methodik 40
3.3.6 Präparation und Aufreinigung von DNA-Fragmenten
DNA-Fragmente aus Restriktionsverdaus oder PCR-Ansätzen mußten für die weitere
Verarbeitung aufgereinigt werden. Dabei richteten die Anforderungen an die Reinheit der
DNA sich nach dem Weiterverwendungszweck.
3.3.6.1 Aufreinigung über präparative Gele
Zum Einsatz in Ligationsreaktionen bestimmte DNA-Fragmente wurden über eine Low-
Melting Agarose aufgetrennt, bei 320nm auf dem UV-Leuchttisch ausgeschnitten, für 10
Minuten bei 68°C geschmolzen, und schließlich nach Abkühlen auf 37°C direkt aus dem Gel
eingesetzt.
Für alle weiteren Zwecke, insbesonders für die Sequenzierung, wurde die DNA über 0,7%
Agarosegele aufgetrennt und die entsprechenden Gelstücke wie oben beschrieben
ausgeschnitten. Die Extraktion der DNA aus dem Gel erfolgte mit Hilfe des QIAEXII Gel-
Extraktions Kit der Firma Quiagen, Hilden.
Die extrahierte DNA wurde zusätzlich mit Butanolfällung oder Ethanol aufgereinigt, das
Pellet wurde in 20μl 1x TE Puffer aufgenommen. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte
analog zu den bereits beschriebenen Verfahren.
3.3.6.2 Aufreinigung aus flüssigen Ansätzen
Die Aufreinigung aus flüssigen Ansätzen erfolgte nach zwei unterschiedlichen Methoden, der
Butanolfällung und der Phenol/Chloroform-Aufreinigung.
Bei der Butanolfällung wurden jeweils 100μl DNA in H2O mit 1ml Butanol vermischt und
präzipitiert. Es folgte ein Zentrifugationsschritt für 4 Minuten bei 13000rpm und schließlich
die Lösung des DNA-Pellets in 20μl 1xTE.
Die zweite Methode bestand in der Zugabe von 1 Volumen Phenol/Chloroform mit Abnahme
der wässrigen Phase nach Zentrifugation für 5 Minuten bei 11000rpm. Die DNA wurde dann
durch Zugabe von 1/10 Volumen 3M Na-Acetat und 2½ Volumina Ethanol abs. gefällt und
durch zweimaliges Waschen in 70% Ethanol zusätzlich aufgereinigt.
Nach leichtem Trocknen wurde das DNA-Pellet in 20μl 1x TE Puffer aufgenommen.

3 Material und Methodik 41
3.3.7 Erstellen von Plasmidklonen
Für die weiteren Arbeiten eigneten sich Plasmidvektoren aufgrund ihrer Eigenschaften viel
besser als Lambda-Phagen. So ermöglichen sie durch die Antibiotika-Resistenz und vor allem
durch die Lac-Z-Inaktivierung eine direkte Selektion rekombinanter Plasmide. Die
Sequenzierung der Insert-DNA kann sofort in den Plasmid-Vektoren durchgeführt werden.
Der einzige Nachteil besteht in der geringen Länge von maximal 5 kbp der klonierbaren
DNA, was jedoch in den meisten Fällen keine Rolle spielt. Als Ausgangsmaterial für die
Klonierungen und Subklonierungen dienten verschiedene Genbankklone nach restriktiven
Verdaus sowie PCR-Amplifikate die nicht direkt aus der PCR sequenziert werden konnten.
3.3.7.1 Ligation
Die Ligationen erfolgten in den zuvor linearisierten Plasmid-Vektoren pBlueskript KS+ oder
pUC19. Die Selektion rekombinanter Plasmide erfolgt durch die Inaktivierung der Lac-Z-
Region, was die Enstehung von weißen Kolonien auf Ampicillin-xGal-Platten zur Folge hat.
Für die Ligationsreaktionen wurden Insert-DNA und Vektor-DNA in einem Verhältnis von
4:1eingesetzt.
Der Vektor wurde mit den entsprechenden Restriktionsenzymen linearisiert und die Enzyme
durch 10minütige Inkubation bei 70°C inaktiviert. Die Insert-DNA wurde direkt nach der
Auftrennung aus einem 0,6% Low-Melting Gel verwendet. Die eigentliche Ligation wurde
wie folgt durchgeführt. Erst wurden die verdauten DNA-Proben zur Inaktivierung der
Restriktionsenzyme bei 70°C, 10 Minuten inkubiert. In ein steriles Eppendorf-Cup wurden
anschließend Vektor-DNA und Insert-DNA in einem Verhältnis von 1:4 pippetiert und mit
H2O auf ein Gesamtvolumen von 10μl eingestellt. Dieser Ansatz wurde dann zur besseren
Durchmischung 10 Minuten, bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 4μl 5x Ligase-Puffer,
5μl H2O und 1μl T4 DNA-Ligase ( 1 Unit ) der Firma Gibco BRL dazugegeben. Nach gutem
Durchmischen und kurzem Anzentrifugieren wurden die Ansätze bei 16°C für 12-16 Stunden
inkubiert.
3.3.7.2 Transformation
Für die Transformation wurden kompetente E.coli Zellen ( subcloning efficiency DH5α ,
Gibco BRL ) verwendet. Die Ligationsansätze wurden bei 68°C 10min. inkubiert und mit 1x

3 Material und Methodik 42
TE-Puffer 1:3 verdünnt um die für die Zellen störenden Inhaltsstoffe zu minimieren. Dann
wurden 6μl des verdünnten Ligationsansatzes zu 50μl der kompetenten Zellen gegeben und
gemischt. Nach 30 Minuten auf Eis folgte die Inkubation der Ansätze für 20 Sekunden bei
37°C und anschließend nochmal für 2 Minuten auf Eis. Nach Zugabe von 450μl LB-Medium
wurden die Proben dann bei 37°C 1 Stunde geschüttelt und schließlich auf LB-Ampicillin-
xGal-Agaroseplatten in verschiedenen Konzentrationen mit sterilen Glasspateln
ausgestrichen.
Nach Inkubation über Nacht bei 37°C konnten dann die erfolgreich transformierten,
rekombinanten Plasmide in Form von weißen Bakterienkolonien auf den Platten identifiziert
werden.
3.3.8 Präparation der Plasmid-DNA
Zur Verwendung für alle weiteren Arbeiten ( Restriktionsverdaus; Sequenzierungen ), mußte
die klonierte DNA in möglichst reiner Form aus den Bakterien isoliert werden.
Als Ausgangsmaterial für die Präparation von Plasmid-DNA diente die gesättigte Kultur einer
isolierten weißen Kolonie in LB-Medium.
3.3.8.1 Minipräparation
Vor der eigentlichen Präparation in größeren Mengen erfolgte eine Vorabanalyse der
klonierten DNA, bestehend aus der Isolation geringer Mengen Plasmid-DNA durch alkalische
Lyse (Miniprep., BIRNBOIM und DOYLE, 1979 ) mit anschließender Überprüfung der
Länge des klonierten Fragmentes.
Dazu wurde eine gewisse Anzahl weißer Kolonien einzeln mit einem sterilen Zahnstocher aus
den Agaroseplatten gepickt und in Cups mit jeweils 2ml LB-Medium und 10μl Ampicillin
( 20mg/ml ) überimpft. Diese Ansätze wurden über Nacht bei 37°C und 170rpm geschüttelt.
Für die eigentliche Isolation wurden die Bakterien aus 1,5ml gesättigter Kultur für 30
Sekunden bei 11000rpm abzentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde das Pellet in
100μl Lösung I ( 50mM Glukose, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA ) resuspendiert. Nach
vollständigem Lösen des Pellets durch Vortexen und 5minütigem Stehenlassen bei
Raumtemperatur erfolgte die Zugabe von 20μl Lösung II ( 0,2N NaOH, 1%SDS ) mit
anschließendem Mischen und 5minütiger Inkubation auf Eis. Nach Zugabe von 150ml
Lösung III ( 60ml 5M Kac, 11,5ml Essigsre., 28,5ml H2O ) und weiteren 5 Minuten auf Eis
wurden die Zellwandbestandteile und Fremdproteine durch zweimaliges Zentrifugieren für

3 Material und Methodik 43
5 Minuten bei 11000rpm entfernt. Die DNA wurde schließlich mit ETHO abs. präzipitiert und
bei 14000rpm. abzentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen mit ETHO 70% und
anschließendem Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur wurde die DNA in 20μl 1x TE-
Puffer gelöst.
Die so isolierte DNA wurde dann mit dem entsprechenden Restriktionsenzym verdaut ( 37°C,
1 Stunde ) und auf einem 0,7% Agarosegel aufgetrennt. Dabei konnten die positiven und
negativen Klone anhand der Länge der Inserts unterschieden werden.
Infolge dieser Resultate konnten die entsprechenden positiven Bakterienstämme für die
Gewinnung größerer Mengen Plasmid-DNA ( Maxiprep. ) in 10ml LB-Medium mit 10μl
Ampicillin pro 100μl Kultur angeimpft und über Nacht bei 37°C und 170rpm inkubiert
werden.
3.3.8.2 Plasmidmaxipräparation
Die infolge der Minipräparation angeimpfte Kultur bildete das Ausgangsmaterial für die
Präparation großer Mengen der gewünschten DNA.
Die Präparation der DNA erfolgte mit einem Plasmid-Mini-Kit der Firma Qiagen. Dabei
wurden 3-5ml der gesättigten Kultur eingesetzt, der Rest als Stock ( je 850μl Kultur + 150μl
Glycerin ) bei -70°C eingefroren, um für neue Präparationen zur Verfügung zu stehen.
Die Ausbeute der Präparationen wurde photometrisch bestimmt. Die so isolierte DNA eignete
sich aufgrund ihres höheren Reinheitsgrades gut für die weiteren Manipulationen.
3.3.9 Sequenzierung
Die Sequenzierung erfolgte teils sofort im Plasmid, teils direkt an den PCR-Produkten mit
Hilfe spezifischer Primer, wobei jeweils vom 3`- und vom 5`- Ende her sequenziert wurde.
Dabei konnten jeweils bis zu 450 Nukleotide erfaßt werden.
Für die Sequenzierung im Plasmid mußte die DNA durch verschiedene Restriktionsverdaus
fragmentiert werden. Diese Fragmente wurden dann subkloniert und dienten als
Ausgangsmaterial für die Sequenzierungsreaktionen. Als Primer dienten hier der M13

3 Material und Methodik 44
Universal Sequencing Primer mit der Sequenz 5´-GTAAAACGACGCCCAGT-´3 und der
Reverse Sequencing Primer mit der Sequenz 5´-CAGGAAACAGCTATGAC-´3. Die
Sequenzinformationen wurden durch Computeranalyse und Homologievergleiche zu anderen
Spezies analysiert.
Um verschiedenen Sequenzierungslücken zu schließen sowie als Kontrolle bereits
vorhandener Sequenzinformationen, wurden etliche Sequenzierungen direkt an PCR-
Amplifikaten mit sequenzspezifischen Primern durchgeführt. Die DNA wurde zu diesem
Zwecke wie oben beschrieben aufgereinigt und die genaue Konzentration des Eluates
photometrisch bestimmt.
Die Sequenzierung erfolgte nach der Chain-Termination-Methode ( SANGER und
COULSON, 1979 ), wobei die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff erfolgt.
Die einzelnen Ansätze wurden mit einem Sequenzierungskit der Firma Perkin-Elmer wie folgt
vorbereitet: In ein PCR-Cup wurden 8μl Enzym-Mix ( Polymerase, dNTP`s, ddNTP`s ), 0,5μl
M13-Primer ( for., rev. ), sowie die zu sequenzierende DNA in einer Konzentration von 7ng
pro 100bp in einem Gesamtvolumen von 20μl pipettiert. Die anschließende PCR wurde unter
folgenden Bedingungen durchgeführt:
Denaturierung: 96°C
Annealing: 50°C 25 Zyklen
Extension: 60°C
Die amplifizierten Proben wurden dann nach Aufreinigung am Institut für Hygiene und
Infektionskrankheiten der Tiere der Justus-Liebig-Universität über Nacht auf einem 4,2%
Polyacrylamidgel aufgetrennt und in einem ALF-Sequencer ausgewertet.
3.3.10 Physikalische Kartierung
Die chromosomale Lokalisation von c-fos beim Schwein wurde mittels einer somatischen
Zell-Hybrid-Analyse vom Tierärztlichen Institut der Universität Göttingen durchgeführt. Das
verwendete Hybridpanel bestand aus 27 Zellhybriden aus Schweine- und Hamsterzellen. Es
war 1996 von YERLE et al. und ROBIC et al. entwickelt und mit PCR, FISH,
Zytogenetischen Methoden und QFQ-Bänderung charakterisiert worden.

3 Material und Methodik 45
Die Amplifikation des porcinen c-fos Genes erfolgte dabei mit in der Promotorregion/Exon 1
lokalisierten Primern, FP5U und FP5L ( siehe Tabelle 10 ) im PCR-Ansatz ( Perkin Elmer
Thermocycler 480 ). Dabei wurden 100ng Hybrid-DNA, sowie je eine Schweine- und eine
Nager-DNA als Kontrolle eingesetzt. Das Reaktionsvolumen betrug 50μl mit einer
Primerkonzentration von 20pMol und 40nMol dNTP´s. Des weiteren waren im
Reaktionsansatz enthalten: 1,5mM MgCl2, 10mM Tris-HCl ( pH 8,5 ), 50mM KCl, 0,01%
Gelatine und 1 Einheit Taq-Polymerase ( Pharmacia ). Die PCR wurde mit 32 Zyklen à 94°C,
54°C und 72°C jeweils für 1 Minute durchgeführt. Die Auswertung erfolgte auf einem 2%
Agarosegel in 1x TBE-Puffer.

