Ergebnisse und Diskussion 102 Untersuchung und ... - tuprints

Material und Methoden
neutralisiert, indem die Membran viermal 1 min auf ein mit Soak II getränktes Whatmanpapier
gelegt wurde. Diese Schritte wurden besonders vorsichtig durchgeführt, da die DNA auf der
Membran noch nicht fixiert war. Nach einem weiteren Trocknungsschritt wurde die DNA auf der
Membran durch eine Bestrahlung mit UV-Licht im UV -Stratalinker fixiert. Die Prähybridisierung
erfolgte anschließend mit 5 ml QuickHyb (Stratagene, USA) für 30 min bei 68°C, dann wurde
die denaturierte, radioaktive DNA-Sonde (siehe IV.2.10.2) zugegeben und über Nacht inkubiert.
Am nächsten Tag wurde die Membran für 30 min mit Wash 1 bei 68°C gewaschen, dann für 30
min bei RT mit Wash 2. Anschließend wurde sie exponiert und die Signale mit dem
PhosphoImager quantifiziert. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm TINA 2.0.
Soak I: 0,5 M NaOH Soak II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4
1 M NaCl 3 M NaCl
Wash 1: 10 % 20 x SSC Wash 2: 1 % 20 x SSC
0,1 % SDS 0,5 % SDS
2.10 Isolierung replikativer Intermediate und Southern Blot
2.10.1 Isolierung replikativer Intermediate
Um replikative Intermediate aus mit DHBV-Konstrukten transfizierten LMH-Zellen zu isolieren,
wurden die Kulturen zuerst mit PBS gewaschen und dann von der Platte abgeschabt. Die
Zellen wurden durch eine Zentrifugation für 5 min bei 4°C und 8.000 rpm pelletiert. Das Pellet
wurde in 1 ml eines NP-40-haltigem Lysepuffer aufgenommen und lysiert. Dann wurde für 5 min
bei 13.000 rpm zentrifugiert, um die Nuklei zu pelletieren. Der Überstand wurde in zwei
Reaktionsgefäße überführt (je 500 µl), ein Gefäß wurde bei -20°C gelagert. Zu dem anderen
wurden 100 µg/ml DNase I (Roche, Mannheim) gegeben, um die Input-DNA der Transfektion zu
zerstören, virale DNA in Core-Partikeln war vor diesem Verdau geschützt. Es wurde für 30 min
bei 37°C inkubiert, woraufhin 50 µl 0,5 M EDTA zugegeben und für weitere 5 min bei 37°C
inkubiert wurde, um die DNase zu inaktivieren. Dann wurde die virale DNA freigesetzt, indem
100 µg Proteinase K (Roche, Mannheim) zugegeben und 2 h bei 56°C inkubiert wurde.
Anschließend wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA durchgeführt und danach die
DNA mit Ethanol präzipitiert. Das daraus resultierende DNA -Pellet wurde in 20 µl H2O
aufgenommen. 5 µl davon wurden für einen Southern Blot eingesetzt.
NP-40-Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8
1 mM EDTA
1 % Nonidet P-40
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