UGCh-Th05-V2: Bestimmung der Phosphatase-Aktivität in Boden

Prof. Dr. Harald Platen 

FH Gießen-Friedberg - Wiesenstraße 14 - D-35390 Gießen 

Praktikum Umwelt- und Gefahrstoffchemie, Praktikumsthema 5, Versuch 

2 

(4. Auflage, SS 2008) Stand: 13.03.2008 

Praktikumsthema 5 / Versuch 2: 

Bestimmung der Phosphatase-Aktivität in Boden 

1 Einleitung 

UGChP Th-5 V-2 Seite 1 

Als Einleitung in das Thema und den Versuch gelten die Inhalte der 8 Einzelvorträge, die zur Vorbereitung 

auf diesen Versuch gehalten wurden. 

2 Material und Methoden 

2.1 Geräte 

Erlenmeyerkolben, Nennvolumen: 100 mL, 3 Stück 

Kunststoffrührstab für Küvetten 

Küvette(n) für Photometer, d = 1 cm, Hellma, Typ OS, Sao Paolo, BRA, 2 Stück 

Magnetrührbank mit mind. 3 Rührstellen oder 3 Magnetrührer 

Magnetrührstäbchen, Länge ca. 4 cm, 3 Stück 

Messpipetten, Glas (2 mL; 5 mL) 

Muffelofen 

Pasteurpipetten mit Ansaughütchen 

Photometer, Hichachi, Typ 1100, Colora, Lorch, FRG 

Pipettenspitzen für Kolbenhubpipette, gelb 

Porzellanschale 

Safe Lock Reaktionsgefäße, 1,5 mL, Eppendorf, Hamburg, FRG, mind. 30 Stück 

Spatel 

Ständer für Safe Lock Reaktionsgefäße, 1,5 mL 

Trockenschrank 

Waage, Auflösung mind. 0,01 g 

Wasserbad aus Kunststoff für Eisbad 

Wasserbad aus Kunststoff mit Thermostat zur Temperierung auf 37°C 

Zentrifuge für Safe Lock Reaktionsgefäße, Typ EBA 12, Hettich, Tuttlingen, FRG 

2.2 Handelsübliche Chemikalien und Zubereitungen 

4-Nitrophenol Qualitätsstufe p.A. 

4-Nitrophenylphosphat-Na-Salz, Dihydrat, Qualitätsstufe p.A. 

Glycin, wasserfrei, Qualitätsstufe p.A. 

Magnesiumchlorid-Hexahydrat Qualitätsstufe p.A. 

2.3 Laboreigene Zubereitungen chemischer Stoffe 

Wasser, Qualitätsstufe RO (reverse osmosis), RO-Wasser 

Natronlauge (c = 1,0 mol/L) 

4-Nitrophenylphosphat-Lösung 0,5 mmol/L 

Glycin-NaOH-Puffer 50 mmol/L, pH 10,5 

2.4 Probenmaterial 

Boden mit mittelhohem bis hohem Gehalt an Lehm und/oder Ton mit einem Glühverlust von >5% 

FB04-KMUB - Fachgebiet Umweltanalytik und Ökotoxikologie Dokument-ID: HP2110-UGChP-Th05-V02 vom 13.03.2008 / HP




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2.5 Bestimmung der AP-Aktivität 

Es wird 150 mL Reaktionspuffer (Glycin-NaOH-Puffer 50 mmol/L, pH 10,5; 4-Nitrophenylphosphat 

0,5 mmol/L) hergestellt, der zu je 45 mL in drei Erlenmeyerkolben (Nennvolumen 100 mL) überführt wird. Die 

restlichen ca. 15 mL verbleiben als Referenzlösung zur Bestimmung des Blindwertes. 2 mL davon werden 

entnommen, in eine Photometerküvette (d = 1 cm) überführt, und bei 405 nm gegen Wasser (Nullwert) vermessen. 

