Molekulargenetische Grundlagen der Zystischen Fibrose

Monatsschr Kinderheilkd
2001 · 149:215–221 © Springer-Verlag 2001
Zusammenfassung
Die Zystische Fibrose (CF) wird durch mehr
als 900 verschiedene Mutationen im CFTR-
Gen (CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator) verursacht. Mittels einer
speziellen SSCP/HD-Technik ist es möglich,
etwa 97% aller CF-Mutationen molekulargenetisch
nachzuweisen. Dies ermöglicht eine
zuverlässige Diagnosestellung,Trägererfassung
und vorgeburtliche Untersuchungen
(pnD) bei Patienten und ihren Familienangehörigen.
Die Mechanismen hingegen, die zu einer Dysfunktion
des CFTR-Proteins führen, können
aufgrund des Defekts in der DNA nicht vorausgesagt
werden, sondern müssen für jede
einzelne Mutation anhand funktioneller Studien
definiert werden.Klonierung und Charakterisierung
des CFTR-Gens sowie die Identifikation
der die Krankheit verursachenden
Mutationen und Genotyp-Phänotyp-Assoziationsstudien
bieten die Grundlagen für neue
diagnostische und prognostische Perspektiven,
für einen vertieften Einblick in die Zusammenhänge
der Pathogenese sowie für die
Entwicklung neuer kausaler Therapieansätze.
Schlüsselwörter
Zystische Fibrose · CFTR-Gen ·
SSCP/HD-Technik
Zystische Fibrose
S. Gallati
Molekulare Humangenetik, Medizinische Universitätskinderklinik, Inselspital, Universität Bern
Molekulargenetische
Grundlagen der Zystischen
Fibrose
Das Fachgebiet der Humangenetik hat
sich, insbesondere im molekularen Bereich,
zu einer Schlüsseldisziplin in der
gesamten Medizin entwickelt. Obwohl
auch heute noch der klassische Weg der
Erforschung von Erbkrankheiten als erstes
über die Erfassung und Beschreibung
des Phänotyps und ausgedehnte
Stammbaumanalysen führt, beinhaltet
der nächste Schritt die Suche nach der
molekularen Ursache der Krankheit im
Gen und deren Auswirkungen auf Transkript
und Genprodukt.
Heterogenes Krankheitsbild
erschwert die Diagnose.
Molekulargenetische Untersuchungen
gewinnen im ärztlichen Alltag immer
mehr an praktischer Bedeutung, indem
aussagekräftige genetische Tests einer
klaren Indikationsstellung bedürfen
und die daraus hervorgehenden Resultate
und Interpretationen den Patienten
und ihren Familienangehörigen verständlich
und kompetent mitgeteilt werden
müssen. Zudem ist es unerlässlich, Möglichkeiten
und Grenzen molekulargenetischer
Analysen richtig beurteilen zu
können. Mit nachfolgendem Artikel soll
anhand einer häufigen und sehr komplexen
monogenen Erbkrankheit, der
Zystischen Fibrose (CF), das Interesse
und Verständnis für die molekulare Medizin
geweckt und deren Bedeutung aufgezeigt
werden.
Die Zystische Fibrose oder Mukoviszidose
manifestiert sich mit einer enormen
Variabilität und überdurchschnittlichen
Komplexität, die Wissenschaftler
und Kliniker schon seit Jahrzehnten beschäftigt.
Im Verlauf der letzten Jahrzehnte
haben sich Dank einer verbesserten
Diagnostik und Therapie Lebensqualität
und Lebenserwartung von Patienten
mit CF deutlich verbessert. Sind früher
die meisten Betroffenen im Kindesalter
verstorben, liegt die mittlere Lebenserwartung
heute bei 30–35 Jahren.
Die phänotypische Heterogenität, das
Vorkommen milder oder untypischer
Krankheitsbilder sowie grenzwertige bis
sogar normale Ergebnisse des Schweißtests
können die Diagnose erschweren,
die jedoch aus therapeutischen Gründen
und für die Familienberatung unerlässlich
ist. Nach wie vor existiert noch keine
kausale Therapie, und die Entwicklung
einer sicheren, wirksamen und effizienten
Gentherapie wird noch Jahre
dauern [10].
