Phosphorylierungen bei Signalproteinen erkennen ... - BIOspektrum

270 WISSENSCHAFT · SPECIAL: PROTEOMICS
Posttranslationale Modifikationen
Phosphorylierungen bei
Signalproteinen erkennen und deuten
GERALD RADZIWILL, ADRIAN FISCHER, BETTINA WARSCHEID
INSTITUT FÜR BIOLOGIE II, BIOCHEMIE – FUNKTIONELLE PROTEOMIK UND BIOSS
CENTRE FOR BIOLOGICAL SIGNALLING STUDIES, UNIVERSITÄT FREIBURG
Detailed knowledge of phosphorylation events in proteins is an important
key for a better understanding of biological signalling processes in health
and disease. The combined use of traditional biochemical methods and
modern mass spectrometry employing innovative fragmentation technologies
opens up new avenues for detailed functional studies of signalling
proteins.
DOI: 10.1007/s12268-013-0307-z
© Springer-Verlag 2013
˚ Abb. 1: Zelluläre Signalübermittlung. Die Bindung eines Liganden (L) an seinen spezifischen
Rezeptor führt zu dessen Aktivierung. Aktivierte Rezeptoren induzieren oft die Rekrutierung zytoplasmatischer
Signalproteine an die Plasmamembran. Gerüstproteine (G) binden simultan mehrere
Signalproteine (S) und dienen der räumlichen und zeitlichen Koordination der Signalprozesse.
Posttranslationale Modifikationen von Proteinen wie die Phosphorylierung (P) spielen eine wichtige
Rolle bei der Signalübermittlung und somit der Steuerung biologischer Vorgänge.
Biologische Signalsteuerung
ó Der Informationsaustausch zwischen Zellen
und die Weiterleitung der Signalinformation
über intrazelluläre Übertragungswege
ist grundlegend für die Regulation biologischer
Vorgänge wie Zellteilung, Differenzierung,
Migration und den regulierten
Zelltod, die Apoptose. Signale werden meist
über Rezeptoren auf der Zelloberfläche
detektiert, wodurch sich die Konformation
und/oder Aktivität des Rezeptors verändern
können. Der aktivierte Rezeptor rekrutiert
intrazelluläre Signalmoleküle an die Plasmamembran
– eine makromolekulare Signalübertragungsmaschinerie
bildet sich aus.
Eine wichtige Funktion beim Aufbau dieses
Signalosoms übernehmen die Gerüstproteine.
Diese Multidomänenproteine binden
simultan mehrere Proteine einer Signalkette
und können so Signalwege räumlich und
zeitlich koordinieren (Abb. 1, [1, 2]). Die
Fehlregulation spezifischer Signalwege ist
wiederum verantwortlich für das Auftreten
von Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes
oder die Entstehung und Progression von
Tumoren.
Das Gerüst protein CNK, ein Target
von Protein kinasen
Ein Schwerpunkt unserer Arbeiten ist die
funktionelle Studie des Ge rüstproteins CNK
(connector enhancer of KSR) und seiner Rolle
bei der Aktivierung onkogener Signalwege
während der Tumorprogression. CNK bindet
in einem trimeren Komplex die Tyrosinkinase
SRC (sarcoma) und die Serin/Threonin -
kinase C-RAF (rapidly accelerated fibrosarcoma)
und ermöglicht dadurch die SRC-abhängige
Aktivierung von C-RAF [3]. Darüber hinaus
ist CNK selbst ein Target von Proteinkinasen.
So führt die Stimulation von Zellen
mit dem Wachstumsfaktor PDGF (platelet-derived
growth factor) zur Phosphorylierung von
CNK, wie ein deutlich verlangsamtes Laufverhalten
in der SDS-PAGE zeigt (Abb. 2A).
Die Stimulation der Zellen in Anwesenheit
eines MEK(MAPK/ERK-Kinase)-Inhibitors
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A
B
˚ Abb. 2: Analyse von Phosphorylierungsereignissen.
A, FLAG-CNK-überexprimierende
HEK293-Zellen wurden mit PDGF
(platelet-derived growth factor) in Anwesenheit
(+) oder Abwesenheit (–) eines
MEK(MAPK/ ERK-Kinase)-Inhibitors stimuliert.
Zelllysate wurden mittels SDS-PAGE
aufgetrennt und CNK in einem Immunoblot
mit Anti-FLAG-Antikörpern detektiert. B,
Affinitätsaufge reinigte CNK-Fragmente aus
Lysaten von CNK-überexprimierenden Zellen
wurden als Substrate für ERK in einer
in vitro-Kinase-Reaktion in Anwesenheit
von [γ- 32 P]ATP eingesetzt. Die Reaktionsprodukte
wurden über SDS-PAGE und
Autoradiografie analysiert. pCNK, phosphorylierte
CNK-Isoform.
bestätigt, dass CNK durch MEK oder ERK
(extracellular signal-regulated kinase) phosphoryliert
wird.