4 Ergebnisse 46
4. Ergebnisse
4.1 Isolierung und Charakterisierung von c-fos
4.1.1 Isolierung von c-fos aus einer genomischen Genbank vom Schwein
4.1.1.1 Amplifikation eines spezifischen Genabschnittes des c-fos Genes
Als Ausgangsmaterial für die Sonde diente ein mittels PCR amplifizierter Sequenzabschnitt
aus dem Exon 4 des c-fos Genes. Die dazu eingesetzten Primer wurden aus
Homologievergleichen zwischen Maus und Mensch abgeleitet um eine größtmögliche
Übereinstimmung zum porcinen Gen zu gewährleisten. Diese Primer FU4 und FL4 sind 22
bzw.26 Basenpaare lang und binden im Bereich des Exon 4 ( Pos. 2840- 2862 ), bzw. des
3´Endes ( Pos. 3381-3406 ) an die Template-DNA:
FU4: -TCTGAGGAGGCCTTCACCCTGC-
FL4: -TCACGCACAGATAAGGTCCTCCCTAG-
Die Bezeichnung der Primer beinhaltet das F als Abkürzung für fos und ein U ( Sequenz
entspricht Codon ) bzw. L ( Sequenz entspricht Anticodon ) für die Syntheserichtung. Die
Numerierung entspricht der Lokalisation im jeweiligen Exon.
FU4 zeigte eine Homologie von 100%, FL4 von 96% zum porcinen c-fos Gen.
Als Template diente eine genomische, aus Vollblut isolierte DNA vom Schwein. Die PCR
wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt :
Denaturierung 92°C
Annealing 66°C X 25 Zyklen
Extension 72°C.
Das dabei entstandene Amplifikat ist 566 bp lang und konnte durch eine Sequenzanalyse
eindeutig dem Exon 4 des porcinen c-fos Genes zugeordnet werden.

4 Ergebnisse 47
4.1.1.2 Isolierung des c-fos Genes aus der genomischen Genbank vom Schwein
Mit Hilfe der spezifischen Sonden-DNA konnten zwei Klone aus der Genbank isoliert
werden.
Um die eindeutige Zugehörigkeit der in den Phagen klonierten DNA zu dem gesuchten Gen
zu überprüfen, wurde vorerst die DNA in kleiner Menge aus den Phagen isoliert und mit den
für die Sonde synthetisierten Primern in einer PCR eingesetzt. Die Bedingungen entsprachen
denen der Sondenamplifikation. Dabei zeigte sich einer der beiden Isolate als falsch positiv.
Für die weiteren Untersuchungen stand also nur ein Klon λ FE mit einer Insertlänge von ca
11000 bp zur Verfügung.
4.1.2 Kartierung von c-fos
4.1.2.1 Kartierung des gesamten Klons
Der isolierte Klon wurde nun mehreren Restriktionsverdaus zur Erstellung einer ersten
Restriktionskarte unterzogen. Dabei wurden die Enzyme so ausgewählt daß sie eine
Schnittstelle in der Multiple-Cloning-Site des Lambda-Phagen hatten. Die Verdaus wurden
zuerst mit den Enzymen EcoRI und HindIII durchgeführt. Anhand des entstandenen Bildes
konnte folgende vorläufige Restriktionskarte des gesamten Inserts von ca. 12 Kbp erstellt
werden:
0 3 6 9 12 Kbp
H H H H
E E E E E E
E = EcoRI; H = HindIII
Abb. 9: Restriktionskarte des isolierten Insertes

4 Ergebnisse 48
4.1.2.2 Erstellen von Sekundärklonen
Zur weiteren Charakterisierung von c-fos mußte als erstes eine Zuordnung der einzelnen
Fragmente zu dem gesuchten Gen erfolgen.
Nach Einzelverdaus mit den Enzymen EcoRI und Hind III wurde eine Southern-Blot-
Hybridisierung mit einer humanen c-fos-Sonde durchgeführt. Anhand der radioaktiven
Markierung konnten die das gesuchte Gen abdeckenden Fragmente spezifiziert werden. Dabei
zeigten sich die in Abbildung 10 dargestellten 3,5 bzw.4 Kbp großen EcoRI-Fragmente als
am besten geeignet für die Subklonierung in Plasmidvektoren.
0 5 10Kbp
E E E E E
FE3 FE4
= markierte Bereiche
= FE3, FE4
Abb. 10: Lokalisation der markierten Bereiche im Insert
Die beiden EcoRI Fragmente wurden in Plasmidvektoren umkloniert um eine bessere
Handhabung zu gewährleisten.
So entstanden zunächst zwei Sekundärklone FE3 und FE4, die die Grundlage für alle
folgenden Untersuchungen bildeten.
4.1.2.3 Kartierung von c-fos
Die Sekundärklone FE3 und FE4 wurden Einzel-und Doppelverdaus mit den
Restriktionsenzymen BamHI, EcoRV, HincII, HindIII, KpnI, PstI, PvuI, PvuII, RsaI, SacI,
SacII SalI, ScaI, SmaI, XbaI, XhoI und XmaI unterzogen, geeignete Fragmente wurden weiter
subkloniert. Für die Enzyme SalI, HincII, EcoRV, KpnI und XbaI konnten keine
Schnittstellen ausgemacht werden. Die in der Folge erstellte Restriktionskarte von c-fos ist in
Abbildung 11 dargestellt.

4 Ergebnisse 49
Abb. 11: Restriktionskarte des porcinen c-fos Protoonkogens
4.1.3 Komplette Nukleotidsequenz des porcinen c-fos Protoonkogens
4.1.3.1 Übersicht
RsaI
SmaI
PstI
XhoI
0 1000
EcoRI
DraI
SacII SacI PvuII
E1 E2 E
3
2000 3000 4000 bp
Abb.12 : Klonierungsstrategie für c-fos aus einem 11Kbp Lamda-FixII Fragment
E4

4 Ergebnisse 50
Die Klonierungs- und Sequenzierungstrategie ist in Abbildung 12 dargestellt. Als
Ausgangsmaterial für die Erstellung von Subklonen wurden Einzel- und Doppelverdaus
herangezogen.
Alle Klone und Subklone wurden mit den M13 Universal Sequencing- und M13 Reverse
Sequencing Primern von den Enden her ansequenziert und die Sequenzdaten einem
Homologievergleich zu Mensch, Maus und Ratte unterzogen um die Plausibilität der Daten zu
überprüfen. Die Gesamtheit der dabei sequenzierten Abschnitte ergibt sich aus den Pfeilen im
unteren Teil der Abb. 12.
Durch die Homologievergleiche konnten die ansequenzierten Klone den jeweiligen Bereichen
des c-fos Genes genau zugeordnet werden und bildeten die Grundlage für die zweite
Sequenzierungsstrategie mit sequenzspezifischen Primern.
Nicht alle Sequenzinformationen konnten mit den M13 Primern erarbeitet werden, die
bestehenden Lücken wurden durch die direkte Sequenzierung mit sequenzspezifischen
Primern geschlossen.
Anhand der zuerst vorliegenden Sequenzdaten wurden Primer nach den oben beschriebenen
Kriterien ausgewählt und gezielt in Sequenzierungsreaktionen mit den betreffenden Klonen
eingesetzt. Auf diese Weise konnten die Sequenzlücken zuverlässig geschlossen werden, ohne
auf das Vorhandensein von akkuraten Restriktionschnittstellen zur weiteren Klonierung
angewiesen zu sein.
Alle Sequenzabschnitte wurden mindestens zweimal, zumeist in beiden Strängen sequenziert.
Eine Überlappung der Sequenzen ergab sich einerseits daraus daß bestimmte
Sequenzabschnitte mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und dann kloniert wurden,
andererseits durch den gezielten Einsatz der sequenzspezifischen Primer.
Sämtliche Sequenzinformationen liegen somit doppelt und überlappend vor.
Teilweise mußten die Sequenzierungsreaktionen mit mehreren verschiedenen Primern
wiederholt werden. Dies einerseits um Unstimmigkeiten bei der DNA-Sequenz
auszuschließen oder zu korrigieren, andererseits weil einzelne Sequenzierungsreaktionen mit
bestimmten Primern nicht funktionierten.
Tabelle 3 zeigt die für die Sequenzierung synthetisierten Primer mit ihrer jeweiligen
Lokalisation.

4 Ergebnisse 51
Tabelle 3: Übersicht über die eingesetzten Primer zur Sequenzanalyse
Primer Sequenz Lokalisation
FAl gct gac gca gat gtc cta at 365-384
FBu att ggg ctc att cat aaa atg ctg 618-641
FCl gct gag ctg ggt aag agc gc 736-755
FDu gct tca acg ccg act acg ag 830-850
FEu gga gcc ccg gac ttg ttc 1102-1120
FFl cgg ctc tag tta gcc agt c 1251-1270
FGu cac tgg gca ctc cgc tca 1636-1656
FHl gga gac ggc cag atc ggt g 1724-1742
FIl gat ggg gca acc gag gag 1820-1837
FJu cct cgg gtg ggg ctt act cc 1876-1895
FKl gga tac aga gga tac agc a 2618-2636
FLu gag atc gcc aac ctg ctg a 2681-2699
FMu tct gag gag gcc ttc acc ctg c 2840-2861
FNl cat gct gct gac gtt ctt gac tgg 2900-2923
FOu gca acg agc ctt cct ctg a 3228-3246
FPl tca cgc cca gat aag gtc ct 3381-3406
FQu cgc atg gag tgt gta ttg tc 3494-3513
FRl atc agc tgc act aga tac aat t 3664-3685
FSu gat cat gca ttg gtg agg tg 3850-3869
Die einzelnen Primer sind duchlaufend nach ihrer Lokalisation im c-fos Gen alphabetisch
numeriert ( A-S ), wobei das F am Anfang für Fos, und die Kleinbuchstaben u oder l am Ende
für die Amplifikationsrichtung (u: Sequenz entspricht Codon; l: Sequenz entspricht
Anticodon) stehen.

4 Ergebnisse 52
4.1.3.2 Nukleotidsequenz
Das c-fos Protoonkogen vom Schwein wurde über einen Bereich von 4200 Basen sequenziert
und die einzelnen Sequenzinformationen per Computeranalyse aufgearbeitet.
Dabei ergab sich die in Abbildung 13 dargestellte Sequenz, die in der EMBL-Genbank unter
der Acc.No.AJ132510 abgelegt ist.
TCTGCTTCCA CAGTTTGCAC CGAATTAGTG ATAGAATGAG GAATGGGGGT GGAGGCGCAT 60
TCCTTCGGGG GCCAAGGCTT AAGCCCAAGG GGCTGTGTAC CTATCTCGCC TATACCTGAA 120
CCTCAGAACT CTTCCCGGGT TTCTGTACAC AAGTAAAAAG GCGCCTACGC CCCATCCCCC 180
AACCCCGGGA ACAAGGGTCC GCATTGAACC AGGTGCGAAT GTTCGCTCGC CTTCTCTGCC 240
TTTCCCGCCT CCCCTCCCCC CGGCCACGGC CCCCGCCTCC CCCCCGCGCT GCACCCTTGG 300
TGTTGGCTGC AGCCCGCGAG CAGTTCCCGT CAATCCCTCC CTCCCGTTTA CACAGGATGT 360
CArG SRE E-Box AP1
CCATATTAGG ACATCTGCGT CAGCAGGTTT CCACGGCCGT TCCCTGAAGT TGTGGGGGGA 420
GCCATCCCCG AAGTCCCTCA TTTTAGGGGG TCTACGCGAC CCCAAGACCG AGACTGAGAA 480
AAGCTCAGAA GATAAAGAAA CACAATAAGA CGAAAGGCAG GGGGCTGAGA CGGCGGAAGA 540
GGCAGCAAAG AGGCTGCAGA GGTGGCAAGA TCCGAGCGCC ACCCCTCGAG AGCTGCAATG 600
CRE
GTAGCGCTCC GTGACGTATT GGGCTCATTC ATAAAATGCT GTTATAAAAG CAGTGGCCTA 660
CAP-Site
GTACTCCAAC CGCATCTGCA GCGAGCAGCT AAGCTGAGAC AGAACCGGCA GCGGCGCAGC 720
GAGCGAGCAG CGACCGCGCT CTTACCCAGC TCAGCCCCGC AGCTCCTACC TGTCTCCGCC 780
Exon 1
CCTCAGCCCC TCGCCCGGCT TTGACTACCT GCGATCATGA TGTTCTCCGG CTTCAACGCC 840
GACTACGAGG CGTCATCATC CCGCTGCAGC AGCGCCTCCC CTGCCGGGGA CAGTCTCTCC 900
TACTACCACT CACCGGCCGA CTCCTTCTCC AGCATGGGCT CTCCCGTCAA TGCGCAGGTA 960
AGGCTGGCTT CGTGCCACCG CGGGGCTCGG GGCTCGGGGT TACCGGGGAG GAGACACTGG 1020
GACGGGACGC TCAGGAAGAC AAGCCGGGGA CCCCATTGGC CAGAGAGGGA GGCTTGCCCC 1080
GGCCGGATCA GCCCTATCTC GGGAGCCCCG GACTTGTTCG GAGCGCACAC ATGCTTGTCA 1140
AAATAAGAAT CTTTTCTCCT CTCCCGCTGT GGGCTCATTC TGAGCTGACC CTGGCCCACG 1200
Intron 1
CGCTCTGACT GGTCTCTGAC ATTAGCTGGG GGCAAAAGTG TCCCAAGCAA AGACTGGCTA 1260
ACTAGAGCCG GGCACCTCCG GGGGAGGAGG CAAAAAGCGG CGATCCTCCC TCCCCTCGCA 1320
GCCTGGAGCA GGGAGGAGGG TGAGAGGAGG AGGGTGAAGC CGGCGGGTGT GTAAGGCAGT 1380