Häufigkeit und Vererbung
Die Zystische Fibrose ist die zweithäufigste
autosomal-rezessive Erbkrankheit
der weißen (kaukasischen) Bevölkerung.
Wie viele andere genetische Krankheiten
tritt die CF in Abhängigkeit vom ethnischen
Ursprung einer Bevölkerungsgruppe
mit unterschiedlicher Häufigkeit
auf.Während in der asiatischen Population
nur 1 Kind unter 100.000 oder in
der afrikanisch-amerikanischen Bevölkerung
1 Kind unter 17.000 erkrankt,
Prof. Dr. Sabina Gallati
Molekulare Humangenetik,
Medizinische Universitätskinderklinik,
Inselspital, Universität Bern, CH-3010 Bern,
Schweiz, E-Mail: sabina.gallati@insel.ch
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Monatsschr Kinderheilkd
2001 · 149:215–221 © Springer-Verlag 2001
S. Gallati
Genetics of cystic fibrosis
Abstract
Cystic Fibrosis (CF) is the second most common
autosomal-recessive disorder in Caucasians
with an incidence of 1 in 2500 to 1 in
1600 and a carrier frequency of 4 to 5%.
More than 900 different disease-causing
mutations within the cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator (CFTR)
gene have been reported so far.The large
size of the CFTR gene (250 kb of genomic
DNA, 6100 bp of coding sequences) as well
as the multiplicity of mutations complicate
molecular genetic diagnostics.Therefore, a
specific and efficient SSCP/HD technique has
been established detecting 97% of all CF
mutations and enabeling reliable diagnosis,
carrier detection and prenatal analyses in
patients, family members and partners.
However, how the different types of mutations
(nonsense, missense, frameshift, splice
site mutations, in-frame deletions and insertions)
disrupt the protein function is not predictable
by the gene defect alone but has to
be evaluated for each single mutation by
functional investigations. Characterization of
the CFTR gene and identification of the
pathogenic mutations as well as genotype
phenotype association studies offer the basic
knowledge for the development of new
diagnostic, prognostic and therapeutic perspectives
and extensive insight into the
pathogenesis of the disease.
Keywords
Cystic fibrosis · CFTR gene ·
SSCP/HD technique
| Monatsschrift Kinderheilkunde 3•2001
Zystische Fibrose
liegt in Nordamerika und Europa die Inzidenz
zwischen 1:2500 und 1:1600.
Heterozygote tragen ein gesundes
und ein mutiertes CF-Allel, sind klinisch
asymptomatisch und werden als gesunde
Träger oder Carrier bezeichnet. In
Nordamerika sind etwa 4%, in Nordeuropa
5% der Bevölkerung gesunde Träger
einer CF-Mutation, was zur Folge
hat, dass bei 1 unter 400 bzw. 1 unter 600
Ehepaaren beide Partner ein gesundes
und ein mutiertes CF-Gen besitzen. Diese
Paare haben bei jeder Schwangerschaft
ein Risiko von 25%, dass ihr Kind
an CF erkranken wird. Phänotypisch gesunde
Geschwister von CF-Patienten
sind mit einer Wahrscheinlichkeit von
2/3 Träger einer CF-Mutation.
Gen und Genprodukt
Im Jahre 1989 wurde das CF-Gen auf dem
langen Arm von Chromosom 7 (7q31.3)
entdeckt (Abb.1a) und charakterisiert [3,
6, 7]. Es erstreckt sich über 250.000 Basenpaare
(bp) genomischer DNA, wobei
die kodierenden Sequenzen in 27 Exons
unterteilt sind (Abb. 1b). Das ausgereifte
Transkript (mRNA) enthält nur noch
2,6% (6500 bp) der gesamten Gensequenzen
(Abb.1c) und kodiert für das aus 1480
Aminosäuren (AS) zusammengesetzte
Genprodukt. Das CF-Gen ist für die Produktion
eines Proteins (cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator,
CFTR) verantwortlich, das Chloridionen
durch die apikale Membran verschiedener
Epithelien,hauptsächlich aber des Respirations-
und Verdauungstraktes,transportiert.