Die Küvette bleibt für die verbleibende Reaktionszeit befüllt und dient zur Blindwertmessung. Die 

drei Erlenmeyerkolben werden mit den Bezeichnungen 1, 2 und 3 beschriftet, allen Ansätzen wird ein Magnetrührstab 

zugefügt. Die Erlenmeyerkolben werden in Temperierbäder eingebracht, die auf Magnetrührern 

stehen. Ansatz 1 wird in ein mit Eis auf etwa 10°C abgekühltes Wasserbad eingestellt (aktuelle Temperatur 

ist zu protokollieren), Ansatz 2 verbleibt bei Raumtemperatur (aktuelle Temperatur notieren) und Ansatz 3 

wird mit dem Thermostat auf 37°C temperiert. Alle Ansätze enthalten je einen Magnetrührstab der mit 

200 rpm dreht. 

5 g Bodenprobe wird in 25 mL Glycin-NaOH-Puffer (50 mmol/L, pH 10,5 ohne(!) 4-Nitrophenylphosphat) 

durch Rühren mittels Magnetrührer 5 Minuten lang suspendiert. Man lässt 5 Minuten absetzen, dekantiert 

den Überstand in ein kleines Becherglas (Nennvolumen 20 mL), entnimmt 3 mal 5 mL und pipettiert jeweils 

5 mL in die Erlenmeyerkolben 1, 2 und 3 (s.o.), wodurch die Reaktion gestartet wird. Aus jedem Ansatz entnimmt 

man sofort ein Aliquot von etwa 2 mL, überführt zügig in ein SafeLock-Reaktionsgefäß und zentrifugiert 

für 1 Minute bei 18000 x g in einer entsprechenden Zentrifuge. Über eine Stunde hinweg wird in zeitlichen 

Abständen von etwa 10 min. mit einer 2 mL Vollpipette aus den Reaktionsansätzen 2 mL Probe entnommen, 

zu gleichen Teilen in zwei Safe Lock Zentrifugengefäße überführt (1,5 mL Fassungvermögen, 

Eppendorf, Hamburg, FRG), w.o. beschrieben zentrifugiert (Hettich-Zentrifuge, Typ EBA 12, Tuttlingen, 

FRG), anschließend mit einer Pasteurpipette in eine Photometerküvette überführt und im Photometer sofort 

bei 405 nm vermessen. Die Messwerte aller Ansätze und der zugehörige Probenahmezeitpunkt werden 

protokolliert. 

2.6 Bestimmung der Trockensubstanz 

Etwa 20 g des Bodenmaterials wird in einen Porzellantiegel (vorher dessen Leermasse bestimmen!) eingewogen 

und in einem Trockenschrank bei 103°C ± 2°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet (etwa 2 bis 4 

Stunden, je nach Wassergehalt). Man lässt in einem Exsikkator abkühlen und bestimmt anschließend die 

Masse durch Wägung. Der Trockensubstanzgehalt ergibt sich nach Gleichung 1, wobei gilt: mT = Masse des 

Tiegels in g; mT+FS = Masse Tiegel mit Frischsubstanz; mT+TS = Masse Tiegel mit getrockneter Substanz. 

m 

TS% = 

m 

T+ 

TS 

T+ 

FS 

⋅100% 

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− m 

− m 

T 

T 

Gleichung 1 

2.7 Bestimmung der organischen Substanz (Glühverlust) 

Der Tiegel mit dem getrockneten Boden aus Abschnitt 2.6 wird in einen Muffelofen überführt und für 3 Stunden 

bei 550°C geglüht. Anschließende lässt man außerhalb des Muffelofens auf einer Keramikkachel abkühlen 

bis er etwa nur noch 100°C warm ist, überführt dann in einen Exsikkator, lässt auf Raumtemperatur abkühlen 

und bestimmt die Masse des Tiegels mit dem Glührückstand (mT+GR). Der Glühverlust wird mit Gleichung 

2 berechnet. 

⎛ m 

GV% = 

⎜ 

⎜1− 

⎝ m 

T+ 

GR 

T+ 

TS 

− m 

− m 

T 

T 

⎞ 

⎟ ⋅100% 

⎠ 

Gleichung 2




2 


3 Ergebnisse und Diskussion 


3.1 Bestimmung der Phosphataseaktivität bei 3 verschiedenen Temperaturen 

3.1.1 Erfassung der Messwerte und Bestimmung der Aktivität 

Tabelle 1: Messergebnisse zur Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase in der Bodenprobe 

____________________ am __.__.____. Dem Reaktionspuffer (45 mL) wurde 5 mL 

einer abgesetzten Bodensuspension (___ g/____ mL bezogen auf die Frischsubstanz) zugesetzt. 