4 Ergebnisse 53
TTCATTGATA AAAAGCGAGT TCATTCAGGA GACTCCGGAG CGGCGTCTGC GTCAGCGCAG 1440
ACGTCAGGGA TATTTATAAC AACCCCCCTT TCAAGCGAGT GATGCTGAAG GGATAACGGG 1500
AACGCAGCAG CAGGATGGAG GAGAAAGGCA CTGCGCTGCG GAATTCTTGG GAAGGGAGAG 1560
ACCTTTCATC CAGGATGAAG GACATATAAA AATACATAAG CAGTCCATTT TTCACTCTCT 1620
CCCTGCTGCA TGCGGCACTG GGCACTCCGC TCACCCCACC TGCGTCCAGA GCCTGGTCGC 1680
Exon 2
TCACGTCAGC TTTCCCCTTC TATATTTCAT TCTAGGACTT CTGCACCGAT CTGGCCGTCT 1740
CCAGTGCCAA CTTCATCCCA ACGGTGACTG CTATCTCGAC CAGCCCAGAC CTGCAGTGGC 1800
TAGTGCAACC CACCCTGGTC TCCTCGGTTG CCCCATCCCA GACCAGAGCC CCTCACCCCT 1860
ACGGAGTCCC CACTCCCTCG GCTGGGGCTT ACTCCAGGGC TGGAGTCGTG AAGACCATGC 1920
CAGGAGGCAG AGCTCAGAGC ATTGGCAGAA GGGGCAAGGT GGAACA GGTG AGGGTTCTCA 1980
ACACCTTCTC TCTGGTGGTG GCTGGGGTTG GGGGGGTAAG GTCAGTCTTG ATGGAGATGG 2040
GGAGCATAGT GGACAGGGTG AAGCCATGGG TGGAACTGAT TACATATCCT GGACTGGGAA 2100
CCCCGGCTCC AAGCCCTATC CATCCCAAGT CAGACTCTAA TAGTCCACCC TAAGTAATAT 2160
Intron 2
CCAATGTGCA GTTTCTTCCC TAATAGTTTC TTATCTCACC CTTGTAGCTT CTCTTTGTTC 2220
TCCTGCTGAG GTTCTTATTT TAAATGCAAG TCACACCCAG CTTGCAACTG CAGGTTAGAA 2280
ATGGCTTCAC AGAAGAGGTG CCAGGAGGCG GGAAGCTGCA GGCGCCAGTT TTCCTAGGGT 2340
GGGTGAACGG AGCTGATAGC AGGCACTGTT ACTGAATGTT GCCCTCTCTC TCTCTCCCCA 2400
Exon 3
CCTCCAGTTG TCCCCAGAAG AAGAAGAGAA AAGGAGAATC CGAAGGGAAA GGAATAAGAT 2460
GGCTGCAGCC AAATGCCGGA ACCGGAGGAG GGAGCTGACT GACACACTCC AAGCGGTAGG 2520
TAGAATCCAT GGATCACTTC TTTCGAAAAC TTAAGGGCAA AGTTAGAGAC TGGGTAGAAG 2580
Intron 3
GGAACAGAGT CTTTGAGTAA GACCGTGTCT TATGCTTTGC TGTATCCTCT GTATCCAGGA 2640
Exon 4
GACAGACCAG CTAGAAGACG AGAAGTCTGC TTTGCAGACT GAGATCGCCA ACCTGCTGAA 2700
GGAGAAGGAA AAACTCGAGT TCATCCTGGC AGCTCACCGA CCTGCCTGCA AGATCCCTGA 2760
TGACCTGGGC TTCCCTGAAG AGATGTCTGT GGCTTCCCTT GATCTGAGTG GGGGCCTGCC 2820
TGAGGCTGCC ACCCCCGAAT CTGAGGAGGC CTTCACCCTG CCCCTCCTCA ATGACCCGGA 2880
GCCCAAGCCC TCCGTGGAGC CAGTCAAGAA CGTCAGCAGC ATGGAGCTGA AGGCCGAGCC 2940
CTTTGATGAC TTCCTGTTCC CAGCATCGTC CAGGCCCGGC GGCTCTGAGA CAGCCCGCTC 3000
TGTGCCGGAC ATGGACCTGT CTGGTTCCTT CTATGCAGCA GACTGGGAGC CCCTGCATGG 3060
TGGCTCCCTG GGGATGGGGC CCATGGCCAC AGAGCTGGAG CCCCTGTGTA CCCCGGTGGT 3120

4 Ergebnisse 54
CACCTGCACC CCCAGCTGCA CTACTTACAC GTCTTCCTTC GTCTTTACCT ACCCCGAGGC 3180
TGACTCCTTC CCCAGCTGTG CGGCTGCCCA CCGCAAGGGC AGCAGCAGCA ACGAGCCTTC 3240
CTCTGACTCG CTCAGCTCAC CCACGCTGCT GGCCCTGTGA GCGGGCAGAG AGGGGAGGCA 3300
GCAGGCAGGC ACGCGCCACT GCCCGAGTCG GTGCATTATG GAGAGGAGAA ACACGTCTTC 3360
CCTCGAGGGT TCCCGTAGAC CTAGGGAGGA CCTTATCTGG GCGTGAAACA CACCACCAGG 3420
CCGTGGGCCT CAAGGACTTG AAAGCATCCA CGTGTGGACT CGAGTCCTTA CCTCTTCTGG 3480
AGATGTAGCA AAACGCATGG AGTGTGTATT GTCCCCAGTG ACACATCTGA GAGCTGGTAG 3540
TTAGTAGCAT GTTGAGCCAG GCCTGGGTCT GTGTCTCTTT TTCTCTTGCT CTTTAGTCTT 3600
CTCATAGCAT TAACTAATCT ATTGGGTTCA TTATTGGAAT TAACCTGGTG CTGGATATTT 3660
TCAAATTGTA TCTAGTGCAG CTGATTTTAA CAATAACTAC TGTGTTCCTG GCAATAGTGT 3720
GTTCTGATTA GCGATGACCA ATATTAAACT AAGCAAAGAT ATGACTTTAT TTTCTAGTAG 3780
Poly A
ATAGAAATAA ATAGCTATAT CCATGTACTG TAGTTTTCCT TCGGCATCAA TGTTCATTGT 3840
AATGTTACTG ATCATGCATT GGTGAGGTGG TCTGAATGTT CTGACATTAA CAGTTTTCCA 3900
TGAAAACGTT TTATTGTGTT TTTAATTTAT TTATTAAGAT GGATTCTCAG ATATTTATAT 3960
TTTTATTTTA TTTTTTTCTA CCTTGAGGTC TTTTGACATG TGGAAAGTGA ATTTGAATGA 4020
Poly A
AAAATTTAAG CATTGTTTGC TTATTGTTCA AAGACATTGT CAATAAAAGC ATTTACGTTG 4080
AATGCGACCA ACCTTGAGCC CTTTTCATTC TGGAAGTTCG GTAAGCGTCT GAGAGGTATT 4140
ATCGGAGACC AGTTTGTCGA GAAGGGCAGC TCCTGGAGGG GACACACCCC TCTGTTAGAT 4200
Abb. 13: Nukleotidsequenz des porcinen c-fos Protoonkogens
Die Exonbereiche sind eingerahmt. Die wichtigsten Abschnitte des Promotorbereiches sind
mit Grautönen hinterlegt.
Die Sequenz ist in Folgen von 10 Basen eingeteilt mit je 60 Basen/Zeile. Die Position der
letzten Base einer Zeile ergibt sich aus der Zahlenangabe hinter der Zeile.
Die Lokalisation der wichtigsten Sequenzbereiche ist der besseren Übersicht wegen in
Abbildung 14 schematisch dargestellt.
E 1 E 2 E 3 E 4 Poly-A1/2
TATA CAP
817-957 1716-1967 2408- 2639-3280
2515
0 1 2 3 4 5Kbp
Abb. 14: Schema des porcinen c-fos Protoonkogens mit Exon-und Intronbereichen

4 Ergebnisse 55
Das gesamte Gen erstreckt sich von der TATA-Box an Position 653 bis 659 bis zum Poly-A2
Signal über 3425 Basenpaare. Die genaue Analyse der Basenzusammensetzung der Sequenz
ergibt folgenden prozentualen Anteil der einzelnen Basen ( mit der absoluten Anzahl in
Klammern ):
% A = 22,38 ( 944 )
% G = 26,83 ( 1127 )
% T = 22,95 ( 964 )
% C = 27,74 ( 2292 )
% A+T = 45,43 ( 1908 )
% C+G = 54,57 ( 2292 )
Das 5´Ende hat im Gegensatz zum 3´Ende einen sehr hohen G + C-Anteil von 59,56%.
Dahingegen überwiegen im 3´Ende die Basen A und T mit einem prozentualen Anteil von
58,19%.
Im Gegensatz zu anderen Spezies enthält das porcine c-fos Gen analog zum humanen Gen
zwei Poly-A Signale ( Position 3785-3793 und Position 4062-4068 ) am 3´-UTR, wobei das
zweite als das für die Transkription ausschlaggebende anzusehen ist.
Von der CAP-Site bis zum zweiten Poly-A-Signal ergibt sich ein primäres Transkript von
3403 bp. Der Vergleich der Konsensussequenzen für RNA splice acceptor- und donor-
Bereiche ermöglicht analog zu allen bisher untersuchten Spezies eine Unterteilung in drei
Intron- und vier Exonbereiche.
Die kodierende Region beginnt mit einem Startkodon ATG an Position 817 der EMBL-
Sequenz und endet mit dem Terminierungskodon TGA an Position 3280.
Das Exon 1 beginnt mit Nukleotid 817 und endet mit Nukleotid 957. Exon 2 erstreckt sich
von Position 1716 bis 1967 . Exon 3 ist mit 107 Basenpaaren von Position 2408 bis 2515 das
kürzeste. Exon 4 befindet sich zwischen Position 2639 und 3280.

4 Ergebnisse 56
4.1.3.2.1 Das 5´ Ende
Der regulatorische Bereich des porcinen c-fos Genes am 5´-Ende weist verschiedene
charakteristische Sequenzen auf die für die Beeinflussung der Genexpression durch
verschiedene Faktoren wichtig sind. Sie sind in Abbildung 15 eingerahmt.
Das Dyad Symmetry Element ( DSE ) oder Serum Response Element ( SRE ) erstreckt sich
als wichtigstes Element für die Grundregulation über 27 Basenpaare ( 56-82 ) und ist
unentbehrlich für die Induktion des Genes durch Serum, PDGF, TPA oder EGF und andere.
Tabelle 4 zeigt die mit dem SRE überlappenden regulatorischen Elemente mit ihrer jeweiligen
Funktion und Lokalisation.
Tabelle 4: Regulatorische Elemente im SRE-Bereich des c-fos Genes
Element Bindestelle für Lokalisation
CarG Serum Response Element 362-370
E-Box MyoD 370-375
AP1 AP1 376-382
Das gesamte SRE stellt sich bei Schwein, Mensch und Maus als 100% homologe Sequenz
dar, was die wichtige Funktion hervorhebt ( Abbildung 15 ) .
CarG E-Box AP 1
Schwein GATGTCCATATTAGGACATCTGCGTCA
Mensch GATGTCCATATTAGGACATCTGCGTCA
Maus GATGTCCATATTAGGACATCTGCGTCA
SRE
Abb. 15 : Serum Response Element von Schwein, Mensch und Maus

4 Ergebnisse 57
Als weitere wichtige Sequenz im regulatorischen Bereich kann das CRE ( Calcium Response
Element ) gedeutet werden, das sich beim Schwein von Position 411-420 über 9 Basenpaare
erstreckt und für die direkte Beeinflussung der Expression des Genes durch Calcium und
cAMP verantwortlich ist. Dieses Element stellt sich beim Menschen durch die Deletion eines
Nukleotids leicht unterschiedlich zu Schwein und Maus dar ( Abbildung 7 ).
CRE
Schwein TGACGTATT
Mensch TGACGT –TT
Maus TGACGTATT
Abb. 16: Calcium Response Element von Schwein, Maus und Mensch
Der Vergleich des 5´Endes von Schwein, Mensch und Maus zeigt folgende Homologiewerte:
Schwein-Mensch 78,4%, Schwein-Maus 67,1%.
4.1.3.2.2 Sekundärstrukturen
Die Untersuchung der Sequenz auf spezifische Nukleotidanordnungen in Form von
Palindromen, Repeats oder Hairpin-Loops wurde mit dem DNAsys-Computerprogramm
durchgeführt.
An Position 982 befindet sich das mit 18 Basenpaaren längste Palindrom mit der Sequenz
5´-GGGGCTCGGGGCTCGGGG-3´.
Ein 17 Nukleotide zählendes Palindrom 5´-CCCTCTCTCTCTCTCCC-3´ ist an Position 2382
lokalisiert.
Die Nukleotidpositionen 3834 und 3966 zeigen zwei 16 Basenpaare lange Palindrome mit den
Sequenzen 5´-TCATTGTAATGTTACT-3´ bzw. 5´-TTTTTATTTTATTTTT-3´.
Der längste Repeat von 12 Nukleeotiden befindet sich an den Positionen 1332 und 1346, die
Sequenz lautet 5´-GGAGGAGGGTGA-3´.
Des weiteren konnten vier von der Länge her bedeutende Hairpin-Loops lokalisiert werden.
Zwei davon sind in Intronbereichen lokalisiert, der erste befindet sich im Bereich des Intron 1
( Basen 1424-1444 ), ein weiterer stellt sich im Bereich des Intron 2 ( Basen 2244-2266 ) dar.

