Phosphorylierungen bei Signalproteinen erkennen ... - BIOspektrum

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A B ˚ Abb. 2: Analyse von Phosphorylierungsereignissen. A, FLAG-CNK-überexprimierende HEK293-Zellen wurden mit PDGF (platelet-derived growth factor) in Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (–) eines MEK(MAPK/ ERK-Kinase)-Inhibitors stimuliert. Zelllysate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und CNK in einem Immunoblot mit Anti-FLAG-Antikörpern detektiert. B, Affinitätsaufge reinigte CNK-Fragmente aus Lysaten von CNK-überexprimierenden Zellen wurden als Substrate für ERK in einer in vitro-Kinase-Reaktion in Anwesenheit von [γ- 32 P]ATP eingesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden über SDS-PAGE und Autoradiografie analysiert. pCNK, phosphorylierte CNK-Isoform. bestätigt, dass CNK durch MEK oder ERK (extracellular signal-regulated kinase) phosphoryliert wird. Mithilfe einer in vitro-Kinase-Reaktion in Anwesenheit von ERK und radioaktiv markiertem [γ- 32 P]ATP können wir zeigen, dass CNK ein spezifisches Substrat von ERK ist (Abb. 2B). Anhand des Autoradiogramms des SDS-Gels ist zu sehen, dass ERK CNK im Bereich der Aminosäuren 280 bis 720 phosphoryliert. Somit ist CNK einerseits ein positiver Regulator der durch verschiedene Wachstumsfaktoren stimulierten, zentralen RAF-MEK-ERK-Signalkette. Andererseits ist CNK selbst ein Substrat dieser Signalkette, BIOspektrum | 03.13 | 19. Jahrgang eine Beobachtung, die auf einen möglichen Rückkopplungsmechanismus hinweist. Ziel unserer aktuellen Studien ist es, Kinase-vermittelte Phosphorylierungsereignisse in CNK umfassend zu entschlüsseln. Moderne Massenspektrometrie(MS)-basierte Methoden stellen einen sehr eleganten Ansatz zur genauen Bestimmung von in vivo-Phosphorylierungsstellen in Signalproteinen sowie zur detaillierten Untersuchung von Kinase-Substrat-Beziehungen dar. Analyse von Phosphorylierungsmustern Für die MS-basierte Kartierung von in vivo- Phosphorylierungsstellen empfiehlt es sich, das endogen exprimierte Protein in Anwesenheit von Phosphatase-Inhibitoren affinitätsbasiert aufzureinigen. Nachfolgend können eventuell störende Komponenten mittels einer SDS-PAGE abgetrennt werden. Einen interessanten Ansatz bietet auch die PhostagTM-SDS-PAGE [4], mit der phosphorylierte und nicht phosphorylierte Proteinisoformen vor der MS-Analyse aufgetrennt werden können (Abb. 3A). Die Verwendung eines zweiwertigen Metallionenkomplexes (Mn2+ -Phos-tag) führt zur spezifischen Bindung von Phosphomonoester-Dianionen wie Phosphoserin, Phosphothreonin oder Phosphotyrosin in Proteinen und damit zur Retardierung der phosphorylierten Proteinisoformen während der Gelelektrophorese. Alternativ bietet sich ein gelfreier Ansatz an. Das Protein wird hierzu z. B. mit Aceton präzipitiert und in einem geeigneten Puffersystem aufgenommen. Nach proteolytischem Verdau der Proteine in der Gelmatrix oder in Lösung erfolgt die Analyse mittels Flüssigkeitschromatografie in direkter Kopplung mit der Massenspektrometrie (LC/MS) (Abb. 3A). Die Auswertung der Daten erfolgt über spezielle Suchalgorithmen. Fragmentierung zur Lokalisierung der Phosphatgruppe Eine umfassende sowie zuverlässige Bestimmung von Phosphorylierungsstellen beruht zum einen auf einer möglichst vollständigen und zum Teil redundanten Sequenzierung des Proteins durch den Einsatz verschiedener Proteasen (z. B. Chymotrypsin, AspN) neben der Standardprotease Trypsin. Zum anderen ist es erforderlich, positionsspezifische Fragmentionen in MS/MS-Spektren zu detektieren, anhand derer Phos-