Das CFTR-Protein besteht aus 2
Transmembranregionen (TM1,TM2) mit
je 6 hydrophoben Segmenten (Loops), 2
Nukleotidbindungsfalten NBF1 und NBF2,
die ATP binden, und einer Regulatoroder
R-Domäne, die die beiden symmetrischen
Teile des Genprodukts (TM1,
NBF1 – TM2,NBF2) verknüpfen (Abb.1d).
Die R-Domäne ist durch zahlreiche geladene
Seitenketten charakterisiert und
funktioniert als Pforte.In phosphoryliertem
Zustand öffnet sich der Kanal und ermöglicht
den Chloridionentransport,bei
fehlender Phosphorylierung wird der Ionenfluss
blockiert.
Mutationen des CF-Gens
Mehr als 900 verschiedene,über das ganze
Gen verteilte Mutationen wurden bisher
dem Cystic Fibrosis Genetic Analysis
Consortium (http://www.genet.sickkids.
on.ca/cftr/) gemeldet, wobei nur wenige
eine Häufigkeit von 1–2% erreichen. Die
meisten Abweichungen von der normalen
Basensequenz sind Punktmutationen
oder Minimutationen, die nur ein
bzw. einige wenige Nukleotide betreffen.
Punktmutationen sind durch den
Austausch einer Base (Substitution) definiert,
der jedoch unterschiedliche
Konsequenzen hat. Missense-Mutationen
verursachen im Genprodukt den
Austausch einer Aminosäure gegen eine
andere, Nonsense-Mutationen dagegen
verwandeln durch die Basensubstitution
ein Aminosäurekodon in ein
Stoppkodon, sodass die Translation
frühzeitig abgebrochen wird. Spleißstellenmutationen
erzeugen oder zerstören
Spleißerkennungssequenzen, sodass ein
verkürztes oder verlängertes Transkript
entsteht. Frameshift-Mutationen verursachen
durch Verlust oder Einschieben
einer oder mehrerer Basen das Verschieben
des Leserasters, was ebenfalls
in einem verfrühten Translationsabbruch
resultiert.
Im CF-Gen kommen sämtliche Formen
von Punktmutationen,Minideletionen
und Insertionen sowie einige wenige
größere Deletionen vor, die sich über
mehrere Exons erstrecken. Missense-
Mutationen werden etwa in 40%, Nonsense-Mutationen
in 18%, Spleißstellenmutationen
ebenfalls in 18%,Frameshift-
Mutationen in 22% und andere Mutationen
wie Promotormutationen, Inframe-
Deletionen oder große Deletionen in etwa
2% der CF-Chromosomen nachgewiesen.
Die weltweit häufigste CF-Mutation
ist die so genannte ∆F508, eine 3 Basenpaare
umfassende Inframe-Deletion
(∆) in Exon 10, welche den Verlust der
508. Aminosäure, ein Phenylalanin (F),
verursacht.
In Tabelle 1 sind die 24 weltweit am
häufigsten nachgewiesenen Mutationen
und ihre Verteilung auf einzelne Länder
Europas dargestellt. Ein Screening für
diese 24 Mutationen erfasst in Deutschland,
der Schweiz, in Großbritannien, in
Frankreich, Belgien, den Niederlanden
und in Tschechien/Slovakei mehr als
80% aller mutierten Gene in CF-Patienten.
Je östlicher und/oder südlicher die
Länder in Europa gelegen sind, umso
seltener kommen diese 24 Mutationen
vor und umso wichtiger ist es für diese
Populationen, dass noch nach anderen
Mutationen gesucht wird.