4 Ergebnisse 58
Zwei weitere befinden sich auf Höhe von Exon 4 ( Basen 3045-3068, Basen 3202-3223 ).
A C
C C
C A A C
T G C A
G-C T G
C-G G-C
G-C A-T
T-A A-T
C-G C-G
T-A G-C
G-C T-A
-GAGCGGC GTCAGGG- -TTAAA ACTGCA-
1424 1444 2244 2266
C A
G T G
T G C C
C G C A
C T A A
C-G C-G
C-G C-G
G-C C-G
A-T G-C
G-C T-A
G-C C-G
G-C G-C
-CAGACT TGGGGA- -TGTGCG AGCAGC-
3045 3068 3202 3223
Abb. 17: Hairpin-Loops im Bereich Intron 1, 2 und Exon 4

4 Ergebnisse 59
4.1.3.3 Homologievergleich mit dem Menschen
Die Homologie zwischen Schwein und Mensch beträgt für das gesamte Gen 84,8%.
Aufgeteilt auf die einzelnen Bereiche lassen sich bedeutende Unterschiede feststellen, wobei
erwartungsgemäß die Exonbereiche die höchsten Homologien aufweisen. Sie betragen für die
Exons 1-4 90,6%; 89,7%; 96,3% und 94,2%. Auch das 3´-Ende weist mit 93,2% einen sehr
hohen Homologiegrad auf.
Die Homologiewerte der Intronbereiche1-3 liegen mit 78,8%; 71% und 71,8% deutlich unter
den oben beschriebenen Homologien, sind jedoch immer noch beachtlich hoch für zwei
unterschiedliche Spezies. Das 5´-Ende mit dem Promotorbereich weist einen Homologiewert
von 78,7% auf.
%
Ho
mo
log
ie
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
78,7
5´
En
de
90,8
Ex
on
1
78,8
Int
ron
1
89,7
Abb. 18: Homologie zwischen Schwein und Mensch
Ex
on
2
71
Int
ron
2
96,3
Ex
on
3
71,8
Int
ron
3
94,2 93,2
Ex
on
4
3´
En
de

4 Ergebnisse 60
Die genaue Analyse der Sequenzabschnitte beider Spezies zeigt daß die Bereiche mit den
geringsten Homologiewerten Basendeletionen oder -Insertionen von 5 bis 8 Basenpaaren
enthalten.
So befinden sich im Bereich des 5´Endes zwei Deletionen von 6 bzw. 8 Basenpaaren an
Position 100 bzw. 658 beim Schwein. Eine weitere von 5 Basenpaaren ist im Intron 1 an
Position 1554 lokalisiert.
Auch im Bereich des Intron 2 mit dem niedrigsten Homologiegrad befindet sich eine 6
Basenpaare-Deletion an Position 2207 im Vergleich zur humanen Sequenz.
Schließlich ist im Bereich des Intron 3 an Position 2582 beim Schwein eine 7 bp Insertion
vorhanden.
4.1.4 Das c-Fos Protein
4.1.4.1 Die Aminosäuresequenz von c-Fos
Das c-fos Gen kodiert für ein Protein von 380 Aminosäuren. Die entsprechende c-DNA
erstreckt sich über 1143 Nukleotide von Exon 1 bis Exon 4 und enthält folgende Basenanteile
in Prozent:
Tabelle 5: Prozentualer Anteil der einzelnen Basen an der c-DNA von c-fos
A T G C
20,47% 18,37% 27,12% 34,03%

4 Ergebnisse 61
Die Abbildung 19 zeigt die Aminosäuresequenz vom Schwein ( 1. Zeile ) im Vergleich zum
Menschen ( 2. Zeile ).
1 25 50
MMFSGFNADYEASSSRCSSASPAGDSLSYYHSPADSFSSMGSPVNAQDFCTDLAVS
MMFSGFNADYEASSSRCSSASPAGDSLSYYHSPADSFSSMGSPVNAQDFCTDLAVS
75 100
SANFIPTVTAISTSPDLQWLVQPTLVSSVAPSQTRAPHPYGVPTPSAGAYSRAGVVKT
SANFIPTVTAISTSPDLQWLVQPALVSSVAPSQTRAPHPFGVPAPSAGAYSRAGVVKT
125 Basische 150 Region
MPGGRAQSIGRRGKVEQLSPEEEEKRRIRRERNKMAAAKCRNRRRELTDTLQAETD
MTGGRAQSIGRRGKVEQLSPEEEEKRRIRRERNKMAAAKCRNRRRELTDTLQAETD
175 Leucin-Zipper 200 225
QLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKIPDDLGFPEEMSVASLDLSGGLP
QLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKIPDDLGFPEEMSVASLDLTGGLP
250 275
EAATPESEEAFTLPLLNDPEPKPSVEPVKNVSSMELKAEPFDDFLFPASSRPGGSETA
EVATPESEEAFTLPLLNDPEPKPSVEPVKS I SSMELKTEPFDDFL FPASSRPSGSETA
300 325
RSVPDMDLSGSFYAADWEPLHGGSLGMGPMATELEPLCTPVVTCTPSCTTYTSSFV
RSVPDMDLSGSFYAADWEPLHSGSLGMGPMATELEPLCTPVVTCTPSCTAYTSSFV
350
FTYPEADSFPSCAAAHRKGSSSNEPSSDSLSSPTLLAL 380
FTYPEADSFPSCAAAHRKGSSSNEPSSDSLSSPTLLAL 380
Abb. 19: Aminosäurensequenz vom porcinen und humanen c-Fos
Die Aminosäurenaustausche im Vergleich zum Schwein sind bei der humanen Sequenz grau
hinterlegt. Die Homologie zwischen Mensch und Schwein beträgt insgesamt 96,8 %.
Das porcine Protein enthält 33 basische ( K, R ) und 51 saure ( D, E ) Aminosäuren. Davon
sind 113 hydrophob ( A, I, L, F, W, V ) und 111 polar ( N, C, Q, S, T, Y ). Der Isoelektrische
Punkt liegt bei 4,675 und die Ladung bei pH 7,0 entspricht –17,435.
Die genaue Ausprägung und Anzahl der der Translation zugrunde liegenden Kodons wird aus
der Tabelle 5 ersichtlich.

4 Ergebnisse 62
Tabelle 6: Anzahl der benutzten Kodons für die Translation von c-Fos
gca Ala(A) 5 cag Gln(Q) 7 uug Leu(L) 2 uaa Ter(.) 0
gcc Ala(A) 18 --- Gln(Q) 9 --- Leu(L) 32 uag Ter(.) 0
gcg Ala(A) 4 gaa Glu(E) 9 aaa Lys(K) 3 uga Ter(.) 1
gcu Ala(A) 12 gag Glu(E) 22 aag Lys(K) 11 --- Ter(.) 1
--- Ala(A) 39 --- Glu(E) 31 --- Lys(K) 14 aca Thr(T) 4
aga Arg(R) 4 gga Gly(G) 3 aug Met(M) 10 acc Thr(T) 11
agg Arg(R) 8 ggc Gly(G) 11 --- Met(M) 10 acg Thr(T) 3
cga Arg(R) 2 ggg Gly(G) 5 uuc Phe(F) 13 acu Thr(T) 6
cgc Arg(R) 3 ggu Gly(G) 2 uuu Phe(F) 2 --- Thr(T) 24
cgg Arg(R) 2 --- Gly(G) 21 --- Phe(F) 15 ugg Trp(W) 2
cgu Arg(R) 0 cac His(H) 4 cca Pro(P) 7 --- Trp(W) 2
--- Arg(R) 19 cau His(H) 1 ccc Pro(P) 18 uac Tyr(Y) 7
aac Asn(N) 6 --- His(H) 5 ccg Pro(P) 4 uau Tyr(Y) 1
aau Asn(N) 3 aua Ile(I) 0 ccu Pro(P) 7 --- Tyr(Y) 8
--- Asn(N) 9 auc Ile(I) 6 --- Pro(P) 36 gua Val(V) 0
gac Asp(D) 16 auu Ile(I) 1 agc Ser(S) 13 guc Val(V) 9
gau Asp(D) 4 --- Ile(I) 7 agu Ser(S) 3 gug Val(V) 8
--- Asp(D) 20 cua Leu(L) 2 uca Ser(S) 4 guu Val(V) 1
ugc Cys(C) 6 cuc Leu(L) 6 ucc Ser(S) 19 --- Val(V) 18
ugu Cys(C) 2 cug Leu(L) 21 ucg Ser(S) 5
--- Cys(C) 8 cuu Leu(L) 1 ucu Ser(S) 9
caa Gln(Q) 2 uua Leu(L) 0 --- Ser(S) 53
4.1.4.2 Räumliche Anordnung
Das c-Fos Protein zeigt ein charakteristisches bZIP-Motiv ( AS 82- 135 ), bestehend aus dem
Leucin-Zipper ( 107-135 ) mit insgesamt 7 Leucinen im Abstand von je 4-5 Aminosäuren und
der davor liegenden basischen Region ( 82-101 ) mit auffallend vielen basischen
Aminosäuren.
Die Formation von aktiven DNA-bindenden AP1 Komplexen durch Dimerisation mit c-Jun
erfolgt auf Höhe des Leucin-repeats in Form einer coiled-coil-Struktur. Die Darstellung des
betreffenden Sequenzabschnittes in Form einer α-Helix ( Abbildung 20 ) verdeutlicht diese
Rolle.

4 Ergebnisse 63
a
d
E A
L E
K Q A
I E S
K Q D
T e D
T b
L
L c
L g T
L E Q
L E A
E N
E K
I A
Abb. 20: Räumliche Anordnung des Fos-Proteins
f ADTKF
Das Protein ordnet sich in diesem Bereich in Form einer α-Helix an, wobei jede siebte
Aminosäure an eine bestimmte Position zu liegen kommt ( a bis g ). Die Positionen a und d
werden dabei von hydrophoben Aminosäuren eingenommen und bilden die Berührungsfläche
zur Bildung der coiled-coil Struktur mit dem Dimerisationspartner c-Jun. Dabei wird die
Position d von den Leucinresten des Leucin-Zippers gebildet. Auf der gegenüberliegenden
Seite der Helix befinden sich hydrophile Aminosaürereste mit geladenen Seitengruppen.
Es ensteht somit eine amphipatische Helix.
Die basische Region befindet sich exakt sieben Aminosäuren N-terminal des ersten Leucins
und besteht aus 16 Aminosäuren. Dies führt zu einer spezifischen dreidimensionalen Struktur
zwischen Leucin-Zipper und der DNA-Kontaktfläche innerhalb der basischen Region und
spezifiziert somit die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors.

4 Ergebnisse 64
4.1.4.3 Vergleich zu anderen Spezies
Der direkte Vergleich der Proteinsequenzen von Schwein, Mensch, Maus und Huhn ergibt
folgende Homologiewerte ( Tabelle 7 ).
Tabelle 7: Übereinstimmung und Differenz der Aminosäurenzusammensetzung von
Fos bei Schwein, Mensch, Maus und Huhn.
Schwein Mensch Maus Huhn
Schwein 96,8 94,7 72,5
Mensch 3,2 94,5 71,4
Maus 5,5 5,7 70,3
Huhn 21,7 23,2 25,5
Die Zahlen oben rechts geben die prozentuale Übereinstimmung, die Zahlen unten links die
prozentuale Differenz wieder.
Die Homologien in der Aminosäurensequenz liegen mit 96,8% bei Schwein und Mensch und
mit 94,7% bei Schwein und Maus in einem recht hohen Bereich. Beim Huhn liegt dieser Wert
mit 72,5% zum Schwein, respektiv 71,4% bzw. 70,3% zu Mensch und Maus deutlich
niedriger.
Diese Werte beziehen sich auf das gesamte Protein, ohne Unterschiede bezüglich der
einzelnen funktionellen Domänen. Betrachtet man die Sequenzen in Bezug auf die
verschiedenen funktionellen Bereiche, so kann man feststellen, daß erwartungsgemäß diese
Bereiche weniger von Austauschen betroffen sind ( Abbildung 21 ). Dies verdeutlicht die
wichtige Funktion dieser Sequenzabschnitte. Nur beim Huhn gibt es in dieser Region zwei
ausgetauschte Aminosäuren im Vergleich zu den anderen Spezies.