Mithilfe einer in vitro-Kinase-Reaktion in
Anwesenheit von ERK und radioaktiv markiertem
[γ- 32 P]ATP können wir zeigen, dass
CNK ein spezifisches Substrat von ERK ist
(Abb. 2B). Anhand des Autoradiogramms
des SDS-Gels ist zu sehen, dass ERK CNK im
Bereich der Aminosäuren 280 bis 720 phosphoryliert.
Somit ist CNK einerseits ein positiver
Regulator der durch verschiedene
Wachstumsfaktoren stimulierten, zentralen
RAF-MEK-ERK-Signalkette. Andererseits ist
CNK selbst ein Substrat dieser Signalkette,
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eine Beobachtung, die auf einen möglichen
Rückkopplungsmechanismus hinweist. Ziel
unserer aktuellen Studien ist es, Kinase-vermittelte
Phosphorylierungsereignisse in
CNK umfassend zu entschlüsseln. Moderne
Massenspektrometrie(MS)-basierte
Methoden stellen einen sehr eleganten
Ansatz zur genauen Bestimmung von
in vivo-Phosphorylierungsstellen in Signalproteinen
sowie zur detaillierten Untersuchung
von Kinase-Substrat-Beziehungen
dar.
Analyse von
Phosphorylierungsmustern
Für die MS-basierte Kartierung von in vivo-
Phosphorylierungsstellen empfiehlt es sich,
das endogen exprimierte Protein in Anwesenheit
von Phosphatase-Inhibitoren affinitätsbasiert
aufzureinigen. Nachfolgend können
eventuell störende Komponenten mittels
einer SDS-PAGE abgetrennt werden. Einen
interessanten Ansatz bietet auch die PhostagTM-SDS-PAGE
[4], mit der phosphorylierte
und nicht phosphorylierte Proteinisoformen
vor der MS-Analyse aufgetrennt werden
können (Abb. 3A). Die Verwendung
eines zweiwertigen Metallionenkomplexes
(Mn2+ -Phos-tag) führt zur spezifischen Bindung
von Phosphomonoester-Dianionen wie
Phosphoserin, Phosphothreonin oder Phosphotyrosin
in Proteinen und damit zur
Retardierung der phosphorylierten Proteinisoformen
während der Gelelektrophorese.
Alternativ bietet sich ein gelfreier Ansatz
an. Das Protein wird hierzu z. B. mit Aceton
präzipitiert und in einem geeigneten
Puffersystem aufgenommen. Nach proteolytischem
Verdau der Proteine in der Gelmatrix
oder in Lösung erfolgt die Analyse
mittels Flüssigkeitschromatografie in direkter
Kopplung mit der Massenspektrometrie
(LC/MS) (Abb. 3A). Die Auswertung der
Daten erfolgt über spezielle Suchalgorithmen.
Fragmentierung zur Lokalisierung
der Phosphatgruppe
Eine umfassende sowie zuverlässige Bestimmung
von Phosphorylierungsstellen beruht
zum einen auf einer möglichst vollständigen
und zum Teil redundanten Sequenzierung
des Proteins durch den Einsatz verschiedener
Proteasen (z. B. Chymotrypsin,
AspN) neben der Standardprotease Trypsin.
Zum anderen ist es erforderlich, positionsspezifische
Fragmentionen in MS/MS-Spektren
zu detektieren, anhand derer Phos-

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A
B
˚ Abb. 3: Analyse von in vivo-Phosphorylierungsstellen. A, Das affinitätsaufgereinigte Protein
einschließlich seiner phosphorylierten Isoformen wird entweder über SDS-PAGE bzw. Phos-tag-
SDS-PAGE oder direkt aus der Lösung analysiert. Im Anschluss erfolgt ein proteolytischer Verdau
im Gel oder in Lösung. Die generierten Peptide werden mittels LC/MS analysiert. B, Analyse eines
phosphorylierten Peptids mit unterschiedlichen MS/MS-Methoden. Fragmentierung mittels CID
(collision-induced dissociation) und MSA (multistage activation) führt jeweils zum Verlust der
Phosphatgruppe unter Abspaltung von H 3 PO 4 (98 u) als Neutralteilchen. Die Generierung
sequenzspezifischer Fragmentionen ist generell effizienter mit MSA im Vergleich zu CID. ETD
(electron transfer dissociation) erlaubt die Fragmentierung phosphorylierter Peptide ohne Abspaltung
der Phosphatgruppe. Es werden sowohl sequenz- als auch positionsspezifische Fragmentionen
im Spektrum beobachtet.
phatgruppen in der Aminosäuresequenz lokalisiert
werden können. Bei der Fragmentierung
von Peptiden mit phosphorylierten
Serin- oder Threoninresten mittels CID (collision-induced
dissociation) ist jedoch die Spaltung
der Phosphoesterbindung bevorzugt.