Abb. 1a–d Molekulare Grundlagen der Zystischen Fibrose: vom Chromosom (a) über das Gen (b)
und das Transkript (c) bis zum Chloridkanal (d)
Molekulargenetischer
Mutationsnachweis
Untersuchungen auf Genebene, so genannte
DNA-Analysen, bieten sehr präzise
und mehrheitlich eindeutige Resultate,
deren Bedeutung und Richtigkeit
jedoch damit steht und fällt, ob die zur
Verfügung stehenden technischen Möglichkeiten
korrekt eingesetzt und die erhaltenen
Informationen richtig verstanden
und interpretiert werden.
Folgende Gründe machen eine Mutationsanalytik
für viele genetische Erkrankungen,
insbesondere aber für die
Zystische Fibrose, unerlässlich: Der klinische
Verlauf ist häufig sehr heterogen,
z. T. hervorgerufen durch die vielen verschiedenen
Krankheit verursachenden
Mutationen, zusätzlich aber auch durch
den genetischen Background und Umweltfaktoren,
was eine eindeutige Diagnosestellung
erschwert (Tabelle 2). Bei
rezessiven Erbkrankheiten sind Träger
einer Mutation asymptomatisch, da ein
intaktes Gen für die volle Funktionsfähigkeit
des Genproduktes ausreicht, sodass
sie nur auf Genebene identifiziert
werden können. Paare, bei denen beide
Träger einer Mutation sind, haben ein
Risiko von 25%, ein krankes Kind zu bekommen.
Die Frage, ob ein erwartetes Kind erkranken
wird oder nicht, lässt sich nur
anhand einer vorgeburtlichen molekulargenetischen
Untersuchung eindeutig
beantworten.
Mutationsanalysen sind schon bei Neugeborenen,
ja sogar bei Frühgeborenen
durchführbar, und zwar nicht nur aus
Blut,sondern z.B.auch aus Mundschleimhaut-
oder Nasenepithelzellen, was einen
rechtzeitigen Therapiebeginn und
damit verbunden eine verbesserte Le-
bensqualität ermöglicht. In Österreich
wird, im Gegensatz zu Deutschland, bereits
ein Neugeborenenscreening durchgeführt.
Die Wahl der Methode für einen
molekulargenetischen Mutationsnachweis
hängt von den genetischen Mechanismen
einer Krankheit sowie von der
zur Verfügung stehenden Information
über das Gen und dessen Sequenzen ab.
Je mehr Mutationen im CF-Gen detektiert
wurden, umso mehr drängte sich
die Entwicklung von Methoden auf, die
routinemäßig so rasch und einfach wie
möglich ein sensitives und zuverlässiges
Mutationsscreening erlauben.Von mehreren
Firmen entwickelte Kits erfüllen
zwar den Anspruch des raschen und relativ
kostengünstigen Nachweises, doch
ist die Zahl der detektierbaren Mutationen
auf die weltweit häufigsten 12–31 beschränkt,
was Ländern mit einer anderen
Mutationsverteilung wenig Nutzen
bringt und generell den Anteil erfassbarer
CF-Chromosomen nicht erhöht.
In den letzten Jahren wurden verschiedenste
Methoden wie z.B.die Dena-
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Tabelle 1
Verteilung der weltweit 24 häufigsten Mutationen innerhalb Europas mit Angabe der Anzahl detektierter Chromosomen mit der entsprechenden Mutation
und der relativen Frequenzen in Klammer. Die Anzahl untersuchter Chromosomen ist unter dem Namen jedes Landes angegeben,n.u.nicht untersucht,