4 Ergebnisse 65
30
1. MMFSGFNADYEASSSRCSSASPAGDSLSYYHSPADSFSSMGSPVNAQDFCTDLAVS
2.
3. T A S
4. YQ AGE T P S
60 90
SANFIPTVTAISTSPDLQWLVQPTLVSSVAPSQTRAPHPYGVPTPSAG-AYSRAGVVK
A F A -
L Q - A M
V I N G- A APPA - PA L
120 basische Region 150
TMPGGRAQSIGRRGKVEQLSPEEEEKRRIRRERNKMAAAKCRNRRRELTDTLQAET
T
VS
KAP Q
Leucin-Zipper 180 210
DQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKIPDDLGFPEEMSVAS-LDLSGGL
- T
T
E A M EE R S LAA TA GAPS
240 270
PEAATPESEEAFTLPLLND-PEPKPSVEPVKNVSSMELKAEPFDDFLFPASSRPGGSET
V - S I T S
S - L S I NV T S
A - - - - A MTEA PAV PK - - S G GL EL S GR - - - - A
300 330
ARSVPDMDLSG- -SFYAADWEPLHGGSLGMGPMATELEPLCTPVVTCTPSCTTYTSSF
- - S A
S V - - SN V G
S P AS S GA G - - - - - - CPS T
360
VFTYPEADSFPSCAAAHRKGSSSNEPSSDSLSSPTLLAL
A
Abb. 21: Lokalisation der einzelnen Aminosäurenaustausche bei Mensch ( 2. Zeile ),
Maus ( 3. Zeile ) und Huhn ( 4. Zeile ) im Vergleich zum Schwein
( 1. Zeile )

4 Ergebnisse 66
Die jeweiligen Positionen ergeben sich aus der Numerierung oberhalb der Sequenz. Die
ausgetauschten Aminosäuren im Vergleich zum Schwein sind in den jeweiligen Zeilen
angegeben.
Grau hinterlegt sind die funktionellen Regionen mit den respektiven Austauschen. Die Pfeile
oberhalb der Sequenz geben die Position der Introns auf dem Nukleotidlevel an.
Die Beteiligung der einzelnen Aminosäuren an den Austauschen kann aus der Tabelle 8
entnommen werden.
Tabelle 8: Häufigkeit der Austausche zwischen den einzelnen Aminosäuren
C S T P A G N D E Q H R K M I L V F Y
C 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
S 0 6 7 9 6 3 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0
T 0 0 0 14 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P 0 1 0 3 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
A 0 1 5 0 6 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0
N 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
D 0 0 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
A= Ala; C= Cys; D= Asp; E= Glu; F= Phe; G= Gly; H= His; I= Ile; K= Lys; L0 Leu; H= Met;
N= Asp; P= Pro; Q= Gln; R= Arg; S= Ser; T0 Thr; V= Val; W= Trp; Y= Tyr
Die proteinspezifischen Daten lassen sich für die angesprochenen Spezies aus der Tabelle 9
entnehmen. Sie wurden aus den jeweiligen Sequenzen abgeleitet.

4 Ergebnisse 67
Tabelle 9: Eckdaten des c-Fos Proteins von Schwein, Mensch, Maus und Huhn
Schwein Mensch Maus Huhn
AS-Anzahl 380 380 380 367
basische AS 33 33 33 33
saure AS 51 51 50 48
hydrophobe AS 113 116 112 117
polare AS 111 111 118 98
Isoel. Punkt 4,675 4,675 4,418 4,742
Ladung ph 7 -17,435 -17,434 -16,435 -14,763
Bei allen oben aufgeführten Spezies handelt es sich bei dem Genprodukt von c-fos um ein
saures hydrophobes Protein mit einer sehr ähnlichen Zusammensetzung.
4.2 Chromosomale Lokalisation von c-fos
Physikalische Kartierung
Die chromosomale Lokalisation von c-fos wurde vom Tierärztlichen Institut der Universität
Göttingen durchgeführt. Sie erfolgte mit Hilfe der Primer P5U und P5L ( Tabelle 10 ) mittels
Screening eines Schweine-Nager-Zellhybrid-Panels.
Das Gen konnte auf dem Chromosom SSC 7 q ( P = 1,0 ) des Schweines lokalisiert werden.
Innerhalb von Chromosom 7 zeigten die Regionen q12-q23 und die Region q26 mit P =
0,4494 und einer Korrelation ϕ = 0,92 die höchsten Wahrscheinlichkeiten.
Tabelle 10: Wahrscheinlichkeiten und Korrelationen zur Lokalisation der
chromosomalen Region vom c-fos Gen des Schweines.
Region P Korrelation
q12-23 0,4494 0,92
q26 0,4494 0,92

4 Ergebnisse 68
4.3 Sequenzunterschiede des c-fos Genes bei Schweinen unterschiedlicher
Rasse und Konstitution
Als Grundlage für weitergehende Sequenzanalysen mit Hilfe von eventuell vorhandenen
RFLP´s sollten in einem ersten Schritt die konstitutionell sehr unterschiedlichen Rassen
Pietrain und Meishan auf Sequenzunterschiede untersucht werden.
4.3.1 Sequenzinformationen bei Pietrain und Meishan
Aufgrund der sehr hohen Homologie zwischen den einzelnen Spezies wurde die Suche nach
Sequenzunterschieden zwischen den Rassen mit Hilfe von spezifischen PCR-Systemen zur
Amplifikation definierter Sequenzabschnitte durchgeführt. Dieses Verfahren ermöglicht die
Darstellung auch einzelner Basenaustausche, ohne auf das Vorhandensein von Schnittstellen
definierter Restriktionsenzyme angewiesen zu sein.
Um die möglichst vollständige Darstellung der Sequenz für beide Rassen zu gewährleisten
wurden 7 verschiedene PCR-Systeme entwickelt, deren Amplifikate einen Großteil des Genes
abdecken. Als Grundlage für die einzelnen Amplifikationen wurden in einem ersten Schritt
kompatible Primerpaare aufgrund der vorhandenen kompletten Sequenz vom Schwein
ausgesucht. Die Tabelle 11 gibt einen Überblick über die eingesetzten Primer und ihre
Lokalisation.
Tabelle 11: Primerkombinationen zur Amplifizierung verschiedener Bereiche des cfos
Protoonkogens aus genomischer DNA unterschiedlicher
Schweinerassen
Upper Primer Lokalisation Lower Primer Lokalisation Produkt (bp)
FP2U 1102-1119 FP2L 1724-1742 Poly 2 ( 640 )
FP1U 1724-1742 FP1L 2491-2515 Poly 1 ( 791 )
FP4U 3387-3406 FP4L 3850-3870 Poly 4 ( 483 )
FP6U 2840-2861 FP6L 3381-3406 Poly 6 (566 )
FP5U 532-552 FP5L 1014-1033 Poly 5 ( 481 )
FP9U 2491-2515 FP9L 2900-2923 Poly 9 ( 432 )
FPendU 3850-3870 FPendL 4180-4200 Polyend (350 )

4 Ergebnisse 69
Die Bezeichnung der einzelnen Primer enthält den Buchstaben F für c-fos, den Buchstaben P
für Polymorphismensuche und die Buchstaben U bzw. L für upper oder lower. Die
Numerierung entspricht der Reihenfolge der durchgeführten Reaktionen, wobei die
Numerierungslücken sich aus nicht erfolgreichen Amplifikationsversuchen erklären.
Die PCR-Bedingungen mußten für jede einzelne Primerkombination optimiert werden, wobei
die Anzahl und Dauer der Grundzyklen für alle Reaktionen beibehalten wurde ( Abb. 22 ):
1 × 30 Zyklen 1 ×
94°C 94°C 72°C 72°C
4´ 15´´ 50-64°C 50-64°C
15´´ 30´´ 15´´ 5´
Abbildung 22: PCR-Bedingungen für die Amplifikation definierter
Sequenzabschnittebei Pietrain und Meishan
Die Denaturierungs- und Extensionstemperaturen waren für alle Polymerasereaktionen gleich.
Die Annealingtemperatur variierte je nach Primerkombination und wurde aufgrund der
errechneten Tm empirisch ermittelt. Tabelle 12 zeigt die Sequenz der benutzten Primer sowie
die Tm und die tatsächliche Annealingtemperatur.
Tabelle 12: Primersequenzen, Tm ( Schmelzpunkt ) und Annealingtemperatur
Primer 1 ( U ) Primer 2 ( L ) Tm Annealing
Poly 2 gga gcc ccg gac ttg ttc gga gac ggc cag atc ggt g 60
64
60
Poly 1 cac cga tctg gcc gtc tc gag tgt gtc agt cag ctc c 60
60
60
Poly 4 agg acc tta tct ggg cgt ga cac ctc acc aat gca tga tc 62
60
60
Poly 6 tct gag gag gcc ttc acc ctg c tca cgc cca gat aag gtc ct 72
62
62
Poly 5 ggc gga aga ggc agc aaa gag tga gcg tcc cgt ccc agt gt 68
66
52
Poly 9 gga gct gac tga cac act c cat gct gct gac gtt ctt gac 60
64
52
Poly end gat cat gca ttg gtg agg tg cgt cag cgc tag agt ttc tt 60
60
53
4°C

4 Ergebnisse 70
Die Sequenzen sind in 5´-3´ Richtung angegeben; die obere Tm entspricht dem Primer 1 , die
untere dem Primer 2. Tm und Annealingtemperatur sind in °C angegeben.
Insgesamt konnten die sieben in der Tabelle 9 aufgeführten Produkte von 430 bis 800 bp für
die beiden Rassen aus genomischer DNA amplifiziert werden. Die Amplifikate wurden
teilweise nach Aufreinigung, teilweise nach Auftrennung über präparative Gele in
Sequenzierungsreaktionen eingesetzt, wobei jeweils von beiden Seiten mit den
entsprechenden Primern sequenziert wurde. Bis auf die Sequenzierung von Poly 5, die nur mit
dem lower Primer gelungen ist, konnten sämtliche Amplifikate vollständigen
Sequenzanalysen unterzogen werden.
Auf diese Weise konnten Sequenzinformationen über insgesamt 3579 bp für die Rassen
Pietrain ( Pi ) und Meishan ( M ) gewonnen werden . Die Abbildung 23 zeigt einen Überblick
über die Lokalisation der sequenzierten Amplifikate bei beiden Rassen.
0 1 2 3 4 Kbp
Poly 5 Poly 2 Poly 1 Poly 9 Poly 6 Poly 4 Poly end
Abb. 23: Überblick über die Lokalisation der zur Sequenzierung gelangten
Amplifikate ( Poly1-end )
Die Kästen oberhalb der Skala stellen die Exons 1-4 dar, die unteren Vierecke die jeweiligen
Amplifikate.
4.3.2 Homologievergleiche zwischen Pietrain ( P ) und Meishan ( M )
4.3.2.1 Nukleotidsequenz
Nach Fertigstellen der einzelnen Sequenzierungsreaktionen erfolgte die genaue Analyse der
Nukleotidsequenzen mittels des DNAsys Computerprogramms, wobei die
Sequenzinformationen von Pietrain und Meishan jeweils untereinander und mit der
Grundsequenz aus Abbildung 13 verglichen wurden.
Hierbei konnten die im folgenden aufgeführten Basenaustausche dokumentiert werden.

4 Ergebnisse 71
Tabelle 13: Lokalisation und Ausprägung der Basenaustausche des c-fos Genes bei
Pietrain ( P ) und Meishan ( M ) im Vergleich zur Genbanksequenz ( G )
Amplifikat Lokalisation des Basenaustausches Ausprägung bei
G PI M
Bezeichnung
Poly 5 991 ( Intron 1 ) G G T P.5.1
Poly 2 1256 ( Intron 1 ) G G C P.2.1
Poly 9 2544 ( Intron 3 )
C C A P.9.1
2650 ( Exon 4 )
G G A P.9.2
Poly 6 2884 ( Exon 4 )
C C T P.6.1
2902 ( Exon 4 )
A A G P.6.2
2910 ( Exon 4 )
A A G P.6.3
2997 ( Exon 4 )
G A G P.6.4
3339 ( 3´Ende )
T T C
P.6.5
Poly 4 3493 ( 3´Ende ) A A C P.4.1
Die Basendifferenzen im Vergleich zur Genbank sind fettgedruckt. Die unterstrichenen
Basenaustausche entsprechen einem Aminosäurenaustausch auf Proteinebene.
G = Genbank; Pi = Pietrain; M = Meishan.
Insgesamt konnten für die sequenzierten Abschnitte 10 Basenaustausche lokalisiert werden.
Auffallend ist, daß sich 5 von diesen Austauschen im Bereich des Exon 4 des c-fos Genes
befinden, von denen zwei ( Poly 6.3 und Poly 6.4 ) mit einem Aminosäurenaustausch auf der
Proteinebene einhergehen. Poly 6.3 wiederholt sich auch im Vergleich zwischen
verschiedenen Spezies. Der Mensch und der Hamster zeigen sich an dieser Position identisch
mit der Sequenz des Meishan, während Maus und Ratte die gleiche Basenfolge wie der
Pietrain aufzeigen.
Die restlichen 5 Mutationen befinden sich im untranslatierten Bereich des Genes, zwei auf
Höhe des Intron 1, einer im Intron 3-Bereich und schließlich zwei im Bereich des vorderen
3´Endes.
Der mittlere Bereich des Genes von Position 1257 bis Position 2443 mit Teilen des Intron 1
sowie der gesamten Introns 2 und 3 und der Exons 2 und 3 weist keine Unterschiede in der
Nukleotidfolge zwischen den aufgeführten Tieren auf. Auch das Exon 1 zeigt keine
Sequenzunterschiede.
Es ergeben sich für die aufgeführten Sequenzabschnitte folgende Homologiewerte in Prozent
zwischen Pietrain und Meishan:

4 Ergebnisse 72
Poly 2: 99,8 %
Poly 4: 99,7 %
Poly 5: 99,7 %
Poly 6: 99,0 %
Poly 9: 99,2 %
4.3.2.2 Aminosäurensequenz
Wie bereits oben erwähnt, führen nicht alle aufgeführten Sequenzunterschiede auf der
Nukleinsäureebene auch zu einem Aminosäurenaustausch auf der Proteinebene.
Nur zwei der zehn Basenaustausche haben eine unterschiedliche Proteinzusammensetzung des
c-fos Proteins bei beiden Rassen zur Folge. Es sind dies Poly 6.3. und Poly 6.4. ( siehe
Tabelle 13 ) die sich im Bereich des Exon 4 des Genes befinden. In allen anderen
Exonbereichen sind die Basenaustausche nicht von einer Veränderung der
Proteinzusammensetzung begleitet, der genetische Code wird nicht verändert.
Durch die zwei betreffenden Basenaustausche kommt es beim Pietrain ( Poly 6.4 ) und beim
Meishan ( Poly 6.3 ) im Vergleich zur Genbanksequenz zu einer Veränderung des genetischen
Codes und somit zu einem Austausch der Aminosäuren auf der Proteinebene.
In der Abbildung 24 sind die c-fos Proteinsequenzen von Pietrain ( PPRO.PRO ) und Meishan
( MPRO:PRO ) unter der Genbanksequenz ( PIG.PRO ) aufgelistet.
Beim Meishan führt die als Poly 6.3 bezeichnete Mutation auf der DNA–Ebene zur
Einfügung eines Serins anstelle eines Asparagins. Beim Pietrain wird infolge des als Poly 6.4
bezeichneten Basenaustausches ein Arginin durch ein Histidin ersetzt.