272 WISSENSCHAFT · SPECIAL: PROTEOMICS A B ˚ Abb. 3: Analyse von in vivo-Phosphorylierungsstellen. A, Das affinitätsaufgereinigte Protein einschließlich seiner phosphorylierten Isoformen wird entweder über SDS-PAGE bzw. Phos-tag- SDS-PAGE oder direkt aus der Lösung analysiert. Im Anschluss erfolgt ein proteolytischer Verdau im Gel oder in Lösung. Die generierten Peptide werden mittels LC/MS analysiert. B, Analyse eines phosphorylierten Peptids mit unterschiedlichen MS/MS-Methoden. Fragmentierung mittels CID (collision-induced dissociation) und MSA (multistage activation) führt jeweils zum Verlust der Phosphatgruppe unter Abspaltung von H 3 PO 4 (98 u) als Neutralteilchen. Die Generierung sequenzspezifischer Fragmentionen ist generell effizienter mit MSA im Vergleich zu CID. ETD (electron transfer dissociation) erlaubt die Fragmentierung phosphorylierter Peptide ohne Abspaltung der Phosphatgruppe. Es werden sowohl sequenz- als auch positionsspezifische Fragmentionen im Spektrum beobachtet. phatgruppen in der Aminosäuresequenz lokalisiert werden können. Bei der Fragmentierung von Peptiden mit phosphorylierten Serin- oder Threoninresten mittels CID (collision-induced dissociation) ist jedoch die Spaltung der Phosphoesterbindung bevorzugt. Dies führt zum Verlust des Phosphatrestes plus Wasser (H 3 PO 4 , 98 u) durch β-Elimination – ein Phänomen, das die Lokalisierung der Phosphatgruppe in Peptiden mit mehreren potenziellen Phosphorylierungsstellen oft erschwert und auf einfach, aber insbesonde- re mehrfach phosphorylierte Peptide zutrifft (Abb. 3B). Der Einsatz neuer MS/MS-Techniken wie MSA (multistage activation) [5] und HCD (higher energy collisional dissociation) [6] kann zu einer verbesserten Fragmentierung und somit Identifizierung von Phosphopeptiden führen, jedoch wird der Verlust der Phosphatgruppe nicht verhindert. Eine vielversprechende Alternative bietet ETD (electron transfer dissociation) [7]. Bei dieser Methode wird die Fragmentierung des Peptids durch die Übertragung eines Elektrons und Bildung eines Radikalkations initiiert. Es kommt letztlich zur Spaltung der N-Cα-Bindung im Peptid, ohne Verlust der Phosphatgruppe (Abb. 3B). ETD stellt daher eine leistungsstarke Methode zur genauen Lokalisierung von Phosphorylierungsstellen in Proteinen mit komplexen Modifikationsmustern dar. Bedeutung für das Verständnis von Erkrankungen Die Analyse von Kinase-Substrat-Beziehungen zeigte, dass lineare Signalketten zu einem komplexen zellulären Signalnetzwerk verknüpft sind. Die Funktionstüchtigkeit dieses Signalnetzwerks muss gewährleitet sein; Störungen sind die Ursache vieler Erkrankungen. Mithilfe moderner MS-basierter Ansätze lassen sich Kinase-vermittelte Phosphorylierungsmuster genau erkennen, deren Deutung nicht nur die Grundlage für das Verständnis biologischer Signalprozesse bildet, sondern auch zum Verständnis der Entstehung von Erkrankungen beiträgt und die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze ermöglicht. Danksagung Die Arbeiten sind von der Deutschen Forschungsgemeinschaft und der Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder (EXC 294 BIOSS) gefördert. ó Literatur [1] Good MC, Zalatan JG, Lim WA (2011) Scaffold proteins: hubs for controlling the flow of cellular information. Science 332:680–686 [2] Fritz RD, Radziwill G (2011) CNK1 and other scaffolds for Akt/FoxO signaling. Biochim Biophys Acta 1813:1971–1977 [3] Ziogas A, Moelling K, Radziwill G (2005) CNK1 is a scaffold protein that regulates Src-mediated Raf-1 activation. J Biol Chem 280:24205–24211 [4] Kinoshita E, Kinoshita-Kikuta E, Takiyama K et al. (2006) Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol Cell Proteomics 5:749–757 [5] Schroeder MJ, Shabanowitz J, Schwartz JC et al. (2004) A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal Chem 76:3590–3598 [6] Olsen JV, Macek B, Lange O et al. (2007) Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nat Methods 4:709–712 [7] Syka JE, Coon JJ, Schroeder MJ et al. (2004) Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci USA 101:9528–9533 Korrespondenzadresse: Prof. Dr. Bettina Warscheid Prof. Dr. Gerald Radziwill Institut für Biologie II, Biochemie – Funktionelle Proteomik Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Schänzlestraße 1 D-79104 Freiburg Tel.: 0761-203-2689 Fax: 0761-203-2601 bettina.warscheid@biologie.uni-freiburg.de gerald.radziwill@bioss.uni-freiburg.de BIOspektrum | 03.13 | 19. Jahrgang
Seite 1: 270 WISSENSCHAFT · SPECIAL: PROTEO

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