aus Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium, Juli 1999, http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)
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Land Deutsch- Österreich Schweiz Schweden, UK und Belgien Nieder- Frankreich Spanien Portugal Italien Griechen- Tschechien Bulgarien
land Dänemark Irland lande land und Slovakei
Zystische Fibrose
Mutation 3046 634 892 1118 8019 982 1043 4683 1404 285 2613 326 628 252
G85E 0 (0,0) n. u. 2 (0,22) 0 (0,0) 15 (0,19) 0 (0,0) n. u. 11 (0,2) 8 (0,56) n. u. 3 (0,11) n. u. 1 (0,16) 1 (0,4)
R117H 4 (0,13) 1 (0,16) 1 (0,11) 3 (0,27) 46 (0,57) 0 (0,0) 1 (0,1) 6 (0,13) 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) n. u. 1 (0,16) 0 (0,0)
621+1G:T 1 (0,03) 2 (0,3) 3 (0,34) 6 (0,54) 79 (0,98) 0 (0,0) 0 (0,0) 5 (0,1) 3 (0,21) 1 (0,35) 9 (0,3) 19 (5,8) 1 (0,16) 0 (0,0)
711+1G:T 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,01) 0 (0,0) n. u. 14 (0,3) 13 (0,9) n. u. n. u. n. u. n. u. 0 (0,0)
1078delT 6 (0,2) n. u. 2 (0,22) 1 (0,09) 7 (0,09) 0 (0,0) n. u. 12 (0,3) 1 (0,07) n. u. 1 (0,04) n. u. n. u. 0 (0,0)
R334W 2 (0,06) 0 (0,0) 4 (0,45) 2 (0,18) 1 (0,01) 0 (0,0) 0 (0,0) 12 (0,3) 14 (1,0) 2 (0,7) 1 (0,04) 2 (0,6) 1 (0,16) 0 (0,0)
R347P 36 (1,2) 2 (0,3) 5 (0,56) 1 (0,09) 9 (0,15) 0 (0,0) 1 (0,1) 7 (0,15) 0 (0,0) n. u. 10 (0,4) 0 (0,0) 6 (0,95) 5 (2,0)
A455E 1 (0,03) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (0,2) 31 (3,0) 1 (0,02) 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0)
∆I507 4 (0,13) 0 (0,0) 1 (0,11) 0 (0,0) 20 (0,25) 2 (0,2) 1 (0,1) 28 (0,6) 5 (0,36) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
∆F508 2166 (71) 419 (66) 589 (66) 788 (70) 5719 (71) 734 (75) 804 (77) 3222 (69) 735 (52) 128 (45) 1290 (49) 173 (53) 336 (66) 137 (54)
1717-1G:A 15 (0,49) 1 (0,16) 29 (3,2) 0 (0,0) 35 (0,44) 15 (1,5) 16 (1,5) 62 (1,3) 1 (0,07) 0 (0,0) 41 (1,6) 0 (0,0) 2 (0,32) 0 (0,0)
G542X 43 (1,4) 10 (1,6) 14 (1,6) 7 (0,63) 155 (1,9) 35 (3,6) 19 (1,8) 152 (3,2) 93 (6,6) 5 (1,7) 75 (2,9) 15 (4,6) 21 (3,3) 12 (4,8)
S549N 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) 9 (0,11) 0 (0,0) 0 (0,0) 9 (0,19) 0 (0,0) n. u. 2 (0,08) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
G551D 38 (1,2) 9 (1,4) 0 (0,0) 3 (0,27) 232 (2,9) 0 (0,0) 1 (0,1) 31 (0,7) 5 (0,36) 0 (0,0) 2 (0,08) 1 (0,3) 20 (3,2) 0 (0,0)
R553X 62 (2,0) 3 (0,5) 44 (4,9) 2 (0,18) 35 (0,44) 8 (0,8) 12 (1,1) 27 (0,58) 1 (0,07) 0 (0,0) 11 (0,4) 0 (0,0) 7 (1,1) 0 (0,0)
R560T 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) 35 (0,44) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0)
1898+1G:A 1 (0,03) n. u. 1 (0,11) 0 (0,0) 30 (0,37) 0 (0,0) n. u. 2 (0,04) n. u. n. u. 0 (0,0) n. u. 10 (1,6) 0 (0,0)
2184delA 2 (0,06) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,01) 1 (0,1) n. u. 8 (0,17) 5 (0,36) n. u. n. u. n. u. n. u. 2 (0,8)
2789+5G:A 9 (0,3) n. u. 2 (0,22) 1 (0,09) 2 (0,02) 0 (0,0) n. u. 11 (0,2) 7 (0,5) n. u. n. u. n. u. 1 (0,16) 2 (0,8)