4 Ergebnisse 73
Abb. 24: Proteinsequenz von c-fos der Rassen Pietrain und Meishan im Vergleich
zur aus der Genbank abgeleiteten Sequenz
Die Sequenzunterschiede von Pietrain ( PPRO ) und Meishan ( MPRO ) sind eingerahmt. Die
Skala oberhalb der Sequenzen entspricht der jeweiligen Position der einzelnen Aminosäuren.
Die aufgeführten Sequenzunterschiede befinden sich außerhalb der wichtigsten funktionellen
Domänen Basische Region und Leucin-Zipper und haben somit keinen direkten Einfluß auf
deren Funktion. Es kommt jedoch infolge der Austausche zu einer Veränderung verschiedener
Parameter wie Molekulargewicht, Isoelektrischer Punkt und Ladung des Proteins. Diese
Unterschiede sind in Tabelle 14 zusammengefaßt.

4 Ergebnisse 74
Tabelle 14: Verschiedene Parameter des c-fos Proteins bei unterschiedlichen Rassen
Grundsequenz Pietrain Meishan
Molekulargewicht 40682.00 40663.00 40655.00
Isoelektr. Punkt 4,68 4,67 4,68
Ladung bei pH7 -17,43 -18,27 -17,43
Die Anzahl der geladenen Aminosäuren ist bei allen drei Rassen gleich.
Durch das Vorhandensein eines Histidins anstelle eines Arginins an Position 287 des Proteins
geht die Anzahl der basischen Aminosäuren von 33 bei den Vergleichstieren auf 32 beim
Pietrain zurück.
Beim untersuchten Meishan wird ein Asparagin mit einer Amid-Seitengruppe durch ein Serin
mit einer Hydroxygruppe ersetzt. Beide Seitengruppen nehmen an Wasserstoff-
Brückenbindungen teil, und ziehen somit keine Veränderung der Sekundärstruktur des
Proteins nach sich.
4.3.3 Weitergehende Analyse der gefundenen Mutationen
Die durch die direkte Sequenzinformation einzelner Tiere der Rassen Pietrain und Meishan
offensichtlich gewordenen Mutationen in der Basenabfolge der DNA-Sequenz des c-fos
Genes dienten als Grundlage für eine weiterführende Analyse der betreffenden
Sequenzabschnitte bei mehreren Tieren der gleichen Rassen und bei Schweinen anderer
interessanter Rassen.
4.3.3.1 Etablierunng von PCR/Restriktionssystemen zur RFLP-Analyse
Die genaue Analyse der entsprechenden Sequenzabschnitte bei größeren Tierzahlen ist aus
Zeit- und Kostengründen nicht mittels direkter Sequenzierung durchführbar. Hier bietet sich
die RFLP-Analyse mit charakteristischen Restriktionsenzymen an.

4 Ergebnisse 75
4.3.3.1.1 Kartierung der entsprechenden Sequenzabschnitte
Alle Mutationen enthaltende Sequenzabschnitte wurden per Computeranalyse ( Map Draw;
DnaStar ) auf Restriktionsschnittstellen untersucht, die den jeweiligen Basenaustausch
einbeziehen. Dabei wurde das Hauptaugenmerk auf die Sequenzabschnitte gelegt, die
Mutationen im Exonbereich aufweisen ( Poly 6 und Poly 9 ).
In dem Sequenzabschnitt Poly 9 ( 432 bp ) konnten für beide Mutationen P9.1 und P9.2
charakteristische Restriktionsschnittstellen gefunden werden, die eine RFLP-Analyse
ermöglichen. Das Restriktionsenzym TaqI weist je nach Vorhandensein der P9.1 Mutation
verschiedene Schnittstellen auf. Die Mutation P9.2 neutralisiert eine AluI-Erkennungssequenz
im Poly 9 Amplifikat. Die Anzahl und Lokalisierung der betreffenden Schnittstellen dieser
beiden Enzyme in Poly 9 sind in der Abbildung 13 dargestellt.
Meishan Pietrain
Abb. 25: Restriktionsschnittstellen von AluI und TaqI in Poly 9 bei Pietrain und
Meishan
Durch die Mutation P9.1 zeigt das Enzym TaqI beim Meishan nur eine Schnittstelle an
Position 225. Beim Pietrain befindet sich durch die unterschiedliche Basenfolge eine zweite
Schnittstelle an Position 53. Ähnlich verhält es sich beim Enzym AluI, wo durch die P9.2
Mutation beim Meishan nur zwei Schnittstellen an Position 4 und 242 vorhanden sind. Beim
Pietrain befindet sich eine dritte Erkennungssequenz an Position 160.
Das c-fos Teilamplifikat Poly 6 ( 566 bp ) weist, wie bereits oben beschrieben, eine sehr
interessante Mutation P6.3 an Position 71 auf. Die Sequenz ACGT entspricht der
Erkennungssequenz von TaiI, und wird durch den Austausch des Arginins in ein Guanin
neutralisiert.
In Abbildung 26 sind die entsprechenden Schnittstellen des Enzyms bei den beiden
Genotypen dargestellt.

4 Ergebnisse 76
Pietrain Meishan
Abb. 26: Restriktionsschnittstellen von TaiI bei Pietrain und Meishan
Die beiden Schnittstellen an Position 309 und 513 des 566 Basenpaare zählenden Amplifikats
sind bei beiden Genotypen vorhanden. Beim untersuchten Pietrain findet sich eine zusätzliche
Erkennungssequenz des Enzyms an Position 71.
4.3.3.1.2 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen
Mit Hilfe der hier beschriebenen Restriktionsschnittstellen können die betreffenden
Sequenzabschnitte nach der PCR-Amplifikation bei verschiedenen Tieren einer RFLP-
Analyse unterzogen, und so den einzelnen Genotypen zugeordnet werden.
$ O X , 5 ) / 3
0 D 8 Y % % $ $ $ %

4 Ergebnisse 77
Abb. 27: Darstellung der gefundenen RFLPs
Ma=Marker 50bp; Uv= Unverdaute Probe; AA=Genotyp A; BB= Genotyp B; AB=Genotyp
AB
7 D L , 5 ) / 3
7 D T , 5 ) / 3
0 D $ $ % % $ %
0 D 8 Y % % $ $ $ %

4 Ergebnisse 78
Ein TaqI-Restriktionspolymorphismus entsteht durch den Basenaustausch an Position 2544
des Gesamtgenes. Er besteht aus einer 225bp (A) Bande und zwei 172bp bzw.53bp (B)
Banden.
Der erste Austausch im Exon 4 an Position 2650 bewirkt einen AluI-
Restriktionpolymorphismus mit einer 238bp (A) Bande und zwei Banden von 156bp
bzw.82bp (B).
Der mit einem Aminosäurenaustausch einhergehende Polymorphismus an Position 2910 läßt
sich durch einen TaiI-Restriktionspolymorphismus nachweisen.
Die Variante A zeigt eine 309bp Bande, während die Variante B aus einer 238bp und einer
71bp Bande besteht.
Untersucht wurden je 6 Tiere der Rassen Pietrain und Meishan. Dabei konnten für den TaqI-
RFLP bei der Rasse Meishan alle drei Genotypen gefunden werden, wohingegen alle Tiere
der Rasse Pietrain den Genotyp BB aufwiesen.
AluI zeigte bei den Tieren der Rasse Meishan die Genotypen AA und AB, bei den Tieren der
Rasse Pietrain nur den Genotyp BB.
Bei dem TaiI-RFLP zeigten alle Meishans den Genotyp AA, während die Pietrains sich
einheitlich als BB darstellten.

5 Diskussion 79
5 Diskussion
Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, in einem ersten Schritt die komplette
Nukleotid- und Proteinsequenz des porcinen c-fos Protoonkogens darzustellen. Hierauf
aufbauend erfolgte dann die chromosomale Lokalisation des Genes beim Schwein, sowie die
vergleichende Betrachtung der Sequenz bei Tieren unterschiedlicher Konstitution und
Bemuskelung und die Dokumentation vorhandener Sequenzunterschiede.
Der Aufklärung der molekularbiologischen Zusammenhänge des Antagonismus zwischen
Muskelhypertrophie und konstitutionellen Aberrationen beim Schwein kommt eine, im
Hinblick auf Wirtschaftlichkeit und Tierschutz in der Schweinezucht, bedeutende Rolle zu.
Dabei bildet die Identifikation von Einzelgenen mit eventueller direkter Beteiligung an den
zellphysiologischen Vorgängen neben der QTL-Analyse eine wichtige Herangehensweise.
JANSS et al. ( 1997 ) unterstreichen die Wichtigkeit der Erforschung von Einzelgenen mit
Effekten auf Fleischqualitätsmerkmale in der Schweinezucht. Die Bedeutung eines solchen
methodischen Ansatzes wird durch die Entdeckung der mit dem Porcinen Stress Syndrom in
Verbindung stehenden Punktmutation im MHS-Gen ( BRENIG und BREHM, 1992 )
untermauert. Die molekularbiologische Aufklärung der Kalziumregulationsstörung als
auslösender Faktor für das wirtschaftlich sehr relevante Krankheitsbild der Malignen
Hyperthermie beim Schwein ermöglichte in der Folge ein direktes Eingreifen auf
züchterischer Ebene. Die Identifikation der Merkmalsträger durch den in der Folge etablierten
MHS-Gentest ist ein Paradebeispiel für die züchterische Nutzung molekularbiologischer
Grundlagenforschung in der Tierzucht.
Der Ansatz der vorliegenden Untersuchungen ist in diesem Sinne als Grundlagenforschung
zur Aufklärung der molekularbiologischen Zusammanhänge der mit dem Krankheitsbild des
Porcinen Stress Syndroms einhergehenden extremen Skelettmuskelhypertrophie zu verstehen,
und stellt außerdem einen wichtigen Beitrag zur weiteren Aufklärung des Schweinegenoms
dar. Der Charakterisierung von Einzelgenen und der Untersuchung der Einflüße verschiedener
Genotypen dieser Einzelgene auf Merkmale wie Muskelwachstum oder Fettansatz kommt für
das Verständnis der Zusammenhänge eine zunehmende Bedeutung zu. Dies zeigen auch die
Untersuchungen von TE PAS et al. ( 1999 ) zur Beteiligung verschiedener Myogenin-
Genotypen bei der Entstehung phänotypischer Merkmale wie Muskelmasse und
Wachstumsrate verschiedener Schweinerassen.

5 Diskussion 80
Die Wahl des c-fos Genes als Untersuchungsobjekt ergibt sich vor allem aus dessen
ausreichend dokumentierter Rolle als Transkriptionsfaktor bei verschiedenen Zellwachstums-
und Zelldifferenzierungsprozessen ( SASSONE-CORSI et al., 1988 ), wobei in erster Linie
dessen Beteiligung am Geschehen der Muskelzellhypertrophie ( KIM et al., 1992;
WHITELAW und HESKETH, 1992; DAWES et al., 1996; OSBALDESTON et al., 1995 )
interessant erscheint. Der vermutete direkte Zusammenhang zwischen Kalziumregulations-
störung und der Hypertrophie von Skelettmuskelzellen über die Expression der
Protoonkogene c-fos und c-myc als Zwischenglieder ( REINER, 1993 ), läßt diese Gene als
Kandidaten für die weitere Aufklärung der oben genannten Zusammenhänge erscheinen.
REINER ( 1999 ) hat durch die Charakterisierung des porcinen c-myc-Locus mit der
folgenden Evaluierung von Assoziationen zwischen Genvarianten und konstitutionellen
Merkmalen beim Schwein einen Grundstein zum Verständnis einer eventuellen Rolle
verschiedener Protoonkogen-Genotypen bei der Ausprägung unterschiedlicher phänotypischer
Merkmale gelegt. Obwohl die direkten Auswirkungen der untersuchten Effekte von c-myc auf
die Schlachtkörperqualität nur relativ gering ausgeprägt sind, zeigt sich eine deutliche
Interaktion mit dem MHS-Locus. Die Effekte des MHS-Genes auf die Merkmale der
Schlachtkörperqualität sind innerhalb des einen c-myc Genotyps deutlicher als im anderen.
Diese Resultate deuten eine mehr oder weniger große Rolle dieses Protoonkogens bei der
angesprochenen Thematik an.
Das in zellregulatorischen Prozessen direkt mit c-myc in Verbindung stehende Protoonkogen
c-fos stellt ein weiteres wichtiges Forschungsobjekt dar, umso mehr, als eine direkte
Interaktion der Protoonkogene c-fos und c-myc bei der Regulation von Zellwachstum und
Zelldifferenzierung dokumentiert ist ( BAUTERS et al., 1988 ).
Sequenzierung von c-fos
Die in dieser Arbeit durchgeführte Aufklärung der kompletten Sequenz des porcinen c-fos
Protoonkogens bildete eine wichtige Grundlage für die in der Folge durchgeführten
Sequenzvergleiche definierter Genabschnitte bei Tieren unterschiedlicher Konstitution und
Bemuskelung.
Das porcine c-fos Protoonkogen zeigt analog zu allen bisher untersuchten Spezies ( VAN
STRAATEN ET AL., 1983; VAN BEVEREN et al., 1983; CURRAN et al., 1987;
FUJIWARA et al., 1987; CHANG et al., 1996, SARABIA und LIEHR, 1998 ) eine
Aufteilung in drei Intron- und vier Exonbereiche. Auch die funktionell wichtigen Domäne wie