Der Trockensubstanzanteil des Bodens betrug ____ %, der Anteil an organischer 

Substanz (Glühverlust) betrug ____ % in der Trockensubstanz. Die Temperatur des Messansatzes 

bei Raumtemperatur betrug ____°C. Δt, ΔE und Δc stellen jeweils die Differenzen 

zum vorhergehenden Messwert dar. 

Uhrzeit t 

[min] 

Δt 


E 

[---] 

ΔE 

[---] 


Δc 

mmol/L 

Δc/Δt 

mmol⋅ 

L -1 ⋅min -1 

Δc/Δt⋅m 

bzgl. FS 

mmol⋅ 

min -1 ⋅g -1 

Δc/Δt⋅m 

bzgl. TS 

mmol⋅ 


Δc/Δt⋅m 

bzgl. OS 

mmol⋅ 


0 XXXX XXXX XXXX XXXX XXXX XXXX XXXX




2 










Uhrzeit t 


Δt 


E 

[---] 

ΔE 

[---] 


Δc 

mmol/L 

Δc/Δt 

mmol⋅ 


Δc/Δt⋅m 

bzgl. FS 

mmol⋅ 


Δc/Δt⋅m 

bzgl. TS 

mmol⋅ 


Δc/Δt⋅m 

bzgl. OS 

mmol⋅ 






2 










Uhrzeit t 


Δt 


E 

[---] 

ΔE 

[---] 


Δc 

mmol/L 

Δc/Δt 

mmol⋅ 


Δc/Δt⋅m 

bzgl. FS 

mmol⋅ 


Δc/Δt⋅m 

bzgl. TS 

mmol⋅ 


Δc/Δt⋅m 

bzgl. OS 

mmol⋅ 






2 


3.1.2 Grafische Darstellung des Substratumsatzes 

Extinktionswerte bei d = 1 cm 


Zeit [min] 

Abbildung 3: Grafische Darstellung der Messergebnisse zur Bestimmung der Aktivität der alkalischen 

Phosphatase in der Bodenprobe ________________ vom __.__.____. Einzelheiten siehe 

Tab. 2 bis 4. 

[ ] Symbole für den Reaktionsansatz bei ___°C 







2 



3.2 Bestimmung von Trockensubstanz, Glühverlust (organische Substanz) und Zentrifugalbeschleunigung 

bei der Zentrifugation 

Tabelle 4: Messwerte zur Bestimmung des Trockenrückstandes 

A Masse des Porzellantiegels (Leer), mT g 

B Masse Porzellantiegel mit frischer Bodenprobe; mT+FS g 

C Masse Porzellantiegel mit getrockneter Bodenprobe; mT+TS g 

D Trockensubstanzgehalt [(B-A)/(C-A)]*100% % 

Tabelle 5: Messwerte zur Bestimmung des Anteils an organische Substanz (Glühverlust) 

A Masse der Porzellantiegel (Leer); mT g 

B Masse Porzellantiegel mit getrockneter Bodenprobe; mT+TS g 

C Masse Porzellantiegel mit geglühter Bodenprobe; mT+GR g 

D Glührückstand [(B-A)/(C-A)]*100% % 

E Anteil organischer Substanz 100% - D % 

Tabelle 6: Berechnung der maximalen relativen Zentrifugalbeschleunigung (RZB) bei der Zentrifugation 

mit Hilfe der Gleichung (bitte aufführen)….. 

A Radius des Rotors cm 

B Umdrehungen pro minute rpm 

C Faktor: 1,119⋅10 -5 cm -1 rpm -2 

D RZB = x g 

Platz für Nebenrechnungen etc.: 





2 


3.3 Beurteilung der Ergebnisse 


Ergibt sich ein linearer Verlauf der Extinktionsänderung? Ist dies zu erwarten? Was bedeutet es, wenn dies 

nicht der Fall ist? Sind die Messergebnisse zuverlässig oder welche Fehler sind ggf. zu berücksichtigen?

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