R1162X 2 (0,06) 9 (1,4) 6 (0,67) 0 (0,0) 3 (0,04) 1 (0,1) 12 (1,1) 18 (0,38) 24 (1,7) 1 (0,35) 25 (1,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
3659delC 4 (0,13) 1 (0,16) 0 (0,0) 4 (0,36) 12 (0,15) 1 (0,1) 2 (0,19) 15 (0,32) n. u. n. u. 0 (0,0) n. u. n. u. 0 (0,0)
3849+10kbC:T 16 (0,52) 0 (0,0) 5 (0,56) 0 (0,0) 5 (0,06) 0 (0,0) n. u. 2 (0,04) 0 (0,0) n. u. 1 (0,04) n. u. 5 (0,8) 2 (0,8)
W1282X 5 (0,16) 1 (0,16) 17 (1,9) 2 (0,18) 19 (0,24) 10 (1,0) 7 (0,7) 62 (1,3) 8 (0,56) n. u. 18 (0,7) 4 (1,2) 5 (0,8) 2 (0,8)
N1303K 40 (1,3) 3 (0,5) 19 (2,1) 8 (0,71) 39 (0,49) 27 (2,7) 9 (0,9) 71 (1,5) 28 (2,0) 1 (0,35) 89 (3,4) 10 (3,1) 20 (3,2) 16 (6,3)
Detektionsrate [%] 80,16 72,64 83,27 73,59 80,77 85,3 87,69 81,02 67,32 48,45 60,09 68,6 82,07 70,70

Tabelle 2
Wissenswertes für den Auftraggeber einer molekulargenetischen Untersuchung des CFTR-Gens
Bedeutung Symptome Zeitraum
Indikationen für eine Mekoniumileus bei Neugeborenen
molekulargenetische Untersuchung Grenzwertiger oder positiver Schweißtest
Chronisch-rezidivierende Pneumonien und Bronchitiden
Unklare Lungenfunktionsstörungen
Emphysem
Gedeihstörung
Pankreasinsuffizienz, chronische Pankreatitis unklarer Ätiologie
Fertilitätsstörung, Azoospermie oder hochgradige Oligospermie
Bestimmung des Trägerstatus bei Verwandten von CF-Patienten
Pränataldiagnose bei nachgewiesener Heterozygotie der Eltern
Mutationsscreening bei Partnern/Partnerinnen von nachgewiesenen Mutationsträgern
Untersuchungsmaterial 3–5 ml EDTA-Blut (DNA-Analyse)
Mundschleimhautzellen bei Neu- und Frühgeborenen (DNA)
Mundschleimhautzellen und/oder Nasenbrushing für Transkriptanalyse (RNA)
Dauer der Analysen Patienten mit Verdacht auf CF 1–6 Wochen
Trägererfassung bei bekannten Mutationen 3–5 Tage
Pränataldiagnose bei bekannten Mutationen 2 Tage
Mutationsscreening des ganzen Gens 4–6 Wochen
turing-gradient-Gelelektrophorese
(DGGE),die Heteroduplex(HD)-Analyse
und die Single-strand-conformation-polymorphism(SSCP)-Analyse
zum Nachweis
von Punktmutationen entwickelt.Eigene
Modifikationen haben zur Entwicklung
eines Mutationsscreeningprotokolls
geführt, das auf einer Kombination von
SSCP- und HD-Analytik basiert und das
Erfassen von mehr als 97% aller in den
untersuchten Sequenzen eines Gens vorkommenden
Punktmutationen, Minideletionen
und -insertionen unabhängig
von Ort,Art oder Häufigkeit der Mutationen
ermöglicht [4].
Aufgrund der Verteilung und Frequenzen
der CF-Mutationen wurde eine
Strategie für ein Totalscreening entwickelt
(Abb. 2), die es erlaubt, in
6–10 Tagen alle 27 Exons (inklusive
Exon-Intron-Übergänge), die Introns 11
und 19 sowie die Promotorregion des
CF-Gens auf Abweichungen von der
Normalsequenz zu untersuchen. Jede
Variante wird direkt sequenziert, um
die betreffende Mutation oder den
eventuellen Polymorphismus zu charakterisieren.Abbildung
3 zeigt ein Beispiel
eines SSCP-/HD-Bandenmusters
von 13 CF-Mutationen (3 Missense, 4
Nonsense, 2 Inframe-Deletionen, 3 Frameshift,
1 Spleißstelle) in 5 verschiedenen
Exons des Gens.