5 Diskussion 81
Promotorbereich und PolyA-Signal zeigen grundsätzlich den gleichen Aufbau wie bei
anderen untersuchten Spezies. Jedoch muß bemerkt werden, daß vor allem das 5´Ende eine
recht niedrige Homologie zu anderen Spezies aufweist, wobei allerdings die funktionellen
Bereiche wie SRE oder AP1, wie bereits angedeutet, 100% homolog sind. Nur das Calcium
Response Element ( CRE ) zeigt zwischen Mensch und Schwein einen leicht
unterschiedlichen Aufbau. Die Bedeutung dieser einzelnen Deletion ist jedoch bis jetzt nicht
klar.
Erwartungsgemäß sind die Homologien am höchsten für die Exonbereiche, wobei auch die
Intronbereiche immer noch beachtliche Werte aufweisen.
Das Vorhandensein von zwei PolyA-Signalen am 3´Ende des porcinen c-fos Genes ist im
Gegensatz zu den anderen Spezies bisher nur beim Menschen ( VAN STRAATEN et al.,
1983 ) dokumentiert worden. Insgesamt sind die Homologiewerte zwischen Schwein und
Mensch, verglichen mit anderen Spezies, am höchsten.
Der grundsätzliche Aufbau des Proteins mit dem typischen bZIP-Motiv ist bei allen bisher
untersuchten Spezies identisch und in diesem Bereich des Proteins befinden sich keine
Aminosäuerenaustausche zwischen Schwein, Mensch und Maus. Dies deutet auf die
elementare Rolle des Proteins in vielen zellphysiologischen Regulationsprozessen hin. Die
Aminosäurensequenz zeigt sehr hohe Homologiewerte zwischen den Spezies Schwein,
Mensch, Maus und Huhn, wobei die Werte zwischen Schwein und Mensch mit knapp 97%
am höchsten liegen. Mit ca. 72% Homologie zum Schwein liegt die Sequenz des Huhnes auch
noch in einem recht hohen Bereich. Beim Huhn finden sich im Gegnsatz zu den o.g. Spezies
auch Aminosäurenaustausche im funktionell wichtigen Bereich des bZIP-Motivs. Die
Bedeutung dieser Begebenheit ist jedoch noch unklar.
Die aufgezeigten hohen Sequenzhomologiewerte zwischen den Spezies sind gleichbedeutend
mit einer hohen Konservierung des Genes während der Evolution und stehen in Einklang mit
der beschriebenen elementaren Rolle als Transkriptionsfaktor im Organismus.
Die vorgestellte komplette Sequenz des porcinen c-fos Genes und Proteins bildet die
Grundlage für die Suche nach Sequenzunterschieden bei den Rassen Pietrain und Meishan.
Diese beiden Rassen wurden einerseits als typische Vertreter der europäischen Nutzrassen mit
fleischbetontem Exterieur und konstitutionellen Defiziten, andererseits als Vertreter der

5 Diskussion 82
konstitutionell sehr stabilen chinesischen Rassen mit überdurchschnittlichem Fettansatz bei
gleichsam geringer Muskelmassenbildung für diese Untersuchungen ausgesucht.
Chromosomale Lokalisation von c-fos
Das porcine c-fos Protoonkogen wurde mittels PCR-Screenings eines Schweine-Nager-
Zellhybridpanels auf Chromosom 7 lokalisiert. Als genaue Banden innerhalb des
Chromosoms kommen aufgrund der identischen Wahrscheinlichkeitswerte q12-23 und q26 in
Frage.
Der Vergleich bestimmter Chromosomenabschnitte zwischen verschiedenen Spezies kann
Aufschluß über die mögliche Lokalisation von Genen geben.
Durch Analyse der Synthenie zwischen Chromosom 7 des Schweines und den entsprechenden
Chromosomen beim Menschen können die in Frage kommenden Lokalisierungsbanden von c-
fos auf dem Chromosom 7 des Schweines weiter eingegrenzt werden.
Tabelle 15: Synthenie zwischen Chromosom 7 des Schweines und den entsprechenden
Chromosomen beim Menschen ( aus http://www.toulouse/INRA )
Schwein Mensch
7p-q14 6p
7q13-q22 15q24-qter
7q21-q25 14q11-q13
14q22-qter
Aus der Tabelle 15 können die mit dem Chromosom 7 des Schweines homologen
Chromosomenabschnitte beim Menschen entnommen werden.
7q12 entspricht dem Chromosom 6 des Menschen, 7q13-q22 dem Chromosom 15. Mit
Chromosom 14, dem Lokalisationsort des c-fos Genes beim Menschen ( Hspa14q24.3-q31 )
ist allein der Bereich 7q21-q25 des Schweines synthenisch. Der Bandenbereich 7q26 des
Schweines ist noch nicht typisiert worden.
SSC7q23 bietet sich somit als genauer chromosomaler Lokalisationsort des c-fos Genes beim
Schwein an, zumal hier auch eine Synthenie zur entsprechenden Lokalisation 14q24.3-q31
des c-fos Genes beim Menschen besteht.

5 Diskussion 83
Die Aufklärung der chromosomalen Lokalisation des c-fos Genes bei der Spezies Schwein
eröffnet die Möglichkeit der weiterführenden Analyse seiner möglichen Bedeutung durch
verschiedene Kopplungsanalysen mit ausgewählten Markern und Genen in diesem Bereich.
Besonders hervorzuheben ist in diesem Zusammenhang die Lokalisation des RYR3 Genes im
Bereich 7q22-23 ( Leeb et al., 1998 ), dessen eventuelle Bedeutung jedoch erst im Verlauf der
angesprochenen Folgearbeiten abgeschätzt werden kann.
Im Bereich des Chromosom 7 des Schweines werden auch für Wachstum und
Schlachkörperzusammensetzung relevante QTL´s beschrieben ( WANG et al., 1998 ).
Sequenzunterschiede innerhalb der Spezies Schwein
Die Polymorphismensuche wurde mittels direkter Sequenzierung geeigneter
Sequenzabschnitte durchgeführt. Auf diese Weise war es, im Gegensatz zur RFLP-Analyse
mittels Southern-Hybridisierung möglich, auch einzelne, keine spezifische
Restriktionschnittstellen betreffende, Basenaustausche zu lokalisieren. Aufgrund der zwischen
den Spezies schon sehr hohen Homologiewerte schien uns diese Herangehensweise zur
Erstlokalisation eventueller Mutationen innerhalb der Spezies Schwein am
erfolgversprechendsten.
Die gewählte Methode erforderte die Synthese geeigneter Primerpaare zur Amplifikation von
Sequenzabschnitten, die den gesamten Genbereich abdecken. Auf Basis der hier vorgestellten
Genbanksequenz vom Schwein wurden passende Primersequenzen nach den beschriebenen
Kriterien ausgesucht und getestet. Die PCR-Bedingungen wurden jeweils an die einzelnen
Abschnitte angepaßt, wobei vor allem hinsichtlich der Annealing-Temperatur große
Abweichungen von den Richtwerten festgestellt wurden.
Für einzelne Sequenzabschnitte stellte sich die Amplifikation bei beiden Rassen als sehr
schwierig dar. Jedoch konnte durch die Kombination verschiedener Primerpaare, sowie durch
die Modifikation der einzelnen Reaktionsbedingungen, fast der gesamte Genbereich bei
beiden Rassen amplifiziert und sequenziert werden.
Im vorderen 5´Bereich des Genes ist eine komplette Amplifikation und Sequenzierung bei
den zwei beschriebenen Rassen trotz des Einsatzes verschiedener Primer,
Primerkombinationen und PCR-Bedingungen nicht gelungen. Die Sequenzunterschiede
scheinen hier, wie schon im Vergleich zwischen verschiedenen Spezies festgestellt, auch
innerhalb der Spezies Schwein sehr groß zu sein, welches ein Grund für suboptimales
Annealing sein kann. Dies umso mehr, da es sich bei der Template-DNA um genomische

5 Diskussion 84
DNA handelt, und die Möglichkeit eines falsch positiven Annealing der Primer bei nicht
100% Homologie mit der Zielsequenz groß ist.
Über den Großteil des Promotorbereiches liegen somit keine differenzierten
Sequenzinformationen vor, womit die vergleichende Darstellung der in diesem Bereich
lokalisierten wichtigen regulatorischen Elemente wie SRE und CRE nicht möglich ist.
Aufgrund der diese Elemente betreffenden 100% Homologie zwischen verschiedenen
untersuchten Spezies, ist jedoch hier auch nicht mit dem Auftreten relevanter
Polymorphismen zu rechnen.
Die fast lückenlose Analyse der gesamten Intron- und Exonbereiche und des 3´Endes bei
beiden Rassen ist eine wichtige Grundlage für weitergehende Untersuchungen.
Vor dem Hintergrund der sehr hohen Konservierung der Sequenz bei unterschiedlichen
Spezies war mit einer sehr hohen Sequenzhomologie innerhalb der Spezies Schwein zu
rechnen.
Die hier aufgezeigten 10 Basenaustausche zwischen einzelnen Vertretern der Rassen Pietrain
und Meishan stellen somit in ihrer Gesamtheit eine interessante Begebenheit dar.
Die Lokalisation von 5 dieser Mutationen im Bereich der translatierten Region des Exon 4 ist
beachtlich, zumal zwei davon mit einem Aminosäurenaustausch auf Proteinebene
einhergehen. Obwohl diese ausgetauschten Aminosäuren an Position 258 ( Serin durch
Asparagin, Poly 6.3 ) und Position 287 ( Arginin durch Histidin, Poly 6.4 ) nicht im Bereich
der funktionell wichtigen Domäne des bZIP-Motivs lokalisiert sind, ist eine direkte
Auswirkung auf die physiologische Funktion des Transkriptionsfaktors nicht auszuschließen.
Durch den Austausch einzelner Aminosäuren können verschiedene Bindungs- und
Dimerisationseigenschaften von Proteinen beeinflußt werden.
Serin und Asparagin sind zwei neutrale Aminosäuren mit polaren Seitenketten, wobei
Asparagin im Gegensatz zu Serin zwei Amino-Gruppen enthält, die an
Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sind. Bei physiologischem pH sind die Seitengruppen
negativ geladen. Die Hydroxygruppe in der Seitenkette von Serin ist auch an Wasserstoff-
Brücken beteiligt und kann durch Phosphorylierung modifiziert werden.
Arginin und Histidin gehören beide zu den basischen Aminosäuren. Arginin enthält zwei
ionisierte Amino-Gruppen die für die positive Ladung verantwortlich sind. Der Imidazolring
des Histidins kann je nach Umgebung ungeladen oder positiv geladen sein. Histidin befindet
sich häufig im reaktiven Zentrum verschiedener Proteine, in dem es wechselnde Bindungen
eingeht.

5 Diskussion 85
Infolge dieser unterschiedlichen Aminosäurenzusammensetzung kommt es zu Abweichungen
der verschiedenen Proteinparameter wie Molekulargewicht, Isoelektrischer Punkt und Ladung
bei pH7, was auch Auswirkungen auf das Verhalten des Proteins unter bestimmten reaktiven
Bedingungen hat.
Ob und inwiefern die beschriebenen Unterschiede in der Aminosäurenzusammensetzung
direkte oder indirekte Auswirkungen auf die Funktionalität des Fos-Proteins haben, wird sich
erst im Laufe von Folgeuntersuchungen darstellen lassen.
Unabhängig von eventuellen direkten Auswirkungen auf die Aminosäurenzusammensetzung
des Fos-Proteins, sind alle gefundenen Mutationen potentielle Markerkandidaten in Bezug auf
die mit Muskelhypertrophie, Fleischqualität und verschiedenen konstitutionellen Parametern
wie Fruchtbarkeit in Verbindung stehenden Merkmale.
Die Aufklärung einer entsprechenden Bedeutung der dokumentierten Sequenzunterschiede
erfordert die Genotypisierung einer größeren Anzahl unterschiedlicher Tiere mit sich
anschließenden Segregations- und Assoziationsstudien.
Entwicklung von PCR/Restriktionssystemen zur Genotyp-Analyse
Voraussetzung für die gezielte Untersuchung der gefundenen Sequenzunterschiede in Form
von Segregations- und Assoziationsstudien an geeignetem Familienmaterial ist die
Möglichkeit der einfach durchführbaren Genotypisierung großer Tierzahlen.
Eine im Gegensatz zur aufwendigen Southern-Blot Hybridisierung kostengünstig und
verhältnismäßig einfach durchführbare Methode der Typisierung stellt die PCR/RFLP-
Analyse dar. Nach Amplifikation der entsprechenden Sequenzabschnitte erfolgt die
restriktionsenzymatische Spaltung der Amplifikate mit, für den einzelnen Basenaustausch
spezifischen, Restriktionsenzymen und die Visualisierung der entstandenen DNA-Fragmente
per Gelelektrophorese. Dies erfordert jedoch das Einfügen oder Entfernen entsprechender
spezifischer Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen durch die einzelnen Mutationen.
Für drei der gefundenen Polymorphismen im Intron 3 ( Poly 9.1 ) und Exon 4-Bereich ( Poly
9.2 und Poly 6.3 ) konnten auf Anhieb entsprechende Restriktionsschnittstellen in den
Amplifikaten lokalisiert werden, die eine RFLP-Analyse ermöglichen ( siehe Abbildung 27 ).
Die bisher durchgeführten Vorversuche an je 6 Tieren der Rassen Pietrain und Meishan
deuten vor allem bei Poly 6.3 auf eine interessante Verteilung der Genotypen hin, da sich hier
bisher alle untersuchten Tiere als homozygot erwiesen haben. Dies verspricht interessante

