Isolierung und Charakterisierung des porcinen c-Fos ...

3 Material und Methodik 33
aktuelle Titer der Genbank betrug 0,9x10E 6 /μl. Anschließend wurde die optimale
Wachstumszeit zum Erreichen der richtigen Plaquegröße durch nochmaliges Ausplattieren der
Genbank auf zwei 150mm Agarplatten in einer Solldichte von 5x10E 4 /Platte ermittelt. Hierzu
wurden 1,4μl einer 1/10 Verdünnung der Genbank mit 1,2 ml ( 600μl/Platte ) Bakterien wie
bereits beschrieben ausplattiert. Nach ca. 5 Stunden wurde die Plaquegröße in regelmäßigen
Abständen kontrolliert und so die optimale Wachstumszeit festgelegt.
3.3.3.2.2 Ausplattieren der Genbank; Übertragen des Phagenmaterials auf
Nitrozellulosefilter
Um zu gewährleisten, daß ein möglichst repräsentativer Teil der Genbank gescreent werden
konnte, mußte eine möglichst große Anzahl an Platten ausplattiert werden. Es wurden 25
150mm Agaroseplatten mit NZY-Medium zum ausplattieren vorbereitet
Das nötige Genbankmaterial wurde anhand der Solldichte ( 5x10E 5 /Platte ) und des in der
Vorbereitung bestimmten Titers von 0,9x10E 6 ausgerechnet. Für 25 Platten mußten 1,39μl
Genbank und 15ml Bakterien ( MRA; OD = 0.5; in MgSO4 ) verwendet werden. Zur
Transfektion wurden die Bakterien mit der Genbank vermischt und anschließend auf 25
sterile Falconröhrchen verteilt, die dann 15 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. Die
Agaroseplatten wurden warmgestellt ( 37°C ). Der zum Ausplattieren verwendete Top-Agar
ist auf ca 55°C vorgewärmt worden. Beim Ausplattieren wurden dann mit einer sterilen
Glaspipette 8ml Top-Agar zu jedem Falconröhrchen gegeben, durch vortexen vermischt,
unter Vermeidung von Luftblasen auf die vorgewärmten Agaroseplatten gegossen und durch
leichte Schwenkbewegungen verteilt. Die fertigen Platten wurden dann nach dem Trocknen
bei 37°C für 7 Stunden inkubiert. Nach Vollenden der Inkubationszeit wurden die Platten in
den Kühlschrank gestellt.
Der nächste Schritt bestand nun in der Übertragung des Phagenmaterials auf Nitrozellulose-
Membranen, dem sogenannten Plaque-Lifting. Sind die Phagen auf diese Membranen
übertragen, können nach Abwaschen der Proteinbestandteile die gesuchten DNA-Fragmente
mittels radioaktiv markierter Sonden gekennzeichnet werden. Diese Methode wird als Plaque-
Lift-Hybridisierung bezeichnet.
Verwendet wurden für das Plaque-Lifting Nitrozellulose-Filter der Firma Sartorius. Pro Platte
wurden zwei Filter verwendet, um falsch-positive Signale beim späteren Hybridisieren
auszuschließen. Diese Filter wurden nacheinander auf die Platten aufgelegt und markiert.