Sind bei einem Patienten/einer Patientin
beide Krankheit verursachenden
Mutationen identifiziert, ist in der betreffenden
Familie bezüglich dieser
beiden Mutationen eine 100% sichere
Trägererfassung und Pränataldiagnostik
(PnD) möglich.
Die Durchführung der Analysen erfolgt
in diesen Fällen aus Gründen der Qualitätskontrolle
[2] immer in 2 unabhängigen
PCR-Ansätzen der entsprechenden
Exons, um Laborfehler (Probenverwechslung,
Kontamination) möglichst auszu-
schließen. Für die Trägererfassung werden
immer amplifizierte DNA einer gesunden
Kontrolle und des Indexpatienten
mit der zu analysierenden DNA aufs
Gel aufgetragen, um anhand des Bandenmustervergleichs
festzustellen, ob
die betreffende Person eine Mutation
trägt oder nicht.
Es ist empfehlenswert, Partner oder
Partnerinnen gesunder Mutationsträger
und von CF-Patienten ebenfalls mit oben
genanntem Totalscreening zu untersuchen.Falls
keine Mutation gefunden wird,
reduziert sich das Risiko des Paares, ein
Abb. 2 Totalscreeningstrategie für direkten Mutationsnachweis in den 27 Exons des CF-Gens
Monatsschrift Kinderheilkunde 3•2001 | 219

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Zystische Fibrose
Abb. 3 Silbergefärbtes Polyacrylamidgel mit PCR-Produkten von Exon 7, 10, 11, 19 und 20 des CF-
Gens. Mutationsnachweis mittels SSCP/HD: BW Reagenzienblindwert; Exon 7: 1 R347P/–; 2 R334 W/–;
3 1078delT/–; 4 gesunde Kontrolle; Exon 10: 1 und 6 gesunde Kontrollen; 2 ∆I507/–; 3 ∆F508/Q525X;
4 ∆F508/∆F508; 5 ∆F508/–; Exon 11: 1 und 4 1717-1G:A/–; 2 R553X/–; 3 G542X/–; 5 gesunde
Kontrolle; Exon 19: 1 S1235R/–; 2 R1162X/–; 3 gesunde Kontrolle; Exon 20: 1 W1282X/–; 2 3905insT/–;
3 gesunde Kontrolle
Abb. 4 CF-Mutationen und ihre Mechanismen: Einteilung in 6 Klassen (a–f) und ihre
funktionellen Auswirkungen auf das CFTR-Protein
| Monatsschrift Kinderheilkunde 3•2001
Kind mit CF zu bekommen, von 1,25%
auf weniger als 0,001%.
Bei Pränataldiagnosen muss in 2
weiteren Analysen mittels Mikrosatelliten
geprüft werden, ob das Choriongewebe
nicht mit mütterlicher DNA kontaminiert
ist. Um eine zuverlässige Auswertung
zu ermöglichen und Verwechslungen
auszuschließen, werden immer
amplifizierte DNA einer gesunden Kontrolle,
des Indexpatienten sowie der Eltern
des Föten mit der zu analysierenden
DNA aufs Gel aufgetragen. Anhand
des Bandenmustervergleichs lässt sich
feststellen, ob das erwartete Kind krank
(2 Mutationen) oder gesund (eine oder
keine Mutation) sein wird [8].
Mutationsklassifizierung
Pathogene Mutationen im CF-Gen können
die Menge des CFTR-Proteins reduzieren,
den Transport des Genprodukts
zur Plasmamembran verhindern oder
die Funktion des Chloridkanals beeinflussen.