5 Diskussion 86
Untersuchungsergebnisse bei im Anschluß durchführbaren Folgearbeiten in Form von
Typisierungen geeigneten Familienmaterials der beiden Rassen, umso mehr als dieser
Polymorphismus sich, wie oben beschrieben, auch zwischen verschiedenen Spezies
wiederholt.
Poly 9.1 und Poly 9.2 zeigen sich bisher bei den Angehörigen der Rasse Pietrain als
ausschließlich homozygot, wohingegen bei den Meishan-Tieren auch heterozygote Tiere
typisiert wurden. Eine detaillierte Typisierung größerer Tierzahlen wird Aufschluß über die
genaue Allelverteilung geben.
Schlußfolgerung und Ausblick
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die komplette Gen- und Proteinsequenz eines in
zellregulatorischen Fragen sehr wichtigen Protoonkogens, c-fos, für die Spezies Schwein
darzustellen und im Vergleich zu anderen Spezies zu analysieren. Dies ist ein wichtiger
Beitrag zur weiteren Vervollständigung der Analyse des Schweinegenoms, da bis zu diesem
Zeitpunkt die komplette Nukleotidsequenz dieses Genes, sowie seine chromosomale
Lokalisation nicht bekannt war.
Zusätzlich wurden mit der vorliegenden Arbeit die Voraussetzungen für eine weitergehende
Untersuchung der Rolle dieses Genes im Rahmen konstitutioneller und wachstumsassoziierter
Merkmale geschaffen. Durch Studien der gefundenen Polymorphismen an geeignetem
Familienmaterial mit anschließenden Assoziations- und Segregationsanalysen können
Aussagen über eine mögliche Zuordnung der verschiedenen c-fos-Allele zu den mit
Wachstum und Konstitution direkt oder indirekt verbundenen Merkmalsbereichen getroffen
werden. Dank der hier etablierten RFLP/PCR-Systeme können drei interessante
Polymorphismen ohne weitere Voruntersuchungen sofort einer gezielten Typisierung an
größerem Tiermaterial unterzogen werden.
Des weiteren bietet die Aufklärung der chromosomalen Lokalisation die Möglichkeit,
verschiedene interessante, in diesem Genabschnitt lokalisierte Gene und Genmarker sowie
relevante QTL´s in diese Untersuchungen einzubeziehen.

6 Zusammenfassung 87
6 Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das porcine c-fos Protoonkogen vor dem Hintergrund seiner
ausreichend dokumentierten Rolle als Transkriptionsfaktor bei Zellwachstums- und
Zelldifferenzierungsprozessen, vor allem auch im Rahmen von Muskelzellhypertrophie,
isoliert und in Form der kompletten Sequenzierung und chromosomalen Lokalisierung
charakterisiert. Weiterhin wurde die genetische Variabilität des Genes bei konstitutionell sehr
unterschiedlichen Schweinerassen auf Sequenzebene untersucht. Für einzelne manifest
gewordene Sequenzpolymorphismen wurden PCR/Restriktionssteme zur Typisierung
größeren Tiermaterials entwickelt.
Die Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen:
Das c-fos Protoonkogen wurde mittels einer schweinespezifischen Sonde aus einer Lambda-
FixII-Genbank vom Schwein isoliert, in Plasmidvektoren subkloniert, und in einer
Ausdehnung von insgesamt 4200 bp sequenziert ( EMBL Acc.No.AJ132510 ). Auf der Basis
von Homologievergleichen zu anderen Spezies konnte der charakteristische Aufbau des
Genes mit den 4 Exon- und 3 Intronbereichen sowie den funktionell wichtigen Domänen und
Promotorelementen dokumentiert werden.
Das c-fos Gen kodiert für ein 380 Aminosäuren zählendes Protein mit dem charakteristischen
bZIP-Motiv als funktionell wichtigster Bereich.
Die Homologie zum Menschen beträgt für das gesamte Gen 84,8%, im Bereich der
funktionell wichtigen Domäne der basischen Region und des Leucin-Zippers befinden sich
keine Basenaustausche.
Mit Hilfe eines Schweine-Nager-Zellhybridpanels konnte c-fos auf dem ChromosomSSC
7q12-23 oder q26 lokalisiert werden. Durch Synthenievergleiche mit dem Menschen konnte
der wahrscheinliche Lokalisationsort auf SSC 7q23 begrenzt werden.
Die Suche nach Sequenzunterschieden zwischen konstitutionell unterschiedlichen Rassen
erfolgte mittels spezifisch entwickelter PCR-Systeme zur Amplifikation definierter
Sequenzabschnitte mit anschließender Sequenzierung. So konnten für die Rassen Pietrain und

6 Zusammenfassung 88
Meishan detaillierte Sequenzinformationen über insgesamt 3579 bp des Genes erhalten
werden.
Insgesamt zeigten sich im Vergleich zur Genbanksequenz zehn Basenaustausche. Davon
befinden sich interessanterweise fünf im Bereich des Exon 4, zwei davon gehen mit einem
Aminosäurenaustausch auf der Proteinebene einher. An Position 2910 befindet sich beim
Meishan im Gegensatz zum Pietrain ein Guanin anstelle eines Adenins, was auf Proteinebene
den Austausch eines Asparagins durch ein Serin bedeutet. Dieser Polymorphismus zeigt sich
auch zwischen den Spezies, wo Mensch und Hamster die gleiche Sequenz wie das Meishan
zeigen. Maus und Ratte sind hier identisch mit Pietrain und der Genbanksequenz. Des
weiteren ist an Position 2997 beim Pietrain ein Guanin durch ein Adenin ersetzt wodurch es
zum Austausch eines Arginins durch ein Histidin auf Proteinebene kommt. Dieser Austausch
wiederholt sich nicht bei anderen untersuchten Spezies.
Bei den restlichen handelt es sich um stille Mutationen ohne direkte Auswirkung auf die
Proteinzusammensetzung von c-Fos.
Alle weiteren Austausche befinden sich im untranslatierten Bereich des Genes, zwei auf Höhe
des Intron 1, einer im Intron 3-Bereich und schließlich zwei im Bereich des vorderen 3´Endes.
Der mittlere Bereich des Genes von Position 1257 bis Position 2443 mit Teilen des Intron 1
sowie der gesamten Intron 2 und 3 und der Exons 2 und 3 weist keine Unterschiede in der
Nukleotidfolge zwischen den untersuchten Tieren auf. Auch das Exon 1 zeigt keine
Sequenzunterschiede.
Die gefundenen Basen- und Aminosäurenaustausche bedürfen der Verifizierung an größeren
Tierzahlen. Zu diesem Zwecke wurden für einzelne Austausche PCR/Retsriktionssysteme
entwickelt, die eine Typisierung größeren Probenmaterials ermöglichen.
Ein TaqI-Restriktionspolymorphismus entsteht durch den Basenaustausch an Position 2544.
Der erste Austausch im Exon 4 an Position 2650 bewirkt einen AluI-
Restriktionpolymorphismus
Der mit einem Aminosäurenaustausch einhergehende Polymorphismus an Position 2910 läßt
sich durch einen TaiI-Restriktionspolymorphismus nachweisen.
Alle hier aufgezeigten RFLP´s müssen anhand von größeren Tierzahlen überprüft werden.
Durch das Screenen geeigneten Familienmaterials können dann Assozaitions- und
Segregationsstudien erfolgen.

7 Summary 89
7 Summary
The objective of the present work was the isolation and characterization of the porcine c-fos
protooncogene. The product of this gene plays an important role as a transcription factor in
several cell growth and differentiation processes, especially concerning muscle cell
hypertrophy.
Complete sequencing and chromosomal localization of the gene was realized. Additionally its
genetic variability concerning constitutionally very different pig breeds was examined.
PCR/Restriction-systems were developed for some of the sequence polymorphisms found, in
order to realize further investigations in a large number of animals from different breeds.
Following results were obtained:
The c-fos protooncogene was isolated from a lambda fixII genomic bank by hybridization to a
pig-specific probe, subcloned in plasmid-vectors and sequenced in a range of 4200bp ( EMBL
Acc.No.AJ132510 ). The characteristic structure of the gene with its 4 exons and 3 introns
and the functionally important domains and promotor elements were documented based on
the homology to other species.
The c-fos gene represents the code for a protein of 380 amino acids with a characteristic
functionally very important bZIP domain.
Homology between pig and human is 84,8%, while there are no base exchanges in the
functionally very important domains like the basic domain or the leucine zipper.
Screening a pig/rodent cell hybrid panel, c-fos was localized on SSC 7q12-23 or q26. By
comparing genetic mapping data the localization could be precised to SSC7q23.
The search for sequence differences between constitutionally different pig breeds was carried
out by developing specific PCR systems for the amplification of defined sequence regions and
the following sequencing of these regions. Detailled sequence information over 3579bp was
achieved for meishan and pietrain breeds. Ten base exchanges could be documented in
comparision to the sequence of the genebank. Five mutations are located in the region of the
exon 4, two of them also present an exchange in the protein sequence. First the presence of a
guanin in the meishan breed instead of an adenin in pietrains at position 2910 means the

7 Summary 90
exchange of serin to asparagin in the protein. This polymorphism also figures between
different species. Human and hamster sequences fit with the meishan while mouse and rat are
identical to the pietrain and genebank sequence.
There is also an exchange of a guanin to an adenin at position 2997 in pietrains which means
the exchange of an arginin to a histidin in the protein. This polymorphism does not appear
between other species.
All the others are quiet mutations without effect on the protein sequence of c-Fos.
The other five base exchanges are located in the untranslated parts of the gene, two in intron
1, one in intron 3 and finally two in the 3´end of the gene. The mid part of the gene from
position 1257 to position 2443 including parts of intron 1 as well as the whole intron 2 and 3
and the exons 2 and 3 doesn´t show any sequence differences between the examined animals.
The exon 1 is also identical between the two breeds.
The base- and amino acid exchanges found must be verified on a larger number of animals.
Thats why we established PCR/Restrictionsystems for defined mutations allowing the
screening of a large number of probes.
A TaqI-RFLP corresponds to the base exchange at position 2544.
The first mutation in the fourth exon at position 2910 which corresponds to a TaiI-
polymorphism.
All described RFLP´s have to be verified on larger animal numbers. The screening of defined
families then allows association and segregation studies.

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Danksagung
Mein ganz besonders herzlicher Dank gilt Herrn Professor V. Dzapo für die zur
Verfügungstellung des Themas und die außerordentlich wertvolle fachliche Unterstützung
während der Durchführung der gesamten Arbeit. Besonders möchte ich ihm für das stets faire
und verständnisvolle Entgegenkommen in schwierigen Situationen danken.
Herrn Dr. G. Reiner danke ich für die Hilfe bei der genauen Ausarbeitung des
Dissertationsthemas und die Unterstützung bei der Einarbeitung in die molekulargenetischen
Methoden. Er war jederzeit ein wertvoller Ansprechpartner für theoretische und praktische
Fragen während der Durchführung der gesamten Arbeit.
Frau Heidi Schomber danke ich herzlich für die tolle Hilfe bei der Durchführung der
Laborarbeiten und für das sehr freundschaftliche Arbeitsklima. Sie hat es verstanden, mich in
Zeiten des Zweifelns stets wieder neu zu motivieren, und so einen wesentlichen Anteil zum
Gelingen der Arbeit beigetragen.
Desweiteren möchte ich sämtlichen Mitarbeitern des Institutes Für Tierzucht und
Haustiergenetik, besonders am Oberen Hardthof, für die freundschaftliche
Arbeitsathmosphäre danken. Mein besonderer Dank gilt hier Frau Katja Hoffmann, Frau
Susanne Portmann und Herrn Holger Matthiak für die tatkräftige Unterstützung meines
Durchhaltevermögens.
Herrn H. Willems und Frau C. Jäger vom Institut für Infektionskrankheiten der Tiere danke
ich für die Hilfe bei der Durchführung der Sequenzierungen.

Der Deutschen Forschungsgesellschaft danke ich für die Zurverfügungstellung von
Forschungsmitteln.
Beim Ministere de l´éducation nationale in Luxemburg möchte ich mich herzlich für das mir
gewährte Stipendium bedanken.
Familie und Freunden und Haustieren danke ich an dieser Stelle für die geduldige und
motivierende Anteilnahme in Krisenzeiten. Herrn Dr. Andreas Steinbeck danke ich speziell
für die Unterstützung bei computerbezogenen Problemen. Ein besonderer Dank gilt hier
meiner Schwester für die zahllosen nervenaufreibenden Telefongespräche und Diskussionen
in denen sie es immer wieder verstand mich neu aufzubauen.
Ein ganz besonders herzliches Dankeschön geht an meine Mutter, die meine Ausbildung
ermöglicht, und mich während meiner gesamten Studienzeit in jeder Hinsicht unterstützt und
gefördert hat.