Dies führt zum Verlust des Phosphatrestes
plus Wasser (H 3 PO 4 , 98 u) durch β-Elimination
– ein Phänomen, das die Lokalisierung
der Phosphatgruppe in Peptiden mit mehreren
potenziellen Phosphorylierungsstellen oft
erschwert und auf einfach, aber insbesonde-
re mehrfach phosphorylierte Peptide zutrifft
(Abb. 3B).
Der Einsatz neuer MS/MS-Techniken wie
MSA (multistage activation) [5] und HCD
(higher energy collisional dissociation) [6] kann
zu einer verbesserten Fragmentierung und
somit Identifizierung von Phosphopeptiden
führen, jedoch wird der Verlust der Phosphatgruppe
nicht verhindert. Eine vielversprechende
Alternative bietet ETD (electron
transfer dissociation) [7]. Bei dieser Methode
wird die Fragmentierung des Peptids durch
die Übertragung eines Elektrons und Bildung
eines Radikalkations initiiert. Es kommt letztlich
zur Spaltung der N-Cα-Bindung im
Peptid, ohne Verlust der Phosphatgruppe
(Abb. 3B). ETD stellt daher eine leistungsstarke
Methode zur genauen Lokalisierung
von Phosphorylierungsstellen in Proteinen
mit komplexen Modifikationsmustern dar.
Bedeutung für das Verständnis von
Erkrankungen
Die Analyse von Kinase-Substrat-Beziehungen
zeigte, dass lineare Signalketten zu einem
komplexen zellulären Signalnetzwerk verknüpft
sind. Die Funktionstüchtigkeit dieses
Signalnetzwerks muss gewährleitet sein; Störungen
sind die Ursache vieler Erkrankungen.
Mithilfe moderner MS-basierter Ansätze
lassen sich Kinase-vermittelte Phosphorylierungsmuster
genau erkennen, deren Deutung
nicht nur die Grundlage für das Verständnis
biologischer Signalprozesse bildet, sondern
auch zum Verständnis der Entstehung von
Erkrankungen beiträgt und die Entwicklung
neuer therapeutischer Ansätze ermöglicht.
Danksagung
Die Arbeiten sind von der Deutschen Forschungsgemeinschaft
und der Exzellenzinitiative
des Bundes und der Länder (EXC 294
BIOSS) gefördert. ó
Literatur
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mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci USA 101:9528–9533
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Bettina Warscheid
Prof. Dr. Gerald Radziwill
Institut für Biologie II, Biochemie – Funktionelle
Proteomik
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Schänzlestraße 1
D-79104 Freiburg
Tel.: 0761-203-2689
Fax: 0761-203-2601
bettina.warscheid@biologie.uni-freiburg.de
gerald.radziwill@bioss.uni-freiburg.de
BIOspektrum | 03.13 | 19. Jahrgang

AUTOREN
BIOspektrum | 03.13 | 19. Jahrgang
Gerald Radziwill
1980–1985 Biologiestudium,
Universität Heidelberg. 1989
Promotion, Zentrum für
Molekulare Biologie, Heidelberg.
1989–1993 wissenschaftlicher
Mitarbeiter, Max-
Planck-Institut für Molekulare
Genetik, Berlin. 1994–2008
Assistent/Oberassistent,
Institut für Virologie, Universität
Zürich. 2008 Habilitation
für das Fach Molekulare
Medizin, Universität Zürich.
Seit 2009 Professurvertretung
für Biochemie, Fakultät für
Biologie, Universität Freiburg.
2012 Ernennung zum außerplanmäßigen
Professor, Universität
Freiburg.
Adrian Fischer
2006–2012 Biologiestudium
an der Universität Freiburg.
Seit 2012 Doktorand in der
Abteilung Biochemie – Funktionelle
Proteomik, Institut für
Biologie II, Universität Freiburg.
Bettina Warscheid
1991–1997 Chemiestudium,
TU Dortmund. 2002 Promotion,
Leibniz-Institut für
Analytische Wissenschaften,
Dortmund. 2002–2003 DFG-
Forschungsstipendium,
University of Maryland, College
Park, MD, USA. 2003–
2010 Gruppenleiterin, Medizinisches
Proteom-Center, Ruhr-
Universität Bochum. 2004–
2009 W1-Professur, Ruhr-Universität
Bochum. 2009–2010
W2-Professur, Universität
Duisburg-Essen. Seit 2010
W3-Professur für Funktionelle
Proteomik, Fakultät für Biologie
und BIOSS Centre for Biological
Signalling Studies, Universität
Freiburg.
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