Von den mehr als 900 bisher
entdeckten CF-Mutationen sind vorläufig
nur wenige auf funktioneller Ebene
charakterisiert worden. Dies erschwert
eine Prognose bezüglich ihrer Auswirkung
auf das Protein, da sich aufgrund
der DNA-Veränderung allein nicht zuverlässig
definieren lässt, wie die Funktion
des CFTR beeinträchtigt oder gestört
wird.

Sechs verschiedene Mechanismen
werden heute diskutiert, um zu erklären,
wie CF-Mutationen den CFTR-abhängigen
Chloridtransport durch die Epithelzellen
beeinflussen [5].Nonsense-,Spleißstellen-
und Frameshift-Mutationen werden
der Klasse I zugeordnet. Sie lassen
meistens instabile, in ihrer Länge reduzierte
Transkripte entstehen, die zu einer
defekten Proteinsynthese führen.
Von den Klasse-I-Mutationen wird erwartet,
dass sie wenig bis kein intaktes
Protein produzieren und einen vollständigen
Funktionsverlust des CFTR zur
Folge haben (Abb. 4a).
Die Klasse II beinhaltet Mutationen,
die den Ausreifungsprozess des Proteins
verhindern oder beeinträchtigen, sodass
wiederum wenig bis kein funktionsfähiges
CFTR die apikale Membran der Epithelzellen
erreicht (Abb. 4b). Die ∆F508-
Deletion sowie viele verschiedene Missense-Mutationen
bewirken eine nicht
korrekte Faltung des Proteins und verhindern,
dass es seine native Konformation
einnehmen kann. Um die Auswirkungen
dieser Klasse-II-Mutationen korrigieren
zu können, müsste das falsche
Falten verhindert werden, was in vitro
und in vivo mittels verschiedenster pharmakologischer
Therapieansätzen versucht
wird [11].
Mutationen der Klasse III und IV
produzieren vollständig ausgereifte Proteine,
die zwar an die Plasmamembran
gelangen, aber entweder einen nicht
bzw. schlecht aktivierbaren Chloridka-
nal darstellen (Abb. 4c) oder einen gestörten
Ionendurchfluss zeigen (Abb.4d).
Klasse V (Abb. 4e) beinhaltet Mutationen,
die die Menge an intaktem Transkript
und Protein variabel reduzieren.
Das heißt, es wird sowohl normales
funktionsfähiges wie auch mutiertes
Protein produziert, wobei das Verhältnis
zwischen intaktem und mutiertem
CFTR maßgebend für den Phänotyp
verantwortlich ist. Zur Klasse V gehören
Mutationen, die eine alternative Spleißstelle
in einem Intron kreieren. Zu dieser
Gruppe gehört eine polyvariante
Mutante in Intron 8, kurz vor dem
Übergang zu Exon 9 des CFTR-Gens. Sie
liegt in Form eines TG-Repeats, gefolgt
von einem T-Repeat, vor, die beide in
der Anzahl ihrer Repeats variieren und
in Abhängigkeit von ihrer Länge in einem
variablen Anteil der CFTR-mRNA-
Transkripte den Verlust von Exon 9 verursachen,
was wiederum, basierend auf
der Ratio CFTR+Exon 9 versus CFTR-
Exon 9, den klinischen Verlauf beeinflusst
[1].
Der Klasse VI (Abb. 4f) werden Mutationen
zugeordnet, die sich auf die Regulation
anderer Kanäle auswirken. Das
CFTR-Protein ist ein positiver Regulator
der outwardly rectified chloride channels
(ORCC) und ein negativer Regulator der
epithelial sodium channels (ENaC) [9].
Unterschiedliche Mechanismen, verursacht
durch mehrere hundert verschiedene
Mutationen, führen zu einer Dysfunktion
des CFTR-Proteins. Aufgrund
des DNA-Defekts lässt sich die Auswirkung
auf die Funktion des Proteins
nicht voraussagen. Eine Zuordnung
der Mutationen zu einer bestimmten
Klasse darf nicht ohne vorhergegangene
funktionelle Studien vorgenommen
werden.
Zusätzlich muss beachtet werden, dass
eine Mutation u. U. mehr als einer Klasse
angehören kann.
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Monatsschrift Kinderheilkunde 3•2001 | 221